CN104730249A - 一种检测人附睾分泌蛋白4的酶联免疫试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人附睾分泌蛋白4(HE4)双抗夹心法检测试剂盒,主要包括抗HE4小鼠单克隆包被抗体,酶标HE4兔多克隆抗体以及重组表达的HE4蛋白标准品。本发明可以用于定性或定量检测样本中的HE4水平,优点是检验方法方便易行,检测灵敏度和准确度高、特异性强、能够同时快速检测大批样本。本发明通过定量检测肿瘤标志物HE4,能够为卵巢癌的早期诊断和疾病监测提供有效方法,同时在临床研究中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及酶联免疫分析技术领域中的一种检测人附睾分泌蛋白4的酶联免疫试剂盒。
背景技术
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤,发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌而列居第二位,由于其发病隐匿,难被早期发现,预后凶险,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。现阶段的筛查方法主要有妇科检查、肿瘤标志物及影像学检查等。通过肿瘤标志物进行的血清学诊断检测简便且无创,而且较之影像学可明显前移卵巢癌诊断窗口期,在肿瘤的筛查、诊断、指导治疗、估计预后等方面有着非常广泛的运用前景。
就卵巢癌而言,目前只有癌抗原125(CA125)检测被广泛应用于临床卵巢癌的诊断。大量的研究表明,CA125水平的升降与卵巢癌的发生、发展及消退有关。但是,CA125在检测卵巢癌时仍有不足:首先,假阳性率高,在其他癌症、子宫内膜异位症、盆腔炎症等妇科良性疾病及生理条件下(如月经、妊娠)中也可出现阳性表达;其次,I期卵巢癌仅有50%-60%的患者CA125值升高,单用CA125诊断阳性率<10%,联合其他检测手段如联合超声,也只可将阳性诊断率提高到20%,因此,需要一种灵敏性和特异性较强的标志物来提高卵巢癌的诊断水平。
人附睾分泌蛋白4(human epididymis protein4,HE4,又名WFDC2),其基因的cDNA最早由Kiehhof等首先从附睾的上皮远端分离出来,其编码的蛋白质主要由WAP类型的4个二硫键核心(WFDC)组成。2003年,Hellstrom等人比较卵巢癌患者及正常人血清中的HE4蛋白含量,发现大多数卵巢癌患者血清中的HE4蛋白量明显提高,而正常组织及良性疾病中含量很低,确定HE4作为一个潜在血清肿瘤标记物来鉴别卵巢癌。2008年,Moore等人的出HE4诊断卵巢癌的敏感性高达72.9%、特异性达95%的结论,无论在特异性还是敏感性都明显优于CA125。目前,国外已经有HE4诊断试剂盒应用于卵巢癌的早期诊断和病程监测,进一步证实和扩展其应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测灵敏度高、准确性强、低成本的人HE4双抗夹心法检测试剂盒。
本发明所提供的检测试剂盒包括特异性的HE4包被抗体,酶标HE4检测抗体以及人HE4蛋白标准品。
其中所述HE4包被抗体为单克隆抗体,所述酶标HE4检测抗体为单克隆抗体或多克隆抗体,所述单克隆抗体可以为鼠源或兔源抗体,所述多克隆抗体可以为兔源、羊源、马源抗体,所述包被用单克隆抗体优选为鼠单克隆抗体,其轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,所述酶标检测抗体优选为兔多克隆抗体。所述人HE4蛋白标准品为人293细胞表达的具有生物活性的重组人HE4蛋白。
所述单克隆抗体采用重组人HE4蛋白免疫动物,利用杂交瘤技术制备获得。所述多克隆抗体采用重组人HE4蛋白免疫动物,通过蛋白A纯化和抗原亲和纯化技术制备获得。酶标抗体按照常规方法利用辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)标记抗体获得。所述重组人HE4蛋白是经人293细胞表达后纯化获得。
本发明的技术方案为优选具有高灵敏度、高特异性的单克隆抗体与酶标多克隆抗体配对组合,将单克隆抗体作为包被抗体吸附于固相载体上,包被抗体可以特异性的捕获样本中的HE4以及HE4蛋白标准品,加入酶标检测抗体后,形成包被抗体、抗原、检测抗体复合物,相应底物显色后终止,读取样本吸光值,通过与标准曲线比较即可得出HE4的含量。
