CN106841630A - 一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒及应用 - Google Patents

一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒，属于免疫学检测领域。其包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂；所述化学发光板的各孔包被有抗HE4抗体；所述试剂包括：HE4系列标准品溶液，HE4系列质控品，生物素标记抗HE4抗体，链酶亲和素‑HRP，样本稀释液，酶稀释液，化学发光溶液 A、B液，浓缩洗涤液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测卵巢癌的辅助诊断。

Description

一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及一种检测人附睾蛋白4(HE4)的化学发光酶免疫检测试剂盒，用于检测卵巢癌病人血清中的HE4蛋白的浓度，可用作监测卵巢癌的疾病状态、反映治疗疗效、早期发现、癌症复发情况，属于免疫学检测领域。
技术背景
卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，也是妇科肿瘤死亡率最高的肿瘤类型。卵巢癌高危人群包括：50岁以上的绝经女性；未婚或晚婚、不育或少育、不哺乳的女性；使用促排卵药物的不孕症者；有遗传性卵巢家族史的女性，有乳腺癌家族史者，有非息肉性结肠癌家族史者。卵巢癌通常表现为附件肿块，因临床症状不明显，容易造成漏诊与误诊。因此，超过70-75％的卵巢癌患者确诊时已处于癌症晚期，并已扩散到其他器官，错过了最佳治疗时机。
目前，卵巢癌的诊断主要依据两种检测手段。一种是经阴道超声检查。这种方法尽管应用较为普遍，但并不能准确检测出该肿块是良性还是恶性；另一种方法是检测生物标志物CA125，但是CA125的特异性及敏感度较低，容易出现假阴性或假阳性。大约50％的卵巢癌I期患者并没有CA125水平升高的现象，也就是说有一半的卵巢癌患者可能被漏诊。
人附睾蛋白4(human epididymis gene product 4,HE4)为WFDC2基因的编码产物，是一种分泌蛋白，属于乳酸蛋白结构域家族蛋白，是很有诊断潜力的卵巢肿瘤标志物。正常生理情况下，HE4在人体中有非常低水平的表达，但在卵巢癌组织和患者血清中均高度表达，可用于卵巢癌的早期诊断、鉴别、治疗监测及预后评估。88％的卵巢癌患者都会出现HE4升高的现象。
与CA125相比，HE4的灵敏度更高、特异性更强，尤其在疾病初期无症状表现阶段。HE4在良性肿瘤患者和正常人血清中含量极低，而在93％的卵巢浆液性癌及100％的卵巢子宫内膜样癌中呈阳性表达。HE4在鉴别卵巢肿瘤的良恶性质时灵敏度达到72.9％，明显优于CA125的43.3％((特异度为95％时)；单一HE4对I期卵巢癌诊断的灵敏度45.9％也明显优于单一CA125对I期15.1％(特异度为95％时)HE4与CA125是相互补充的标志物，两者联合应用，敏感性可增加到92％，能将假阴性结果减少30％，大大增加了卵巢癌诊断的准确性。CA125和HE4联合检测是卵巢癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期诊断的敏感性达到60.0％、77.80％、95.20％和100.00％.
