CN109239352A - 细胞上清的总蛋白定量检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了细胞上清的总蛋白定量检测试剂盒及其制备方法与应用。该用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒,包括标准品包被的酶标板和考马斯亮蓝G250染色液，所述标准品包被的酶标板按照包括下述步骤的方法制备：将牛血清白蛋白用溶剂配制成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。本发明实现了快速、灵敏和准确地检测液体中的总蛋白含量，可用于生物化妆品制备，抗体制备，中药刺激细胞产生分泌物领域中的细胞培养上清液中的蛋白质含量的检测。

Description

细胞上清的总蛋白定量检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及蛋白质含量检测领域中一种细胞上清的总蛋白定量检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，每一条多肽链有二十至数百个氨基酸残基不等；各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16.3％，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.8kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质的不同在于其氨基酸的种类、数目、排列顺序和肽链空间结构的不同。蛋白质是机体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和修补的主要原料。人体的每个组织：毛发、皮肤、肌肉、骨骼、内脏、大脑、血液、神经、内分泌等都是由蛋白质组成。
细胞培养上清液含有丰富多彩的分泌蛋白，比如：酶、抗体、蛋白质类的激素、细胞因子等。细胞因子是可溶性蛋白，是机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，是由活化细胞分泌的具有高活性、多功能的主要介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽，通过结合细胞表面的相应受体发挥生物学作用，具有调节固有免疫和适应性免疫应答，促进造血，以及刺激细胞活化，增殖，分化等功能。由于基因工程、细胞工程研究的飞速发展，不仅克隆了早先发现的生物活性肽的cDNA，而且发现了许多新的细胞因子，并对各种细胞因子产生来源、分子结构和基因、相应的受体、生物学功能以及与临床的关系等进行了大量的研究，成为当今基础免疫学和临床免疫学研究中一个活跃的领域。细胞因子对人类许多常见病、多发病及传染性疾病的治疗作用，已经不是传统疗法(化学药物治疗、放射治疗、手术治疗等)所能比拟的。细胞因子的发现、合成及其有关生物学特性已经或将要继续不断被阐明，愈来愈多的细胞因子得以商品化。比如：生物化妆品，制备抗体，中药刺激细胞产生分泌物研究领域等。
生物化妆品是指应用生物工程技术及其制品制得的化妆品，其主要成分生物活性多肽大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接或间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。细胞生长因子经过稳定的结构修饰或特殊的保护处理后，以一定的有效浓度添加到化妆品中，可以有效地与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞营养代谢，保护皮肤，预防由于各种原因导致的皮肤损伤。正常护肤品中添加活性细胞生长因子还可以有效地促进皮下胶原细胞的功能，加速皮肤胶原细胞的生长，使细胞加速分泌胶原，从而达到抗皱及延缓衰老的作用。
由免疫反应抗原刺激机体后，产生的特异性反应，包括细胞免疫、体液免疫，表现为免疫细胞分裂繁殖，产生淋巴因子，合成并分泌抗体。对于免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体。
由细胞自体产生的分泌蛋白，或由于药物或外来条件刺激细胞产生的分泌到培养基中蛋白质目前已经越来越多的商品化，研发测定细胞培养上清液中总蛋白含量的检测试剂盒可以更好的监测这类产品的质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速、灵敏和/或准确地测定细胞培养上清液中的总蛋白质含量。
为了解决以上技术问题，本发明提供了测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒。
本发明所提供的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒,包括标准品包被的酶标板和考马斯亮蓝G250染色液，所述标准品包被的酶标板按照包括下述步骤的方法制备：将牛血清白蛋白用溶剂配制成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
