CN101482555A

CN101482555A - 体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法

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Publication number: CN101482555A
Application number: CNA2009101049989A
Authority: CN
Inventors: 刘瑜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-01-13
Filing date: 2009-01-13
Publication date: 2009-07-15

Abstract

一种体外检测精子－卵母细胞相互作用的方法，包括：a.上泳法或密度梯度法提取精子；b.在培养液中按一定比例混合经步骤a提取后的精子与卵母细胞，另设立卵母细胞空白对照，并均置于培养箱中反应；c.去除步骤b中未与卵母细胞表面结合的精子，倒置相差显微镜下检测与卵母细胞透明带结合的精子数量；d.使步骤c中与卵母细胞透明带结合的精子和卵母细胞分离，分别收集分离后的精子和卵母细胞；e.将卵母细胞空白对照精子、经步骤d分离后的精子涂于载玻片上，干燥，固定液固定，洗涤，加入荧光素－凝集素标记物，反应后再次洗涤，荧光显微镜下检测精子顶体反应率；f.倒置相差显微镜下检测经步骤d分离的卵母细胞胞内已穿透进入其中的精子数量。所述方法减少了标本资源的消耗，降低了检测成本和检测时间，提高了检测效率。

Description

体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法

技术领域

本发明涉及体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法，更具体地，涉及体外联合检测精子-卵母细胞相互作用的方法。

背景技术

哺乳动物的精子必须具备良好的生理功能才能完成受精过程。受精是一个复杂的过程，需要经历精子与卵细胞透明带结合、透明带诱发顶体反应和精子穿过透明带并与卵黄膜结合等过程才能完成，任何一个环节出现问题均可导致受精失败。可通过精子-卵母细胞相互作用试验对这些过程进行体外评估，从而寻找不孕不育的病因，并为辅助生殖助孕方式的选择提供直接的科学依据。

精子-卵母细胞相互作用试验包括精子-透明带结合试验、透明带诱发精子顶体反应试验和精子-透明带穿透试验，通常需要分成三个不同检测项目分别进行检测，需要消耗较多标本资源，检测成本高，检测时间长且检测效率低。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于减少标本资源的消耗，降低检测成本，降低检测时间并提高检测效率。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法，所述方法包括如下步骤：a.上泳法或密度梯度法提取精子；b.在培养液中按一定比例混合经步骤a提取后的精子与卵母细胞，另设立卵母细胞空白对照，并均置于培养箱中反应；c.去除步骤b中未与卵母细胞表面结合的精子，倒置相差显微镜下检测与卵母细胞透明带结合的精子数量；d.使步骤c中与卵母细胞透明带结合的精子和卵母细胞分离，分别收集分离后的精子和卵母细胞；e.将卵母细胞空白对照精子、经步骤d分离后的精子涂于载玻片上，干燥，固定液固定，洗涤，加入荧光素-凝集素标记物，反应后再次洗涤，荧光显微镜下检测精子顶体反应率；f.倒置相差显微镜下检测经步骤d分离的卵母细胞胞内已穿透进入其中的精子数量。

其中所述步骤c中通过以下方法去除步骤b中未与卵母细胞表面结合的精子：将反应后的卵母细胞转移至另一盛有培养液的细胞培养皿中，反复吹打卵母细胞，然后转移精子-卵母细胞结合物至另一盛有培养液的细胞培养皿中。

其中所述步骤d中通过以下方法使步骤c中与卵母细胞透明带结合的精子和卵母细胞分离：将精子-卵母细胞结合物移入微滴中，反复吹打卵母细胞，然后将卵母细胞转移至另一盛有培养液的细胞培养皿中。

其中所述培养液的NaCl重量含量为0.28-1.11％、KCl重量含量为0.02-0.07％、CaCl₂·2H₂O重量含量为0.01-0.05％、KH₂PO₄重量含量为0.01-0.03％、MgSO4·7H₂O重量含量为0.01-0.06％、酚红重量含量为0.0005-0.003‰、NaHCO₃重量含量为0.10-0.42％、葡萄糖重量含量为0.05-0.20％、焦丙酮酸钠重量含量为0.015-0.060‰、BSA重量含量为0.17-0.70％、青霉素的含量为10000-20000单位％、硫酸链霉素重量含量为0.05-0.50‰和乳酸钠糖浆(600g/L)体积含量为0.18-0.74％，余量为蒸馏水。

