CN108152189A - 一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法，通过精子分离预处理，精子前处理暴露精子Izumo1蛋白表位，使用荧光素标记精子Izumo1蛋白并使用流式细胞仪检测。本发明首次利用流式细胞术对人类精子中Izumo1蛋白进行定量检测，直接实现了对Izumo1蛋白的精确定量，且操作易于标准化，快速准确，精密度高。相对于传统的细胞免疫荧光，荧光原位杂交等定性或半定量检测Izumo1蛋白的方法，本发明方法具有检测方便，精密度高，速度快等优势，可在定量检测精子表面Izumo1蛋白表达中的应用，易于推广，检测结果可用于对精子受精能力进行辅助评估，适于实用。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种使用流式细胞术对人类精子表面出云蛋白1 (Izumo1)的定量检测法方定。
背景技术
在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，受精率低(<30％)和不受精的病例屡有发生。综合报道受精失败(受精率低和不受精)的病例数占总周期数的10％-25％左右，极大的影响了辅助生育技术的治疗效果同时也为不孕不育夫妇心理上带来了严重创伤。
受精失败的原因有精子因素和卵子因素。精子因素主要包括精子透明带结合或穿透异常，顶体反应缺陷等。如果对因精子因素导致受精失败的患者采用ICSI方式受精，可以获得满意的受精率和临床妊娠率。
受精是有性生殖的终极事件，由单倍体的精子和卵子创造一个新的，具有遗传异质性的二倍体子代。精子首先在女性生殖道内需要获得对卵子受精的能力，即精子获能。随后精子发生顶体反应，将先前隐藏的受体蛋白暴露在表面。伴随着精卵发生相互作用，在受精完成后透明带和卵膜会发生相应生化改变，使卵母细胞不能再接受其他精子，从而减少多精受精的发生。在受精过程中，有许多受体蛋白在精卵识别与融合进程中起作用。但在体内，有一对蛋白对受精具有重要作用，即位于精子中的出云蛋白1(Izumo1)和位于卵母细胞中的朱诺蛋白(Juno)，也称之为叶酸受体4(Folate receptor 4,Folr4)。Izumo1是免疫球蛋白超家族的成员之一，蛋白定位在精子顶体内膜，在精子发生顶体反应后暴露于内膜表面，并与卵膜上的Juno蛋白结合识别并发挥作用。Izumo基因敲除研究证明，雄性Izumo-/-小鼠的精子形态和动力均和野生型小鼠无异，但是在受精过程中，由于缺乏Izumo1精子可以穿透透明带而不能穿透卵膜，因此不具备受精能力。由此可见精子中Izumo1的表达对受精过程的完成具有重要作用。
通过测定精子中Izumo1蛋白的表达水平可以对精子的受精能力进行评估，从而有助于选择合适的受精方式，为患者节约宝贵的治疗时间，也避免了由于受精失败对患者带来的巨大打击。
流式细胞术(flow cytometry)是利用流式细胞仪快速准确定量分析细胞群的物理化学特征的技术，可以对细胞的颗粒度，抗原分子表达等情况进行测定。利用流式细胞术对精子表面Izumo1蛋白进行检测具有快速准确，精密度好等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种精子表面出云蛋白1(Izumo1)的定量检测方法，是应用流式细胞术定量检测人类精子表面Izumo1蛋白的方法，具体通过以下步骤实现：
(1)精子分离预处理
a.在塑料试管中将三份含有10％血清替代物(synthetic serum substitute)的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲人输卵管液(HTF)以体积比为3：1比例加入一份精液标本中并混匀，
b.以200×g离心力离心5min洗涤精子，移除上清液，再加入HTF液重悬后重复洗涤一次，
c.小心吸除上清液，保留试管底部沉淀精子，并取1ml含有10％血清替代物的G-IVF液小心加在洗涤后的精子上方，
d.将试管45°角斜放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内培养30min使活力高的精子上游，
e.将上游后的精子小心吸出并置于离心管中200×g离心力离心5min，移除上清留取沉淀后的精子。处理后的精子标本放置于37摄氏度培养箱内备用；
(2)分离后精子样本前处理，暴露出云蛋白1表位
a.配制精子前处理反应培养液，取2ml含有10％血清替代物的人卵裂期胚胎培养液G-1，并加入终浓度为100μM的钙离子载体A23187，混匀后放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内平衡8 小时，
b.取适量精子前处理反应培养液加入到处理后的精子沉淀中，混匀，并调整精子终浓度为1-5×107/ml，放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内反应2小时，使精子充分反应，暴露精子Izumo1蛋白表位，
c.将充分反应后的精子加入1×PBS缓冲液并以200×g离心力离心5min，洗涤两次后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬备用；