鉴于此，建立一种有效、快速、简单、灵敏的检测HE4的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种人附睾蛋白4(HE4)的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒及应用。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点，用于检测卵巢癌病人血清中的HE4蛋白的浓度。
为实现上述目的，本发明利用了化学发光酶联免疫分析法，该方法是化学发光法和酶联免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。该方法采用了一步双抗体夹心法，主要原理是将包被抗体包被于微孔板中形成固相抗体，在包被后的微孔中加入标准品、质控品、样品，再加入生物素标记抗HE4抗体，再加入HRP-链酶亲和素反应后，弃上清洗涤，最终形成固相抗体—抗原—生物素标记抗HE4检测抗体—HRP-链酶亲和素复合物，加入发光液A液、B液，立刻读数获得RLU值。在整个反应过程中，样品中HE4含量越高，反应体系中发光强度越强RLU值越高；反之，样品中HE4含量越少，发光强度越弱RLU值越低。
本发明提供了HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)测定方法及其检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂，包括：
1.化学发光板。为白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发光板，各孔包被有抗HE4的抗体，抗体包被浓度为5.0μg/mL。
2.HE4系列标准品溶液。浓度分别为：0、50、70、250、500、1800pmol/L。
3.HE4系列质控品溶液。浓度分别为：250±80、70±14pmol/L。
4.生物素标记抗HE4抗体。由抗HE4抗体与生物素偶合制成的偶联物作为检测抗体。
5.辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素。
6.化学发光溶液A、B液。A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的水溶液，所述百分比为质量百分比。
7.浓缩洗涤液。浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20(Tween-20)缓冲液的20倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。
本发明提供的HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的制备过程对本发明试剂盒检测的灵敏度以及相关性能影响很大，其制备关键步骤如下：
1.预包被化学发光板的制备：采用将抗HE4抗体置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应2小时包被。采用的抗体包被浓度为5.0μg/mL，采用的是pH＝9.5的碳酸钠—碳酸氢钠缓冲溶液。微孔板中所包被的抗HE4抗体在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板。包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，在37℃恒温箱中反应2小时封闭。
2.HE4系列标准品溶液的制备：HE4抗原溶液浓度是决定本发明中HE4酶联免疫检测试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。将HE4抗原溶液可以用抗原稀释液稀释成1:1000的工作浓度，而后按照倍比稀释的方法稀释抗原至终浓度为0、50、70、250、500、1800pmol/L的系列标准品溶液。
3.HE4系列质控溶液的制备：HE4质控溶液浓度是本发明中HE4酶联免疫检测试剂盒实验操作质控的重要因素。将HE4抗原纯品溶液用抗原稀释液稀释成1:1000的工作浓度，而后稀释至终浓度为250、70pmol/L的质控溶液。
4.生物素标记抗HE4抗体的制备：10μl标记抗体加1μl溶解后的生物素，用标记液稀释至100μl，37℃水浴锅中反应1小时，而后转移至准备好的透析袋中，置于透析液中，置在磁力搅拌器上进行透析，透析液需4～6h更换一次，更换5次后即可收抗体。
本发明提供的HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的内设以及制备过程中的试剂溶液对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大，所涉及相关溶液的配制方法如下：
1.HE4标准品溶液：以既定方法将HE4抗原纯品用抗原稀释液配制成浓度分别为0、50、70、250、500、1800pmol/L的HE4系列标准溶液。
2.HE4质控品溶液：以既定方法将HE4抗原纯品用抗原稀释液配制成浓度分别为250、70pmol/L的质控品溶液。
3.生物素标记抗HE4抗体：按照既定方法将生物素与抗体进行偶联透析后获得的生物素标记抗HE4抗体，用抗体稀释液稀释成1:2000的工作浓度作为检测抗体。
4.抗原稀释液：为含有BSA，蔗糖的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，是每升含有20g BSA，50g蔗糖，8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4的水溶液。
5.抗体稀释液：为含有蔗糖的0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，是每升含有50g蔗糖，8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4的水溶液。
6.化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M，pH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的水溶液。
7.浓缩洗涤液：按体积分数0.05％将吐温-20添加至pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。
8.包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH＝9.5。
9.封闭溶液：10g BSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的P300。