本发明采用双抗夹心法定量或定性检测样本中的HE4水平,检验方法方便易行,检测灵敏度和准确度高、特异性强、能够同时快速检测大批样本,制备抗体所需免疫原和筛选抗原以及试剂盒中的蛋白标准品全部采用具有生物活性的重组人HE4蛋白,试剂盒主要组成部分的抗体和蛋白标准品均为自主研发,因此成本低,可靠性强,预计将在HE4相关基础和临床研究中发挥重要作用。
附图说明
图1重组人附睾分泌蛋白4电泳鉴定图
图2人附睾分泌蛋白4酶联免疫试剂盒检测标准曲线图
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步的描述和说明。
实施例1酶联免疫试剂盒的组分制备
1.人HE4蛋白小鼠单克隆抗体的制备:
1)动物免疫
采用Balb/c小鼠作为免疫动物,以北京义翘神州生物技术有限公司生产的具有生物学活性的重组人HE4蛋白为免疫原,免疫剂量为50μg/只,首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂,腹部皮下多点注射,间隔2-3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂,加强免疫两次,三次免疫后测定血清效价,取血清效价高的小鼠腹腔加强免疫一次,4天后取脾细胞进行融合。
2)细胞融合和克隆化
取免疫小鼠脾细胞,按4:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞混合,利用聚乙二醇法进行融合,获得杂交瘤细胞。采用重组人HE4蛋白作为包被抗原,用ELISA法测定细胞上清液,选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化,直至得到稳定分泌TNF特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3)单克隆抗体的生产与纯化
选取杂交瘤细胞株,利用培养瓶或生物反应器进行细胞培养,收集细胞培养上清,利用蛋白A进行亲和纯化,鉴定抗体纯度和浓度后分装,于-20℃低温保存。
4)单克隆抗体的序列测定
收集培养的细胞,按照说明书(Invitrogen)加入TRIzol,提取总RNA,电泳检测RNA质量,UV测定浓度。按Roche反转录试剂盒操作说明反转为cDNA,-20℃冻存备用。参考文献设计引物,以cDNA为模板分别PCR获得抗体的轻链和重链片段。将轻链和重链片段TA到可用于真核细胞表达的pcDNA3T载体上,转化大肠杆菌,挑取阳性克隆,测序鉴定。分析测序结果,获得正确的轻链和重链氨基酸序列SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2。
2.人HE4蛋白兔多克隆抗体的制备:
采用新西兰大白兔作为免疫动物,以重组人HE4蛋白为免疫原,免疫剂量为500μg/只,首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂,颈背部皮下多点注射,间隔2-3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂,加强免疫一次,共免疫四次,测定血清效价,心脏取血,经蛋白A和HE4蛋白抗原亲和纯化后得到纯化的多克隆抗体。
3.酶标抗体的制备:
1)称取5mg HRP溶解于0.5ml蒸馏水中。
2)于上液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。
3)将上述溶液装入透析袋中,对1mM的醋酸钠缓冲液(pH4.4)透析,4℃过夜。
4)加0.2M碳酸盐缓冲液(pH9.5),使以上醛化HRP的pH升高到9.0~9.5,然后立即加入5mg IgG在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时。
5)加0.2ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,于4℃放置2小时。
6)将上述液装入透析袋中,于pH7.4,0.15M的PBS透析,4℃过夜。
实施例2检测人HE4的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测人HE4的酶联免疫试剂盒,包含以下试剂:
1)小鼠抗人HE4单克隆包被抗体;
2)HRP标记的兔多克隆抗体;
3)重组人HE4蛋白标准品;
4)包被缓冲液为pH7.4,0.1mol/L的磷酸盐缓冲液;
