CN219652972U - 一种用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片和装置 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片和装置。本申请用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片包括微流道膜，微流道膜上设有第一加样孔、第二加样孔和收集孔；第一加样孔和第二加样孔间通过微流道连通，第二加样孔和收集孔间通过微流道连通；第一加样孔和第二加样孔间设有挡板；第一加样孔和挡板间的区域为第一包被区，挡板和收集孔间的区域为第二包被区；挡板将第一包被区和第二包被区隔开；第一包被区和第二包被区分别用于包被循环AsAb和局部AsAb。本申请的芯片能简单、快速、无损伤或低损伤的筛选无抗精子抗体的精子，这对免疫性不育来源的优质精子筛选具有重要意义，提高了体外精子筛选质量，提高了临床辅助生殖质量和效率。
Description
技术领域
本申请涉及精子体外筛选技术领域，具体涉及一种用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片和装置。
背景技术
全球育龄夫妇中约有15％存在不孕不育问题，其中约有一半原因是由男性因素引起。约有5％～15％的男性不育是由免疫因素引起，且男性不育患者中约10％在体内存在抗精子抗体(anti-sperm antibody，AsAb)。AsAb是可与精子表面抗原特异性结合的抗体，分为循环AsAb(血清)和局部AsAb(生殖道)两种。血清AsAb主要是IgG和IgM，生殖道ASA则主要是IgG和IgA。AsAb可直接作用于精子或通过改变局部微环境而间接影响精子功能，包括引起精子凝集、补体依赖性精子制动、抑制顶体活性或抑制受精卵发育等，导致不孕不育的发生。
精子及其细胞膜属特异性抗原，具有自身和异体抗原性，两性均可通过免疫应答产生多克隆抗精子抗体，进而导致免疫性不孕不育发生。AsAb产生的原因目前认为与下列因素有关：1)生理屏障的破坏；2)生殖道炎症；3)精浆免疫抑制物缺乏；4)其他原因，例如生殖道局部免疫功能异常。抗精子抗体的存在，对精子的影响包括：1)凝集和/或制动作用，干扰精子运动和穿透宫颈粘液能力；2)直接或间接杀伤精子；3)阻碍精卵融合和植入，结合与精子头部的AsAb可通过干扰顶体反应而阻碍精子获能影响精卵结合和胚胎发育。因此，抗精子抗体对精子获能、顶体反应和精卵融合都有影响。
女性生殖道并不是免疫豁免的地方，而是免疫系统在局部起保护作用对抗感染原、建立和维持妊娠的地方；其中，产生AsAb时则对生育起反作用。AsAb可能影响体外受精(IVF)的部位包括精子结合透明带，精子穿入透明带，透明带反应，配子融合、分裂和胚胎发育。AsAb还可能引起不育，因为精子被抗精子抗体包裹，不能正常通过宫颈粘液而进入宫内。
当前，伴随临床辅助生殖技术如人工授精(IUI)、体外受精和卵子胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)等的发展，都对体外精子优选，特别是筛选活力好、存活率高的精子提出了更高的体外筛选需求。传统的精子分离技术包括上游法、密度梯度离心法等。这些方法均需要体外离心处理，可能会造成精子的机械性损伤和氧化损伤，进而影响精子质量和精卵受精。
发明内容
本申请的目的提供一种改进的用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片和装置。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片，其包括微流道膜，微流道膜上开设有第一加样孔、第二加样孔和收集孔；第一加样孔和第二加样孔之间通过微流道连通，第二加样孔和收集孔之间通过微流道连通；第一加样孔和第二加样孔之间设计有挡板，第一加样孔和挡板之间的区域为第一包被区，挡板和收集孔之间的区域为第二包被区，挡板将第一包被区和第二包被区隔开；第一包被区和第二包被区分别用于包被循环AsAb和局部AsAb。
需要说明的是，本申请以微流控芯片为基础，在微流控芯片上分别设计包被循环AsAb和宫腔局部AsAb的第一包被区和第二包被区，能够有效的筛选获得无抗精子抗体的精子，避免了由于抗精子抗体导致的精子质量问题，提高了体外精子筛选的质量，进而提高了临床辅助生殖的质量和效率。此外，本申请的芯片，还能够实现个体精准化筛选。
