CN111879592A - 一种防掉片细胞dna定量染色液及其制备方法 - Google Patents

一种防掉片细胞dna定量染色液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法，优选硫堇‑亚硫酸盐染色，易溶于热水，并有显著的因光异色作用，最大吸收波长(水中)602.5nm，适用于高特异性细胞核DNA定量染色，弥补了Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)共染带来的背景杂乱，特异性不高的缺点。本发明适用于各类细胞核DNA染色，尤其适用于细胞DNA定量染色分析；可与其余多种细胞质/蛋白染色方法联用，适用性广，商业用途价值高。

Description

一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞DNA定量检测的染色方法，尤其涉及一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)染色方法有Feulgen法、甲基绿-派洛宁法、吖啶橙荧光法等，其中最经典的是Feulgen法，Feulgen染色由Feulgen和Rossenbeck在1924年发现的一种细胞核内DNA染色技术。该法是一种经典的酶组织化学法。Leagene Feulgen stain原理在于：DNA经弱酸(1mol/LHCl)水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与Schiff(无色品红亚硫酸溶液)试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基(醌基是一个具有颜色的发色团)，所以凡含有DNA的部位，就呈紫红色。而RNA用此法处理后则分解。Feulgen染色使DNA特异性着色。其染色的深浅与DNA的含量或倍体成正比。
细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA进行特异性染色、仪器测定细胞核内DNA含量或倍体来判断细胞的生理状态和病理改变。DNA定量细胞学在宫颈癌、口腔鳞癌、头颈部肿瘤、颈部淋巴结肿大、乳腺癌、胃癌、肺癌、泌尿系肿瘤、胸腹积液的临床应用及研究中有重大意义。
因传统方法中由载玻片承载的组织、细胞经酸解、固定、水洗等操作后，极易出现不同程度的载玻片掉片(即组织、细胞等标本从载玻片上部分或全部脱落缺失的现象)，造成假阴性的情况，直接影响结果的判定甚至降低方法学的准确性。为此，科研人员研发了各类防脱载玻片，例如CN201921220040.1、CN201521113399.0等所设计的防脱载玻片通过提高洁净度、增加黏附层、增设卡槽等手段对液基细胞学、组织染色等出现的掉片现象有大幅改善。
然而，由于传统方法染色过程繁琐，极易受组织固定液种类、酸解时间和温度的影响，仅仅通过增强黏附力防止掉片是治标不治本的，防脱载玻片的脱片仍时有发生。方法学中冷、热、酸、碱、醇对于防脱载玻片的影响仍未得到根本解决。因碱性Schiff特异性不高，背景易出现共染现象，影响结果的判定，降低准确性。
发明内容
针对上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液，包括：
试剂A，包括：硫堇、染色助剂和水；
试剂B，选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇、盐酸、磷酸中的一种或多种；
试剂C，包括：亚硫酸盐和超纯水；
所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比为：5：1：4(V/V/V)。
硫堇，带黑绿色闪光针状结晶。易溶于热水，开始是蓝色，后呈紫色，并有显著的因光异色作用。溶于氯仿，微溶于乙醇、乙醚和冷水。最大吸收波长(水中)602.5nm。也是染色剂，如细胞核的染色，类淀粉蛋白、嗜碱性细胞和黏蛋白染色，活体染色。替代Feulgen染色的碱性品红，特异性更高(背景不易出现共染现象)。
亚硫酸盐是一种含氧酸盐，白色结晶性粉末，有二氧化硫的气味，可溶于水，也微溶于醇。兼具还原性、氧化性，多表现还原性用途广泛，在空气中易被氧化为硫酸盐。联合碱性硫堇共同作用，特异性定量标记细胞核DNA。
优选地，所述试剂A中，按重量份计，包括：硫堇50-150份，染色助剂20-50份，蒸馏水50-250份。
优选地，所述试剂B选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种，或者甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的混合物。更优选地，甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的体积比为7：1。
优选地，所述试剂C中，按重量份计，包括：亚硫酸盐20-50份和超纯水50-150份。
