CN107860633B - 一种白细胞分析用染色剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种白细胞分析用染色剂及其制备方法。该染色剂包括阳离子表面活性剂0.1~2.0g/L、非离子表面活性剂1.1~4.0 g/L、缓冲剂5‑30 g/L、电导率补充剂6.0~10.0g/L、助溶剂20‑50 g/L、染料0.010~0.050g/L。本发明的白细胞分析用染色剂，是适用于采用化学染色剂方法对白细胞进行五分类分析用的血液分析仪，该染色剂配方简单，测量准确，性能稳定，降低研发成本及各医疗机构的试剂使用成本，并解决了各级医疗机构对进口试剂的依赖性。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种白细胞分析用染色剂及其制备方法。
背景技术
由于临床的需要，五分类血液分析仪的需求越来越多。基于各厂家白细胞分类原理不同，所用的试剂也不一样。主流五分类血液分析仪白细胞分类原理主要包括高频电导激光散射联合检测法（即VCS技术）、光散射和细胞染色联合检测法、电阻抗和射频电导联合检测法、多角度激光偏振光散射检测法等，但其方法不外乎光学法加染色技术。所用试剂主要包括溶血素、染液。其中染色液主要用到核酸染色液及化学染色液。
本发明主要涉及化学染色技术。适用于化学染色剂原理的血液分析仪，例如法国ABX系列五分类血液分析仪。该技术原理是在仪器的LMNE 检测池中，全血样品与染色剂充分混匀，在35˚C 条件下进行孵育，此过程中染色剂中的溶血成分溶解红细胞，并固定白细胞的形态，使其保持自然的状态，后染液对单核细胞的初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色，同时对细胞的膜( 细胞膜、核膜、颗粒膜) 也进行不同程度的着色。由于淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞对染色剂的着色程度不同、每种细胞特定的细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，产生了特定的吸光率和散射光强度。因此在散点图中根据吸光度及散射光强度的不同可以检测出嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的结果。结合嗜碱溶血素检测出的嗜碱性粒细胞的结果即可完成对白细胞的五分类。
由于目前白细胞分类用染色剂存在的问题是试剂配方难度大，使用成本高、长期依赖进口，购买渠道繁琐等，无法及时满足医院的正常使用。因此开发一种配方简易，成本较低，能够代替原装试剂上机使用的白细胞分析用染色剂，降低对国外进口产品的依赖性，是十分必要的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种适用于五分类血液分析仪的白细胞分析用染色剂及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种白细胞分析用染色剂，该染色剂包括阳离子表面活性剂0.1~2.0g/L、非离子表面活性剂1.1~4.0 g/L、缓冲剂5-30 g/L、电导率补充剂6.0~10.0g/L、助溶剂20-50 g/L、染料0.010~0.050g/L。
进一步的，所述阳离子表面活性剂为季铵盐类；优选的为十二烷基三甲基氯化铵，浓度为0.2~1.0 g/L。
进一步的，所述非离子表面活性剂为聚山梨醇酯类和皂苷类；优选的为聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯 Tween 60和三萜皂苷；所述Tween 60浓度为1.0 ~3.0g/L ，优选的是1.2 ~2.0g/L；所述三萜皂苷浓度为0.1~1.0g/L，优选的是 0.2~0.5 g/L。
进一步的，所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂；优选的为磷酸二氢钾和十二水合磷酸氢二钠；所述磷酸二氢钾，浓度为5.0~10.0 g/L；所述十二水合磷酸氢二钠，浓度为0.2~0.5g/L。
进一步的，所述电导率补充剂为氯化钠、氯化钾、碳酸钠或硫酸钠；优选的为氯化钠。
进一步的，所述助溶剂为乙二醇、乙醇、1,2-丙二醇及异丙醇中的一种或几种；优选的为异丙醇和1,2-丙二醇；所述助溶剂为异丙醇时，浓度为30~50g/L；所述助溶剂为1,2-丙二醇时，浓度为20~40g/L。
进一步的，所述染料为苏丹黑B、偶氮黑E和活性黑KN-B中的一种或几种。
本发明所使用的染料，具体如下：
（1）苏丹黑B ，苏丹黑B又称2,3-二氢-2,2-二甲基-6-[[4-(苯基偶氮)-1-萘]偶氮]萘嵌间二氮杂苯，其分子式为C29H24N6，分子量为456.54。
其结构式如下：
（2）偶氮黑E，又称4-氨基-3 - [[4' - [（2,4-二氨基苯基）偶氮] [1,1'-联苯] -4-基]偶氮] -5-羟基-6-（苯偶氮）萘-2，7-二磺酸；分子式是C34H27N9O7S2，分子量为737.76。
其结构式如下：
（3）活性黑KN-B，又称2,7-萘二磺酸，4-氨基-5-羟基-3,6-双[[对- [（2-羟基乙基）磺酰基]苯基]偶氮]，3,6-双（硫酸氢盐）（酯） ，四钠盐；分子式: C26H21N5Na4O19S6；分子量: 991.82。
其结构式如下：
所述染料优选苏丹黑B ，浓度为0.010~0.050g/L。
本发明还提供了上述的白细胞分析用染色剂的制备方法，包括以下步骤： （1）取600ml水，依次加入阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、缓冲剂和电导率补充剂，并充分搅拌溶解；