5)封闭液是含有2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液;
6)样品稀释液为含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液;
7)浓缩洗涤液为含有2%吐温的Tris缓冲液或含有2%吐温的磷酸盐缓冲液洗涤液;
8)显色液A和显色液B组成,显色液A为过氧化氢或过氧化脲,显色液B为四甲基联苯;
9)终止液为2mol/L的硫酸。
实施例3检测人HE4的酶联免疫试剂盒的制备
1.利用正交试验摸索酶联免疫试剂盒的最佳抗体浓度
按照紫外分光光度计法,测定抗体及抗原的浓度。采用正交试验方法,将抗HE4单克隆抗体稀释至浓度为4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml,重组HE4蛋白浓度稀释至1000pg/ml、100pg/ml、0pg/ml,HRP标记的抗HE4兔多克隆抗体稀释浓度至2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml。综合考虑背景及重组蛋白的光吸收值,选择抗体的包被浓度为2μg/ml,HRP标记抗体的工作浓度为0.5μg/ml。
2.试剂盒的批量制备
1)包被酶标板:用磷酸盐包被缓冲液(称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,用纯化水溶解并定容至1L,调pH值为7.4),将抗HE4抗体稀释至浓度为2μ g/ml,100 μL/孔,包被96孔酶标板,4℃孵育过夜。
2)封闭:倒去未包被的液体,拍干酶标板。加入300μl封闭液封闭非特异性结合位点,室温孵育2小时。拍干后,用真空包装机包装,4℃保存备用。
3)蛋白标准品的制备:用含0.5%BSA的PBS稀释重组人HE4蛋白,分装后冻干,4℃保存备用。
4)酶标抗体的制备:将亲和纯化后的抗HE4多抗用HRP标记,加入50%甘油,分装后-20℃保存备用。
实施例4试剂盒主要参数的测定
对影响试剂盒质量的主要参数包括特异性、灵敏度和精密度进行测定,具体方法和结果如下:
1.试剂盒的特异性:将重组的人EGF、TNFa、IL33、AFP、TIMP1、BAFF、HGF、TGF-β1、γ-IFN和IGF1稀释至100ng/ml,用人TNF酶联免疫检测试剂盒测试,试验结果证明,该试剂盒与100ng/ml的人EGF、TNFa、IL33、AFP、TIMP1、BAFF、HGF、TGF-β1、γ-IFN和IGF1无交叉反应。
2.试剂盒的灵敏度
1)将HE4蛋白用含0.1%BSA的PBST稀释成,182PM,91PM,45.5PM,22.8PM,11.4PM,5.7PM,2.8PM,0PM,100μl/孔加入到上述包被好的酶标板中,其中0PM浓度20个重复,5.7PM浓度10个重复,室温孵育2小时。PBST洗板3遍。
2)将HPR标记抗体用含0.1%BSA的PBST稀释至0.5μg/ml,100μl/孔加入反应孔中,室温孵育1小时。PBST洗板3遍。
3)加入200μ1新鲜配置的TMB底物,室温避光显色20分钟,加入50μl2M硫酸终止反应,酶标仪450nm波长的下读值。
4)根据0PM的标准差(SD0),5.7PM的浓度值及OD平均值减去0PM的OD平均值,按照下面公式计算:最低检出限=3SD0/(/低浓度质控品浓度)。HE4酶联免疫试剂盒的检出限<2PM,说明本试剂盒有较高的检测灵敏度。
3.试剂盒的精密度测定
1)重复性实验
选择4份含有不同HE4浓度的血清样品,每个样品5个重复,平行在3块酶标板检测,各板分别设置标准品对照曲线,分别计算每个检测结果的变异系数(C.V),平均变异系数为4.7%(见表1)。
表1HE4ELISA试剂盒的重复性实验
2)中间精密度实验
选择5份含有不同HE4浓度的血清样品,每个样品5个重复,重复检测6次,每次板内设置标准品对照曲线,计算同一份样品6次检测结果间的变异系数(C.V),6份样品5次检测结果的变异系数平均为8.2%(见表2)。
表2HE4试剂盒的中间精密度实验
4.试剂盒的回收率测定
将HE4重组蛋白加入到50例正常人血清标本等比例混合制备的混合人血清中,对样本进行稀释,测定HE4含量。回收率=((测得的HE4含量-内源HE4含量)/加入的HE4含量)×100%。计算本试剂盒的回收率为100±20%,实验结果见表3。
表3HE4试剂盒的回收率测定
5.试剂盒线性检测