还需要说明的是，本申请用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片，使用时，先将循环AsAb和宫腔局部AsAb分别包被到第一包被区和第二包被区，例如，将获取自血清的循环AsAb加入第一加样孔中，将获取自宫腔冲洗液的局部AsAb加入第二加样孔中，进行第一包被区和第二包被区的包被，包被完成后，使用时，拔出挡板，直接将待处理精液加入第一加样孔中，精子依序经过第一包被区和第二包被区进行循环AsAb和局部AsAb筛选后，即可在收集孔中获得无抗精子抗体的精子。
本申请的一种实现方式中，微流道膜呈长条状。
本申请的一种实现方式中，微流道膜的长为60-80mm，宽25-35mm，厚度为2-5mm。
本申请的一种实现方式中，微流道的宽为100-140微米，深为30-70微米。
本申请的一种实现方式中，第一加样孔、第二加样孔和收集孔为直径4-8mm的圆柱孔。
本申请的一种实现方式中，挡板设置于微流道膜的中间位置，将第一包被区和第二包被区分割成大小相当的两部分。
本申请的一种实现方式中，微流道膜由聚二甲基硅氧烷制成。
可以理解，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)只是本申请的一种实现方式中经过证实能够用于本申请的无抗精子抗体精子筛选的微流控芯片材料，不排除还可以采用其他的微流控芯片材料，只要材料本身对精子无毒性即可。
本申请的一种实现方式中，本申请的芯片还包括载玻片，载玻片用于支撑微流道膜。
可以理解，本申请中，载玻片的作用主要支撑微流道膜，不排除还可以采用其他类似的具有支撑作用的材料，在此不作具体限定。
本申请的另一面公开了一种采用本申请的芯片的精子筛选装置。
需要说明的是，本申请用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片，为了使用方便，可以将其固定或安装在某些装置中，例如按照芯片的大小设计一个壳体，并在第一加样孔、第二加样孔和收集孔的位置预留孔洞，在挡板位置预留缝隙，形成一个更方便运输、存放的精子筛选装置；又或者，与其他自动加样、取样的装置组合形成自动化的精子筛选装置。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片，能够简单、快速、无损伤或低损伤的筛选无抗精子抗体的精子，这对免疫性不育来源的优质精子筛选具有重要意义，提高了体外精子筛选的质量，提高了临床辅助生殖的质量和效率。
附图说明
图1为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片的结构示意图；
图2为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片显微镜观察结果图；
图3为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片处理前后的精子存活率的统计结果；
图4为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片处理前后精子含有抗精子抗体计数变化(MAR)的检测结果；
图5为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片处理前后精子前向运动能力的检测结果；
图6为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片处理前后精子获能情况的检测结果；
图7为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片处理前后精子与透明质酸酶结合的实验结果；
图8为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片处理前后精子顶体反应(PSA-FITC)检测的显微镜观察结果；
图9为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片处理前后精子顶体反应的统计结果；
图10为本申请实施例中用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片处理前后精子穿去透明带小鼠卵母细胞的实验结果。
具体实施方式