上述试剂盒中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液可为将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于水(如双蒸水)中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。
上述试剂盒中，所述N种溶液可为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的溶液。
制备上述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的制备上述试剂盒的方法，可包括如下制备标准品包被的酶标板的步骤：将牛血清白蛋白用溶剂配置成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
上述方法中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液可为将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于水(如双蒸水)中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。
上述方法中，所述N种溶液可为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的溶液。
上述方法中，所述方法还包括将考马斯亮蓝G250染色液和所述标准品包被的酶标板单独包装后装入试剂盒得到用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的步骤。
上文中，包被所述酶标板可在4℃放置8-12小时。
上述试剂盒在检测细胞培养上清液中的蛋白质含量中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述检测细胞培养上清液中的蛋白质含量可为检测检测细胞培养上清液中的总蛋白质含量。
上述应用中，所述细胞可为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
上述应用中，所述动物细胞可为哺乳动物细胞，如鼠或人。
上述应用中，所有应用的直接目的可以是非疾病治疗目的、非疾病预后目的和/或非疾病诊断目的。
本发明根据考马斯亮蓝法(Bradford法)开发了用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒，其原理是考马斯亮蓝(Coommassie Brilliant Blue)G-250与蛋白质的碱性和芳香族氨基酸特别是精氨酸(Arginine)在酸性介质中结合后，溶液转变为蓝色，溶液最大吸收峰从465nm迁移到595nm，颜色的变化与蛋白质浓度成正比。因此，可通过检测595nm处的吸光度对溶液中蛋白质浓度进行测定。众所周知，蛋白质的不稳定性在很大程度上限制了其广泛的应用，其影响因素较多，主要是pH，无机盐和有机溶剂等通过改变蛋白质的物理、化学性质，进一步对其稳定性造成不同程度的影响。因此，研究pH，无机盐和有机溶剂对蛋白质稳定性的影响及其热稳定性实验(37℃加速试验)对该试剂盒是至关重要的。本发明采用上述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液作为溶剂制备牛血清白蛋白包被的标准品包被的酶标板，实现了快速、灵敏和准确地检测液体中的总蛋白含量。本发明可用于生物化妆品制备，抗体制备，中药刺激细胞产生分泌物领域中的细胞培养上清液中的蛋白质含量的检测。
附图说明
图1为标准曲线。
图2为用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测人脐带间充质干细胞培养上清液及不同滤膜处理样品中的蛋白质含量的差异显著性分析。
图3为用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的热稳定性实验的各处理组的回归曲线。
图4为蛋白质含量随pH的变化曲线。
图5为蛋白质含量随氯化钠浓度的变化曲线。
图6为蛋白质含量随硫酸铵浓度的变化曲线。
图7为蛋白质含量随乙腈浓度的变化曲线。
图8为蛋白质含量随甲醇浓度的变化曲线。
图9为蛋白质含量随葡萄糖浓度的变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的制备
本实施例提供的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒，组成为：一块标准品包被的酶标板和考马斯亮蓝G250染色液25ml。
标准品包被的酶标板的制备方法如下：将牛血清白蛋白用溶剂配制成牛血清白蛋白浓度不同的8种溶液，将该8种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；该溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
该pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液是将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于双蒸水中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。
