CN105277711A - 一种用于检测he4的酶联免疫试剂盒 - Google Patents
一种用于检测he4的酶联免疫试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测HE4(人附睾蛋白4)的酶联免疫试剂盒。本发明所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,包括酶标板、标本稀释液、包被抗体、检测抗体、检测抗体稀释液、标准品、洗涤液、底物、终止液;其中,包被抗体为由保藏编号为CCTCC?NO:C201472的杂交瘤细胞株HE4-2B8分泌的抗HE4单克隆抗体;检测抗体为已标记HRP的抗HE4多克隆抗体。本发明所述试剂盒采用了专门针对卵巢癌的抗HE4单抗,该单抗具有良好的特异性,与CA125无交叉反应,可以以此为基础建立检测卵巢癌的体外诊断试剂盒,并且可联合CA125蛋白用于卵巢癌的辅助诊断,从而为临床与实践的不同需要提供了建立快速,特异,敏感的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种用于检测HE4(人附睾蛋白4)的酶联免疫试剂盒。
背景技术
卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,也是妇科肿瘤死亡率最高的肿瘤类型,每年约为25%即每四个卵巢癌患者中就有一人死亡。据估计,中国每年每10万人中就有五人被诊断为新发卵巢癌。卵巢癌通常表现为附件肿块,因临床症状不明显,容易造成漏诊与误诊。因此,超过70-75%的卵巢癌患者确诊时已处于癌症晚期,并已扩散到其他器官,错过了最佳治疗时机。在女性的一生中,每五位女性就会有一位出现盆腔肿块,需要接受检查来排除恶性肿瘤的可能性。近20年来,卵巢癌的5年生存率一直徘徊在较低水平,5年内的复发率高达80%,且复发时间主要集中在治疗期的3年内。尽管卵巢癌的预后较差,但如果卵巢癌能被尽早诊断,癌细胞仅在于卵巢内,患者的存活率可以提高到75-95%,极有可能被治愈。因此,卵巢癌的早期诊断和治疗监测尤为重要。
目前,卵巢癌的诊断主要依据两种检测手段。一种是经阴道超声检查(TUV)。这种成像方法可用于检查女性的生殖器官,包括子宫、卵巢、宫颈及阴道。尽管其应用较为普遍,但是这种方法并不能准确检测出该肿块是良性还是恶性。此外,该方法还需要经验丰富的临床技师对检测结果进行解读。另一种常规检测方法是检测生物标志物CA125,这种方法被视为卵巢癌诊断的“金标准”。但是,CA125的特异性及敏感度较低,容易出现假阴性或假阳性。大约50%的卵巢癌I期患者并没有CA125水平升高的现象,也就是说有一半的卵巢癌患者可能被漏诊。某些良性卵巢疾病也会导致CA125水平升高,造成假阳性。因此,在临床诊断上亟需一种更好的诊断工具以尽早诊断卵巢癌。
人附睾蛋白4,即HE4是1991年在人的附睾中被偶然发现的。1999年,发现HE4在卵巢癌组织中呈过度表达。2002年,证实HE4可以作为卵巢癌的血清标志物,2007年通过了试剂研发。2008年研究证明HE4可以作为卵巢癌的检测,并在同年通过了美国FDA的批准。2011年,FDA通过批准了ROMA(恶性风险计算方法)指数,用来分析卵巢癌的风险评估。HE4水平与年龄有关,年龄越大它的水平就越高。健康女性的HE4在140以下,大约98%的女性HE4水平是低于140的。HE4在卵巢癌病例中是高水平表达,显著升高者80%以上都是卵巢癌。HE4水平与疾病进展有关。如果HE4指标明显增加,说明这个疾病有进展。HE4水平还可反映化疗效果。HE4指标增加,显示疾病进展,如果指标下降了,说明疾病在缓解,治疗产生了效果。HE4也可以反映手术效果。绝大部分患者术后HE4都下降了,有一些人甚至下降90%以上。如果术后随访中发现HE4水平下降以后再上升,则提示肿瘤可能复发,所以说HE4也是肿瘤早期复发的一个检测指标。