微流控芯片具有与体内微血管直径接近的微通道，且采用流体灌流方式，使精子自动通过微通道实现精子筛选。微流控芯片采用对精子无毒性的材料，本申请研究显示，在微流控芯片中提前包被筛选媒介，即可实现个体化精准筛选无AsAb抗体的优质精子，进而改善免疫不孕不育患者的生殖需求和结局。
基于以上研究和认识，本申请研发了一种用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片，如图1所示，其包括微流道膜1，微流道膜上开设有第一加样孔11、第二加样孔12和收集孔13；第一加样孔11和第二加样孔12之间通过微流道连通，第二加样孔12和收集孔13之间通过微流道连通；第一加样孔11和第二加样孔12之间设计有挡板2，将两者连通的微流道阻断，使其不能连通；第一加样孔11和挡板2之间的区域为第一包被区14，挡板2和收集孔13之间的区域为第二包被区15；挡板2将第一包被区14和第二包被区15隔开；第一包被区14和第二包被区15分别用于包被循环AsAb和局部AsAb。并且，为了使用方便，微流道膜1封接在载玻片3上。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、材料和方法
1、试剂
精子洗液购自瑞典vitrolife公司，精子顶体反应和穿透明质酸酶试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，精子抗体MAR检测试剂盒购自深圳华康生物，聚二甲基硅氧烷(PDMS)购自美国康宁公司。
2、人精子标本收集和处理
本研究获得我院医学临床研究伦理委员会的批准，并经过每位受试者知情同意。按照世界卫生组织标准(WHO，2010)，从我院生殖科男科精液检测室收集21～40岁的正常健康生育者(n＝50，年龄35.0±5.0岁)和抗精子抗体阳性患者(n＝43，年龄35.7±8.2岁)的精液标本。排除具有内分泌或解剖学疾病家族史的受试者。
禁欲3～5天后收集精液标本，37℃液化30min后，采用计算机辅助精液分析系统(Computer assisted semen analysis system，CASA)检测精液体积、浓度、精子形态、活力和活率。正常健康生育者(control)精液标本符合以下标准：在小于一年怀孕预期内自然受孕，且距本研究不到一年时间，正常精子浓度≧15×106个细胞/mL，总精子活力包括前向运动(Progressive motility，PR)+非前向运动(Non-progressive motility，NP)≧40％(38-42％，5th centile，95％ Cl)，且PR≧32％(31-34％，5th centile，95％ Cl)，形态正常≧4％。抗精子抗体阳性患者MAR>50％。
3、微流控芯片的设计及制备
采用SU-8胶首先制成模具，管道二次曝光制作掩膜，然后采用聚二甲基硅氧(polydimethylsiloxane,PDMS)硅胶灌注制成含有通道和样本池的微流道膜，打孔、封接即制成本例的用于无抗精子抗体的精子筛选的微流控芯片。本例的芯片尺寸为长×宽＝70mm×28mm，厚度3mm，芯片侧通道宽约120微米，深约50微米，如图1所示，其中，第一加样孔11，用于加入待处理的精液样本；第二加样孔12为包被加样孔；收集孔13，用于回收无AsAb抗体的精子洗液；挡板2，用于分隔开第一包被区14和第二包被区15，本例的第一包被区14为循环AsAb包被区，第二包被区15为局部AsAb包被区。
先制备SU-8模板，真空脱气后，80℃烘烤2h，将固化的PDMS微流道膜1从模板上剥离，用打孔器在第一加样孔11、第二加样孔12和收集孔13处打孔。经清洗，纯氧气处理后，将微流道膜1与制成载玻片3对准后封接，备用。
4、微流控芯片的包被及精子筛选
(1)循环AsAb血清的制备方法：女方EDTA-肝素抗凝管取血后，静置1h后离心3000rpm，30min，取上清，用精子洗液HTF进行1:10稀释，作为循环AsAb组。
(2)宫腔冲洗液的制备方法：在女方取卵手术前，截石位，采用人工受精管1mL无菌精子洗液冲洗宫腔后收集冲洗液，离心3000rpm，30min，取上清，用精子洗液HTF进行1:10稀释，为宫腔冲洗液AsAb组。
(3)微流控芯片包被：在不拔出挡板2的情况下，在第一加样孔11加入100μL循环AsAb组，对第一包被区14进行包被，作为循环AsAb包被区；在第二加样孔12加入100μL宫腔冲洗液AsAb组，对第二包被区15进行包被，作为宫腔局部AsAb包被区。分别在4℃下包被过夜，或37℃下包被1h。