牛血清白蛋白浓度不同的8种溶液为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的溶液。
该用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的具体制备方法如下：
1)标准品包被的酶标板的制备
将牛血清白蛋白(北京普利莱基因技术有限公司的标准蛋白(4mg/ml BSA),产品编号为P1512)用上述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液稀释成牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的8种溶液。将这8种溶液每种溶液加入酶标板(96孔板)孔内，每孔加入100ul，每种溶液3个副孔，4℃放置过夜。次日，将每孔100ul的液体弃掉，尽量吸干，得到标准品包被的酶标板，将加入该8种溶液的孔称为标准品孔。
2)考马斯亮蓝G250染色液的制备
考马斯亮蓝G250染色液按照如下方法配制：将100mg考马斯亮蓝G-250(美国Biorad公司产品)溶于50ml 95％乙醇溶液，加入100ml 85％的磷酸溶液，然后，用蒸馏水补充至1000ml，得到考马斯亮蓝G250染色液。该考马斯亮蓝G250染色液在4℃保存。
3)包装得到用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒
将标准品包被的酶标板和考马斯亮蓝G250染色液25ml分别独立包装后放入同一个试剂盒，得到用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒。
实施例2、实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的灵敏度
向按照实施例1的方法制备的标准品包被的酶标板的每个标准品孔内加入考马斯亮蓝G250染色液，每孔250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值，可以立即测定吸光度，也可以在2小时内测定，2小时内检测数据无显著变化。根据595nm处的吸光度值和标准品的浓度建立标准曲线(图1)。请配合参阅图1所示，以吸光度(Y)为纵坐标，牛血清白蛋白质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝0.1131X+0.3494(R2＝0.9972)且线性关系好(样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.99以上，则此标准曲线才具有有效性和稳定性，样品的检测数据具有准确性。
该标准曲线的线性范围为0.1mg/ml～4.0mg/ml。以上结果表明，该用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒可以灵敏地检测蛋白含量。
实施例3、用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测人脐带间充质干细胞培养上清液中的蛋白质含量
将从满月自然分娩的胎儿脐带血中分离的人脐带间充质干细胞在无血清培养基中在37℃培养箱连续培养4代，每代培养3天小时，在人脐带间充质干细胞培养第四代结束时，对该细胞培养液进行离心，收集上清液，得到细胞培养上清液(简称细胞上清，即细胞上清原液)。将该细胞上清原液在实施例1中的pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液中进行截留分子量为100kD的超滤膜浓缩，保留截留液(即细胞上清100kD渗透液)，此过程可以滤除100kD以上的蛋白；同时收集透过液(即100kD透过液)。再将细胞上清100kD渗透液在实施例1中的pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液中进行截留分子量为3kD的超滤膜浓缩，保留截留液(即3kD渗透液)，此过程主要去除氨基酸类、维生素类、无机盐、微量元素等，同时收集透过液(即3kD透过液)。将3kD渗透液经过0.22μm过滤，得到的浓缩液即为富含间充质干细胞分泌因子的精华液(简称3kD截留液除菌)。将超滤杯经在实施例1中的pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液冲洗得到超滤杯清洗液留样。
将细胞上清原液、细胞上清100kD渗透液、100kD透过液、3kD渗透液、3kD透过液、超滤杯清洗液留样和3kD截留液除菌分别作为样品，用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测各样品的蛋白质含量。具体方法如下：
向按照实施例1的方法制备的标准品包被的酶标板的空白孔(未包被牛血清白蛋白的孔)内加样品，每种样品5ul，每种样品三个复孔，将这些孔称为样品孔,向每个样品孔和每个标准品孔内加入考马斯亮蓝G250染色液，每孔250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)，可以立即测定吸光度，也可以在2小时内测定，2小时内检测数据无显著变化。根据标准品孔的595nm处的吸光度值和标准品的浓度建立标准曲线。以吸光度(Y)为纵坐标，牛血清白蛋白质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线Y＝0.2618X+0.7252(R2＝0.9972)，其线性关系好。根据标准曲线测定各个样品的蛋白质含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.7252)/0.2618，算出X为各个样品对应的浓度值。结果如表1所示。