其中所述步骤b中的卵母细胞可以是新鲜卵母细胞或者是保存在卵细胞保存液中的卵母细胞，其中所述卵细胞保存液的(NH₄)₂SO₄重量含量为6.6-26.4％和Tris重量含量为0.12-0.48％，余量为蒸馏水，其pH值为7.0-7.8。

其中可在步骤e中荧光显微镜下计数精子顶体反应率之前加入荧光封固液，所述荧光封固液是含对苯二胺的磷酸盐缓冲液，其pH值为7.5-9.0。

其中所述步骤e中固定液是多聚甲醛、丙酮和甲醇的混合液。

其中所述步骤e中洗涤所使用的洗涤液是含Tween-20的磷酸盐缓冲液，其pH值为7.2-7.6。

其中所述步骤e中荧光素-凝集素标记物中的荧光素为异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基异硫氰酸若丹明(TRITC)，凝集素为刀豆蛋白A、豌豆凝集素或花生凝集素。

本发明的有益效果在于实现了精子-透明带结合试验、透明带诱发精子顶体反应和精子-透明带穿透试验三个项目的联合检测，并由此减少了精子标本的消耗，尤其是减少了来源困难的卵母细胞的消耗，较大程度地节约了标本资源；减少了操作环节，较大程度地降低了检测成本；减少了操作步骤，降低了操作时间，大大提高了检测效率；同时所述检测方法具有较高的准确性，有利于临床常规应用与推广。

具体实施方式

下文对本发明作进一步的详细描述。

一样本

精子来源于新鲜液化精液，也可采用液氮超低温保存的解冻精子。

卵母细胞为新鲜卵母细胞或以卵细胞保存液2-8℃贮存的卵母细胞。临用前用培养液洗涤以卵细胞保存液贮存的卵母细胞3次。

二试剂

1.培养液

培养液用于提取高活力精子，洗涤活体配子，并为精子和卵母细胞提供能量和适宜的反应条件。

本发明培养液的NaCl重量含量为0.28-1.11％、KCl重量含量为0.02-0.07％、CaCl₂·2H₂O重量含量为0.01-0.05％、KH₂PO₄重量含量为0.01-0.03％、MgSO4·7H₂O重量含量为0.01-0.06％、酚红重量含量为0.0005-0.003‰、NaHCO₃重量含量为0.10-0.42％、葡萄糖重量含量为0.05-0.20％、焦丙酮酸钠重量含量为0.015-0.060‰、BSA重量含量为0.17-0.70％、青霉素的含量为10000-20000单位％、硫酸链霉素重量含量为0.05-0.50‰和乳酸钠糖浆(600g/L)体积含量为0.18-0.74％，余量为蒸馏水。

如下配制本发明培养液：称取NaCl 2.77-11.08g、KCl 0.17-0.70g、CaCl₂·2H₂O 0.12-0.50g、KH₂PO₄ 0.08-0.32g、MgSO4·7H₂O 0.14-0.58g、酚红0.5-3mg置烧杯中，加蒸馏水至1000ml，搅拌溶解备用；称取NaHCO₃ 0.10-0.42g、葡萄糖0.05-0.20g、焦丙酮酸钠1.5-6.0mg、BSA 0.17-0.70g、青霉素10000-20000单位和硫酸链霉素5-50mg，向其加入乳酸钠糖浆(600g/L)0.18-0.74ml和上述步骤配制好的溶液100ml，搅拌溶解即可。

优选每1000ml本发明培养液包含NaCl 5.54g、KCl 0.35g、CaCl₂·2H₂O 0.25g、KH₂PO₄ 0.16g、MgSO4·7H₂O 0.29g、酚红1mg、NaHCO₃ 2.1g、葡萄糖1.0g、焦丙酮酸钠30mg、BSA 3.5g、青霉素100000单位、硫酸链霉素100mg和乳酸钠糖浆(600g/L)3.7mL。

所述培养液还可用其他培养液代替，例如HTF、F10和Earle培养液等。

2.卵细胞保存液

卵细胞保存液用于在2-8℃条件下保持卵母细胞的功能稳定性。

本发明卵细胞保存液为pH 7.4的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。所述卵细胞保存液的(NH₄)₂SO₄重量含量为6.6-26.4％和Tris重量含量为0.12-0.48％，余量为蒸馏水。

如下配制本发明卵细胞保存液：称取(NH₄)₂SO₄ 66.0-264.2g和Tris 1.2-4.8g置烧杯中，加蒸馏水至900ml，搅拌溶解；调pH调至7.0-7.8，加蒸馏水至1000ml，4℃保存。