人附睾蛋白4(HE4)是一种新的肿瘤标志物。正常生理情况下,HE4在人体中有非常低水平的表达,但在卵巢癌组织和患者血清中均高度表达,可用于卵巢癌的早期诊断、鉴别、治疗监测及预后评估。88%的卵巢癌患者都会出现HE4升高的现象。与CA125相比,HE4的敏感度更高、特异性更强,尤其是在疾病初期无症状表现的阶段。疾病早期HE4诊断的敏感度是82.7%,而CA125却仅有45.9%。与CA125仅20%的特异性相比,HE4的特异性高达99%。这意味着,临床医生对HE4的检测结果更具信心。仅仅凭借CA125的检测结果诊断卵巢癌时,10位女性中可能有8位会被误诊。HE4与CA125是相互补充的标志物,两者联合应用,敏感性可增加到92%,能将假阴性结果减少30%,大大增加了卵巢癌诊断的准确性。此外,对卵巢癌患者进行HE4定量检测,还可帮助监测疾病状态、反映治疗疗效并早期发现癌症复发,有重要的参考价值。多数卵巢癌HE4和CA125会同时升高,但有些卵巢癌只出现单一肿瘤标志物的升高。因此,两者联合使用,可避免单一应用的阴性结果造成疾病复发监测的漏诊。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测HE4(人附睾蛋白4)的酶联免疫试剂盒。
本发明所述的一种用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,包括酶标板、标本稀释液、包被抗体、检测抗体、检测抗体稀释液、标准品、洗涤液、底物、终止液;其中,包被抗体为由保藏编号为CCTCCNO:C201472的杂交瘤细胞株HE4-2B8分泌的抗HE4单克隆抗体;检测抗体为已标记HRP的抗HE4多克隆抗体。
本发明所述试剂盒采用了专门针对卵巢癌的抗HE4单抗,它是由杂交瘤细胞株HE4-2B8所分泌,其保藏号为CCTCCNO:C201472,保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址是中国湖北省武汉市武汉大学;保藏日期为2014年4月23日。该单抗具有良好的特异性,与CA125无交叉反应,可以以此为基础建立检测卵巢癌的体外诊断试剂盒,并且可联合CA125蛋白用于卵巢癌的辅助诊断,从而为临床与实践的不同需要提供了建立快速,特异,敏感的检测方法。
根据本发明所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒的进一步特征,所述酶标板的包被抗体封闭液为含有5%BSA、0.2%蔗糖的PBS溶液。
根据本发明所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒的进一步特征,所述标本稀释液为含有0.5%BSA、0.05%的吐温20、0.1-1%还原剂的PBS缓冲液。
根据本发明所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒的进一步特征,所述检测抗体稀释液为含有0.5%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液。
根据本发明所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒的进一步特征,所述标准品为HE4标准品蛋白干粉。
根据本发明所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒的进一步特征,所述10X洗涤液含有:0.2MTris-HCl、5MNaCl、0.5%吐温20。
根据本发明所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒的进一步特征,所述底物为TMB溶液。
根据本发明所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒的进一步特征,所述终止液为2MH2SO4。
在ELISA中血清标本可按常规方法采集有可能产生溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。另外,如果血清标本未在新鲜时检测,可能有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。
本发明所述HE4定量检测试剂盒不仅检测速度快,血液标本用量少,试剂盒组份中的稀释液加入一定量的还原物质,避免了非特异性结合,检测结果的精密度高,为临床医师提供更准确的检测结果,极大改善卵巢癌的诊断与管理。