(4)精子筛选前，拔出挡板2，从第一加样孔11加入精液样本500μL，显微镜下观察精子流速，稳定流速静置20min后，从收集孔13收集液体，并进行后续精子存活率、活力和功能实验。
5、精子存活实验
对照组为已证明无细胞毒性的耗材(商品化标准四腔检测切片，Leja，Netherlands)。微流控芯片为待测的耗材，即“4、微流控芯片的包被及精子筛选”收集孔13的收集液。采用伊红苯胺黑染色法进行精子存活试验，评估芯片材料是否对精子及活动里具有潜在毒性。加入10μL收集液于EP离心管，取30μL染液后混匀，静置30s；取出10μL于玻片一端，拉片制成涂片，空气干燥20×或40×物镜下观察，计数至少200个精子。精子死亡后，细胞膜的通透性发生改变，伊红染料渗入精子头部染色成红色，活细胞则不被染上。生存指数的计算方式为，生存指数＝微流控芯片内精子存活率/对照管内精子存活率×100％。如果对照组精子存活率≥70％，生存指数达到80％或以上，则提示无精子毒性。小于80％，应考虑可能有细胞毒素的存在。
6、改良抗球蛋白反应试验(SpermMAR)
MAR检测精子表面抗原和AsAb结合的试验。采用直径2mm的乳胶珠由IgG包被，代替红细胞。先加入10μL收集液，再加入10μL乳胶珠，混合后加入高度特异性的抗IgG 10μL，热台35℃下反应10min后显微镜下观察精子与乳胶珠的结合情况，结合区域即精子AsAb的位置。当50％的精子与乳胶珠结合，视为MAR阳性。MAR检测是常规筛查方法，可以检测道精子表面的IgA和IgG。
7、精子活力测定(CASA)
收集正常生育者和ASA阳性患者的精液，待其完全液化后，各取500μL，经微流控芯片筛选后，从收集孔中收集精子，以HTF培养液(3％BSA)调1×106活动精子/mL的精子悬液，采用CASA系统计算至少200条精子前向运动活力。参照2010版WHO 5th标准，设置CASA超极化活力的参数设置。每个样本加入孕酮后，在60赫兹帧速率下随机选取10个视野400多条精子的运动轨迹。记录精子运动参数的平均值，包括曲线速度(mean curvilinear velocity，VCL)、直线速度(mean progressive velocity，VSL)、平均路径速度(VAP)、侧向头部位移幅度(amplitude of lateral head displacement，ALH)、比例线性(percentage linearity，LIN＝VSL/VCL)和直线度(STR＝VSL/VAP)。如VCL≥150mm/s，线性度≤50％和ALH≥7mm，则定义为精子活力超激活(Hyperactivation，HA)。
8、精子获能(ELISA)和诱发精子顶体反应检测(钙离子载体诱发荧光染色法，FITC-PSA)
收集正常生育者和ASA阳性患者的精液，待其完全液化后，各取500μL，经微流控芯片筛选后，从收集孔中收集精子，以HTF培养液(3％BSA)调1×106活动精子/mL的精子悬液，37℃ 3h 5％ CO2，95％空气孵育1h，以诱导精子获能。精子获能后，按照说明书采用ELISA试剂盒检测精子cAMP浓度。
精子涂片经75％乙醇固定后，采用PSA-FITC染色检测顶体反应。向测定管内避光加入A23187 2.5μL，向对照管中加入对照液2.5μL，混匀；将两管在CO2培养箱内孵育15min。取10μL精子悬液涂片；干燥；固定；洗涤；加入FITC 50μL，水平放置于湿盒内，37℃反应60min，洗涤3次；封片；在激发光450～490nm荧光显微镜100×物镜下观察结果。每个涂片窗至少观察400个精子，记录发生顶体反应的精子数量。最后，计算处理组(试验％AR)和对照样品(对照％AR)中顶体反应精子的百分比。
9、精子透明带结合试验(Hyaluronan binding assay，HBA)
按照MidAtlantic Diagnostics提供的实验步骤进行精子透明带结合试验(BCT-HBA-10,MidAtlantic Diagnostics,Origio)。
收集正常生育者和ASA阳性患者的精液，待其完全液化后，各取500μL，经微流控芯片筛选后，从收集孔中收集精子，在HTF培养基(含3％ BSA)中获能30min，37℃，5％ CO2。调整精子浓度后，各取10μL精滴加入切片小室中，37℃下孵育15min。HBA结合的公式表示＝结合精子数目/总活动精子数目。