表1.不同样品的OD595nm和蛋白质含量
细胞上清100kD渗透液和细胞上清原液相比具有显著差异性(***P<0.0001,t-tset)；3kD渗透液和3kD截留液除菌之间也具有显著差异性(**P＝0.0017,t-tset)(图2)。通过此试剂盒可以制定快速、合理、有效的生产工艺流程图。
同时采用凯氏定氮法(Kjedahl法)测定细胞上清原液、细胞上清100kD渗透液、100kD透过液、3kD渗透液、3kD透过液、超滤杯清洗液留样和3kD截留液除菌这8种样品的蛋白质含量，结果与用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测各样品的蛋白质含量的结果一致(表2)，说明实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒测定蛋白质含量准确。
表2.凯氏定氮法测定的不同样品的蛋白质含量
由间充质干细胞分泌到胞外的细胞因子主要含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、类胰岛素生长因子、细胞间粘附分子和中性粒细胞胞浆因子等。这些因子可以得到富含间充质干细胞分泌细胞生长因子和小分子多肽的原生蛋白美容产品。培养基上清中除以上物质外，还含有部分易于造成皮肤过敏的氨基酸类、维生素类、无机盐类、微量元素、葡萄糖、酚红等等。利用超滤法截留起到美容效果的细胞因子，将易于引起过敏的小分子物质滤掉，得到富含间充质干细胞分泌细胞生长因子和小分子多肽的原生蛋白美容产品。
实施例4、用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测分泌小鼠单克隆抗的鼠杂交瘤细胞培养上清液中的蛋白质含量
将分泌不同小鼠单克隆抗体的8种鼠杂交瘤细胞(其名称分别为鼠杂交瘤细胞1、鼠杂交瘤细胞2、鼠杂交瘤细胞3、鼠杂交瘤细胞4、鼠杂交瘤细胞5、鼠杂交瘤细胞6、鼠杂交瘤细胞7和鼠杂交瘤细胞8)分别在培养基中在37℃培养箱培养3代，每代培养3天，得到第3代8种鼠杂交瘤细胞培养液，对该8种鼠杂交瘤细胞培养液分别进行离心，分别收集上清液，得到鼠杂交瘤细胞1培养上清液、鼠杂交瘤细胞2培养上清液、鼠杂交瘤细胞3培养上清液、鼠杂交瘤细胞4培养上清液、鼠杂交瘤细胞5培养上清液、鼠杂交瘤细胞6培养上清液、鼠杂交瘤细胞7培养上清液和鼠杂交瘤细胞8培养上清液这8种待检测样品。用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测这8种待检测样品的蛋白质含量。具体方法如下：
向按照实施例1的方法制备的标准品包被的酶标板的空白孔(未包被牛血清白蛋白的孔)内加待检测样品，每种待检测样品5ul，每种待检测样品三个复孔，将这些孔称为样品孔,向每个样品孔和每个标准品孔内加入考马斯亮蓝G250染色液，每孔250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)。根据标准品孔的595nm处的吸光度值和标准品的浓度建立标准曲线。以吸光度(Y)为纵坐标，牛血清白蛋白质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线Y＝0.376X+0.5375(R2＝0.9902)，其线性关系好。根据标准曲线测定各个待测样品中的蛋白质含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.5375)/0.376，算出X为各个样品对应的浓度值。结果如表3所示。
表3.不同样品的OD595nm和蛋白质含量
同时采用凯氏定氮法(Kjedahl法)测定上述8种待检测样品的蛋白质含量，结果与用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测各待检测样品的蛋白质含量的结果一致(表4)，说明实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒测定蛋白质含量准确。
表4.凯氏定氮法测定的不同样品的蛋白质含量
实施例5、用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的热稳定性实验(37℃加速试验)