附图说明
图1显示HE4小鼠免疫效价结果。
图2是试剂盒的灵敏度的标准曲线图。
图3是本发明所述试剂盒的样本测试相关性曲线。
图4是本发明所述试剂盒的样本稳定性测试相关性曲线。
具体实施方式
实施例1:HE4抗原的制备
1)pET28a-HE4重组载体的构建
根据Genbank中提供的人HE4的DNA序列(AAH46106),设计引物,
引物序列为:
上游引物:NGAGAAGACTGGCGTGTGC;
下游引物:GTCACTCCCAATTTCTGA。
在两个引物的5’端分别引入EcoRI+XhoI酶切位点,用测序法验证该HE4基因是否克隆成功。
通过PCR扩增得到HE4的目的基因,将载体pET-32a及经过琼脂糖凝胶纯化的HE4基因片段,用EcoRI+XhoI进行双酶切处理,用T4DNA连接酶将纯化后酶切产物连接,得到重组质粒pET-28a-HE4,并连接产物转化进入大肠杆菌DH5α,在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆,小量制备质粒,通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆,并将其送往公司进行测序,测序结果表明重组的HE4片段与设计的序列完全一致。
2)HE4重组蛋白的表达
HE4质粒经测序验证后,转化进入大肠杆菌(BL21),在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养,可在LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定,小量制备质粒,用双酶切PCR鉴定筛选出阳性克隆,最终获得含有HE4的重组质粒工程菌。
在表达时,将HE4的重组质粒工程菌于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养,A600达到0.5-0.6之间,然后加入终浓度为0.5mM的IPTG于37℃诱导4h,诱导完成后的菌液4,000rpm离心10min,收集菌体,并用PBS洗涤沉淀;PBS重悬沉淀后置于冰浴中,超声破菌后12000rpm离心20min,上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳,结果表明:表达的HE4重组蛋白为胞浆不可溶性表达。
3)HE4重组蛋白的纯化和定量
将大量表达得到的菌体,诱导完成后的菌液4,000rpm离心10min,收集菌体,并用PBS洗涤沉淀;20mMTris-HCl重悬沉淀后置于冰浴中,超声破菌后12000rpm离心20min,将上清成用GEHealthcare公司的HisTrapFF纯化柱将蛋白进行纯化。最终获得的蛋白用SDS-PAGE电泳进行分析,用BCA蛋白定量试剂盒测得其浓度。
实施例2:鼠抗HE4单克隆抗体的制备
1)鼠抗HE4杂交瘤细胞株的建立及单抗亚型的鉴定
a.免疫程序采用4次基础免疫和1次加强免疫。选用6至8周龄左右且健康的雌性BALB/c小鼠2只(18#,19#),适应性饲养1周后,采集阴性血作为对照用;
b.采用中程免疫方案(0.3mL/只,2周/次),首次免疫时(50μg/只)按免疫原与等体积的弗氏完全佐剂搅拌乳化,背部皮下多点注射,此后按免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂搅拌乳化进行常规免疫;
c.3次免疫时,一般50μg抗原+TiterMax等量混合乳化后背部多点注射,7天后测效价。19#小鼠效价明显达到4万以上(如图1及表1所示),准备加强免疫,加强免疫不加佐剂,加强免疫剂量为50μg,加强免疫后3天,摘眼球采血,分离血清保存。同时取脾脏进行融合。
表1:HE4小鼠三次免疫后效价测定
d.细胞融合时,将脾细胞与骨髓瘤细胞按4:1左右进行混合,并在聚乙二醇(PEG,分子量为1450)的促融作用下进行融合,融合细胞再HAT选择性培养液中进行培养,10天后通过间接ELISA方法筛选出能与HE4蛋白反应的阳性杂交瘤细胞,并将初筛得到的阳性杂交瘤细胞扩大培养,两天后进行标签蛋白(His-tag)杂交瘤细胞的排除,以复筛出针对HE4蛋白而非标签的杂交瘤细胞;
