CN111879592A - 一种防掉片细胞dna定量染色液及其制备方法 - Google Patents

一种防掉片细胞dna定量染色液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法,优选硫堇‑亚硫酸盐染色,易溶于热水,并有显著的因光异色作用,最大吸收波长(水中)602.5nm,适用于高特异性细胞核DNA定量染色,弥补了Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)共染带来的背景杂乱,特异性不高的缺点。本发明适用于各类细胞核DNA染色,尤其适用于细胞DNA定量染色分析;可与其余多种细胞质/蛋白染色方法联用,适用性广,商业用途价值高。

Description

一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞DNA定量检测的染色方法,尤其涉及一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)染色方法有Feulgen法、甲基绿-派洛宁法、吖啶橙荧光法等,其中最经典的是Feulgen法,Feulgen染色由Feulgen和Rossenbeck在1924年发现的一种细胞核内DNA染色技术。该法是一种经典的酶组织化学法。Leagene Feulgen stain原理在于:DNA经弱酸(1mol/LHCl)水解后,嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开,并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开,在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与Schiff(无色品红亚硫酸溶液)试剂结合,形成紫红色化合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基(醌基是一个具有颜色的发色团),所以凡含有DNA的部位,就呈紫红色。而RNA用此法处理后则分解。Feulgen染色使DNA特异性着色。其染色的深浅与DNA的含量或倍体成正比。
细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA进行特异性染色、仪器测定细胞核内DNA含量或倍体来判断细胞的生理状态和病理改变。DNA定量细胞学在宫颈癌、口腔鳞癌、头颈部肿瘤、颈部淋巴结肿大、乳腺癌、胃癌、肺癌、泌尿系肿瘤、胸腹积液的临床应用及研究中有重大意义。
因传统方法中由载玻片承载的组织、细胞经酸解、固定、水洗等操作后,极易出现不同程度的载玻片掉片(即组织、细胞等标本从载玻片上部分或全部脱落缺失的现象),造成假阴性的情况,直接影响结果的判定甚至降低方法学的准确性。为此,科研人员研发了各类防脱载玻片,例如CN201921220040.1、CN201521113399.0等所设计的防脱载玻片通过提高洁净度、增加黏附层、增设卡槽等手段对液基细胞学、组织染色等出现的掉片现象有大幅改善。
然而,由于传统方法染色过程繁琐,极易受组织固定液种类、酸解时间和温度的影响,仅仅通过增强黏附力防止掉片是治标不治本的,防脱载玻片的脱片仍时有发生。方法学中冷、热、酸、碱、醇对于防脱载玻片的影响仍未得到根本解决。因碱性Schiff特异性不高,背景易出现共染现象,影响结果的判定,降低准确性。
发明内容
针对上述技术所存在的不足之处,本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液,包括:
试剂A,包括:硫堇、染色助剂和水;
试剂B,选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇、盐酸、磷酸中的一种或多种;
试剂C,包括:亚硫酸盐和超纯水;
所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比为:5:1:4(V/V/V)。
硫堇,带黑绿色闪光针状结晶。易溶于热水,开始是蓝色,后呈紫色,并有显著的因光异色作用。溶于氯仿,微溶于乙醇、乙醚和冷水。最大吸收波长(水中)602.5nm。也是染色剂,如细胞核的染色,类淀粉蛋白、嗜碱性细胞和黏蛋白染色,活体染色。替代Feulgen染色的碱性品红,特异性更高(背景不易出现共染现象)。
亚硫酸盐是一种含氧酸盐,白色结晶性粉末,有二氧化硫的气味,可溶于水,也微溶于醇。兼具还原性、氧化性,多表现还原性用途广泛,在空气中易被氧化为硫酸盐。联合碱性硫堇共同作用,特异性定量标记细胞核DNA。
优选地,所述试剂A中,按重量份计,包括:硫堇50-150份,染色助剂20-50份,蒸馏水50-250份。
优选地,所述试剂B选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种,或者甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的混合物。更优选地,甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的体积比为7:1。