将按照实施例1的方法制备的24个用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒，随机分为8组，每组3个试剂盒。该8组分别为：4℃放置0天组、37℃放置1天组、37℃放置2天组、37℃放置3天组、37℃放置4天组、37℃放置5天组、37℃放置6天组、37℃放置7天组，将这8组分别在4℃放置0天、37℃放置1天、37℃放置2天、37℃放置3天、37℃放置4天、37℃放置5天、37℃放置6天和37℃放置7天后，向每组的每个试剂盒中的标准品包被的酶标板的每个标准品孔内加入考马斯亮蓝G250染色液250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)，根据595nm处的吸光度值和标准品的浓度建立标准曲线(图3)。请配合参阅图3所示，以吸光度(Y)为纵坐标，牛血清白蛋白质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线。4℃放置0天组的回归方程Y＝0.1131X+0.3494(R2＝0.9972)且线性关系好(图3中的4℃曲线)；37℃放置1天组的回归方程Y＝0.1115X+0.3376(R2＝0.9961)且线性关系好(图3中的37℃1D曲线)；37℃放置2天组的回归方程Y＝0.1230X+0.3222(R2＝0.9901)且线性关系好(图3中的37℃2D曲线)；37℃放置3天组的回归方程Y＝0.1191X+0.3132(R2＝0.9903)且线性关系好(图3中的37℃3D曲线)；37℃放置4天组的回归方程Y＝0.06305X+0.3076(R2＝0.6389)且线性关系不好，因为样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.6389，R值低于0.99，则此标准曲线有效性和稳定性很差(图3中的37℃4D曲线)；37℃放置5天组的回归方程Y＝0.04618X+0.3108(R2＝0.6294)同样线性关系不好(图3中的37℃5D曲线)；37℃放置6天组的回归方程Y＝0.03320X+0.3133(R2＝0.6276)同样线性关系不好(图3中的37℃6D曲线)；37℃放置7天组的回归方程Y＝0.02730X+0.3034(R2＝0.6997)同样线性关系不好(图3中的37℃7D曲线)。蛋白质在37℃条件下放置7天的加速实验为验证蛋白质的有效性和稳定性，一般认为37℃放3天相当于4℃放半年，37℃放7天相当于4℃放一年，由此可以看出实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒4℃稳定性为6个月。
实施例6、用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测在干细胞基础培养基中添加中药柴胡皂苷得到的分化培养基培养脂肪干细胞得到细胞上清中总蛋白质含量
在无血清基础培养基中加入中药柴胡皂苷、胎牛血清、人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子得到含中药柴胡皂苷分化培养基，该含中药柴胡皂苷分化培养基中，柴胡皂苷的含量为200ug/ml，胎牛血清的体积百分含量为10％，人表皮生长因子的含量为10ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子的含量为50ng/mL。用该含中药柴胡皂苷分化培养基培养脂肪干细胞，使脂肪干细胞能够分化纯度高和增值效率高。该含中药柴胡皂苷分化培养基还可以修复损伤的神经细胞，并消除神经病变。由该含中药柴胡皂苷分化培养基培养脂肪干细胞得到的细胞培养上清液可以作为美容产品-生物化妆品，该细胞培养上清液利用超滤法得到富含表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子等的原生蛋白美容产品。用该含中药柴胡皂苷分化培养基培养脂肪干细胞，收集细胞培养上清液，将该细胞培养上清液经过超滤法获得富含干细胞分泌因子的精华液(细胞培养上清精华液)，将该富含干细胞分泌因子的精华液在37℃条件下放置7天，每天测定其总蛋白含量，用来验证精华液的有效性和稳定性。用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测该含中药柴胡皂苷分化培养基培养脂肪干细胞得到的细胞培养上清精华液的总蛋白质含量，对原生蛋白美容产品的质量和效价起监督和指导作用。将该含中药柴胡皂苷分化培养基培养脂肪干细胞得到的细胞培养上清超滤所得的精华液4℃放置0天后取样用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量、37℃放置1天后取样用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量、37℃放置2天后取样用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量、37℃放置3天后取样用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量、37℃放置4天后取样用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量、37℃放置5天后取样用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量、37℃放置6天后取样用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量和37℃放置7天后取样用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量。