取2份待检血清样本,做1∶2、1∶4、1∶8和1∶16稀释,分别检测HE4的含量,计算各自回收率,回收率在93-103%之间,实验数据如表4。
表4HE4试剂盒的回收线性评测
实施例5HE4酶联免疫试剂盒的检测步骤
1.样品的收集、处理和保存
1)细胞培养上清液:1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物,将上清收集-20℃保存备用。
2)血清:静脉采血,使用不含热源和内毒素的试管收集血液后,4℃1000×g离心15分钟,避免溶血,收集血清,-20℃保存备用。
3)血浆:静脉采血,使用EDTA试管收集血液,4℃1000×g离心15分钟,去除细胞和颗粒,-20℃保存备用。
2.加样
1)取出包被好的酶标板及冻干的标准品,加1ml含0.1%BSA的PBST将标准品溶解。室温下放置10分钟。将标准品从2000pg/ml起,做2倍的倍比稀释,稀释6个点,将稀释液各取100μl按照下表的顺序加入96孔酶标板中。
2)取待测血清或血浆样本,100μL/孔加入反应孔中。
3)室温孵育2小时。洗液200μL/孔洗板3次,拍干酶标板。
3.加入检测抗体
将HRP标记抗体用0.1%BSA的PBST稀释至0.5ug/ml,100μl/孔加入反应孔中。室温孵育1小时。洗液200μl/孔洗板3次,拍干酶标板。
4.显色
加入200μL新鲜配制的TMB显色液,室温反应20分钟。加入50μL2M硫酸终止反应。酶标仪450nm波长的下读值。
5.标准曲线的建立
以标准品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标建立对数曲线(图2)。将测得的样品OD值代入公式,算出样品中的HE4含量。
实施例6HE4酶联免疫试剂盒的应用
本试剂盒检测60例女性血清中的HE4含量,其中34例正常人血清,16例良性妇科疾病病人血清,其中正常人血清HE4含量均小于600PM,15例良性妇科疾病病人血清HE4含量小于600PM,10卵巢癌患者血清HE4含量均大于1200PM。本检测结果与临床背景有很高的一致性,符合已有的文献研究资料。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然,本发明不限于以上实施例子,还可以有许多变型。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变型,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测人附睾分泌蛋白4的检测试剂盒,其特征在于,包括以识别人附睾分泌蛋白4的单克隆抗体作为捕获抗体,以识别人附睾分泌蛋白4的单克隆抗体或多克隆抗体作为检测抗体,以重组表达的人附睾分泌蛋白4作为抗原标准品。
2.权利要求1所述的抗原标准品为哺乳细胞表达的重组人附睾分泌蛋白4。
3.权利要求2所述的抗原标准品为293细胞表达的重组人附睾分泌蛋白4。
4.权利要求1所述的捕获抗体为小鼠单克隆抗体或兔单克隆抗体。
5.权利要求4所述的捕获抗体为小鼠单克隆抗体。
6.权利要求5所述的小鼠单克隆抗体,特征在于其轻链和重链氨基酸序列分别为SEQID NO:1,SEQID NO:2。
7.权利要求1所述的检测抗体为小鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体。
8.权利要求7所述的检测抗体为兔多克隆抗体。
9.权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,包括包被液、封闭液、浓缩洗涤液、稀释液、显色液和终止液。
10.权利要求9所述包被缓冲液为pH7.40.1mol/L的磷酸盐缓冲液;所述封闭液是含有2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液;所述浓缩洗涤液为含有2%吐温的磷酸盐缓冲液或含有2%吐温的Tris缓冲液;所述样品稀释液为含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液;所述显色液A和显色液B组成,显色液A为过氧化氢或过氧化脲,显色液B为四甲基联苯胺;所述终止液为2mol/L的硫酸。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150624 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |