CN110161025A - 一种测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于茶叶化学分析技术领域,具体是一种测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法。现行国家标准《GBT8313‑2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》中福林酚试剂分光光度计比色法测定茶叶中茶多酚含量测定过程中,加样、加反应试剂、反应时间控制、分光光度比色等过程中,引入误差的人为因素较多,对茶叶中茶多酚百分含量的影响较大。本发明引进了更为精准的连续流动分析技术,可以将以上的人为误差影响因素降到最低,是一种更为先进、快捷的一种分析测定方法,特别是在大样品量等待检测时,体现出更加快捷、方便、精准的优越性,提高了数据的准确性和可比性。
Description
技术领域
本发明涉及茶叶化学分析技术领域,特别是指一种测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法。
背景技术
茶多酚类(Tea polyphenols),亦称“茶鞣制”、“茶单宁”,主要由儿茶素类、黄酮类物质、花青素类和酚酸等四大类物质组成,是一类存在于茶树中的多元酚的混合物,对茶叶的色香味品质的形成有重要作用。茶多酚具有较强的抗氧化作用,同时具有抗肿瘤、防治心血管疾病、降血压、降血糖、抑菌抗病毒、预防泌尿系统感染、抗龋齿护齿及防紫外线照射等药理作用,是茶叶保健功能的首要成分。在茶叶及茶制品行业中,茶多酚的准确测定,有着非常重要的实际意义。
续流动分析仪是一种现代化化学分析仪器,是在系统中连续通入反应试剂,使其与待测样品物质发生反应,试剂的量由不同流速的泵管精确控制,样品被每隔2秒注入的空气气泡分割成20-30小片断,每个片断都被独立读数达100次左右,增加延时圈使反应完全,用比色计检测有色络合物的吸光度,然后与标准品建立校准数据库,达到准确分析的目的。目前常见的应用领域有烟草及烟草制品、地表水成分分析等,还未见应用于茶叶分析领域。
目前现行的最新的茶多酚相关检测国家标准为GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》,使用的是分光光度法和高效液相色谱法检测茶叶中茶多酚的含量。分光光度法测定消耗时间较长,过程中容易引入人为操作误差,样品处理相对繁琐,不适合大批量样品分析检测;高效液相色谱法对样品的处理、试剂的纯度要求较高,且检测色谱柱消耗较快,成本较高。
发明内容
本发明提出一种测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,公开了一种更为精准的连续流动分析技术,可以将背景技术中的人为误差影响因素降到最低,特别是在大样品量等待检测时,体现出更加快捷、方便、精准的优越性,提高了数据的准确性和可比性。
本发明的技术方案是这样实现的:
一种测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,步骤如下:
① 将进样管路的连接置于反应开始之前,使用一个玻璃三通,上面接入空气管路,中间设定为活化水管路,下面引入样品的第一次进样;样品和活化水混合后,被每隔2S的空气气泡分隔开,每两个气泡之间将成为一个独立的样品片断,三路管路混合后,经过一个5匝的玻璃反应延时圈,充分混合均匀后,经过分流,大部分被朝上放置的废液管排走,小部分将进入二次进样;
② 二次进样处仍设计为一个玻璃三通,上面引入空气,中间设定为活化水管路,确保样品与反应试剂比例得当;下面接入经过稀释分流后样品,为该分析方法的二次进样管;三路管路混合后,经过一个10匝的玻璃反应延时圈Ⅰ,准备进行下一步的反应;
③ 紧接步骤②的10匝的玻璃反应延时圈Ⅰ,用管路接入通入的第一个反应试剂福林酚试剂,样品与福林酚混合后发生氧化反应,再联入一个10匝的玻璃反应延时圈Ⅱ,确保样品和福林酚试剂充分混合,准备进行下一步的反应;
④ 紧接步骤③的10匝的玻璃反应延时圈Ⅱ,用管路接入通入的第二个反应试剂碳酸钠试剂,此时多酚在碱性条件下被福林酚氧化的-OH基团开始显浅蓝色,为了确保反应的充分彻底与产物的均匀性,连续联入2个20匝的玻璃反应延时圈,来保证充足的反应的时间;
⑤ 最后将反应产物接入检测器,在660nm滤光片下进行连续在线比色检测。