10、人精子穿去透明带卵试验(Human sperm-hamster’egg penetration assay，SPA)
按照文献报道Grunewald,S.,et al.,Relationship between sperm apoptosissignalling and oocyte penetration capacity.Int J Androl,2008.31(3):p.325-30，选取性成熟的雌性仓鼠(月龄28±45d，n＝5)进行超排卵。具体是腹腔注射“注射用尿促性素粉针”(HMG，丽珠)10IU，48h后再注射绒促性素粉针(hCG，丽珠)l0 IU。注射hCG 15-17h后，颈椎脱臼法处死超排卵后雌鼠，取出卵巢和输卵管放入含有37℃预热的PBS液的培养皿中，漂洗后放入HTF-1023培养液中。在解剖镜下(×1)找到输卵管的膨大部位，用无菌注射器刺破输卵管壶腹部，卵丘卵母细胞复合体(COC)将流出，用巴斯德吸管将COC捡出，放入含有37℃预热后的HTF-1020培养液的培养皿中，分别添加了80IU/mL透明质酸酶和1g/L胰酶的HTF-1023培养液中各消化20s，去掉卵细胞的透明带。
收集正常生育者和ASA阳性患者的精液，待其完全液化后，各取500μL，经微流控芯片筛选后，从收集孔中收集精子，放入获能液中获能，37℃30min；调整精子浓度(1×106活动精子/mL)后，各取10μL精滴，加入100μL含有10个卵细胞的卵培养液中，孵育2h后，相差显微镜拍照。穿卵率(Pernetrating index，PI)的公式＝穿透卵细胞的精子数目/卵细胞数目。
11、统计学处理
采用GraphPad Prism version 7.0(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析。结果表示为mean±s.e.m.。两组间分析采用t检验，多组比较采用一维方差分析、二维方差分析(Bonferroni posttests)和Pearson相关性分析。p<0.05代表具有统计学。
二、结果
1、微流控芯片的构成
筛选无ASA精子的微流控芯片的示意图如图1所示，分为循环AsAb包被区和宫腔局部AsAb包被区，分别从第一加样孔11和第二加样孔12进行加样包被，由挡板2隔开；进行精子分选时，将挡板拔出，形成平行的流道，由收集孔13收集分选后的精子，进行后续精子存活率和功能的检测。芯片长70mm，厚度为3mm，宽28mm，保证在流道内精子与芯片底部包被区充分接触，如精子携带ASA，则可能会与循环AsAb包被区和宫腔局部AsAb包被区的抗体结合，而未结合的活力好的精子则会在10-15min内到达收集孔。采用100×显微镜观察微流道及其吸附精子的情况，结果如图2所示；图2中，图f为显微镜观察的微流道图，图g为精子通过微流道的图，图h为精子黏附在微流道包被区的图。
2、微流控材料对精子无毒性影响
循环AsAb包被区和宫腔局部AsAb包被区的制备均在无菌操作下进行。正常健康生育者和ASA阳性患者来源的精子，经微流控处理后，检测精子存活率。结果发现，微流控分选前后精子的存活率无显著性改变，p>0.05，如图3所示，图3为精子存活率统计结果。图3的结果提示微流控材料和包被区对精子无毒性影响。
3、微流控筛选无ASA精子具有较好的精子质量和受精能力
从微流控芯片收集孔收集精子，分别检测抗精子抗体(MAR)、精子活力、精子获能、顶体反应(AR)、精子与透明质酸酶结合实验(SPA)以及精子穿去透明带小鼠卵母细胞实验检测。
首先，采用MAR检测精子AsAb水平。结果发现，经微流控芯片筛选后，AsAb阳性患者来源的精子MAR水平显著降低，p<0.01，如图4所示，提示大量含AsAb的精子在包被区被结合或粘滞，因此进入收集孔的精子可能以无As Ab为主；采用CASA检测精子前向运动能力，结果发现精子中具有较好运动能力的精子将优先进入收集孔，p<0.05，如图5所示。这提示，此微流控芯片可较好地实现对无AsAb且活力好精子的筛选。图4为微流控芯片处理前后精子含有抗精子抗体计数变化(MAR)检测结果，图5为芯片处理前后精子前向运动能力检测结果。