(3)使用流式细胞仪检测精子Izumo1蛋白表达情况
a.每例样本分别设一管实验管和一管同型对照管，在实验管和对照管中分别加入500μl 洗涤后精子，实验管中加入Izumo1多克隆一抗(1:200)，对照管加等量PBS，室温下孵育1小时，
b.将孵育后的精子使用1×PBS洗涤两遍，
c.在实验管中加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光二抗(1:400)，在对照管中加入 FITC标记的同型对照抗体(1:400)，室温下避光孵育一小时，
d.将孵育后的精子使用1×PBS洗涤两遍，洗去未结合的荧光标记抗体，
e.在实验管和对照管中加入500μl含有乙二胺四乙酸(EDTA)(1mg/ml)的PBS溶液重悬样本后上机检测，
f.流式细胞仪检测采用设门法。检测指标为阳性百分率(％)和平均荧光强度(MFI)，
g.采用ROC曲线划定诊断截断值(cut-off)，计算界定受精能力的精子Izumo1阳性百分率。
其中步骤(2)所述精子前处理反应培养液中，人卵裂期胚胎培养液G-1用人卵裂期胚胎培养液G-IVF替换。或者人卵裂期胚胎培养液G-1用人输卵管液替换。
本发明的另一个目的是提供所述方法在定量检测精子表面Izumo1蛋白表达中的应用。
相对于传统的细胞免疫荧光，荧光原位杂交等定性或半定量检测Izumo1蛋白的方法，本发明方法直接实现了对Izumo1蛋白的精确定量，且操作易于标准化，快速准确，适合实验室对精子受精能力进行评估。实验证明采用本发明方法具有检测方便，精密度高，速度快等优势，适合实验室常规开展检测。本发明方法首次利用流式细胞术对人类精子中Izumo1蛋白进行定量检测，检测结果可用于对精子受精能力进行辅助评估。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。
实施例1
本发明应用流式细胞术定量检测人类精子表面Izumo1蛋白的方法对男性精子受精能力进行评估。
1.在无菌精液采集罐中留取三位受试者精液标本，并放置于37摄氏度水浴箱中30min，使之充分液化。
2.精子分离预处理
(1)在塑料试管中将6ml含有10％血清替代物(synthetic serum substitute)的Hepes 缓冲人输卵管液(HTF)中加入2ml精液标本中并混匀。
(2)以200×g离心力离心5min洗涤精子，小心吸除上清，留取沉淀。再加入HTF液重悬后重复洗涤一次。
(3)小心吸除上清液，保留试管底部沉淀精子，并吸取1ml含有10％血清替代物的G-IVF 液小心加在洗涤后的精子上方。
(4)将试管45°角斜放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内培养30min使活力高的精子上游。
(5)将上游后的精子小心吸出并置于离心管中200×g离心力离心5min，移除上清留取沉淀后的精子。处理后的精子标本放置于37摄氏度培养箱内备用。
3.分离后精子样本前处理，暴露Izumo1蛋白
(1)配制精子前处理反应培养液。取2ml含有10％血清替代物的人卵裂期胚胎培养液G-1，并加入终浓度为100μM的钙离子载体A23187，混匀后放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内平衡8小时。该精子前处理反应培养液配置还可以：取2ml含有10％血清替代物的人卵裂期胚胎培养液G-IVF，并加入终浓度为100μM的钙离子载体A23187，混匀后放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内平衡8小时。或者该精子前处理反应培养液配置还可以：取2ml含有10％血清替代物的人输卵管液HTF，并加入终浓度为100μM的钙离子载体A23187，混匀后放入6％二氧化碳，37 摄氏度培养箱内平衡8小时。上述三种精子前处理反应培养液配置方法均可。
(2)取1ml精子前处理反应培养液加入到处理后的精子沉淀中，混匀，并调整精子终浓度为1×107/ml。放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内反应2小时，使精子充分暴露Izumo1表位。
(3)将充分反应后的精子加入2ml的1×PBS缓冲液并以200×g离心力离心5min，洗涤两次后用PBS重悬备用。
4.使用流式细胞仪检测精子Izumo1蛋白表达情况
(1)分别对三例标本进行编号。每例样本分别设一管实验管和一管同型对照管。在实验管和对照管中分别加入500μl浓度为5×106/ml的处理后的精子。实验管中加入300μl的 Izumo1兔源多克隆一抗(abcam，1:200倍稀释)，对照管加等量PBS，室温下孵育1小时。
(2)将孵育后的精子使用2ml的1×PBS洗涤两遍。
(3)在实验管中加入500μl的FITC标记的羊抗兔IgG荧光二抗(abcam,1:400稀释)，在对照管中加入500μl的FITC标记的同型对照抗体(abcam，1:400稀释)，室温下避光孵育一小时。