所述步骤①中空气管路流量为常用的0.32mL/min,活化水为稀释样品反应浓度,流量为1.2mL/min,进样管路流量为0.42mL/min。
所述步骤②中上面空气流量为0.32mL/min,活化水管路的流量为0.6mL/min,二次进样管的管路流量为0.6mL/min。
所述步骤③中福林酚试剂浓度1~2%,管路流量为0.6mL/min。
所述步骤④中碳酸钠试剂的浓度0.75~1.5%,管路流量为0.6mL/min。
所述样品中茶多酚的计算公式如下:
式中,Cx为样品的仪器观测值,单位为µg/mL;
V为样品的提取液体积,单位为mL;
m为测试样品实际称重,单位为g;
w为测试样品含水率,单位为%(质量分数)。
运用该分析检测方法,不仅数据准确度和精确度非常高,而且进样速度快,试剂消耗量非常少:进样速度大概为40只/H,出峰时间为10分钟左右,120只样品检测试剂消耗量非常少,1N的福林酚用量不超过5mL,分析纯碳酸钠用量不超过3.75g,其余消耗均为水,且体积不超过1000mL。
按照GB/T 8302-2013 《茶取样》标准,进行取样;
按照GB/T 8303-2013 《茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定》标准和GB/T 8303-2013 《茶水分测定》,进行样品磨碎准备及干物质含量、含水量的测定;
根据茶多酚检测原理,结合连续流动分析实际需求,配制反应所需试剂。反应原理为用70%的甲醇水溶液在70℃水浴环境下提取磨碎茶样中的茶多酚,福林酚试剂氧化茶多酚中-OH基团,并在碱性条件下显蓝色。用没食子酸作校正标准,连续流动分析仪常用检测蓝光波段的660nm的滤光片进行在线连续比色定量检测。
本发明的有益效果在于:
(1)利用本发明的方法对绿茶、白茶、黑茶等不同发酵程度茶类稀释100倍后的茶样,进行加标回收率测试,三种茶类回收率分别为94.34%,96.26%,100.22%,平均总回收率96.94%,结果见表1:
表1 不同茶类样品稀释后茶多酚加标回收率
(2)本发明方法对绿茶、白茶、黑茶等不同发酵程度茶类的测定精密度分别为0.48,1.33,0.32μg/ml,详见表2;本方法与现行国家标准分光光度计法检测结果比较,采用双尾检验,选择α=0.05,计算得到t值分别为-1.47,-0.18,0.48,对应p值分别为0.19,0.86,0.65,均大于0.01,由此可见,改进后的测定方法测定结果与现行标准相比,不存在显著性差异。
表2 国标分光光度计法与连续流动分析法检测结果比较
。
(3)本申请的方法相对于现行国家标准《GBT8313-2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》中福林酚试剂比色法测定茶叶中茶多酚含量的方法,检出限为2.13µg/mL,精确度更高,每小时检测样品量30-50只,将大大简化了分析作业,同时也减少了人为误差,具有操作简便、分析速度快、重现性好和应用广泛等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为测定茶叶中多酚类管线连接分布图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一种测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,包括茶多酚反应管线分布图的设定与优化、样品的前处理和反应试剂的配置,然后通过连续流动分析仪对茶多酚进行定量测定,按以下操作步骤进行:
(1)测定前首先根据福林酚法测定茶叶中茶多酚的原理,对连续流动分析仪的茶多酚测定管路进行设定和改进,详见附图1,具体方法如下:
①进样管路的连接置于反应开始之前,使用一个玻璃三通,上面接入空气管路,中间设定为活化水管路,下面引入样品的第一次进样,其中,空气管路流量为常用的0.32mL/min;活化水为稀释样品反应浓度,流量为1.2mL/min,加入活化剂后可以保证管道的清洁与润滑;样品管路流量为0.42mL/min。样品和活化水混合后,被每隔2S的空气气泡分隔开,每两个气泡之间将成为一个独立的样品片断,三路管路混合后,经过一个5匝的玻璃反应延时圈,充分混合均匀后,经过分流,大部分被朝上放置的废液管排走,小部分将进入二次进样。
②二进样处仍设计为一个玻璃三通,上面引入空气,流量仍为常用的0.32mL/min;中间设定为活化水管路,流量为0.6mL/min,确保样品与反应试剂比例得当;下面接入经过稀释分流后样品,为该分析方法的二次进样管,管路流量为0.6mL/min。三路管路混合后,经过一个10匝的玻璃反应延时圈,准备进行下一步的反应。
③接上一步的10匝的玻璃反应延时圈,用管路接入通入的第一个反应试剂福林酚试剂,试剂浓度不能超过2%,管路流量为0.6mL/min,样品与福林酚混合后发生氧化反应,再联入一个10匝的玻璃反应延时圈,确保样品和福林酚试剂充分混合,准备进行下一步的反应。
④紧接上一步的10匝的玻璃反应延时圈,用管路接入通入的第二个反应试剂碳酸钠试剂,试剂浓度不能超过1.5%,管路流量为0.6mL/min,此时多酚在碱性条件下被福林酚氧化的-OH基团开始显浅蓝色,为了确保反应的充分彻底与产物的均匀性,连续联入2个20匝的玻璃反应延时圈,来保证充足的反应的时间。
⑤反应产物接入检测器,在660nm滤光片下进行连续在线比色检测。
运用该分析检测方法,不仅数据准确度和精确度非常高,而且进样速度快,试剂消耗量非常少:进样速度大概为40只/H,出峰时间为10分钟左右,120只样品检测试剂消耗量非常少,1N的福林酚用量不超过5mL,分析纯碳酸钠用量不超过3.75g,其余消耗均为水,且体积不超过1000mL。
按照GB/T 8302-2013 《茶取样》标准,进行取样;
按照GB/T 8303-2013 《茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定》标准和GB/T 8303-2013 《茶水分测定》,进行样品磨碎准备及干物质含量、含水量的测定;
根据茶多酚检测原理,结合连续流动分析实际需求,配制反应所需试剂。反应原理为用70%的甲醇水溶液在70℃水浴环境下提取磨碎茶样中的茶多酚,福林酚试剂氧化茶多酚中-OH基团,并在碱性条件下显蓝色。用没食子酸作校正标准,连续流动分析仪常用检测蓝光波段的660nm的滤光片进行在线连续比色定量检测。反应涉及的试剂有:
①实验所用水均为去离子水或者纯净水。
② 22%-30%聚乙氧基月桂醚溶液。
取25g聚乙氧基月桂醚加入到100mL水中,加热熔解,混合均匀即可。
③2%福林酚试剂。
将5mL的1N的福林酚试剂转移至250mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。该试剂应先配现用。
④1.5%碳酸钠溶液。
称取3.75g±0.01g分析纯无水碳酸钠,加适量水溶解,转移至250mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,上机测试前加入0.5mL聚乙氧基月桂醚溶液。
⑤没食子酸标准储备液。
同现行国标GB/T 8313-2018,称取0.110g±0.001g没食子酸,于100mL容量瓶中溶解,并定容至刻度,摇匀,现配。
⑥没食子酸工作液。
用移液管分别移取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的没食子酸标准储备液于100mL容量瓶中,分别用水定容至刻度,摇匀,浓度分别为10µg/mL、20µg/mL、30µg/mL、40µg/mL、50µg/mL。
⑦70%甲醇水溶液。
根据需要,按比例配制。
(5)样品中茶多酚的提取,同现行国标GB/T 8313-2018。
①样品母液
称取0.2g(精确到0.0001g)均匀磨碎的茶样于10mL离心管中,加入在70℃水浴锅预热过的70%甲醇水溶液5mL,用玻璃棒充分搅拌均匀湿润,立即移入70℃水浴中浸提10min,期间每隔5min搅拌一次,浸提后冷却至室温,转入离心机在5000-8000r/min转速下离心10min左右,将上清液移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70%甲醇水溶液提取一次,重复以上操作,合并提取液定容至10mL,摇匀,用0.45µm膜过滤,待用。
②待测样品测试液。
移取母液1mL于100mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀待测。
(6)按照茶多酚的连续流动福林酚法分析流程图(如图1)要求,连接各路管线,经过开机清洁管道及仪器预热,将试剂按照管线分布图1要求泵入对应管路中,待运行稳定后,对标准溶液和样品进行测定。测定结束后,检测报告上面直接显示的就是样品测试液的浓度值,单位为μg/mL。