优选1000ml本发明卵细胞保存液包含(NH₄)₂SO₄ 132.1g和Tris2.4g，pH为7.4。

所述Tris还可用其他缓冲物质代替，而且Tris的含量也可为其他值，只要能够确保卵细胞保存液的pH值为7.0-7.8且不影响卵细胞保存液稳定卵细胞功能的作用即可。

3.荧光封固液

荧光封固液用于延长荧光标记物在荧光照射下的淬灭时间。

本发明荧光封固液为含对苯二胺和甘油的磷酸盐缓冲液(PBS)。所述荧光封固液的Na₂HPO₄·12H₂O重量含量为0.4-0.8％、KH₂PO₄重量含量为0.02-0.10％、NaN₃重量含量为0.01-0.5％、对苯二胺重量含量为0.05-0.5％和甘油体积含量为5-50％，余量为蒸馏水。

如下配制本发明荧光封固液：称取Na₂HPO₄·12H₂O 0.4-0.8g、KH₂PO₄ 0.02-0.10g、NaN₃ 0.01-0.5g、对苯二胺0.05-0.5g置烧杯中，加蒸馏水至45ml，搅拌溶解；加入甘油5-50ml；调pH至7.5-9.0，加蒸馏水至100ml，4℃保存。

优选每100ml本发明荧光封固液包含Na₂HPO₄·12H₂O 0.6g、KH₂PO₄ 0.05g、NaN₃ 0.02g、对苯二胺0.25g和甘油25ml，pH为8.0。

所述NaN₃还可用其他防腐剂代替，而且防腐剂的含量也可为其他值，只要能抑制细胞生长且对检测无影响即可；所述PBS还可用其他缓冲物质代替，而且PBS的含量也可为其他值，只要能够确保荧光封固液的pH值为7.5-9.0即可，含量的多少基本不会加速荧光素在荧光照射下的淬灭时间。

4.固定液

固定液可终止反应，使精子的蛋白质分子形成交联键沉淀，从而达到稳定精子结构和增加精子在载玻片上的粘合力的效果。

本发明固定液是多聚甲醛、丙酮和甲醇的混合液。所述固定液的多聚甲醛重量含量为1％-3％、丙酮体积含量为40％-50％和甲醇体积含量为30％-45％，余量为蒸馏水。

如下配制本发明固定液：称取多聚甲醛1-3g置烧杯中，加蒸馏水20ml，搅拌溶解；加入丙酮40-50ml和甲醇30-45ml，混匀后室温保存。

优选本发明固定液的多聚甲醛重量含量为2％、丙酮体积含量为45％和甲醇体积含量为40％。

本发明固定液也可用其他能够使精子蛋白质变性并保持精子形态结构不变的物质代替。

5.洗涤液

洗涤液用于在检测透明带诱发精子顶体反应时洗涤载玻片，以去除固定液和未结合的荧光素-凝集素标记物，减少非特异性荧光。

本发明浓缩洗涤液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)。所述浓缩洗涤液的NaCl重量含量为0.5-1.5％、KH₂PO₄重量含量为0.21-0.82％、Na₂HPO₄·12H₂O重量含量为1.63-6.52％、NaN₃重量含量为0.05-0.20％和Tween-20体积含量为0.5-2.0％，余量为蒸馏水。

如下配制本发明浓缩洗涤液：称取NaCl 5.0-15.0g、KH₂PO₄2.1-8.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 16.3-65.2g和NaN₃ 0.5-2.0g置烧杯中，加蒸馏水900ml，搅拌溶解；加入Tween-205-20ml，混匀；调pH至7.2-7.6，加蒸馏水至1000ml，4℃保存。

优选每1000ml本发明浓缩洗涤液包含NaCl 10.0g、KH₂PO₄ 4.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 32.6g、NaN₃ 1.0g和Tween-20 10ml，pH为7.4。

临用前，以蒸馏水稀释上述浓缩洗涤液20倍，4℃贮存备用。

所述NaN₃还可用其他防腐剂代替，而且防腐剂的含量也可为其他值，只要能抑制细胞生长且对反应无影响即可；所述Tween-20还可用其他表面活性剂代替，只要能去除非特异性反应物且对检测结果无影响即可；所述PBS还可用其他缓冲物质代替，而且PBS的含量也可为其他值，只要能够确保洗涤液的pH值为7.2-7.6即可，含量的多少基本不会影响透明带诱发精子顶体反应的检测结果。