更优选地，所述亚硫酸盐选自偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠中的一种或多种。
本发明还提供了上述防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂A，再加入试剂B，混合均匀；
(2)加入试剂C，恒温25-40℃磁力搅拌30-60min，得防掉片细胞DNA定量染色液。
优选地，通过以下方法配制试剂A：按重量份称取硫堇劳氏紫粉末，加入烧杯中，用部分蒸馏水冲洗残留试剂，再加入染色助剂，余量用剩余蒸馏水补齐，然后加热沸腾10-30min，冷却至30-50℃，得试剂A。
优选地，上述方法还包括将步骤(2)得到的染色液放入棕色瓶中，冷藏，有效期7天。
更优选地，每次使用染色液前快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
本发明的有益效果如下：
染色液优选硫堇-亚硫酸盐染色，易溶于热水，并有显著的因光异色作用，最大吸收波长(水中)602.5nm，适用于高特异性细胞核DNA定量染色，弥补了Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)共染带来的背景杂乱，特异性不高的缺点。
本发明适用于各类细胞核DNA染色，尤其适用于细胞DNA定量染色分析；可与其余多种细胞质/蛋白染色方法联用，适用性广，商业用途价值高。
附图说明
图1.传统Feulgen染色实例脱片结果。
图2.本发明染色实例脱片结果。
图3.本发明宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之CV值。
图4.本发明宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之IOD值。
图5.本发明宫颈脱落细胞染色实例扫描结果之线性度。
具体实施方式
为了便于更清楚的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明中，“室温”可以是22-30℃。
可以理解的是，以下实施例中，如未有特殊说明，其采用的材料及方法均通过本领域常规技术手段即可实现。
实施例1
以配制420ml为例，本实施例的DNA染液配液步骤如下：
(1)按重量份计，称取50份的硫堇劳氏紫粉末，加入500ml烧杯中；量取50份的蒸馏水用于冲洗残留试剂；量取20份的染色助剂加入烧杯中，余量用200份蒸馏水补齐。加热沸腾30min，冷却至50℃，即制得试剂A。试剂A中，按重量份计，包括：硫堇50份，染色助剂20份，蒸馏水250份。
(2)按照体积比5：1向冷却的液体中加入试剂B，混合均匀。本实施例中，试剂B为乙二醇：磷酸＝7：1(V/V)。
(3)称取20份的偏重亚硫酸钠充分溶解于150份的蒸馏水中，室温进行，即制得试剂C，向试剂A和试剂B的混合溶液中加入试剂C，试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5：1：4(V/V/V)，再加入蒸馏水至420ml。
(4)在液体中加入磁力搅拌转子后，盖好瓶盖，放置于磁力搅拌器上。
(5)恒温箱35℃搅拌45min后放入棕色瓶中，贴好标签，冰箱冷藏，有效期7天。
(6)每次使用须快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
实施例2
以配制420ml为例，本实施例的DNA染液配液步骤如下：
(1)按重量份计，称取100份的硫堇劳氏紫粉末，加入500ml烧杯中；量取50份的蒸馏水用于冲洗残留试剂；量取50份的染色助剂加入烧杯中，余量用75份蒸馏水补齐。加热沸腾30min，冷却至50℃，即制得试剂A。试剂A中，按重量份计，包括：硫堇100份，染色助剂50份，蒸馏水125份。
(2)向冷却的液体中加入试剂B，混合均匀，试剂B为叔丁醇：盐酸＝7：1(V/V)。所述试剂B与冷却的液体的体积比是5：1(V/V)。
(3)按重量份计，称取35份的亚硫酸氢钠充分溶解于100份的蒸馏水中，室温进行，即制得试剂C，向试剂A和试剂B的混合溶液中加入试剂C，试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5：1：4(V/V/V)，再加入蒸馏水至420ml。
(4)在液体中加入磁力搅拌转子后，盖好瓶盖，放置于磁力搅拌器上。
(5)恒温箱25℃搅拌60min后放入棕色瓶中，贴好标签，冰箱冷藏，有效期7天。
(6)每次使用须快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
实施例3
以配制420ml为例，本实施例的DNA染液配液步骤如下：
(1)按重量份计，称取100份的硫堇劳氏紫粉末，加入500ml烧杯中；量取50份的蒸馏水用于冲洗残留试剂；量取50份的染色助剂加入烧杯中，余量用75份蒸馏水补齐。加热沸腾30min，冷却至50℃，即制得试剂A。试剂A中，按重量份计，包括：硫堇150份，染色助剂50份，蒸馏水50份。