本发明与现行国家标准检测方法GB/T 8313-2018相比,样品前处理与标准储备液、标准工作液仍保持一致,只是在检测部分进行改进和优化。现行的最新的茶多酚相关检测国家标准为GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》,使用的是分光光度法和高效液相色谱法检测茶叶中茶多酚的含量。分光光度法测定消耗时间较长,过程中容易引入人为操作误差,样品处理相对繁琐,尤其不适合大批量样品分析检测;高效液相色谱法对样品的处理、试剂的纯度要求较高,且检测色谱柱消耗较快,成本较高。本方法使用连续流动分析方法测定茶叶中的茶多酚含量,检出限为2.13µg/mL,精确度更高,每小时检测样品量30-50只,试剂消耗少,连续测样120杯后基线较稳定,峰形较好,管路运行平稳,适合大批量长时间样品进样检测。本方法将大大简化了分析步骤,加快了测样速度,同时也减少了人为误差,具有操作简便、分析速度快、重现性好和应用广泛等特点。
因样品前处理、茶多酚提取、稀释及标线配制,分光光度计法与连续流动分析法两种分析方法均保持一致,以下实验数据,将直接用稀释100倍后的待测样品测试液的浓度来对比两种检测方法的测定精密度、加标回收率和双尾检验等。
利用本发明的方法对绿茶、白茶、黑茶等不同发酵程度茶类稀释100倍后的茶样,进行加标回收率测试,三种茶类回收率分别为94.34%,96.26%,100.22%,平均总回收率96.94%,结果见表1:
表1 不同茶类样品稀释后茶多酚加标回收率
本发明方法对绿茶、白茶、黑茶等不同发酵程度茶类的测定精密度分别为0.48,1.33,0.32μg/ml,详见表2;本方法与现行国家标准分光光度计法检测结果比较,采用双尾检验,选择α=0.05,计算得到t值分别为-1.47,-0.18,0.48,对应p值分别为0.19,0.86,0.65,均大于0.01,由此可见,改进后的测定方法测定结果与现行标准相比,不存在显著性差异。
表2 国标分光光度计法与连续流动分析法检测结果比较
采用本发明方法对茶叶及茶制品中茶多酚进行测定,连续进样120杯,基线稳定,峰形对称,管路运行平稳,适合大批量,长时间连续进样。
本发明数据计算公式如下:
式中,Cx为样品的仪器观测值,单位为µg/mL;
V为样品的提取液体积,单位为mL;
m为测试样品实际称重,单位为g;
w为测试样品含水率,单位为%(质量分数)。
实施例1
信阳毛尖的茶多酚的测定
(1)样品前处理
准确称取0.2g(精确到0.0001g)均匀磨碎的信阳毛尖茶样于10mL离心管中,加入在70℃水浴锅预热过的70%甲醇水溶液5mL,用玻璃棒充分搅拌均匀湿润,立即移入70℃水浴中浸提10min,期间每隔5min搅拌一次,浸提后冷却至室温,转入离心机在5000-8000r/min转速下离心10min左右,将上清液移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70%甲醇水溶液提取一次,重复以上操作,合并提取液定容至10mL,摇匀,用0.45µm膜过滤。移取母液1mL于100mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀待测。
(2)配制相关反应试剂
(3)标准工作液范围的设置:用移液管分别移取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的没食子酸标准储备液(1000µg/mL)于100mL容量瓶中,分别用水定容至刻度,摇匀,浓度分别为10µg/mL、20µg/mL、30µg/mL、40µg/mL、50µg/mL。
(4)按照茶多酚的连续流动福林酚法分析流程图运用连续流动分析仪进行样品的在线连续检测
(5)以干物质计算茶多酚的含量,由下式得出:
式中,Cx为样品的仪器观测值,单位为µg/mL;
V为样品的提取液体积,单位为mL;
m为测试样品实际称重,单位为g;
w为测试样品含水率,单位为%(质量分数)。
由以上公式计算出信阳毛尖中茶多酚的含量为20-30%
实施例2
普洱茶的茶多酚的测定
(1)样品前处理