同时，检测精子获能情况、顶体反应、与透明质酸酶结合情况以及穿卵地受精功能，结果如图6至图10所示。图6为芯片处理前后精子获能情况检测结果，图7为微流控芯片处理前后精子与透明质酸酶结合实验(SPA)结果，图8为精子顶体反应(PSA-FITC)检测结果，图9为顶体反应的统计图，图10为微流控芯片处理前后精子穿去透明带小鼠卵母细胞实验结果。
图6至图10的结果显示，微流控芯片筛选后的精子较处理前具有更好的精子cAMP水平、顶体反应和受精能力。这提示，本研究设计的微流控精子筛选装置可实现分离无AsAb且活力和受精功能好精子的目的。
三、讨论
精液分为精浆和精子两部分，均含有多种抗原。其中精浆抗原包括血型抗原、HLA抗原和其他抗原如白蛋白、球蛋白、IgG、IgA和IgM。AsAb可存在于血液、生殖道及宫腔内，结合于精子的不同部位并作用于不同的精子抗原。辅助生殖技术已被广泛应用于治疗受AsAb抗体影响的夫妇，包括宫腔人工授精(IUI)、体外受精(IVF)和单精子卵胞浆内注射(ICSI)技术。当前，针对AsAb阳性和阴性精子的精准筛选方法仍待研发，从而保证仅有无AsAb抗体的精子进入后续的受精和妊娠环节。
目前，主要采用精子凝集试验(SAT)、精子制动试验(SRR)、精子间接免疫荧光试验、免疫珠试验(IBT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、混合抗球蛋白反应实验(MAR)等方法来测定精子上AsAb的存在。但是，以上检测后精子的不能再用于后续使用，如行人工授精、IVF或ICSI，而仅是检测手段。临床上针对抗精子抗体引起不孕不育的治疗方案，包括降低AsAb产生、去除和精子结合的AsAb抗体和辅助生殖技术。其中，去除与精子结合的AsAb抗体的方法包括免疫耗竭、精子冲洗、与AsAb阴性血清孵育和IgA蛋白酶处理。文献报道，把含AsAb阳性患者的精液收集在含3％血清白蛋白的卵母细胞培养基，梯度离心后准备行IUI，怀孕率可高达每周期8.6％。
那么，如何从体外筛选无AsAb的优质精子并进入后续受精环节？虽然从病因学上避开具有抗精子抗体的精子很困难，但可从筛选无抗精子抗体角度来探索。因此，采用合适的精子优选技术，可个性化地把无AsAb的精子优选出来，再注入女性宫腔，避开女性生殖道特别是宫腔对精子抗原的拮抗作用；另一方面，进行体外辅助生殖技术操作如IVF或ICSI前的优选无AsAb的精子的较好策略。而且，本研究采用女方血清和宫腔冲洗液包被的微流控筛选精子技术，可当天取样当天包被，易在精子筛选实验室推广。
微流控由微通道构成流道，可控制流体贯穿系统，可在一块几平方厘米的芯片上实现包括样本制备、反应、分离、检测、培养、分选或裂解等基本操作单元功能。其中，芯片是微流控技术的核心，包括芯片的材料、尺寸、设计、加工和表面修饰等。芯片的设计和制备是微流控芯片研究工作的基础。本研究制备微流控芯片的材料是高分子聚合物即聚二甲基硅氧(polydimethylsiloxane，PDMS)。它能透过250nm以上的紫外与可见光，可实现紫外消毒；无毒、廉价；芯片微通道表面可进行多种修饰和包被。对于精子筛选研究，PDMS材料的生物相容性较好，对小鼠胚胎基配子发育无影响。针对芯片材料对精子毒性的影响，本研究精子存活实验证实采用的微流控制作材料对精子存活率无毒性。
微流控芯片构建的特色是底层玻璃是二氧化硅，上层覆盖的胶是PDMS。可实现精子湍流前行，而不是层流前行，保证每个精子都与底部玻璃结合；底部分为循环AsAb包被区和局部AsAb包被区，保证每个精子都能与包被抗体充分接触，这样的话，携带抗精子抗体的精子将被附着，而不能继续湍流前行。精液在芯片流道内，只有流体向前的扩散里，且有活力的精子会游到接触的包被表面，如果存在抗IgG抗体，则会被站在表面不能游动。
本研究需要解决的关键问题是，微流控如何分选不含AsAb的精子且精子活力好的精子。首先，包被的循环AsAb和宫腔冲洗液均在无菌操作下进行。在女方取卵当天，行IVF/ICSI的AsAb阳性男方患者先取精，女方取卵前取宫腔冲洗液和抽血，提前包被微流控芯片。等精液液化后，把精液调整浓度为1×106个/mL，精液先经过微流控芯片血循环AsAb包被区，再流过宫腔冲洗液AsAb包被区。因为宫腔液相对无菌，取宫腔冲洗液，筛选精子，不影响后续精子体外筛选试验。相比宫颈粘液，宫腔液在妊娠中具有非常重要的意义，它可以在宫腔内直接产生效应，参与精子运动、获能及受精过程，也可能导致精子制动、精卵结合的抑制等，因而其识别的精子抗原更能直接反映与免疫性不孕的相关性。对收集的精子进行后续精子质量和受精实验显示，收集的精子MAR水平显著降低，提示大量含AsAb的精子在包被区被结合和粘滞；同时，证实精子是前向运动能力强，且具有较好精子获能、顶体反应和受精能力的精子。