(2)向冷却的液体中加入试剂B，混合均匀，试剂B为甲醇：盐酸＝7：1(V/V)。所述试剂B与冷却的液体的体积比是5：1(V/V)。
(3)按重量份计，称取50份的亚硫酸氢钠充分溶解于50份的蒸馏水中，室温进行，即制得试剂C，向试剂A和试剂B的混合溶液中加入试剂C，试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5：1：4(V/V/V)，再加入蒸馏水至420ml。
(4)在液体中加入磁力搅拌转子后，盖好瓶盖，放置于磁力搅拌器上。
(5)恒温箱40℃搅拌30min后放入棕色瓶中，贴好标签，冰箱冷藏，有效期7天。
(6)每次使用须快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
试验例
基于本发明防掉片细胞DNA定量染色液进行染色的方法，由以下步骤组成：
I、按照实施例2的方法配制DNA染液。
II、制片：梯度离心沉降法，步骤如下：
(1)样本确认并相应编号。
(2)将样品瓶置于振荡器上充分震荡5min(3-5min均可)。
(3)沿沉降仓壁或滤杯壁向沉降仓中加入2.5ml(1-2.5ml均可)分离液(湖南品胜生物技术有限公司，样本梯度分离液)。
(4)吸取2.5ml(1-2.5ml均可)样品-保存液(湖南品胜生物技术有限公司，液基细胞保存液)沿滤杯壁加入。
(5)对称平衡放入离心机(湖南品胜生物技术有限公司，梯度离心机4000A)，1200rpm(800-2000rpm均可)，离心3min(1-5min均可)。
(6)去掉过滤网，弃上清液，轻轻甩干，旋转取下沉降仓，取出载玻片于染色架。
(7)流水冲洗。
(8)恒温箱35℃烘烤15min(10-30min均可)。
III、染色：步骤如下：
(1)固定：玻片浸入BS固定液中，固定30min(20-50min均可)，恒温箱35℃中进行，本试验例的BS固定液由质量份为220份的甲醛，80份的甲醇、150份的乙酸组成。
BS固定液、酸解液使用时均需提前5-15min预热。
(2)回收：将BS固定液倒回相应回收瓶中(BS固定液只可使用两次，第二次用完后弃用)。
(3)冲洗：流水洗涤3min(1-3min均可)，室温下进行。
(4)酸解：浸入酸解液中，酸解25min(15-35min均可)，恒温箱35℃中进行。本试验例的酸解液由质量份为100份的盐酸(也可以是磷酸或氢溴酸或其组合)和50份的超纯水组成。
(5)回收：将酸解液倒回相应回收瓶中(酸解液只可使用两次，第二次用完后弃用)。
(6)冲洗烘烤：流水洗涤3min(1-3min均可)，恒温箱35℃烘烤15min(10-30min均可)。
(7)染色：浸入DNA染色液中；染色50min(20-50min均可)，恒温箱35℃中进行。
(8)冲洗：流水洗涤3min(1-3min均可)，室温下进行。
(9)漂洗：浸入预热的蒸馏水中，浸泡5min(3-8min均可)，恒温箱35℃中进行。
(10)脱水：浸入50％乙醇中，脱水2min(1-2min均可)，室温下进行。
(11)脱水：浸入75％乙醇中，脱水2min(1-2min均可)，室温下进行。
(12)脱水：浸入95％乙醇中，脱水1min(1-2min均可)，室温下进行。
(13)脱水：浸入无水乙醇中，脱水2min(1-2min均可)，室温下进行。
(14)封片：自然晾干或用冷风吹干后中性树脂进行封片。
为了检测本发明的效果，载玻片同时选用普通载玻片、a公司防脱载玻片产品和b公司防脱载玻片产品作为对照，染色方法采用传统Feulgen染色与采用本发明染色液染色作为对照，分别对宫颈组织和宫颈脱落细胞进行染色，具体实验设计如表1所示。
表1.实施方案(例)
Figure BDA0002648001480000061
Figure BDA0002648001480000071
本试验例进一步以宫颈脱落细胞染色作为示例，采用全自动细胞DNA定量分析系统(湖南品胜生物科技有限公司)进行扫描，出具有IOD、CV、线性度等质控数据，肉眼观察评估脱片情况；宫颈组织染色肉眼观察评估脱片情况。
其中IOD(指积分光密度＝平均光密度*选定对象的面积＝每个像素点光密度之和；OD指光密度，光通过被检测物前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。《科技编辑大辞典》对光密度的定义是：入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值)能够代表染色情况(240<IOD<380，IOD越高染色越深)，往往可以作为质控参数。
其中CV指细胞DNA含量的变异系数，不同标本二倍体细胞DNA指数的CV可以代表它们IOD测量的离散程度，离散程度越小，说明测量精度越高。因此，CV值往往用于质控参数。
其中线性度Z＝四倍体细胞平均值/二倍体细胞平均值，不同标本的线性度，可以代表它们四倍体计算平均偏差，越接近2，平均偏差越小。因此，线性度往往用于质控参数。