准确称取0.2g(精确到0.0001g)均匀磨碎的普洱茶样于10mL离心管中,加入在70℃水浴锅预热过的70%甲醇水溶液5mL,用玻璃棒充分搅拌均匀湿润,立即移入70℃水浴中浸提10min,期间每隔5min搅拌一次,浸提后冷却至室温,转入离心机在5000-8000r/min转速下离心10min左右,将上清液移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70%甲醇水溶液提取一次,重复以上操作,合并提取液定容至10mL,摇匀,用0.45µm膜过滤。移取母液1mL于100mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀待测。
(2)配制相关反应试剂
(3)标准工作液范围的设置:用移液管分别移取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL的没食子酸标准储备液(1000µg/mL)于100mL容量瓶中,分别用水定容至刻度,摇匀,浓度分别为5µg/mL、10µg/mL、15µg/mL、20µg/mL、25µg/mL
(4)按照茶多酚的连续流动福林酚法分析流程图运用连续流动分析仪进行样品的在线连续检测
(5)以干物质计算茶多酚的含量,由下式得出:
式中,Cx为样品的仪器观测值,单位为µg/mL;
V为样品的提取液体积,单位为mL;
m为测试样品实际称重,单位为g;
w为测试样品含水率,单位为%(质量分数);
由以上公式计算出普洱茶中茶多酚的含量为7-12%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,其特征在于,步骤如下:
① 将进样管路的连接置于反应开始之前,使用一个玻璃三通,上面接入空气管路,中间设定为活化水管路,下面引入样品的第一次进样;样品和活化水混合后,被每隔2S的空气气泡分隔开,每两个气泡之间将成为一个独立的样品片断,三路管路混合后,经过一个5匝的玻璃反应延时圈,充分混合均匀后,经过分流,大部分被朝上放置的废液管排走,小部分将进入二次进样;
② 二次进样处仍设计为一个玻璃三通,上面引入空气,中间设定为活化水管路,确保样品与反应试剂比例得当;下面接入经过稀释分流后样品,为该分析方法的二次进样管;三路管路混合后,经过一个10匝的玻璃反应延时圈Ⅰ,准备进行下一步的反应;
③ 紧接步骤②的10匝的玻璃反应延时圈Ⅰ,用管路接入通入的第一个反应试剂福林酚试剂,样品与福林酚混合后发生氧化反应,再联入一个10匝的玻璃反应延时圈Ⅱ,确保样品和福林酚试剂充分混合,准备进行下一步的反应;
④ 紧接步骤③的10匝的玻璃反应延时圈Ⅱ,用管路接入通入的第二个反应试剂碳酸钠试剂,此时多酚在碱性条件下被福林酚氧化的-OH基团开始显浅蓝色,为了确保反应的充分彻底与产物的均匀性,连续联入2个20匝的玻璃反应延时圈,来保证充足的反应的时间;
⑤ 最后将反应产物接入检测器,在660nm滤光片下进行连续在线比色检测。
2.根据权利要求1所述的测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,其特征在于:所述步骤①中空气管路流量为常用的0.32mL/min,活化水为稀释样品反应浓度,流量为1.2mL/min,进样管路流量为0.42mL/min。
3.根据权利要求1所述的测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,其特征在于:所述步骤②中上面空气流量为0.32mL/min,活化水管路的流量为0.6mL/min,二次进样管的管路流量为0.6mL/min。
4.根据权利要求1所述的测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,其特征在于:所述步骤③中福林酚试剂浓度1~2%,管路流量为0.6mL/min。
5.根据权利要求1所述的测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,其特征在于:所述步骤④中碳酸钠试剂的浓度0.75~1.5%,管路流量为0.6mL/min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的测定茶叶及茶制品中茶多酚的连续流动分析方法,其特征在于,所述样品中茶多酚的计算公式如下:
式中,Cx为样品的仪器观测值,单位为µg/mL;
V为样品的提取液体积,单位为mL;
m为测试样品实际称重,单位为g;
w为测试样品含水率,单位为%(质量分数)。
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