当前上游法和密度梯度离心法是精子分选常用的方法，但会损伤精子DNA并产生ROS。因此，理想的精子筛选方法应该是一种简单、快速、无或低损伤的技术。本研究基于微流控分选无ASA精子，从芯片包被及精子筛选的时间流程上，实现个体化精准无缝连接，保证IVF实验室内灵活筛选无AsAb抗体的精子筛选体外操作平台。包被液不取宫颈粘液，因此避开宫颈粘液的影响和感染，保证无菌操作。采用微流控芯片就在微尺度下对精液流动进行控制，应用血清和宫腔ASA包被区实现靶向针对ASA阳性精子，这对免疫性不育来源的优质精子筛选具有重要意义。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (9)
1.一种用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片，其特征在于：所述芯片包括微流道膜(1)，所述微流道膜(1)上开设有第一加样孔(11)、第二加样孔(12)和收集孔(13)；
所述第一加样孔(11)和第二加样孔(12)之间通过微流道连通，第二加样孔(12)和收集孔(13)之间通过微流道连通；
所述第一加样孔(11)和第二加样孔(12)之间设计有挡板(2)，第一加样孔(11)和挡板(2)之间的区域为第一包被区(14)，挡板(2)和收集孔(13)之间的区域为第二包被区(15)，挡板(2)将第一包被区(14)和第二包被区(15)隔开；
所述第一包被区(14)和第二包被区(15)分别用于包被循环AsAb和局部AsAb。
2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述微流道膜(1)呈长条状。
3.根据权利要求2所述的芯片，其特征在于：所述微流道膜(1)的长为60-80mm，宽25-35mm，厚度为2-5mm。
4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述微流道的宽为100-140微米，深为30-70微米。
5.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述第一加样孔(11)、第二加样孔(12)和收集孔(13)为直径4-8mm的圆柱孔。
6.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述挡板(2)设置于微流道膜(1)的中间位置，将第一包被区(14)和第二包被区(15)分割成大小相当的两部分。
7.根据权利要求1-6任一项所述的芯片，其特征在于：所述微流道膜(1)由聚二甲基硅氧烷制成。
8.根据权利要求1-6任一项所述的芯片，其特征在于：所述芯片还包括载玻片(3)，所述载玻片(3)用于支撑所述微流道膜(1)。
9.一种精子筛选的装置，其特征在于：采用权利要求1-8任一项所述的芯片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202320410124.1U CN219652972U (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片和装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202320410124.1U CN219652972U (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种用于无抗精子抗体的精子筛选的芯片和装置 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN219652972U true CN219652972U (zh) | 2023-09-08 |
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ID=87857340
Family Applications (1)
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-
2023
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