检测方法如下：按照实施例1的方法制备的标准品包被的酶标板的空白孔(未包被牛血清白蛋白的孔)内加样品，每种样品5ul，每种样品三个复孔，将这些孔称为样品孔,向每个样品孔和每个标准品孔内加入考马斯亮蓝G250染色液，每孔250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)，可以立即测定吸光度，也可以在2小时内测定，2小时内检测数据无显著变化。根据标准品孔的595nm处的吸光度值和标准品的浓度建立标准曲线。以吸光度(Y)为纵坐标，牛血清白蛋白质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线Y＝0.3346X+0.4896(R2＝0.9971)，其线性关系好。根据标准曲线测定各个样品的蛋白质含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.4896)/0.3346，算出X为各个样品对应的浓度值。结果如表5所示。结果显示，该含中药柴胡皂苷分化培养基培养脂肪干细胞得到的细胞培养上清超滤所得的精华液在37℃放置7天，每天用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测其蛋白质总量，其检测结果之间无显著性差异性，表明该原生蛋白美容产品有效期为1年。
表5.不同样品的OD595nm和蛋白质含量
对比例1、不同pH值的磷酸缓冲盐溶液对蛋白质含量准确性的影响
将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于水中得到磷酸二氢钾浓度为2mmol/L、磷酸氢二钠浓度为10mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的PBS，分别采用浓盐酸及1.0mol·L-1的氢氧化钠溶液调节PBS的pH值分别为5、6、7.4、8、9、10和11，于4℃放置过夜,得到pH值为5的PBS、pH值为6的PBS、pH值为7.4的PBS、pH值为8的PBS、pH值为9的PBS、pH值为10的PBS和pH值为11的PBS这7个pH梯度的溶液。分别用这7个pH梯度的溶液将牛血清白蛋白(北京普利莱基因技术有限公司的标准蛋白(4mg/ml BSA),产品编号为P1512)稀释至2mg/ml，得到7种样品。将7种样品加入酶标板(96孔板)孔内，每孔加入5ul，每种样品3个复孔，然后各孔依次加入考马斯亮蓝G250染色液250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)，根据标准曲线Y＝0.1131X+0.3494(R2＝0.9972)测定各个样品的含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.3494)/0.1131，算出X为各个样品对应的浓度值，再将各个样品对应的浓度值除以2mg/ml，得出样品的蛋白含量用％定义(图4)。请配合参阅图4所示，在pH为7.4，9时蛋白质含量最高分别是(98％和92％)，在pH为5，6，8，10，11时蛋白质含量低分别是(50％、56％、51％、66％和58％)。这是因为随着pH条件的改变，蛋白质含量变化显著，在5～7，8～9时其蛋白质含量与pH呈正相关，而当7～8，9～11时其蛋白质含量与pH负正相关。pH对蛋白质影响较大，蛋白质分子是两性物质，当样品溶液的pH低于蛋白质等电点时，蛋白质便呈正离子状态；当溶液的pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子则成负离子状态。在等电点附近，水化作用最弱，溶液越不稳定。对于样品的溶解性，要通过调节pH来调整，一般呈碱性。
对比例2、不同浓度的无机盐对蛋白质含量的影响
(1)氯化钠对蛋白质含量的影响
制备氯化钠(氯化钠分析纯，采自国药集团化学试剂有限公司)浓度依次为0，0.5，1，1.5，2.0mol·L-1的氯化钠溶液，计算其氯化钠加入量分别0、0.2922、0.5844、0.8766和1.1688g，加入至10ml的双蒸水内，完毕后，振荡、摇匀，于摇床上摇匀1h，4℃放置过夜。分别用这5个不同浓度的氯化钠溶液将牛血清白蛋白(北京普利莱基因技术有限公司的标准蛋白(4mg/ml BSA),产品编号为P1512)稀释至2mg/ml。另外直接取(氯化钠)生理盐水注射液250ml:2.25g,0.9％相当于氯化钠浓度为0.225mol·L-1，采自石家庄四药有限公司，国药准字H13023201，用该生理盐水注射液也将牛血清白蛋白(北京普利莱基因技术有限公司的标准蛋白(4mg/ml BSA),产品编号为P1512)稀释至2mg/ml。混匀后将样品依次每两个复孔加入酶标板孔内，每孔加样品5ul，然后各孔依次加入考马斯亮蓝G250染色液250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)。根据标准曲线Y＝0.1131X+0.3494(R2＝0.9972)测定各个样品的含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.3494)/0.1131，算出X为各个样品对应的浓度值，再将各个样品对应的浓度值除以牛血清标准蛋白(2mg/ml)得出样品的蛋白含量用％定义(图5)。请配合参阅图5所示，在氯化钠浓度依次为0，0.5，1，1.5，2.0mol·L-1，蛋白质含量分别是(84％，78％，66％，62％和61％),在(氯化钠)生理盐水注射液250ml:2.25g,0.9％相当于氯化钠浓度为0.225mol·L-1时蛋白质的含量为86％。相比之下，(氯化钠)生理盐水注射液溶解蛋白相对良好。无机盐盐溶液浓度与蛋白质含量呈负相关，即蛋白质含量随着氯化钠浓度的增加而减少。随着氯化钠浓度的增大，蛋白质含量降低。
