CN108287097A - 一种硫堇伊红染色液及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种硫堇和伊红染色液及其制备方法，以及染色方法，硫堇染色液利用酸解的方法可打断DNA分子链中的嘌呤‑脱氧核糖链，即去嘌呤作用，然后DNA部分区域发生重排，暴漏出醛基，硫堇能与细胞中的醛基反应形成一种醌型化合物，使细胞核DNA染成蓝色；伊红是一种化学合成的酸性染料，在醇中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使细胞浆、细胞质和细胞外基质染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。标本背景清晰，层析分明，染色效果好，色彩饱和，易于数字化图像分析、医生诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种病理学诊断中组织学和细胞学标本染色的特殊染色试剂，具体涉及一种硫堇伊红染色液及其制备方法和应用。
背景技术
硫堇伊红染色法，区别于常用的染色方法，是一种特殊染色方法，可用于组织学、细胞学染色。
硫堇染色液利用酸解的方法可打断DNA分子链中的嘌呤-脱氧核糖链，即去嘌呤，然后DNA部分区域发生重排，暴漏出醛基，硫堇能与细胞中的醛基反应形成一种醌型化合物，使细胞核DNA染成蓝色。硫堇分子式C14H13N3O2S，结构式如下：
伊红是一种化学合成的酸性染料，分水溶性和醇溶性两种，主要使细胞质和细胞间质着红色，在醇中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使细胞浆、细胞质和细胞外基质、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。醇溶性伊红结构式如下：
。
发明内容
本发明的目的是提供一种硫堇伊红染色液的制备及染色方法，可用于人体组织学和细胞学的特殊染色。
本发明提供了所述硫堇伊红染色液及制备方法：
本发明的硫堇伊红染色液，包括硫堇染色液和伊红染色液；
所述的硫堇染色液，每1000ml所述硫堇染色液中包括如下组分：
硫堇（硫堇劳氏紫粉末）0.5-3.0g；染料助剂0.5-2g；醇20-80ml；强酸10-15ml；余量为水；所述的伊红染色液，每1000ml所述伊红染色液中包括如下组分：
曙红3-8g；弱酸30-50ml；水50ml；乙醇900-920ml；
所述染料助剂为亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的至少一种；
所述醇为乙醇、甲醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇中的一种或多种混合物；
所述乙醇为95%乙醇或无水乙醇
所述强酸为盐酸、硫酸或硝酸中的至少一种
所述弱酸为乙酸、水杨酸、柠檬酸、次氯酸、亚硫酸、偏硅酸的一种或多种的混合物；
所述伊红为醇溶性伊红；
所述水为蒸馏水、去离子水、纯化水及体外诊断试剂用纯化水；
本发明的一种硫堇伊红染色液的制备方法，包括以下步骤：
1）硫堇染色液的配制：
a) 将水加热至50-70℃，加入硫堇，搅拌1-2小时，冷却室温过滤；
b) 加入染料助剂和醇，搅拌均匀；
c）使用前，加入强酸，搅拌50-90min，搅拌温度控制在20-30℃，搅拌结束后直接用于染色；
2）伊红染色液的配制：
a）将伊红加入水中，加热搅拌至完全溶解，制备伊红原液；
b）伊红原液中加入弱酸和乙醇，搅拌5-20min，得到伊红染色液。
本发明还提供了一种硫堇伊红染色液的染色方法，包括以下步骤：
1） 病理标本预处理：
2）样本预处理后，可进行手工染色和设备染色：
组织切片染色：二甲苯脱蜡2次，每次2-5分钟；无水乙醇2次，每次2-5分钟；水洗1-3min；固定液40-90分钟，水洗、沥干；分化液30-80分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色40-90分钟，水洗、沥干；95%乙醇40-90s；95%乙醇40-90s；伊红2~10s；95%乙醇5-20s；无水乙醇5-20s；二甲苯2次，每次2分钟；脱水、透明、封片；
细胞涂片染色：湿固定完成后，水洗、沥干；固定液40-90分钟，水洗、沥干；分化液30-80分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色40-90分钟，水洗、沥干；70%乙醇40-90s；95%乙醇40-90s；伊红染色液染色2~10s；95%乙醇5-20s；无水乙醇5-20s；晾干后封片。