e.用有限稀释法将获得的阳性杂交瘤细胞连续亚克隆至少两次以上,每次亚克隆用HT选择性培养基进行培养,亚克隆8-10天后进行ELISA筛选,直至单克隆细胞阳性率为100%为止,获得1株能稳定分泌抗HE4蛋白的抗体的单克隆细胞株2B8。
f.应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定芯片试剂盒(购自美国Raybiotech公司)鉴定单抗亚型,按芯片试剂盒说明书将单克隆细胞株上清分别用DMEM无血清培养基进行80-100倍稀释,加入到阵列中,一个孔含有测定所有亚型的阵列,每个亚型有4次重复,结果显示:2B8杂交瘤细胞上清的抗体亚型为IgG1,轻链亚型均为κ链。
2)鼠抗HE4的腹水抗体制备及纯化
a)选择8-12周龄雌性健康BALB/c小鼠,腹腔注射降植烷,0.5mL/只;7-10天后,给每只小鼠腹腔注射1*106~5*106个单克隆杂交瘤细胞,注意吹下细胞或稀释细胞需用PBS或无血清培养基;
b)将腹水10,000r/min离心15min,除去细胞成分和其他的沉淀物、脂肪以及油层等,收集中间层,测定抗体效价,分装,置-70℃冻存备用。
c)饱和硫酸铵沉淀:吸取5mL处理好的腹水移入小烧杯中,在搅拌下,逐滴加入过0.22μm滤膜的PBS5.0mL;混合均匀后,再逐滴加入10mL饱和硫酸铵溶液(pH7.4),继续缓慢搅拌30min;静置2h后10,000r/min离心15分钟,弃去上清,沉淀物用过0.22μm滤膜的PBS重悬,然后再将该重悬液过0.22μm滤膜;
d)根据抗体不同亚型,选定不同的GEHealthcare公司的纯化柱,IgG和IgM的柱子均有相应说明书,根据其说明书配置不同的缓冲液进行纯化:以IgG抗体纯化为例,先用结合缓冲液、洗脱缓冲液及再生缓冲液将柱子进行平衡,通常平衡5个柱体积,然后将重悬的腹水缓冲液以1mL/min的速度上样,上样完成后用结合缓冲液平衡,再用洗脱液洗至基线位置,收集抗体峰;用PBS缓冲液将抗体进行透析,用BCA蛋白定量试剂盒测定抗体浓度,并将抗体分装保存,并用间接ELISA进行效价测定(如表2所示)。
表2.HE4纯化后抗体效价测定
抗体稀释度(1:X) | HE4-2B8效价 |
5000 | 1.695 |
10000 | 1.374 |
20000 | 1.232 |
40000 | 0.831 |
80000 | 0.467 |
160000 | 0.227 |
负对照 | 0.050 |
空白对照 | 0.065 |
将本实施例获得的杂交瘤细胞株HE4-2B8送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏,地址是中国湖北省武汉市武汉大学,保藏号为CCTCCNO:C201472,保藏日期为2014年4月23日。
实施例3:HE4的间接ELISA检测方法的建立及抗体特异性鉴定
检测方法:在本实施例中,应用实施例1中获得的HE4(或者其他交叉反应蛋白)作为包被抗原,以实施例2中制备的抗体作为识别抗体,建立检测HE4的间接ELISA。
1)酶标板的包被
用包被液(Na2CO31.5g,NaHCO32.9g,Na2N31.2g,加ddH2O到1L,调pH到9.6)将抗原稀释成1μg/mL,混合均匀后加入到96孔酶标板中,每孔100μL,将板密封于4℃过夜。
2)酶标板的封闭
用含有5%脱脂牛奶的PBS作为封闭液。首先将包被过夜的酶标板拍干,加入200μL/well的封闭液,37℃封闭2h,用洗板机洗板6次后将酶标板拍干,并于4℃备用,或-20℃长期保存。
3)加入本发明中制备的抗体,100μL/well,于37℃温育1h,用洗板机洗板6次后将酶标板拍干,再加入一定浓度的生物素标记羊抗-小鼠IgG抗体(购自美国Raybiotech),100μL/well,于37℃温育1h;洗板后加入链霉素标记的辣根过氧化物酶(HRP),100μL/well,于37℃温育1h;洗板后加入TMB显色液,待显色完全后,加入2M的浓硫酸终止显色,并用酶标仪(美国Biotek)测定OD450。并对交叉反应进行比对分析,最终结果表明,该抗体仅识别HE4。