(2)硫酸铵对蛋白质含量的影响
制备硫酸铵(硫酸铵分析纯，采自国药集团化学试剂有限公司)浓度依次为0，0.5，1，1.5，2.0mol·L-1的硫酸铵溶液，计算硫酸铵加入量分别为0、0.6607、1.3214、1.9821和2.6428g，加入至10ml的双蒸水内，完毕后，振荡、摇匀，于摇床上摇匀1h，4℃放置过夜。分别用这5个不同浓度的硫酸铵溶液将牛血清白蛋白(北京普利莱基因技术有限公司的标准蛋白(4mg/ml BSA),产品编号为P1512)稀释至2mg/ml。混匀后将样品依次每两个复孔加入酶标板孔内，每孔加样品5ul，然后各孔依次加入考马斯亮蓝G250染色液250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)。根据标准曲线Y＝0.1131X+0.3494(R2＝0.9972)测定各个样品的含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.3494)/0.1131，算出X为各个样品对应的浓度值，再将各个样品对应的浓度值除以2mg/ml得出样品的蛋白含量用％定义(图6)。请配合参阅图6所示，在硫酸铵浓度依次为0，0.5，1，1.5，2.0mol·L-1，蛋白质含量分别是(84％，78％，73％，57％和42％)。这也是因为无机盐盐溶液浓度与蛋白质含量呈负相关，即蛋白质含量随着硫酸铵浓度的增加而减少。随着硫酸铵浓度的增大，蛋白质含量降低。
由此看出，无机盐盐溶液浓度与蛋白质含量呈负相关，蛋白质含量随着氯化钠和硫酸铵浓度的增加而减少。随着氯化钠或硫酸铵浓度的增大，蛋白质含量降低。蛋白质是由亲水性和疏水性氨基酸组成，其中疏水性氨基酸大部分集中于蛋白质的内部，一小部分分布于蛋白质表面形成不同的疏水区域。在溶剂中，蛋白质分子表面的疏水残基和亲水残基的特征决定其溶解度。虽然在结构上，蛋白质分子上的疏水基团倾向于位于分子内部，剩余部分残基仍会分布在蛋白质分子的表面上，与溶剂发生相互作用。疏水残基对蛋白质的分子行为起了很大的影响作用。
当蛋白质中加入中性盐时，一方面由于盐离子与蛋白质分子中的离子基团作用，降低蛋白质的活度系数，使其溶解度增加。当盐浓度较低时，以这种情况为主，蛋白质表现易于溶解，另一方面，盐与溶液中的水进行水化作用，降低水分子的活度系数，导致蛋白质水合程度的降低，使蛋白质的溶解程度减少。当盐浓度较高时，这种作用起主要作用，蛋白质发生沉淀。
对比例3、不同浓度的有机溶剂对蛋白质含量的影响
(1)乙腈对蛋白质含量的影响
制备乙腈(乙腈分析纯采自天津市福晨化学试剂厂)浓度(体积比)依次为0％，10％，20％，30％，40％，50％的乙腈溶液，计算其加入乙腈量分别为0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，剩余用双蒸水补齐至10ml。加入完毕后，振荡、摇匀，于摇床上摇匀1h，4℃放置过夜。分别用这6个不同浓度的乙腈溶液将牛血清白蛋白(北京普利莱基因技术有限公司的标准蛋白(4mg/ml BSA),产品编号为P1512)稀释至2mg/ml。混匀后将样品依次每两个复孔加入酶标板孔内，每孔加样品5ul，然后各孔依次加入考马斯亮蓝G250染色液250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)。根据标准曲线Y＝0.1131X+0.3494(R2＝0.9972)测定各个样品的含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.3494)/0.1131，算出X为各个样品对应的浓度值，再将各个样品对应的浓度值除以2mg/ml得出样品的蛋白含量用％定义(图7)。请配合参阅图7所示，在乙腈浓度(体积比)依次为0％，10％，20％，30％，40％，50％，蛋白质含量分别是(85％，82％，71％，70％，64％和55％)。有机溶剂体积分数与蛋白质含量呈负相关，即蛋白质含量随着有机溶剂体积分数的增大而减少。随着乙腈浓度的增加，蛋白质含量降低。
(2)甲醇对蛋白质含量的影响
制备甲醇(甲醇分析纯采自天津市福晨化学试剂厂)浓度(体积比)依次为0％，10％，20％，30％，40％，50％的甲醇溶液，计算其加入甲醇量分别为0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，剩余用双蒸水补齐至10ml。加入完毕后，振荡、摇匀，于摇床上摇匀1h，4℃放置过夜。分别用这6个不同浓度的甲醇溶液将牛血清白蛋白(北京普利莱基因技术有限公司的标准蛋白(4mg/ml BSA),产品编号为P1512)稀释至2mg/ml。混匀后将样品依次每两个复孔加入酶标板孔内，每孔加样品5ul，然后各孔依次加入考马斯亮蓝G250染色液250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)。根据标准曲线Y＝0.1131X+0.3494(R2＝0.9972)测定各个样品的含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.3494)/0.1131，算出X为各个样品对应的浓度值，再将各个样品对应的浓度值除以2mg/ml得出样品的蛋白含量用％定义(图8)。请配合参阅图8所示，在甲醇浓度(体积比)依次为0％，10％，20％，30％，40％，50％，蛋白质含量分别是(85％，82％，73％，72％，55％和43％)。有机溶剂体积分数与蛋白质含量呈负相关，即蛋白质含量随着有机溶剂体积分数的增大而减少。随着甲醇浓度的增加，蛋白质含量降低。