其中脱片指切片从载玻片上脱下或切片已与载玻片分离，悬浮但尚未脱下，情况分为三个等级：轻度脱片(切片边缘轻度卷曲至脱落面积＜10％)；中度脱片(10％＜切片脱落面积＜80％)；重度脱片(切片脱落面积＞80％)。
结果如表2(图1)、表3(图2)、图3、图4、图5所示。
表2.传统Feulgen染色实例结果
Figure BDA0002648001480000072
Figure BDA0002648001480000081
表3.本发明染色液染色实例结果
Figure BDA0002648001480000082
结果：组织染色中，随着防脱片载玻片的使用以及品质的优劣，迅速的提升了防脱片效果；细胞染色中，随着防脱载玻片的使用以及品质的优劣，迅速的提升了防脱片效果；传统Feulgen染色与本发明中，本发明每一项实验结果均优与传统染色，且能兼容大部分不同黏附剂的防脱载玻片，甚至在普通载玻片上也表现优异。质控方面，CV值随着染色品质的增加而降低，如图3所示，即本发明变异度低于传统染色法，结果更可靠；本发明中IOD优于传统染色，如图4所示，即染色更深，更有益于观察；线性度(P>0.05，无明显差异)，如图5所示，线性度也与标本有关，在1.9-2.1的可控范围内。
结论：本发明提供的一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法，优选硫堇-亚硫酸盐染色适用于高特异性细胞核DNA定量染色，弥补了传统试剂共染带来的背景杂乱，特异性不高的缺点。质控数据显示，本发明适用于DNA染色，尤其适用于细胞DNA定量染色分析，变异离异程度低，染色更深更易观察；可回收，适用性广，试剂安全稳定，商业用途价值高。
上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种防掉片细胞DNA定量染色液，包括：
试剂A，包括：硫堇、染色助剂和水；
试剂B，选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇、盐酸、磷酸中的一种或多种；
试剂C，包括：亚硫酸盐和超纯水；
所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比为5：1：4。
2.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，所述试剂A中，按重量份计，包括：硫堇50-150份，染色助剂20-50份，蒸馏水50-250份。
3.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，所述试剂B选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种，或者甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的混合物。
4.根据权利要求3所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种与盐酸和/或磷酸的体积比为7：1。
5.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，所述试剂C中，按重量份计，包括：亚硫酸盐20-50份和超纯水50-150份。
6.根据权利要求1所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液，其特征在于，所述亚硫酸盐选自偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠中的一种或多种。
7.权利要求1-6任意一项所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂A，再加入试剂B，混合均匀；
(2)加入试剂C，恒温25-40℃磁力搅拌30-60min，得防掉片细胞DNA定量染色液。
8.根据权利要求7所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法，其特征在于，通过以下方法配制试剂A：按重量份称取硫堇劳氏紫粉末，加入烧杯中，用部分蒸馏水冲洗残留试剂，再加入染色助剂，余量用剩余蒸馏水补齐，然后加热沸腾10-30min，冷却至30-50℃，得试剂A。
9.根据权利要求7所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法，其特征在于，还包括将步骤(2)得到的染色液放入棕色瓶中，冷藏，有效期7天。
10.根据权利要求9所述的一种防掉片细胞DNA定量染色液的制备方法，其特征在于，每次使用染色液前快速取出所需用量至另一棕色瓶中提前5-15min预热。
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