10.标记液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH＝9.5。
11.透析液：0.24g磷酸二氢钠、1.44g磷酸氢二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾溶于1L水中，调节PH＝7.4。
本发明提供了HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)测定方法的检测步骤如下：
1.使用前，将试剂盒所有组分于室温下放置20分钟，清洗液(20×)在使用前必须用纯化水稀释20倍，链霉亲和素-HRP用酶稀释液稀释1000倍后使用，避光存放。
2.化学发光板使用前每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)。重复此操作2次。
3.将校准品、质控品或血清样本各10μl分别加入化学发光板微孔中，再加入生物素标记的抗HE4抗体50μl，再加HRP标记的抗HE4抗体50μl，震荡混匀后，用封板膜封板，37℃水浴10分钟。
4.甩去化学发光板孔内液体，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)。重复此操作5次。
5.加入100μl发光液A发光液B混合液(A、B液体积比例为1:1)立刻置于化学发光仪上读数，获得RLU值。
6.根据标准品的RLU值和浓度为坐标轴，选择合适的数学模型建立标准曲线。将样本的RLU值，代入上述的标准曲线中，得出样本浓度。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测卵巢癌的辅助诊断。
附图说明：
图1：HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的原理概述图。
图2：HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的工艺流程图。
图3：为HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的标准曲线。
图4：为HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的线性考察结果图。
图5：为HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒测定病人血清与正常人的血清HE4含量的散点图。
具体实施方式
实施例一：抗体与包被抗原浓度的优选(方阵法)
纵向用每种包被抗体按80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625μg/mL的系列稀释度包被化学发光板，100μl/孔，置于37℃恒温箱2小时后，拍干；以150μl/孔封闭溶液封闭，37℃恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入50μl/孔一系列稀释的HE4抗原(1:1000至1:512000)，再加生物素标记抗HE4抗体，再加入链酶亲和素-HRP，37℃水浴10分钟，洗板五次，最后一次拍干；分别加入100μl发光液A发光液B混合液(比例为1:1)测定发光强度值RLU值。以发光强度值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
根据上述对包被抗体及抗原浓度的优选实验中确定，包被抗体浓度为5.0μg/mL，抗原标准品的最高点工作浓度为1:1000，即800pmol/L。
实施例二：HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的标准曲线
根据HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)测定方法的检测步骤，获得HE4系列标准品的发光值RLU。根据标准品的RLU值和浓度为坐标轴，选择合适的数学模型建立标准曲线，
标准曲线如图2所示，其相关系数r＝0.9999。
实施例三：HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的准确度
根据HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)测定方法的检测步骤，取定值样本进行检测。重复测量3次后，其平均结果记为M，根据公式(1)计算测量浓度的相对偏差。
B＝(M-T)/T×100％·················公式(1)
式中：
B—相对偏差；
M—测量浓度3次结果的平均值；
T—定值样本的浓度。
准确度结果如表1所示，其相对偏差为3.06％，小于10％，显示该试剂盒在检测样本时具有较好的准确度：
表1：
实施例四：HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的最低检测限
用零浓度样本作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的发光值值(RLU值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应的RLU值，根据试剂盒所用校准品的定标曲线方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为检测限。
检测限结果如表2所示，检测限为1.84pmol/L。
表2：
实施例五：HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的线性
用样本稀释液将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限。将每一浓度样本重复检测2次，计算其浓度的平均值，将结果平均值和稀释后的样本浓度用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r。
线性考察图如图3所示，其r＝0.999，相关系数大于0.9900，试剂盒线性相关性较好。
实施例六 HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的重复性
用两个浓度水平的样本各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，根据公式(2)得出变异系数CV。
CV＝SD/M×100％····················公式(2)
式中：
CV—变异系数；
SD—10次测量结果的标准差；
M—10次测量结果的平均值。
重复性结果如表3所示，变异系数CV均小于15％，显示该试剂盒在检测样本时具有较好的重复性：
表3：
