CN108593393A - 精子活性氧染色试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种精子活性氧染色试剂盒及其使用方法；包括染液A和染液B；所述染液A为pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，染液B为DCFH‑DA荧光探针和pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液的混合液；本发明提供的染色试剂盒操作简单、特异性强、准确度高、能直观判读精子活性氧水平。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种精子活性氧染色试剂盒及其使用方法。
背景技术
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是指机体内或者自然环境中化学性质活泼、氧化能力很强的一类含氧物质。活性氧是氧的代谢产物，包括超氧阴离子、过氧化氢、氢氧基、过氧羟自由基、氧化亚氮等。过高浓度的活性氧可以诱导细胞的脂类、蛋白和DNA氧化损伤，从而启动病理变化。据世界卫生组织预测，在21世纪不孕症将成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的第三大疾病。由于男方原因造成女方不孕者，称为男性不育，约占整个不育因素的50％，其中在25％-40％的不育男性人群中发现有高水平的活性氧类物质。研究表明，生理水平的ROS是必需的，ROS在维持男性生殖生理功能如细胞信号转导、激素的产生、精子获能、顶体反应以及精子活力等方面发挥着重要作用。但当ROS含量过高超过机体抗氧化体系的还原能力时，会导致氧化应激，可引起精子膜脂质过氧化损伤、精子DNA损伤、精子线粒体损伤及细胞凋亡，从而破坏精子功能和存活，引起男性不孕不育，所以活性氧水平是判断男性精子质量的重要实验室指标。
目前临床上用来检测精子ROS水平的主要方法有采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric，TBA)比色法检测ROS攻击细胞膜产生的脂质过氧化产物之一丙二醛(malondial dehyde，MDA)。由于TBA对MDA反应并不具有专一性，此法缺乏特异性。临床上普遍采用的另一种方法是化学发光法，此法检测精子悬液的ROS水平，容易产生白细胞ROS干扰，并不能直观准确的反应精子的ROS水平。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种操作简单、特异性强、准确度高、能直观判读精子活性氧水平的染色试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种精子活性氧染色试剂盒，包括染液A和染液B；所述染液A为pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，染液B为DCFH-DA荧光探针和pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液的混合液。
上述技术方案产生的有益效果为：利用无荧光的DCFH可被活性氧氧化生成有荧光的DCF这一原理，使得细胞内活性氧水平能够通过荧光显微镜下的观察而被直接判读。本发明提供的试剂盒操作简单、特异性强、准确度高。
为保证有足够的荧光探针穿过精子细胞膜进入精子内部，所述染液B中DCFH-DA荧光探针的添加量为1g/1000ml。
本发明的另一个目的是提供一种如上所述的精子活性氧染色试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)染液A和纯化水按照1：19的体积比混匀，制成工作液A；染液B和纯化水按照1：10的体积比混匀，制成工作液B。
(2)用工作液A洗涤待检精液，制成精子浓度为5×106-10×106/ml的精子悬液；
(3)将精子悬液和工作液B混合，37℃孵育1-2小时；
(4)加入工作液A，洗涤、离心，弃去上清液，制成涂片；
(5)设定激发波长范围为420nm-485nm，使用荧光显微镜观察涂片，活性氧阳性精子数量大于20％为异常。
在上述技术方案中，工作液A的作用是洗去精液样本中影响染液结合的杂质，去除精液中的活性氧，降低活性氧背景水平。工作液B能溶解DCFH-DA至工作浓度。经使用后，DCFH-DA可以自由穿过精子细胞膜，再用工作液A进行洗涤，可进一步洗去未装载入精子内多余的DCFH-DA，以降低背景水平。DCFH-DA进入精子内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。之后细胞内的活性氧氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，由于DCFH不能通过细胞膜，因此可通过在荧光显微镜下观察DCF的荧光强度进而直观检测细胞内活性氧水平。
需要说明的是，为方便运输和保存，染液A和染液B先配成浓缩液，使用时再将浓缩液稀释成工作液。实际应用时，也可以按照预定浓度直接配制成工作液A和工作液B。事实上，由于DCFH-DA工作液保存时间短，因此实际使用时，也可先将DCFH-DA粉末置于-20℃下保存，使用时再将DCFH-DA荧光探针添加到pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液中制成工作液B，以提高检测灵敏性。
事实上，精子浓度过高会引起精子细胞间荧光互相增强的效应，使观察到的荧光强度高于实际荧光强度，为保证测试结果的准确性，所述步骤(2)中工作液A和待检精液的混合体积比设为1-5:25，如此可以调节至合适精子浓度。
为了使装载荧光探针的精子细胞与染液分离，去除未装载进细胞的探针，降低背景水平，所述步骤(2)和(4)在洗涤后还需对混合液进行离心处理，离心速度为1000-1500rpm，离心时间为10分钟。步骤(2)离心是为了是精子细胞和精浆分离，去除精浆中杂质。
为保证荧光探针能达到合适的工作浓度，以保证有足够的荧光探针穿过精子细胞膜进入精子内部，所述步骤(3)中精子悬液和工作液B的混合体积比为1-3:1。
所述步骤(5)中的涂片量为5ul/涂片，实际涂片时采用拉薄技术，即将精液滴在载玻片的一端，用第二张载玻片沿第一张载玻片的表面拖拉精液滴，制成涂片，涂片制好后自然干燥即可。
附图说明