(4)将孵育后的精子使用2ml的1×PBS洗涤两遍，洗去未结合的荧光标记抗体。
(5)在实验管和对照管中加入500μl含有EDTA(1mg/ml)的PBS溶液重悬样本后避光保存并上机检测。
(6)流式细胞仪检测采用设门法。检测指标为阳性百分率(％)和平均荧光强度(MFI)。结果如下表1。
表1
| 名称 | 事件 | 百分率 | 平均荧光强度 | 最终百分率％ |
| 1样本 | 18578 | 61.93 | 1001 | 61.55 |
| 1同型对照 | 115 | 0.38 | 690 | |
| 2样本 | 20169 | 67.23 | 1604 | 65.70 |
| 2同型对照 | 460 | 1.53 | 808 | |
| 3样本 | 14455 | 48.18 | 768 | 47.47 |
| 3同型对照 | 212 | 0.71 | 555 |
(7)采用ROC曲线划定诊断截断值(cut-off)，计算界定受精能力的精子Izumo1阳性百分率。
根据50例进行IVF-ET治疗的患者精子受精情况，以受精率30％作为阳性界值，使用ROC曲线计算出用于评价精子受精能力的Izumo1蛋白的阳性百分率(即cut-off值)为52.84％。由此判断样本1与样本2的精子具备正常受精能力，标本3的精子受精能力差，应建议患者在进行辅助生殖治疗时改行单精子胞浆内注射(ICSI)受精方式以期改善治疗结局。
本发明并不受上述实施方法限制，其他的任何未背离本发明实质与原理的改变，替代，变化，置换等均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)精子分离预处理
a.将三份含有10％血清替代物的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲人输卵管液以体积比为3：1比例加入一份精液标本中并混匀，
b.离心5分钟洗涤精子两次，
c.吸除上清液，取1ml含有10％血清替代物的G-IVF液小心加在洗涤后的精子沉淀物上方，
d.将试管45°角斜放入培养箱内培养30分钟使精子上游，
e.将上游后的精子离心5分钟，取沉淀后的精子放置于37摄氏度培养箱内备用；
(2)分离后精子样本前处理，暴露出云蛋白1表位
a.取精子前处理反应培养液加入到处理后的精子沉淀中，混匀，并调整精子终浓度为1-5×107/ml，放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内反应2小时，使精子充分反应，暴露精子出云蛋白1表位；
b.将充分反应后的精子加入1×磷酸缓冲盐溶液离心5分钟，洗涤两次后用磷酸缓冲盐溶液重悬备用；
(3)使用流式细胞仪检测精子出云蛋白1表达情况
a.每例样本分别设一管实验管和一管同型对照管，在实验管和对照管中分别加入500μl洗涤后精子，实验管中加入Izumo1多克隆一抗(1:200)，对照管加等量磷酸缓冲盐溶液，室温下孵育1小时，
b.将孵育后的精子使用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤两遍，
c.在实验管中加入异硫氰酸荧光素标记的荧光二抗(1:400)，在对照管中加入FITC标记的同型对照抗体(1:400)，室温下避光孵育一小时，
d.将孵育后的精子使用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤两遍，洗去未结合的荧光标记抗体，
e.在实验管和对照管中加入500μl含有1mg/ml乙二胺四乙酸的磷酸缓冲盐溶液重悬样本后上机检测，
f.流式细胞仪检测采用设门法，检测指标为阳性百分率和平均荧光强度，
g.采用ROC曲线划定截断值，计算界定受精能力的精子出云蛋白1阳性百分率。
2.根据权利要求1所述的一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)所述精子前处理反应培养液的配置：取2ml含有10％血清替代物的人卵裂期胚胎培养液G-1，并加入终浓度为100μM的钙离子载体A23187，混匀后放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内平衡8小时。
3.根据权利要求1所述的一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)b中以200×g离心力离心5分钟。
4.根据权利要求2所述的一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法，其特征在于，所述精子前处理反应培养液中，人卵裂期胚胎培养液G-1用人卵裂期胚胎培养液G-IVF替换。
5.根据权利要求2所述的一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法，其特征在于，所述精子前处理反应培养液中，人卵裂期胚胎培养液G-1用人输卵管液替换。
6.根据权利要求1所述方法在定量检测精子表面出云蛋白1表达中的应用。
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