优选地,所述试剂C中,按重量份计,包括:亚硫酸盐20-50份和超纯水50-150份。
更优选地,所述亚硫酸盐选自偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠中的一种或多种。
本发明还提供了上述防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法,包括如下步骤:
(1)配制试剂A,再加入试剂B,混合均匀;
(2)加入试剂C,恒温25-40℃磁力搅拌30-60min,得防掉片细胞DNA定量染色液。
优选地,通过以下方法配制试剂A:按重量份称取硫堇劳氏紫粉末,加入烧杯中,用部分蒸馏水冲洗残留试剂,再加入染色助剂,余量用剩余蒸馏水补齐,然后加热沸腾10-30min,冷却至30-50℃,得试剂A。
优选地,上述方法还包括将步骤(2)得到的染色液放入棕色瓶中,冷藏,有效期7天。
更优选地,每次使用染色液前快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
本发明的有益效果如下:
染色液优选硫堇-亚硫酸盐染色,易溶于热水,并有显著的因光异色作用,最大吸收波长(水中)602.5nm,适用于高特异性细胞核DNA定量染色,弥补了Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)共染带来的背景杂乱,特异性不高的缺点。
本发明适用于各类细胞核DNA染色,尤其适用于细胞DNA定量染色分析;可与其余多种细胞质/蛋白染色方法联用,适用性广,商业用途价值高。
附图说明
图1.传统Feulgen染色实例脱片结果。
图2.本发明染色实例脱片结果。
图3.本发明宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之CV值。
图4.本发明宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之IOD值。
图5.本发明宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之线性度。
具体实施方式
为了便于更清楚的理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明中,“室温”可以是22-30℃。
可以理解的是,以下实施例中,如未有特殊说明,其采用的材料及方法均通过本领域常规技术手段即可实现。
实施例1
以配制420ml为例,本实施例的DNA染液配液步骤如下:
(1)按重量份计,称取50份的硫堇劳氏紫粉末,加入500ml烧杯中;量取50份的蒸馏水用于冲洗残留试剂;量取20份的染色助剂加入烧杯中,余量用200份蒸馏水补齐。加热沸腾30min,冷却至50℃,即制得试剂A。试剂A中,按重量份计,包括:硫堇50份,染色助剂20份,蒸馏水250份。
(2)按照体积比5:1向冷却的液体中加入试剂B,混合均匀。本实施例中,试剂B为乙二醇:磷酸=7:1(V/V)。
(3)称取20份的偏重亚硫酸钠充分溶解于150份的蒸馏水中,室温进行,即制得试剂C,向试剂A和试剂B的混合溶液中加入试剂C,试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5:1:4(V/V/V),再加入蒸馏水至420ml。
(4)在液体中加入磁力搅拌转子后,盖好瓶盖,放置于磁力搅拌器上。
(5)恒温箱35℃搅拌45min后放入棕色瓶中,贴好标签,冰箱冷藏,有效期7天。
(6)每次使用须快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
实施例2
以配制420ml为例,本实施例的DNA染液配液步骤如下:
(1)按重量份计,称取100份的硫堇劳氏紫粉末,加入500ml烧杯中;量取50份的蒸馏水用于冲洗残留试剂;量取50份的染色助剂加入烧杯中,余量用75份蒸馏水补齐。加热沸腾30min,冷却至50℃,即制得试剂A。试剂A中,按重量份计,包括:硫堇100份,染色助剂50份,蒸馏水125份。
(2)向冷却的液体中加入试剂B,混合均匀,试剂B为叔丁醇:盐酸=7:1(V/V)。所述试剂B与冷却的液体的体积比是5:1(V/V)。
(3)按重量份计,称取35份的亚硫酸氢钠充分溶解于100份的蒸馏水中,室温进行,即制得试剂C,向试剂A和试剂B的混合溶液中加入试剂C,试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5:1:4(V/V/V),再加入蒸馏水至420ml。
(4)在液体中加入磁力搅拌转子后,盖好瓶盖,放置于磁力搅拌器上。
(5)恒温箱25℃搅拌60min后放入棕色瓶中,贴好标签,冰箱冷藏,有效期7天。
(6)每次使用须快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
实施例3
以配制420ml为例,本实施例的DNA染液配液步骤如下:
(1)按重量份计,称取100份的硫堇劳氏紫粉末,加入500ml烧杯中;量取50份的蒸馏水用于冲洗残留试剂;量取50份的染色助剂加入烧杯中,余量用75份蒸馏水补齐。加热沸腾30min,冷却至50℃,即制得试剂A。试剂A中,按重量份计,包括:硫堇150份,染色助剂50份,蒸馏水50份。