实施例4:检测HE4的酶联免疫试剂盒的组成
1)ELISA微孔板:已包被捕获抗体,其保藏号为C201472,并用含有5%BSA、0.2%蔗糖的PBS溶液进行了封闭。
2)标本稀释液15ml:加入含有0.5%BSA、0.05%的吐温20、0.1-1%还原剂的PBS缓冲液。
3)结合物稀释液15ml:加入含有0.5%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液。
4)结合物:已标记HRP的检测抗体冻干粉。
5)标准品:HE4标准品蛋白干粉。
6)10X洗涤液30ml:0.2MTris-HCl,5MNaCl,0.5%吐温20。
7)底物20ml:TMB溶液
8)终止液10ml:2MH2SO4。
9)试剂盒产品说明书,包装盒,塑料薄膜。
实施例5:检测HE4的酶联免疫试剂盒的操作流程
1)加入梯度稀释的HE4蛋白标准品与待检测的血清样品,每个样品做两个重复,每孔加100ul,37℃反应40分钟。
2)配置1X洗涤液于洗板机上洗板5次共10分钟。
3)将稀释液加入结合物混匀,加入微孔板中孵育40分钟,
4)再次洗涤并加入底物反应10分钟,加入终止液显色,于酶标板上读数。
根据读数计算标准曲线,可以得出读数与HE4蛋白标准品之间的线性关系,将样品的OD值代入线性公式得出样品的含量。整个过程不超过2个小时。
实施例6:检测HE4的酶联免疫试剂盒的质量分析
1)试剂盒的灵敏度
实验操作以零校准品(A)当作样品测量20次,计算其均值及标准差。以A测定值的均值加上2倍的标准差所得的吸光度值代入标准曲线方程计算得出的浓度为其最低检测量。结果见表3。
表3:灵敏度检测结果
浓度值 | 1 | 2 | 3 | 4 |
800 | 2.311 | 2.27 | 0.089 | 0.101 |
400 | 1.204 | 1.226 | 0.081 | 0.046 |
200 | 0.702 | 0.71 | 0.107 | 0.041 |
50 | 0.311 | 0.32 | 0.04 | 0.111 |
15 | 0.139 | 0.135 | 0.098 | 0.054 |
0 | 0.072 | 0.056 | 0.083 | 0.073 |
空白1 | 0.083 | 0.093 | 0.103 | 0.047 |
空白2 | 0.109 | 0.083 | 0.051 | 0.102 |
如表3,抗原蛋白按不同浓度梯度稀释,分别为0pmol/L,15pmol/L,50pmol/L,200pmol/L,400pmol/L,800pmol/L。其中,1和2为抗HE4单抗,3和4为无关抗体,作为对照。
根据以上数据得出散点图和标准曲线方程y=365.7x-44,R平方值为0.997(见图2)。
稀释液测试A值均值为0.07975,标准差值为0.02462,稀释液测试最低检测限,灵敏度为OD值为0.12899。即:HE4最低检测限是3.172pmol/L,线性范围是:15pmol/L-800pmol/L。
2)试剂盒的应用
本发明所述试剂盒与市面上常用的某进口公司诊断试剂盒针对同一批临床样本(60例病人血清)作对比试验,检测结果如表4所示。
表4:试剂盒检测结果的比较
图3是本发明所述试剂盒的样本测试相关性曲线。本图采用样本检测值作为X轴,某进口公司诊断试剂盒检测值作为Y轴绘制散点图,生成趋势线和公式,并得R平方值为0.884,结果表明,本试剂盒与其它试剂盒有很好的相关性,且所需时间更短(只需2个小时,而其它试剂盒需2.5个小时)。
3)试剂盒的特异性(交叉反应)
A.将CA125抗原稀释后用本发明所述的HE4试剂盒检测,其中第1、2列为标准曲线,第3、4列包被CA125抗原。
结果见表5,表明:CA125浓度达1000U/ml的浓度都未见明显的交叉反应。
表5:与CA125蛋白交叉反应的结果
1 | 2 | 3 | 4 | CA125浓度值U/ml | |
A | 2.323 | 2.25 | 0.089 | 0.075 | 1000 |
B | 1.214 | 1.212 | 0.07 | 0.066 | 500 |
C | 0.712 | 0.704 | 0.061 | 0.081 | 250 |
