CN105092857A - 一种蛋白浓度检测试剂盒及其操作方法 - Google Patents

一种蛋白浓度检测试剂盒及其操作方法 Download PDF

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张涛
田方
王巍
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Abstract

本发明涉及适用于蛋白浓度检测领域，提供了一种批量蛋白浓度检测试剂盒及操作方法，试剂盒中包括：96孔酶标板、标准品牛血清白蛋白、A液、B液、清洗液和若干0.5mLEP管。本发明通过试剂盒中溶液之间结合后在一定波长下产生吸光值的原理，用标准品做对照来检测未知蛋白的浓度，并且在96孔酶标板上能实现大规模，快速检测。避免样品检测时间差造成的误差。

Description

一种蛋白浓度检测试剂盒及其操作方法
技术领域
本发明属于分析技术领域。尤其涉及一种蛋白浓度检测试剂盒及操作方法。
背景技术
目前在蛋白浓度检测过程中尤其是利用G-250显色发对蛋白浓度进行检测时，一般采用分光光度计进行检测，对每个样品都要进行单独的检测，而且检测时对每个样品的样品量需要也较大，此种操作方法费时费力，而且对有些宝贵的蛋白样品造成一定量的浪费。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种批量蛋白浓度检测试剂盒及操作方法，可以通过利用较少的样品量在短时间内实现大规模蛋白样品的检测，避免样品检测时间差造成的误差。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种批量蛋白浓度检测试剂盒包括：96孔酶标板、牛血清白蛋白标准品、A液、B液、清洗液和若干0.5mLEP管。
本发明实施例还提供白浓度检测试剂盒操作方法，所述方法包括以下步骤:
(1)用蒸馏水将牛血清白蛋白粉末配置成浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL标准溶液，每种标准溶液配成若干份，分别装在0.5mLEP管中，保存在-20OC冰箱中。
(2)A液和B液需要按照一定的比例进行混合，A液在混合时所占的比例大约为AB混合液总体积的4%-10%。此后AB混合液需在4OC下保存。
(3)取出96孔酶标板，在酶标板的孔内加入10-20微升已知浓度的牛血清白蛋白标准品样品和待测样品，保证每孔的加样量相同。牛血清白蛋白标准品加样浓度为：0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL。
(4)向加过样品的酶标板孔内加入100-180微升的AB混合液，保证每孔加入的混合液量相同，加入后静置5-10分钟。
(5)放入酶标仪中在特定OD595nm波长下或OD450nm和OD630nm叠加波长下进行检测。
(6)检测后将酶标板中的液体倒掉，再在酶标板孔中加入清洗液，加入后手动震荡清洗，倒掉清洗液，反复此步骤2-3次后，再用蒸馏水清洗一次酶标板孔，待酶标板自然晾干后可再次使用。
本发明的优点：本发明降低了待测样品加样量，对珍贵样品检测意义重大，避免浪费。而且可以同时检测最多91个样品，本发明选择酶标仪进行检测，可以同时检测酶标板中所有样品，完全避免常规分光光度计每次检测样品量少导致样品放置时间不同所造成的误差。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是牛血清白蛋白标准曲线。
图2是啤酒酵母不同发酵时间上清液中的蛋白浓度含量。
具体实施方式
1、A液
A液总体积为0.6mL，其中含有0.2mL95%的乙醇，购自天津试剂一厂，0.4mL88%的磷酸，G-250浓度为1.2mg/mL。
2、B液
B液总体积为9.4mL，其中含有8.5mL蒸馏水，0.3mL95%乙醇，0.6mL88%磷酸购自天津试剂一厂。
3、AB混合液的配置
将0.6mL的A液加入到9.4mL的B液中充分混匀备用，AB混合液可放在4℃下长期保存。每次使用前需摇匀。
4、牛血清白蛋白标准溶液的配置
精确称取牛血清白蛋白（购自sigma公司）10mg，用蒸馏水溶解定容至10mL，得到1mg/mL蛋白质溶液。移取1ml浓度为1mg/mL蛋白质溶液，用蒸馏水定容到10mL，得到100μg/mL蛋白质溶液，分别移取1mL、2mL、3mL此蛋白溶液与3支5mL离心管中，分别加入蒸馏水3mL、2mL、1mL混匀，即配置成浓度为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL的牛血清白蛋白标准溶液，将标准溶液分装到若干个0.5mL的EP管（购自fisher公司）中，平时保存在-20OC环境中，使用前将其融化。
5、清洗液
清洗液为无水乙醇。
实例一：测定啤酒酵母在不同发酵时间所产生胞外蛋白含量
取啤酒酵母不同发酵时间发酵液上清，分别取20微升加入到96孔酶标板中。取样时间情况为：12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时。
从冰箱中取出事先配制好的牛血清白蛋白标准溶液，将其融化后将不同浓度的标准溶液分别取20微升加入到96孔酶标板中。
取20微升蒸馏水加入96孔酶标板中作为空白对照。
向加入样品的96孔酶标板孔中分别加入150微升AB混合液，静置5分钟用OD595nm波长的酶标仪进行检测。标准曲线检测结果如表1所示。
根据表1绘制牛血清白蛋白标准曲线图（图1）。
浓度 0μg/mL 25μg/mL 50μg/mL 75μg/mL 100μg/mL
吸光值 0.085 0.138 0.192 0.242 0.294
减去空白后吸光值 0 0.053 0.107 0.157 0.209
表1
根据表1的检测结果以减去空白后的吸光值为横坐标，浓度为纵坐标，利用Excel工作表得出公式如下：
Y=478.8X-0.375
R2=0.999
R2代表公式的线性关系，R2越接近1，说明公式的线性关系越好。
待检测样品检测的结果如表2所示：
样品 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
稀释倍数 1 1 3 4 5 6 7 8
吸光值 0.089 0.228 0.155 0.167 0.180 0.190 0.177 0.177
减去空白后吸光值 0.004 0.143 0.070 0.082 0.095 0.105 0.092 0.092
表2
将减去空白后的吸光值带入到公式中的X后，得到Y即为啤酒酵母不同发酵时间发酵液上清的蛋白浓度，如表3所示。
根据表3绘制不同啤酒酵母不同发酵时间上清液中的蛋白浓度含量图（图2）。
样品 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
稀释倍数 1 1 3 4 5 6 7 8
浓度（μg/mL） 1.54 68.1 33.14 38.89 45.12 49.9 43.68 43.68
乘以稀释倍数后的最终浓度 1.54 68.1 99.42 155.56 225.6 299.4 305.78 349.44
表3
检测结束后将96孔酶标板中的液体全部倒掉，向里面加入清洗液，加入后手动震荡清洗，倒掉清洗液，反复此步骤2-3次后，再用蒸馏水清洗一次酶标板孔，待酶标板自然晾干后可再次使用。