(2)向冷却的液体中加入试剂B,混合均匀,试剂B为甲醇:盐酸=7:1(V/V)。所述试剂B与冷却的液体的体积比是5:1(V/V)。
(3)按重量份计,称取50份的亚硫酸氢钠充分溶解于50份的蒸馏水中,室温进行,即制得试剂C,向试剂A和试剂B的混合溶液中加入试剂C,试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5:1:4(V/V/V),再加入蒸馏水至420ml。
(4)在液体中加入磁力搅拌转子后,盖好瓶盖,放置于磁力搅拌器上。
(5)恒温箱40℃搅拌30min后放入棕色瓶中,贴好标签,冰箱冷藏,有效期7天。
(6)每次使用须快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
试验例
基于本发明防掉片细胞DNA定量染色液进行染色的方法,由以下步骤组成:
I、按照实施例2的方法配制DNA染液。
II、制片:梯度离心沉降法,步骤如下:
(1)样本确认并相应编号。
(2)将样品瓶置于振荡器上充分震荡5min(3-5min均可)。
(3)沿沉降仓壁或滤杯壁向沉降仓中加入2.5ml(1-2.5ml均可)分离液(湖南品胜生物技术有限公司,样本梯度分离液)。
(4)吸取2.5ml(1-2.5ml均可)样品-保存液(湖南品胜生物技术有限公司,液基细胞保存液)沿滤杯壁加入。
(5)对称平衡放入离心机(湖南品胜生物技术有限公司,梯度离心机4000A),1200rpm(800-2000rpm均可),离心3min(1-5min均可)。
(6)去掉过滤网,弃上清液,轻轻甩干,旋转取下沉降仓,取出载玻片于染色架。
(7)流水冲洗。
(8)恒温箱35℃烘烤15min(10-30min均可)。
III、染色:步骤如下:
(1)固定:玻片浸入BS固定液中,固定30min(20-50min均可),恒温箱35℃中进行,本试验例的BS固定液由质量份为220份的甲醛,80份的甲醇、150份的乙酸组成。
BS固定液、酸解液使用时均需提前5-15min预热。
(2)回收:将BS固定液倒回相应回收瓶中(BS固定液只可使用两次,第二次用完后弃用)。
(3)冲洗:流水洗涤3min(1-3min均可),室温下进行。
(4)酸解:浸入酸解液中,酸解25min(15-35min均可),恒温箱35℃中进行。本试验例的酸解液由质量份为100份的盐酸(也可以是磷酸或氢溴酸或其组合)和50份的超纯水组成。
(5)回收:将酸解液倒回相应回收瓶中(酸解液只可使用两次,第二次用完后弃用)。
(6)冲洗烘烤:流水洗涤3min(1-3min均可),恒温箱35℃烘烤15min(10-30min均可)。
(7)染色:浸入DNA染色液中;染色50min(20-50min均可),恒温箱35℃中进行。
(8)冲洗:流水洗涤3min(1-3min均可),室温下进行。
(9)漂洗:浸入预热的蒸馏水中,浸泡5min(3-8min均可),恒温箱35℃中进行。
(10)脱水:浸入50%乙醇中,脱水2min(1-2min均可),室温下进行。
(11)脱水:浸入75%乙醇中,脱水2min(1-2min均可),室温下进行。
(12)脱水:浸入95%乙醇中,脱水1min(1-2min均可),室温下进行。
(13)脱水:浸入无水乙醇中,脱水2min(1-2min均可),室温下进行。
(14)封片:自然晾干或用冷风吹干后中性树脂进行封片。
为了检测本发明的效果,载玻片同时选用普通载玻片、a公司防脱载玻片产品和b公司防脱载玻片产品作为对照,染色方法采用传统Feulgen染色与采用本发明染色液染色作为对照,分别对宫颈组织和宫颈脱落细胞进行染色,具体实验设计如表1所示。
表1.实施方案(例)
Figure BDA0002648001480000061
Figure BDA0002648001480000071
本试验例进一步以宫颈脱落细胞染色作为示例,采用全自动细胞DNA定量分析系统(湖南品胜生物科技有限公司)进行扫描,出具有IOD、CV、线性度等质控数据,肉眼观察评估脱片情况;宫颈组织染色肉眼观察评估脱片情况。
其中IOD(指积分光密度=平均光密度*选定对象的面积=每个像素点光密度之和;OD指光密度,光通过被检测物前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量,特定波长下同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。《科技编辑大辞典》对光密度的定义是:入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值)能够代表染色情况(240<IOD<380,IOD越高染色越深),往往可以作为质控参数。
其中CV指细胞DNA含量的变异系数,不同标本二倍体细胞DNA指数的CV可以代表它们IOD测量的离散程度,离散程度越小,说明测量精度越高。因此,CV值往往用于质控参数。
其中线性度Z=四倍体细胞平均值/二倍体细胞平均值,不同标本的线性度,可以代表它们四倍体计算平均偏差,越接近2,平均偏差越小。因此,线性度往往用于质控参数。
其中脱片指切片从载玻片上脱下或切片已与载玻片分离,悬浮但尚未脱下,情况分为三个等级:轻度脱片(切片边缘轻度卷曲至脱落面积<10%);中度脱片(10%<切片脱落面积<80%);重度脱片(切片脱落面积>80%)。