需要说明的是，采用所述的硫堇伊红染色液进行染色时，本领域技术人员可以根据染色情况及染色要求对染色、分化、返蓝时间进行适当调整。可用于染色样本的类型有石蜡切片、冰冻切片、血液涂片、培养细胞以及体液涂片(如宫颈粘液涂片、胸腔液涂片等)等。
本发明的硫堇伊红染色液，所述硫堇伊红染色液与所述伊红染色液共同使用，所述硫堇染色液利用酸解的方法可打断DNA分子链中的嘌呤-脱氧核糖链，即去嘌呤作用，然后DNA部分区域发生重排，暴漏出醛基，硫堇能与细胞中的醛基反应形成一种醌型化合物，使细胞核DNA染成蓝色，假性蓝色染色较少，染色均匀；所述伊红染色液对细胞质和细胞外基质染色，着色清晰，层次丰富，由此得到的标本背景清晰，层析分明，染色效果好，色彩饱和，易于数字化图像分析、医生诊断。
附图说明：
图1为本发明硫堇伊红染色液的胃组织切片染色示意图；
图2为本发明硫堇伊红染色液的宫颈脱落细胞涂片染色示意图。
具体实施方式：
以下具体实施方式进一步阐明本发明“一种硫堇伊红染色液及制备方法和应用”的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一
本发明“一种硫堇伊红染色液及制备方法”，用于病理学诊断中人体组织切片染色。包括硫堇染色液和伊红染色液，其中：
每1000ml所述硫堇染色液中包括如下组分：硫堇（硫堇劳氏紫粉末）1.5g；染料助剂1.2g；醇50ml；强酸12ml；余量为水；
每1000ml所述伊红染色液中包括如下组分：曙红5g；弱酸40ml；水50ml；95%乙醇910ml；
其制备方法：
1）硫堇染色液配制：
a）将水加热至60℃，加入硫堇，搅拌60min，冷却室温过滤；
b）加入染料助剂和醇，搅拌均匀；
c）加入强酸，搅拌60min，搅拌温度控制在27℃，搅拌结束后直接用于染色；
2）伊红染色液的配制：
a）将伊红加入水中，加热搅拌至完全溶解，制备伊红原液；
b）伊红原液中加入弱酸和乙醇，搅拌15min，得到伊红染色液。
取经上述步骤制得的硫堇伊红染色液，对组织切片进行染色操作：
1）组织标本预处理：组织标本预处理：固定、取材、再次固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片；
固定：将临床取到的组织样本，立即投入固定液以尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性；
取材：按病理诊断的目的和要求，从样本上切取适当大小和数目的组织块，一般厚度以0.2～0.3cm为适，体积不超过2x1.5x0.3cm；
再次固定：取材后将组织块立即投入固定液以尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性；
脱水：用溶剂去除组织中的水分（脱水机可自动完成脱水、透明与浸蜡过程）；
透明：透明剂代替脱水后组织中的水分；
浸蜡：组织浸入石蜡中；
包埋：石蜡注入包埋托内，后用镊子将浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷台，用镊子轻按组织块，平整之后盖上脱水盒底，再加好石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切；
切片：用切片机制成切片；
烤片：石蜡切片在水域中展平整后用载玻片贴上，晾干后烤片；
2）硫堇伊红染色：将步骤1）得到的组织切片二甲苯脱蜡2次，每次3分钟；无水乙醇2次，每次3分钟；水洗2min；固定液50分钟，水洗、沥干；分化液60分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色70分钟，水洗、沥干；70%酒精55s；95%乙醇65s；伊红染色液染色7s；95%乙醇15s；无水乙醇15s；二甲苯2次，每次2分钟；脱水、透明、封片。
数字化图像见附图1。
实施例二：
本发明“一种硫堇伊红染色液及制备方法和应用”，用于病理学诊断中脱落细胞涂片染色：包括硫堇染色液和伊红染色液，其中：
每1000ml所述硫堇染色液中包括如下组分：硫堇1.2g；染料助剂1.2g；醇50ml；强酸11ml；余量为水；
每1000ml所述伊红染色液中包括如下组分：曙红4g；弱酸35ml；水50ml；无水乙醇915ml；
其制备方法：
1）硫堇染色液配制：
a）将水加热至60℃，加入硫堇，搅拌60min，冷却室温过滤；
b）加入染料助剂和醇，搅拌均匀；
c）加入强酸，搅拌60min，搅拌温度控制在27℃，注意避光，搅拌结束后直接用于染色；
2）伊红染色液的配制：
a）将伊红加入水中，加热搅拌至完全溶解，制备伊红原液；
b）伊红原液中加入弱酸和乙醇，搅拌5-20min，得到伊红染色液。
取经上述步骤制得的硫堇伊红染色液，对细胞涂片进行染色操作：
细胞标本预处理：标本振荡、转移、分离、制片、固定：