Claims (7)

1.一种批量蛋白浓度检测试剂盒，其特征在于：包括96孔酶标板、牛血清白蛋白标准品、A液、B液、清洗液和若干0.5mLEP管。
2.根据权利要求1所述的一种批量蛋白浓度检测试剂盒，其特征在于：所述牛血清白蛋白为蛋白粉末，使用前将其配置成所需要的浓度。
3.据权利要求1所述的一种批量蛋白浓度检测试剂盒，其特征在于：所述A液中乙醇含量在20%-50%之间，磷酸含量占50%-75%之间，蒸馏水含量在0-15%之间，考马斯亮蓝G-250含量在0.5mg/mL-2mg/mL之间。
4.据权利要求1所述的一种批量蛋白浓度检测试剂盒，其特征在于：所述B液中乙醇含量在1%-5%之间，磷酸含量在1%-10%之间，蒸馏水含量在85%-98%之间。
5.据权利要求1所述的一种批量蛋白浓度检测试剂盒，其特征在于：所述清洗液是浓度大于80%的乙醇溶液。
6.一种批量蛋白浓度检测试剂盒操作方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)用蒸馏水将牛血清白蛋白粉末配置成浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL标准溶液，每种标准溶液配成若干份，分别装在0.5mLEP管中，保存在-20OC冰箱中；
(2)A液和B液需要按照一定的比例进行混合，A液在混合时所占的比例大约为AB混合液总体积的4%-10%，此后AB混合液需在4OC下保存；
(3)取出96孔酶标板，在酶标板的孔内加入10-20微升已知浓度的牛血清白蛋白标准品样品和待测样品，保证每孔的加样量相同；
(4)向加过样品的酶标板孔内加入100-180微升的AB混合液，保证每孔加入的混合液量相同，加入后静置5-10分钟；
(5)放入酶标仪中在特定OD595nm波长下或OD450nm和OD630nm叠加波长下进行检测；
(6)检测后将酶标板中的液体倒掉，再在酶标板孔中加入清洗液，加入后手动震荡清洗，倒掉清洗液，反复此步骤2-3次后，再用蒸馏水清洗一次酶标板孔，待酶标板自然晾干后可再次使用。
7.据权利要求6所述的一种蛋白浓度检测试剂盒操作方法，其特征在于，所述已知的牛血清白蛋白标准品加样浓度为：0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL。
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CN109239352A (zh) * 2018-08-13 2019-01-18 北京弘润天源基因生物技术有限公司 细胞上清的总蛋白定量检测试剂盒及其制备方法与应用

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