（2）把染液用助染剂充分溶解后加入上述混合液中；
（3）用纯化水定容至1L，混匀后用0.2 μm微孔滤膜过滤，即得。
本发明提供的染色剂pH 为6.0 ~7.0。
本发明的有益效果是：本发明的白细胞分析用染色剂，是适用于采用化学染色剂方法对白细胞进行五分类分析用的血液分析仪，该染色剂配方简单，测量准确，性能稳定，降低研发成本及各医疗机构的试剂使用成本，并解决了各级医疗机构对进口试剂的依赖性。
附图说明
图1为本发明实施例1发明试剂在ABX Pentra 80血液分析仪上的白细胞散点图。
图2为本发明实施例2发明试剂在ABX Pentra 80血液分析仪上的白细胞散点图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中所用试剂纯度均为分析纯。
本发明白细胞分析用染色剂，其组成成分为：十二烷基三甲基氯化铵 0.2~1.0 g/L、Tween 60 1.2~2.0g/L、三萜皂苷0.2~0.5 g/L、 磷酸二氢钾 5.0~10.0 g/L、十二水合磷酸氢二钠 20.0~30.0 g/L、氯化钠 6.0~10.0g/L、异丙醇30~50g/L、1,2-丙二醇20~40g/L、染料苏丹黑B 0.010~0.050g/L。
按照下表配方准确称取各组分，按上述配置方法依次溶解后过滤，即得到本发明所述白细胞分析用染色剂。
实施例1
一种白细胞分析用染色剂，配方如表1。
表1
按上述表格配置基液，混溶后用纯化水定容至1L，用0.2 μm微孔滤膜过滤，即得到本发明所述白细胞分析用染色剂。取5例健康人新鲜血液，在ABX Pentra 80 血液分析仪上分别用原装进口试剂和发明试剂进行测试，对白细胞分类计数结果进行比较。散点图如图1所示。实验结果如表2所示。
表2
为了验证发明试剂配方的稳定性，同样取5例健康人新鲜血液，对放置3个月的发明试剂进行上机检测分析，发明试剂放置3个月后与原装进口试剂对照实验结果如表3所示。
表3
实施例2
一种白细胞分析用染色剂，配方如表4。
表4
按上述表格配置基液，混溶后用纯化水定容至1L，用0.2 μm微孔滤膜过滤，即得到本发明所述白细胞分析用染色剂。取5例健康人新鲜血液，在ABX Pentra 80 血液分析仪上分别用原装进口和发明试剂进行测试, 对白细胞分类计数结果进行比较。散点图如图2所示。实验结果如表5所示。
表5
为了验证发明试剂配方的稳定性，同样取5例健康人新鲜血液，对放置3个月的发明试剂进行上机检测分析，发明试剂放置3个月后与原装进口试剂对照实验结果如表6所示。
表6
对比例1
一种白细胞分析用染色剂，配方如下：
对比例2
一种白细胞分析用染色剂，配方如下：
将实施例1-2及对比例1-2制备的染色剂在ABX Pentra 80全自动五分类血液分析仪上进行白细胞分类计数，设置对照组，对照组使用的染色剂为原装配套染色剂，对白细胞分类计数效果进行比较。结果如表7所示。
表7
由散点图和分类结果对比可见，按照本发明所配制白细胞分析用染色剂，完全可以代替原装试剂在ABX Pentra 80全自动五分类血液分析仪上进行白细胞分类计数。同时由表7对比例可见，两种非离子表面活性剂复配比单一的效果更好。即本发明所述的一种白细胞分析用染色剂的效果更优。
Claims (8)
1.一种白细胞分析用染色剂，其特征在于，该染色剂包括阳离子表面活性剂0 .1~2.0g/L、非离子表面活性剂1 .1~4 .0 g/L、缓冲剂5-30 g/L、电导率补充剂6 .0~10 .0g/L、助溶剂20-50 g/L、染料0 .010~0 .050g/L；
所述阳离子表面活性剂为季铵盐类；
所述非离子表面活性剂为Tween 60和三萜皂苷；
所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂；
所述助溶剂为乙二醇、乙醇、1 ,2-丙二醇及异丙醇中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的白细胞分析用染色剂，其特征在于，所述季铵盐类为十二烷基三甲基氯化铵，浓度为0 .2~1 .0 g/L。
3.根据权利要求1所述的白细胞分析用染色剂，其特征在于，所述Tween 60浓度为1 .0~3 .0g/L；所述三萜皂苷浓度为0 .1~1 .0g/L。
4.根据权利要求1所述的白细胞分析用染色剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲剂为磷酸二氢钾和十二水合磷酸氢二钠；所述磷酸二氢钾，浓度为5 .0~10 .0 g/L；所述十二水合磷酸氢二钠，浓度为0 .2~0 .5 g/L。
5.根据权利要求1所述的白细胞分析用染色剂，其特征在于，所述电导率补充剂为氯化钠、氯化钾、碳酸钠或硫酸钠。
6.根据权利要求1所述的白细胞分析用染色剂，其特征在于，所述助溶剂为异丙醇或1,2-丙二醇；所述助溶剂为异丙醇时，浓度为30~50g/L；所述助溶剂为1,2-丙二醇时，浓度为20~40g/L。
7.根据权利要求1所述的白细胞分析用染色剂，其特征在于，所述染料为苏丹黑B、偶氮黑E和活性黑KN-B中的一种或几种。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的白细胞分析用染色剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取600ml水，依次加入阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、缓冲剂和电导率补充剂，并充分搅拌溶解；
（2）把染液用助染剂充分溶解后加入上述混合液中；
（3）用纯化水定容至1L，混匀后用0.2μm微孔滤膜过滤，即得。
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