CN113106141A - 一种卵透明带结合试验中的精子计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种优化的在卵透明带结合试验中对精子的计数方法。所述方法操作简便，所用试剂易获取，可显著降低试验成本，并解决其因操作复杂，对检测人员要求过高，使其在临床中推广受限的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种优化的透明带结合实验方法，更为具体的，本发明涉及一种卵透明带结合试验中的精子计数方法。
背景技术
不孕症是指夫妻双方在12个月或更长时间内频率正常的无保护性交后未能达到临床妊娠。在发达国家,不育症发生率为5.0-8.0%,而在发展中国家则高达5.8-44.2%，其中由于男性因素导致的不孕占40-50%，约有2%的孕男性精液参数未达到标准。目前临床上对于男性不孕的实验室诊断主要根据《WHO人类精液检查与处理实验室手册（第5版）》，使用计算机辅助精子分析（Computer-aided sperm analysis, CASA）进行精液常规分析，将计算机处理技术和的图像处理技术结合在一起，通过对图像中的精子进行全面分析，可检测精液中精子的密度、活率、活力和精子运动特征等各项量化的指标，从而分析精子的一般状态及运动特征，并将其作为评价男性生育力的重要依据。但是精子从发生到最终形成受精卵需要经过精子获能、顶体反应、结合并穿过透明带、精卵结合等一系列复杂的过程，仅凭对精子形态学指标进行分析，并不能准确反应精子受精能力。因此，临床上需要对精子功能进行检测以充分评估男性生育力。随着辅助生殖技术的发展，特别是卵母细胞胞质内单精子注射技术（Intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的出现和推广，使得精子功能缺陷的不孕男性生育率提高。但是该技术为侵入性操作，且花费较高，因此充分评估精子功能，把握新技术的应用指征，对不孕男性患者有重大意义。人卵透明带试验旨在检测精子与透明带结合的能力，作为检测精子功能的方法之一，为临床全面评估男性生育能力及制定下一步治疗方案提供参考。
人卵透明带试验目前主要有两种方法,一种是半卵透明带检测试验,另一种是精子-透明带结合试验。半卵透明带检测试验是将透明带显微切割成相等的两部分,分别与相同密度的待检测精子和对照精子进行试验，计数每部分卵子分别结合的卵子，评价待检精子与卵子透明带结合的能力。半透明带结合试验经显微切割后，呈现为两个大小均等的半圆形。将等密度处理好的精液加入后，可能会同时与半透明带的内外面相结合，因此在进行精子计数时，应按照一个方向逐步对焦，由内而外或由外而内计数，避免重复。由于两半透明带来自同一个卵，理论上与精子的结合能力应该一致，一半作为实验组一半作为对照组，起到了控制变量的作用。精子-透明带结合试验是用不同的荧光染料分别标记待检测精子和对照精子，即待检测精子用一种荧光染料染色，而对照精子用另一种荧光染料染色，计算结合在同一个卵透明带上的待检测精子和对照精子的数量和比值。
然而，利用这两种方法对精子进行计数时均存在较为明显的缺点：半卵透明带检测试验是将透明带显微切割成相等的两部分进行对照试验，其中切割卵子且保持两部分相等对试验人员的技术要求过高，而精子-透明带结合试验是用不同的荧光染料分别标记精子，计算卵子上结合的待测精子与对照精子的比例进而评判待测精子的结合能力，但是该方法荧光染色剂较昂贵，且操作繁琐，需要在荧光显微镜下观察计数。因此亟需对现有技术进行改进，使精子的计数更为简单高效。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种优化的在卵透明带结合试验中对精子的计数方法。所述方法操作简便，所用试剂易获取，可显著降低试验成本，并解决其因操作复杂，对检测人员要求过高，使其在临床中推广受限的技术问题。
具体的，本发明提供的卵透明带结合试验中的精子计数方法包括如下步骤：
(1) 精子准备；
(2) 卵子准备；
(3) 配子共培养：
a. 用胚胎转移管（商品化或用巴斯德吸管拉制）吸取所需数量的卵母细胞，将其转移至已调好精子受精密度的受精培养液中；
b.在CO2培养箱内孵育3小时；
c.从受精培养液中回收卵母细胞；
d.用胚胎转移管在G-MOPS PLUS培养液中冲洗掉疏松附着在卵母细胞上的精子；
(4) 卵母细胞的分析
a.准备载玻片，将3-5μL伊红染料滴于载玻片上，制备伊红染料微滴；
b.将卵母细胞放入伊红染料微滴；
c.覆盖盖玻片；
d.在放大倍数为×10-80的体视显微镜下观察伊红染料盖片，找到压扁的卵母细胞，在载玻片底面划“圈”，圈出卵的大概位置；
e.在放大倍数为×40的倒置显微镜下观察压片，寻找标记的圆圈并找到卵母细胞，移动载物台，将卵母细胞移至视野中央，转换至放大倍数为×200的高倍镜下观察；
f.计数透明带上的精子。
在一种具体的实施方案中，所述步骤（1）包括：a.充分混匀精液标本；b.用密度梯度离心法或上游法分离精子；c.用巴斯德吸管轻柔地吹吸精子并混匀，测定精子的密度、活力；d.用受精培养液稀释精子至受精密度。更为优选的，所述的受精培养液为G-IVF PLUS（Vitrolife，瑞典），所述受精密度为约0.2×106个精子/ml。
在一种具体的实施方案中，所述步骤（2）中的卵母细胞在使用前储存在37℃，6%CO2培养箱中备用。
在一种具体的实施方案中，所述步骤（3）中配子在37℃、含6%（v/v）CO2的环境中孵育。
在一种具体的实施方案中，所述步骤（3）中所述胚胎转移管直径≥200μm。
本发明提供的方法具有如下优点：
（1）与传统的半卵透明带检测试验相比，将结合了精子的卵子制备成压片，使得卵子上结合的精子由在球体分布转化为在平面分布，便于计数，不易遗漏；减少计数所带来的的实验误差；