(3)葡萄糖对蛋白质含量的影响
将葡萄糖注射液(葡萄糖注射液：规格20ml:10g(50％)，采自山西晋新双鹤药业有限责任公司，国药准字H14022409)(体积比)依次为0％，5％，10％，15％，20％，25％，50％配置，计算其加入葡萄糖注射液量分别为0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，剩余用双蒸水补齐至5ml，50％的浓度为葡萄糖注射液原液。加入完毕后，振荡、摇匀，于摇床上摇匀1h，4℃放置过夜。分别用这6个不同浓度的葡萄糖溶液将牛血清白蛋白(北京普利莱基因技术有限公司的标准蛋白(4mg/ml BSA),产品编号为P1512)稀释至2mg/ml。混匀后将样品依次每两个复孔加入酶标板孔内，每孔加样品5ul，然后各孔依次加入考马斯亮蓝G250染色液250ul。用酶标仪测定595nm处的吸光度值(OD595nm)。根据标准曲线Y＝0.1131X+0.3494(R2＝0.9972)测定各个样品的含量。其中Y值为检测OD值，将OD值代入直线方程得出X＝(OD-0.3494)/0.1131，算出X为各个样品对应的浓度值，再将各个样品对应的浓度值除以2mg/ml得出样品的蛋白含量用％定义(图9)。请配合参阅图9所示，在葡萄糖注射液浓度(体积比)依次为0％，5％，10％，15％，20％，25％，50％，蛋白质含量分别是(85％，84％，82％，69％，66％，52％和40％)。有机溶剂体积分数与蛋白质含量呈负相关，即蛋白质含量随着有机溶剂体积分数的增大而减少。随着葡萄糖浓度的增加，蛋白质含量降低。
由此看出，有机溶剂体积分数与蛋白质含量呈负相关，即蛋白质含量随着有机溶剂体积分数的增大而减少。随着甲醇，乙腈或葡萄糖浓度的增加，蛋白质含量降低。在等电点附近，蛋白质分子主要以偶极离子形式存在，这时如果添加有机溶剂，由于有机溶剂有较低的介电常数，会使溶液的介电常数减小，增强偶极离子之间的静电引力，从而使分子聚集而沉淀。另一方面，有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也促使蛋白质分子脱水而沉淀。有机溶剂降低了水溶液的介电常数，增加了溶质分子电荷间库仑引力，减少了蛋白质溶解度；此外还与溶剂水作用压缩蛋白质分子表面水花层，使蛋白质脱水而相互聚集析出。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒,包括标准品包被的酶标板和考马斯亮蓝G250染色液，所述标准品包被的酶标板按照包括下述步骤的方法制备：将牛血清白蛋白用溶剂配制成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液是将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于水中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述N种溶液为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的溶液。
4.制备权利要求1-3中任一所述的试剂盒的方法，包括如下制备标准品包被的酶标板的步骤：将牛血清白蛋白用溶剂配置成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液是将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于水中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述N种溶液为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的溶液。
7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将考马斯亮蓝G250染色液和所述标准品包被的酶标板单独包装后装入试剂盒得到用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的步骤。
8.权利要求1-3中任一权利要求所述的试剂盒在检测细胞培养上清液中的蛋白质含量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述检测细胞培养上清液中的蛋白质含量为检测细胞培养上清液中的总蛋白质含量。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述细胞为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
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