6.荧光素-凝集素标记物

荧光素-凝集素标记物用于与精子顶体区发生结合反应从而指示是否发生了顶体反应。

本发明荧光素-凝集素标记物中的荧光素为异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸若丹明或这两种荧光染料的代用品，凝集素为刀豆蛋白A、豌豆凝集素或花生凝集素。临用前将所述荧光素-凝集素标记物加入到Tris-HCl缓冲液中，标记物的加入量视不同标记物的不同活性而有所变化。

Tris-HCl缓冲液的Tris重量含量为1.2-4.8％、NaCl重量含量为0.4-1.6％、BSA重量含量为0.1-0.5％和NaN₃重量含量为0.01-0.05％，余量为蒸馏水。

如下配制本发明荧光素-凝集素标记物：称取Tris 1.2-4.8g、NaCl0.4-1.6g、BSA 0.1-0.5g、NaN₃ 0.01-0.05g，溶于80毫升蒸馏水中，搅拌溶解；用1mol/L HCl调pH至7.0-7.8，用蒸馏水定容至100毫升，置4℃保存；在上述溶液中加入荧光素-凝集素标记物。

优选每100ml所述Tris-HCl缓冲液包含Tris 2.4g、NaCl 0.8g、BSA 0.2g和NaN₃ 0.02g，pH为7.5。

所述NaN₃还可用其他防腐剂代替，而且防腐剂的含量也可为其他值，只要能抑制细胞生长且对反应无影响即可；所述Tris还可用其他缓冲物质代替，而且Tris的含量也可为其他值，只要能够确保Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0-7.8即可，含量的多少基本不会影响荧光素-凝集素标记物与精子顶体区发生结合反应。

三体外检测精子-卵母细胞相互作用

1、上泳法收集高活力精子，提取方法如下：

(1)于试管底部加入精液1ml，轻轻在试管精液上层加入1.5ml培养液(培养液:精液＝1.5:1(体积))。

(2)轻轻地将试管置于倾斜45度角的试管架上，置37℃、5％ CO₂培养箱中孵育1小时。

(3)小心吸取最上层1ml培养液。

(4)500g离心5分钟。

(5)吸走精子沉淀团上方的培养液。

(6)加入0.2ml培养液。

2.在细胞培养皿中加入1ml培养液、3-6个卵母细胞和约2×10⁶个提取后的高活力精子。在另一细胞培养皿中加入1ml培养液和约2×10⁶个提取后的高活力精子作为“透明带诱发精子顶体反应”空白对照。

3.置于CO₂培养箱(37℃、5％ CO₂)中孵育2小时。

4.在倒置相差显微镜下以200-400μm内径吸管将反应后的卵母细胞转移至另一盛有培养液的细胞培养皿中，反复吹打卵母细胞以去除未与卵母细胞结合的精子，然后转移精子-卵母细胞结合物至另一盛有培养液的细胞培养皿中。

5.将洗涤后的卵母细胞置于倒置相差显微镜下，计数与透明带结合的精子数量，并依据下式计算每个卵母细胞透明带结合的精子的平均数：

每个卵母细胞透明带结合的精子的平均数＝与卵母细胞结合的精子总数÷卵母细胞个数

此即“精子-透明带结合试验”结果。

观察到4个卵母细胞透明带共结合精子160个，则每个卵母细胞透明带结合的精子的平均数＝160÷4＝40个/透明带。

6.将所有精子-卵母细胞结合物移入约10μl的微滴内，在倒置相差显微镜下以100-200μm内径吸管反复吹打以去除与卵母细胞透明带表面结合的精子，然后将卵母细胞转移至另一盛有培养液的细胞培养皿中。

7.将步骤6处理过的精子悬液和空白对照精子加到载玻片上，在一定范围内(12-40mm²)均匀涂片。

8.载玻片自然干燥后加入固定液室温覆盖30分钟，用洗涤液洗涤载玻片3次，每次2分钟。

9.在载玻片上覆盖荧光素-凝集素标记物，温室反应1-2小时；用洗涤液洗涤载玻片3次，每次2分钟；然后吹干或自然干燥。

10.盖上盖玻片，置于荧光显微镜下至少计数200个精子观察精子顶体反应率

精子顶体反应率(％)＝(发生顶体反应的精子总数÷被观察精子总数)×100％-空白对照精子反应率(％)

此即“透明带诱发精子顶体反应试验”结果。

计数透明带诱发精子300个，其中已发生顶体反应的精子数72个；计数空白对照精子300个，其中已自动发生顶体反应的精子数18个；则精子顶体反应率(％)＝(72÷300)×100％-(18÷300)×100％＝18％。