（2）与传统的精子-透明带结合试验相比，本发明所述方法利用伊红染料染色精子，以便在光镜下计数；
（3）本发明所述方法操作简便，无需价格高昂的设备、试剂及高超的操作技术门槛，易于实施和推广。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例中的压片图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 人卵透明带结合试验
1.试剂及设备:
（1）受精培养液：G-IVF PLUS培养液，Vitrolife，瑞典
（2）伊红Y，0.5(w/v): 将0.5g伊红Y溶于100ml 0.9%NaCl中；
（3）精子和卵母细胞
收集北京大学第三医院生殖中心进行体外受精治疗患者常规IVF周期受精后废弃的精子。收集本生殖中心ICSI治疗周期，受精后第三天受精失败废弃的卵子，排除未成熟、退化的卵子。研究方案已获得本院生殖医学伦理委员会批准。
（4） G-MOPS PLUS培养液（Vitrolife，瑞典）
（5）CO2培养箱（Thermo，3131，美国）
（6）体视显微镜（NIKON，SMZ1000，日本）
（7）倒置显微镜（NIKON,Ti-U，日本）
2.试验步骤:
（1）精液准备：
a.充分混匀精液标本
b.用密度梯度离心法或上游法分离精子
c.用巴斯德吸管轻柔地吹吸分离的精子并混匀，测定精子密度、活力
d将精子稀释至受精密度：0.2×106个精子/ml
(2) 卵子准备
将卵母细胞在使用前储存在37℃，6% CO2的培养箱中备用。
(3) 配子共培养
a.用胚胎转移管吸取所需数量的卵母细胞，将其转移至已调配好精子密度的受精培养液内；
b.在37℃、含6%（v/v）CO2的培养箱内孵育3小时；
c.从受精培养液中回收卵母细胞；
d.用巴斯德吸管，在酒精灯火焰上将其烧软后牵拉制备成直径≥200μm的胚胎转移管，在G-MOPS PLUS 培养液中冲洗掉疏松附着在卵母细胞上的精子。
(4) 卵母细胞的分析
a.准备载玻片，将3-5μL伊红染料置于载玻片上，制备伊红染料微滴。
b.将卵母细胞放入伊红染料微滴。
c.覆盖盖玻片。
d.在体视显微镜（×10-80）下观察伊红染料盖片，找到压扁的卵母细胞，在载玻片底面划“圈”，圈出卵的大概位置。
e.在倒置显微镜（×40）下观察压片，根据标记好的圆圈找到卵，移动载物台，将卵移至视野中央。转换至高倍镜（×200）下观察（图1）。
f.借助实验室计数器，计数透明带上的精子。
由图1可见，卵子通过压片由球体转为平面，伊红染色后精子清晰可见，仅利用简单的计数器即可准确计算透明带上的精子数量。该方法显著降低了对试验人员的技术要求以及实验成本，便于在临床上广泛推广应用。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种卵透明带结合试验中的精子计数方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)精子准备；
(2) 卵子准备；
(3) 配子共培养：
a.用胚胎转移管吸取所需数量的卵母细胞，将其转移至已调好精子受精密度的受精培养液中；
b.在CO2培养箱内孵育3小时；
c.从受精培养液中回收卵母细胞；
d.用胚胎转移管在G-MOPS PLUS培养液中冲洗掉疏松附着在卵母细胞上的精子；
(4) 卵母细胞的分析
a.准备载玻片，将3-5μL伊红染料滴于载玻片上，制备伊红染料微滴；
b.将卵母细胞放入伊红染料微滴；
c.覆盖盖玻片；
d.在放大倍数为×10-80的体视显微镜下观察伊红染料盖片，找到压扁的卵母细胞，在载玻片底面划“圈”，圈出卵的大概位置；
e.在放大倍数为×40的倒置显微镜下观察压片，寻找标记的圆圈并找到卵母细胞，移动载物台，将卵母细胞移至视野中央，转换至放大倍数为×200的高倍镜下观察；
f.计数透明带上的精子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）包括：a.充分混匀精液标本；b.用密度梯度离心法或上游法分离精子；c.用巴斯德吸管轻柔地吹吸并混匀精子，测定精子的密度、活力；d.用受精培养液稀释精子至受精密度。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述受精培养液为vitrolife的洗精受精液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述受精密度为约0.2×106个精子/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的卵母细胞在使用前储存在37℃，6% CO2培养箱中备用。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中配子在37℃、含6v/v% CO2的环境中孵育。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述胚胎转移管直径≥200μm。
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| CN101482555A (zh) * | 2009-01-13 | 2009-07-15 | 刘瑜 | 体外检测精子-卵母细胞相互作用的方法 |
| CN103278649A (zh) * | 2013-05-28 | 2013-09-04 | 深圳市博锐德生物科技有限公司 | 精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒及其检测方法 |
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