D | 0.321 | 0.314 | 0.082 | 0.089 | 125 |
E | 0.142 | 0.133 | 0.076 | 0.081 | 62.5 |
F | 0.066 | 0.075 | 0.086 | 0.079 | 31.25 |
G | 0.1 | 0.094 | 0.065 | 0.058 | 15.625 |
H | 0.062 | 0.064 | 0.092 | 0.086 | 7.8125 |
如表5,CA125蛋白按不同浓度梯度稀释,分别为1000U/ml,500U/ml,250U/ml,125U/ml,62.5U/ml,31.25U/ml,15.625U/ml,7.8125U/ml。
B.通过检测卵巢癌病人血清42例,统计结果如表6所示。按照相关统计得知女性的HE4健康人群的参考值为:60pmol/L的浓度,得知HE4作为检测卵巢癌的特异性为97.6%。
表6:本试剂盒检测卵巢癌病人血清结果
表6中,A至F表示不同的抗原浓度梯度,分别为800pmol/L,400pmol/L,200pmol/L,50pmol/L,15pmol/L,0pmol/L。1A至1F为抗原梯度稀释的检测值,2A至2F为它的重复。其余数值为病人血清的检测值,各个血清设两个重复。
由标准曲线得出散点图,标准曲线方程y=0.002x+0.12将OD值换算成为浓度。见图3和表7。
表7:根据表6数值代入方程所得目标蛋白浓度
样本编号 | 检测浓度值 | 样本编号 | 检测浓度值 | 样本编号 | 检测浓度值 | 样本编号 | 检测浓度值 | 样本编号 | 检测浓度值 | 样本编号 | 检测浓度值 |
01 | 120 | 08 | 662.75 | 015 | 732.5 | 022 | 413.25 | 029 | 813 | 036 | 857.25 |
02 | 376 | 09 | 528.75 | 016 | 172.75 | 023 | 1120 | 030 | 309.75 | 037 | 602.5 |
03 | 407 | 010 | 356 | 017 | 54.75 | 024 | 913.25 | 031 | 604.5 | 038 | 367.75 |
04 | 808.75 | 011 | 606 | 018 | 96.5 | 025 | 506 | 032 | 327.5 | 039 | 113.75 |
05 | 74.75 | 012 | 357.25 | 019 | 770 | 026 | 547.5 | 033 | 218.25 | 040 | 255.5 |
06 | 272.5 | 013 | 903.25 | 020 | 628.5 | 027 | 544.5 | 034 | 163.75 | 041 | 83.5 |
07 | 772.75 | 014 | 423.25 | 021 | 482.25 | 028 | 674.5 | 035 | 1181.75 | 042 | 217.75 |
4)试剂盒的稳定性
试剂盒在37℃条件下经过5天测试其热稳定性,采用两个质控品,其中C1浓度为200pmol/L,C2浓度为400pmol/L。结果如表8和表9所示。
表8:稳定性检测结果
表9:本试剂盒的精密度,准确度的计算
如表9所示,抗原标准品浓度为0至800pm/L,由OD值可知抗原与抗体线性关系,见图4。表中,“blank1”为“空白1”,“blank2”为“空白2”。
该标准曲线方程为y=363.4x-49.49,R平方值为0.997。
实验操作以零校准品(A)当作样品测量20次,计算其均值及标准差。以A测定值的均值加上2倍的标准差所得的吸光度值代入标准曲线方程计算得出的浓度为其最低检测量。
其中最低检测限:((样本的平均值-对照样本的平均值)+2x(样本的标准差-对照样本的标准差)x363.4)-49.49=1.6pm/L;其中,C1精密度为:(质控品样本的平均值+2x质控品样本的标准差)x363.4-49.49=391.6776pm/L;C2精密度为:(质控品样本的平均值+2x质控品样本的标准差)x363.4-49.49=203.66353pm/L。