结果如表2(图1)、表3(图2)、图3、图4、图5所示。
表2.传统Feulgen染色实例结果
Figure BDA0002648001480000072
Figure BDA0002648001480000081
表3.本发明染色液染色实例结果
Figure BDA0002648001480000082
结果:组织染色中,随着防脱片载玻片的使用以及品质的优劣,迅速的提升了防脱片效果;细胞染色中,随着防脱载玻片的使用以及品质的优劣,迅速的提升了防脱片效果;传统Feulgen染色与本发明中,本发明每一项实验结果均优与传统染色,且能兼容大部分不同黏附剂的防脱载玻片,甚至在普通载玻片上也表现优异。质控方面,CV值随着染色品质的增加而降低,如图3所示,即本发明变异度低于传统染色法,结果更可靠;本发明中IOD优于传统染色,如图4所示,即染色更深,更有益于观察;线性度(P>0.05,无明显差异),如图5所示,线性度也与标本有关,在1.9-2.1的可控范围内。
结论:本发明提供的一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法,优选硫堇-亚硫酸盐染色适用于高特异性细胞核DNA定量染色,弥补了传统试剂共染带来的背景杂乱,特异性不高的缺点。质控数据显示,本发明适用于DNA染色,尤其适用于细胞DNA定量染色分析,变异离异程度低,染色更深更易观察;可回收,适用性广,试剂安全稳定,商业用途价值高。
上述实施方式并非是对本发明的限制,本发明也并不仅限于上述举例,本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换,也均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种防掉片细胞DNA定量染色液,包括:
试剂A,包括:硫堇、染色助剂和水;
试剂B,选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇、盐酸、磷酸中的一种或多种;
试剂C,包括:亚硫酸盐和超纯水;
所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5:1:4。
2.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液,其特征在于,所述试剂A中,按重量份计,包括:硫堇50-150份,染色助剂20-50份,蒸馏水50-250份。
3.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液,其特征在于,所述试剂B选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种,或者甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的混合物。
4.根据权利要求3所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液,其特征在于,甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的体积比为7:1。
5.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液,其特征在于,所述试剂C中,按重量份计,包括:亚硫酸盐20-50份和超纯水50-150份。
6.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液,其特征在于,所述亚硫酸盐选自偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠中的一种或多种。
7.权利要求1-6任意一项所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法,包括如下步骤:
(1)配制试剂A,再加入试剂B,混合均匀;
(2)加入试剂C,恒温25-40℃磁力搅拌30-60min,得防掉片细胞DNA定量染色液。
8.根据权利要求7所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法,其特征在于,通过以下方法配制试剂A:按重量份称取硫堇劳氏紫粉末,加入烧杯中,用部分蒸馏水冲洗残留试剂,再加入染色助剂,余量用剩余蒸馏水补齐,然后加热沸腾10-30min,冷却至30-50℃,得试剂A。
9.根据权利要求7所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法,其特征在于,还包括将步骤(2)得到的染色液放入棕色瓶中,冷藏,有效期7天。
10.根据权利要求9所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法,其特征在于,每次使用染色液前快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
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