振荡标本：标本编号振荡5min；
转移：震荡后静置2min以内，转移细胞液到已加入4ml分离液的试管内；
离心去上清液：试管对称放入离心机，梯度离心2次，弃去上清液；
制片：振荡试管，依次添加1ml左右清洁液，震荡，调浓度，震荡，静置2min，转移细胞液到制片仓，静置15min，随后倒出多余细胞液，酒精清洗2次，取下制片仓；
固定：取出玻片放酒精内湿固定30min。
硫堇伊红染色：
将步骤1）得到的细胞涂片进行染色：湿固定完成后，水洗、沥干；固定液60分钟，水洗、沥干；分化液35分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色50分钟，水洗、沥干；70%乙醇60s；95%乙醇50s；伊红染色液染色7s；95%乙醇10s；无水乙醇10s；晾干后封片。
数字化图像见附图2。
对于本领域的技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和构思，上述石蜡切片、冰冻切片、细胞涂片染色溶液的配制和染色步骤和时间可根据具体需要进行调整，而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍应属于本发明创造的保护范围内。
Claims (7)
1.一种硫堇伊红染色液，其特征在于：
每1000ml所述硫堇染色液中包括如下组分：
硫堇（硫堇劳氏紫粉末）0.5-3.0g；染料助剂0.5-2g；醇20-80ml；强酸10-15ml；余量为水；
每1000ml所述伊红染色液中包括如下组分：
曙红3-8g；弱酸30-50ml；水50ml；乙醇900-920ml。
2.根据权利要求1所述的硫堇伊红染色液，其特征在于，所述硫堇染色液伊红染色液中：
所述染料助剂为亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的至少一种；
所述醇为乙醇、甲醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇中的至少一种；
所述乙醇为95%乙醇或无水乙醇；
所述强酸为盐酸、硫酸或硝酸中的至少一种；
所述弱酸为乙酸、水杨酸、柠檬酸、次氯酸、亚硫酸、偏硅酸的一种或多种的混合物；
所述伊红为醇溶性伊红；
所述水为蒸馏水、去离子水、纯化水及体外诊断试剂用纯化水。
3.根据权利要求1-2任一所述的硫堇伊红染色液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
硫堇染色液的配制:
将水加热至50-70℃，加入硫堇，搅拌50-90min，冷却室温过滤；
加入染料助剂和醇，搅拌均匀；
使用前，加入强酸，搅拌50-90min，搅拌温度控制在20-30℃，注意避光，搅拌结束后直接用于染色；
伊红染色液的配制：
a）将伊红加入水中，加热搅拌至完全溶解，制备伊红原液；
b）伊红原液中加入弱酸和乙醇，搅拌5-20min，得到伊红染色液。
4.根据权利要求1-3所述的硫堇伊红染色液的染色方法，其特征在于，硫堇伊红染色液的染色方法，包括如下步骤：
1）病理标本预处理；
2）样本预处理后，可进行手工染色和设备染色：
组织切片染色：二甲苯脱蜡2次，每次2-5分钟；无水乙醇2次，每次2-5分钟；水洗1-3min；固定液40-90分钟，水洗、沥干；分化液30-80分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色40-90分钟，水洗、沥干；95%乙醇40-90s；95%乙醇40-90s；伊红染色液染色2~10s；95%乙醇5-20s；无水乙醇5-20s；二甲苯2次，每次2分钟；脱水、透明、封片；
细胞涂片染色：湿固定完成后，水洗、沥干；固定液40-90分钟，水洗、沥干；分化液30-80分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色40-90分钟，水洗、沥干；70%乙醇40-90s；95%乙醇40-90s；伊红染色液染色2~10s；95%乙醇5-20s；无水乙醇5-20s；晾干后封片。
5.根据权利要求1-4所述的硫堇伊红染色液及染色方法，其特征在于，所述的硫堇伊红染色液用于病理学诊断中组织学和细胞学样本染色，可用于染色样本类型石蜡切片、冰冻切片、细胞涂片等。
6.根据权利要求1-4所述的硫堇和伊红染色液及染色方法，其特征在于，所述的硫堇伊红染色液可用于显微镜分析、数字化图像分析，提高各种样本处理方法的染色效果。
7.根据权利要求1-4所述的硫堇和伊红染色液，其特征在于，所述的硫堇伊红染色液可用于临床检测试剂、科研试剂及试剂盒。
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