其中,准确度为再重复做一次,结果见表10。
表10:本试剂盒准确度的计算结果
9 | 10 | 平均值 |
2.279 | 2.301 | 2.29 |
1.351 | 1.222 | 1.2865 |
0.74 | 0.733 | 0.7365 |
0.317 | 0.319 | 0.318 |
0.13 | 0.148 | 0.139 |
0.078 | 0.069 | 0.0735 |
与前一次做的数值对比(即第二次数值除于第一次数值),结果见表11。
表11:本试剂盒平均准确度的计算结果
2.29 | 2.304 | 99.39236 |
1.2865 | 1.277 | 100.7439 |
0.7365 | 0.717 | 102.7197 |
0.318 | 0.315 | 100.9524 |
0.139 | 0.1315 | 105.7034 |
由表10和表11,可求得平均准确度为101。
实施例5:检测HE4的酶联免疫试剂盒的改良
在ELISA中血清标本可按常规方法采集有可能产生溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。另外,如果血清标本未在新鲜时检测,可能有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。本发明所述试剂盒中的结合物稀释液为加入高浓度的无关蛋白质(0.5至1%牛血清白蛋白)及具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂0.05%的吐温20于PBS缓冲液中,加入高浓度的无关蛋白质可避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上。标本的稀释液是在结合物的稀释液基础上加入0.01-0.1%的还原剂,用于还原标本中游离的过氧化物酶。还原剂可为还原型谷胱甘肽,抗坏血酸。本试剂盒针对改良的试剂作对比实验,针对同一批次样本(已放置冰箱一个星期的20个血清样本)采用不同试剂进行检测,结果如表12所示。
表12:试剂盒的改良结果对比
由表12可见,已加还原剂的检测结果比未加入结果低,得出本试剂盒可有效避免内源过氧化物酶的非特异性结合,提高了试剂盒的精密度。
Claims (8)
1.一种用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,包括酶标板、标本稀释液、包被抗体、检测抗体、检测抗体稀释液、标准品、洗涤液、底物、终止液;其特征在于:包被抗体为由保藏编号为CCTCCNO:C201472的杂交瘤细胞株HE4-2B8分泌的抗HE4单克隆抗体;检测抗体为已标记HRP的抗HE4多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,其特征在于:所述酶标板的包被抗体封闭液为含有5%BSA、0.2%蔗糖的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,其特征在于:所述标本稀释液为含有0.5%BSA、0.05%的吐温20、0.1-1%还原剂的PBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,其特征在于:所述检测抗体稀释液为含有0.5%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,其特征在于:所述标准品为HE4标准品蛋白干粉。
6.根据权利要求1所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,其特征在于:所述10X洗涤液含有:0.2MTris-HCl、5MNaCl、0.5%吐温20。
7.根据权利要求1所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,其特征在于:所述底物为TMB溶液。
8.根据权利要求1所述的用于检测HE4的酶联免疫试剂盒,其特征在于:所述终止液为2MH2SO4。
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