图1是使用精子活性氧染色试剂盒后的染色效果图。
具体实施方式
以下结合实施例1-3对本发明作进一步公开。
实施例1：精子活性氧染色试剂盒
包括染液A：pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。
染液B：DCFH-DA荧光探针和pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液的混合液，混合液中DCFH-DA荧光探针的添加量为1g/1000ml。
上述染液A的制备方法如下：分别称取24.7g Na2HPO4，3.59g NaH2PO4，160.0gNaCl，置于1000ml容量瓶中，加入纯化水溶解定容至1000ml，得到pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。
染液B的制备方法如下：
(1)分别称取1.02gNa2HPO4，0.39g NaH2PO4，8.50g NaCl，置于1000ml容量瓶中，加入纯化水溶解定容至1000ml，得到pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液；
(2)称取DCFH-DA荧光探针粉末1.0g，置于1000ml容量瓶中，加入pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液充分溶解定容至1000毫升，置于棕色瓶中保存，之后分装0.2ml/瓶，冻干机冻干。
实施例2：精子活性氧染色试剂盒的使用
(1)使用实施例1中制备的染液A和染液B，10ml染液A和纯化水按照1：19的体积比混匀，制成200ml工作液A；染液B和2ml纯化水混匀，制成工作液B；
(2)取5ml工作液A洗涤400ul待检精液，1500rpm下离心10分钟，弃去上清液，制成精子浓度为5×106-10×106/ml的精子悬液；
(3)取200ul精子悬液和100ul工作液B混合，37℃孵育1.5小时；
(4)加入5ml工作液A，洗涤，1500rpm下离心10分钟，弃去上清液，混匀，制成2×106/ml精子悬液，取5ul制成涂片，自然干燥；
(5)设定激发波长范围为420nm-485nm，使用荧光显微镜观察涂片，观察200个精子，计数活性氧阳性精子数量，活性氧阳性精子数量大于20％为异常。
实验结果如附图1所示，箭头所示为活性氧染色阳性精子，整体着绿光。
实施例3：精子活性氧试剂盒临床实验报告
对500例临床样本检测精子活性氧水平：
精子活性氧染色法：
(1)取5ml工作液A洗涤400ul待检精液，1500rpm下离心10分钟，弃去上清液，制成精子浓度为5×106-10×106/ml的精子悬液；
(2)取200ul精子悬液和100ul工作液B混合，37℃孵育1.5小时；
(3)加入5ml工作液A，洗涤，1500rpm下离心10分钟，弃去上清液，混匀，制成2×106/ml精子悬液，取5ul制成涂片，自然干燥；
(4)设定激发波长范围为420nm-485nm，使用荧光显微镜观察涂片，观察200个精子，计数活性氧阳性精子数量，活性氧阳性精子数量大于20％为异常，判为阳性。
统计结果表明：500例样本中有52例样本显示精子活性氧水平为阳性，阳性率为10％，因此该方案具有临床意义。
实施例4：精子活性氧试剂盒稳定性检测
(1)将工作液A、工作液B和待检精液在37℃条件下放置2天；
(2)取10个活性氧阳性样本和10个阴性样本。取5ml工作液A洗涤400ul待检精液，1500rpm下离心10分钟，弃去上清液，制成精子浓度为5×106-10×106/ml的精子悬液；
(3)取200ul精子悬液和100ul工作液B混合，37℃孵育1-2小时；
(4)加入5ml工作液A，洗涤，1500rpm下离心10分钟，弃去上清液，混匀，制成2×106/ml精子悬液，取5ul制成涂片，自然干燥；
(5)设定激发波长范围为420nm-485nm，使用荧光显微镜观察涂片，观察200个精子，计数活性氧阳性精子数量。经检测，10个阳性样本活性氧以及10个阴性样本活性氧符合率均达100％，说明本发明的精子活性氧染色试剂盒具有高稳定性。
Claims (7)
1.一种精子活性氧染色试剂盒，其特征在于，包括染液A和染液B；所述染液A为pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，染液B为DCFH-DA荧光探针和pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液的混合液。
2.根据权利要求1所述的精子活性氧染色试剂盒，其特征在于，所述染液B中DCFH-DA荧光探针的添加量为1g/1000ml。
3.一种精子活性氧染色试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)染液A和纯化水按照1：19的体积比混匀，制成工作液A；染液B和纯化水按照1：10的体积比混匀，制成工作液B；
(2)用工作液A洗涤待检精液，制成精子浓度为5×106-10×106/ml的精子悬液；
(3)将精子悬液和工作液B混合，37℃孵育1-2小时；
(4)加入工作液A，洗涤、离心，弃去上清液，制成涂片；
(5)设定激发波长范围为420nm-485nm，使用荧光显微镜观察涂片，活性氧阳性精子数量大于20％为异常。
4.根据权利要求3所述的精子活性氧染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中工作液A和待检精液的混合体积比为1-5:25。
5.根据权利要求3所述的精子活性氧染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)和(4)在洗涤后还需对混合液进行离心处理，离心速度为1000-1500rpm，离心时间为10分钟。
6.根据权利要求3所述的精子活性氧染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)中精子悬液和工作液B的混合体积比为1-3:1。
7.根据权利要求3所述的精子活性氧染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(5)中的涂片量为5ul/涂片，涂好后自然干燥即可。
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