11.将步骤6处理过的卵母细胞置于倒置相差显微镜下，计数头部已穿透进入卵母细胞的精子数量，并依据下式计算每个卵母细胞中穿透精子的平均数：

每个卵母细胞中穿透精子的平均数＝穿入卵母细胞的精子个数÷卵母细胞个数

此即“精子-透明带穿透试验”结果。

观察到共计20个精子头部穿透进入4个卵母细胞，则每个卵母细胞中穿透精子的平均数＝20÷4＝5个。

其中可任选在上述方法步骤9之后载玻片临用前，在载玻片上滴加1滴荧光封固液，然后盖上盖玻片，并置于荧光显微镜下至少计数200个精子观察精子顶体反生率。

目前认为每个卵母细胞透明带结合的精子的平均数≤40个/透明带，透明带诱发精子顶体反应率≤16％，将严重影响精子与卵母细胞自然受精，从而导致不育，是采取经胞浆内精子注射(ICSI)辅助生殖的适应症指标。精子-透明带穿透试验结果与透明带诱发精子顶体反应率具有良好的相关性，当透明带诱发精子顶体反应率<10％时，几乎没有精子可以穿透透明带；当透明带诱发精子顶体反应率<16％时，精子穿透透明带的机率<20％。

Claims

1.一种体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a.上泳法或密度梯度法提取精子；

b.在培养液中按一定比例混合经步骤a提取后的精子与卵母细胞，另设立卵母细胞空白对照，并均置于培养箱中反应；

c.去除步骤b中未与卵母细胞表面结合的精子，倒置相差显微镜下检测与卵母细胞透明带结合的精子数量；

d.使步骤c中与卵母细胞透明带结合的精子和卵母细胞分离，分别收集分离后的精子和卵母细胞；

e.将卵母细胞空白对照精子、经步骤d分离后的精子涂于载玻片上，干燥，固定液固定，洗涤，加入荧光素-凝集素标记物，反应后再次洗涤，荧光显微镜下检测精子顶体反应率；

f.倒置相差显微镜下检测经步骤d分离的卵母细胞胞内已穿透进入其中的精子数量。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤c中通过以下方法去除步骤b中未与卵母细胞表面结合的精子：将反应后的卵母细胞转移至另一盛有培养液的细胞培养皿中，反复吹打卵母细胞，然后转移精子-卵母细胞结合物至另一盛有培养液的细胞培养皿中。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤d中通过以下方法使步骤c中与卵母细胞透明带结合的精子和卵母细胞分离：将精子-卵母细胞结合物移入微滴中，反复吹打卵母细胞，然后将卵母细胞转移至另一盛有培养液的细胞培养皿中。

4.权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，其中所述培养液的NaCl重量含量为0.28-1.11％、KCl重量含量为0.02-0.07％、CaCl₂·2H₂O重量含量为0.01-0.05％、KH₂PO₄重量含量为0.01-0.03％、MgSO4·7H₂O重量含量为0.01-0.06％、酚红重量含量为0.0005-0.003‰、NaHCO₃重量含量为0.10-0.42％、葡萄糖重量含量为0.05-0.20％、焦丙酮酸钠重量含量为0.015-0.060‰、BSA重量含量为0.17-0.70％、青霉素的含量为10000-20000单位％、硫酸链霉素重量含量为0.05-0.50‰和乳酸钠糖浆(600g/L)体积含量为0.18-0.74％，余量为蒸馏水。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤b中的卵母细胞可以是新鲜卵母细胞或者是保存在卵细胞保存液中的卵母细胞，其中所述卵细胞保存液的(NH₄)₂SO₄重量含量为6.6-26.4％和Tris重量含量为0.12-0.48％，余量为蒸馏水，其pH值为7.0-7.8。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中可在步骤e中荧光显微镜下计数精子顶体反应率之前加入荧光封固液。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述荧光封固液是含对苯二胺的磷酸盐缓冲液，其pH值为7.5-9.0。

8.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤e中固定液是多聚甲醛、丙酮和甲醇的混合液。

9.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤e中洗涤所使用的洗涤液是含Tween-20的磷酸盐缓冲液，其pH值为7.2-7.6。

10.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤e中荧光素-凝集素标记物中的荧光素为异硫氰酸荧光素FITC或四甲基异硫氰酸若丹明TRITC，凝集素为刀豆蛋白A、豌豆凝集素或花生凝集素。