实施例六：HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)检测试剂盒的临床样本检测情况
根据HE4的化学发光酶免疫(CLEIA)测定方法的检测步骤，选择了34例病人(临床诊断为卵巢癌)，29例正常人(临床诊断为健康人群)的血清样本，进行检测，获得了血清中HE4的浓度值，绘制散点图。
测定结果图4所示，该试剂盒测定的病人和正常人的血清中HE4的浓度值，具有明显差异性，病人血清中HE4的浓度均值明显高于血清中HE4的浓度均值。该试剂盒是一种较好的HE4浓度测定试剂盒。
本发明公开了人附睾蛋白4(HE4)的化学发光酶免疫(CLEIA)定量测定试剂盒，试剂盒用于检测卵巢癌病人血清中的HE4蛋白的浓度，适用于卵巢癌的辅助诊断，对于监测疾病状态、反映治疗疗效、早期发现、癌症复发检查有所裨益。该试剂盒的拟合标准曲线相关系数可达r＝0.9999，大于0.9900；准确性结果相对偏差为3.06％，小于10％；检测限为1.84pmol/L；线性考察，浓度值拟合直线的相关系数r＝0.999，相关系数大于0.9900；重复性结果的变异系数CV均小于10％；在应用于临床样本的检测中能够明显的区分正常人和病人。该试剂盒展示了良好的准确性、线性、重复性、最低检测限，具有良好的测定血清中的HE4蛋白的浓度的能力，可作为检测卵巢癌的辅助诊断。本发明的试剂盒在2～8℃干燥避光可保存6个月，在2～8℃条件下运输72小时可保持性能稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人附睾蛋白4化学发光酶免疫定量测定试剂盒，包括盒体、设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂，其特征在于：化学发光板包被有抗HE4的抗体；试剂包括：HE4系列标准品溶液，HE4系列质控品溶液，样本稀释液，生物素标记抗HE4抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的链酶亲和素，酶稀释液，化学发光溶液A、B液，浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的化学发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板，各孔包被有抗HE4的抗体，抗体包被浓度为5.0 μg/mL。
3.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：试剂盒的检测样本为人血清样本。
4.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：HE4系列标准品溶液浓度分别为：0、50、70、250、500、1800 pmol/L。
5.根据权利要求4所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：HE4系列质控品溶液浓度分别为：250±80、70±14pmol/L。
6.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：生物素标记抗HE4抗体由HE4抗体与生物素偶合制成，并作为检测抗体。
7.根据权利要求5所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：浓缩洗涤液是含有体积分数0.05 %吐温-20的pH=7.4，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求7所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：化学发光溶液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；化学发光溶液B液为每 100 mL溶液含柠檬酸2.1g，无水 Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲 0.64mL 的水溶液，所述百分比为质量百分比。
9.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：
HE4标准品溶液：将HE4抗原纯品用抗原稀释液配制成浓度分别为0、50、70、250、500、1800 pmol/L的HE4系列标准品溶液；
HE4质控品溶液：将HE4抗原纯品用抗原稀释液配制成浓度分别为250、70 pmol/L的质控品溶液；
生物素标记抗HE4抗体：将生物素与抗体进行偶联透析后获得的生物素标记抗HE4抗体，用抗体稀释液稀释成1:2000 的工作浓度作为检测抗体；
抗原稀释液：为含有BSA，蔗糖的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.4，是每升含有20 gBSA，50 g蔗糖，8 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，1.44 g Na2HPO4的水溶液；
抗体稀释液：为含有蔗糖的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.4，是每升含有50 g蔗糖，8g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，1.44 g Na2HPO4的水溶液；
化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为 0.01M、对甲苯酚含量为 0.001M，pH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲 0.64mL 的水溶液；
浓缩洗涤液：按体积分数0.05%将吐温-20添加至pH=7.4， 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中；
包被溶液：1.59 g 碳酸钠和 2.53 g 碳酸氢钠溶于1 L水中，调节pH=9.5；
封闭溶液： 10 g BSA 溶于 1L 洗涤溶液中，再加入重量比为 5‰的 P300；
标记液：1.59 g 碳酸钠和 2.53 g 碳酸氢钠溶于1 L水中，调节pH=9.5；
透析液：0.24 g磷酸二氢钠、1.44g磷酸氢二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾溶于1L水中，调节PH=7.4。
10.权利要求1-9任意一项所述的人附睾蛋白4化学发光酶免疫检测试剂盒作为卵巢癌的辅助诊断、监测疾病状态、反映治疗疗效的试剂的应用。
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