CN105527366A - 一种检测饲料中抗生素残留的方法 - Google Patents

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Abstract

一种检测饲料中抗生素残留的方法，包括以下步骤：(1)利用粉碎机将饲料加水制成匀浆液，称取匀浆液于离心管中，依次加入破乳剂、甲醇、以及磷酸盐缓冲溶液，超声提取，离心后，得到待净化液；(2)将待净化液转移至固相萃取柱中，进行净化，收集洗脱液。在水浴中用氮气吹至近干，加入乙腈水溶液，在涡旋混合器上混合后，过微孔滤膜后滤液待测；(3)用液相色谱-串联质谱法测定和确证，外标法定量。根据本发明的检测饲料中抗生素残留的方法，能够有效提高检测结果的准确性，为食品安全提供有益保障。

Description

一种检测饲料中抗生素残留的方法
技术领域
本发明涉及一种检测饲料中抗生素残留的方法。
背景技术
在动物饲料中添加少量的抗生素能够有效预防动物疾病，并且，某些抗生素还能够促进动物生长。但如果食用过量的抗生素就会容易在动物体内产生残留，从而影响到动物食品的安全性。因此，目前很多国家都严格规定了饲料中抗生素的使用剂量，同时还对使用抗生素的种类作了限制。我国农业部发布了《允许作饲料药物添加剂兽药品种及使用规定》，允许用作饲料添加剂的抗生素品种有15种，并分别对适用动物、最低用量、最高用量及停药期作了严格规定，但由于兽药管理工作跟不上，实际生产中抗生素的使用品种比规定要多，使用量普遍也较大，而且基本没有执行停药期，特别在蛋鸡的产蛋期，按要求是严格限制使用抗生素的，但据了解，在产蛋期使用抗生素是普遍存在的。因此，对饲料进行抗生素残留检测对保证食品安全具有重要意义。
目前，对抗生素残留检测主要有酶联免疫法和高效液相色谱法。这些检测方法都涉及到样品前处理步骤，需要从饲料中提取出抗生素。由于，饲料中含有膳食纤维、脂肪、糖类等成分，萃取时有机相与水相的界面不清，乳化状态很严重。采用常规的化学试剂并不能完全萃取出其中的抗生素成分，从而造成检测结果的准确度不高。
发明内容
本发明的目的是针对上述背景技术中存在的某些和某个问题，提供一种检测饲料中抗生素残留的方法。
根据本发明的检测饲料中抗生素残留的方法，包括以下步骤：
(1)利用粉碎机将饲料加水制成匀浆液，称取3-5g匀浆液于离心管中，加入0.3-0.5g的破乳剂，超声振荡15-30分钟后，加入10-20mL甲醇，分散均匀后，加入10-30mL的磷酸盐缓冲溶液，超声提取10-20分钟，离心后，移取5mL上清液，加5mL磷酸盐缓冲溶液混匀后，待净化；
(2)将步骤(1)中的待净化液转移至固相萃取柱中，依次用5mL水，5mL甲醇水溶液淋洗，弃去流出液，减压抽干后，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液。在50℃水浴中用氮气吹至近干，加入5mL乙腈水溶液，在涡旋混合器上混合后，过微孔滤膜后滤液待测；
(3)用液相色谱-串联质谱法测定和确证，外标法定量。
破乳剂是一种表面活性物质，它能使乳化状的液体结构破坏，以达到乳化液中各相分离开来的目的。破乳剂可以是化学破乳剂，例如聚氧乙烯聚氧丙烯聚醚或聚氧乙烯聚氧丙烯十八醇醚；也可以是生物破乳剂，例如含芽孢杆菌的生物破乳剂。化学破乳剂成本低、保质期长。生物破乳剂需冷冻保存，但破乳效果通常要优于化学破乳剂。
在本发明的检测方法中，在样品前处理步骤中，加入一定量的破乳剂来消除乳化现象，促使饲料中的膳食纤维、脂肪、糖类与抗生素有效分离，提高样品中抗生素的溶出率。再与合适的萃取剂配合，在合适的pH值条件下，提取出饲料中的抗生素。从而在源头上保证了最终检测结果的准确性。
根据本发明的检测饲料中抗生素残留的方法，能够有效提高检测结果的准确性，为食品安全提供有益保障。
具体实施方式
下面通过具体实施例详细描述检测饲料中抗生素残留的方法。本领域技术人员应当理解，下面描述的实施例仅是对本发明的示例性说明，而非用于对其作出任何限制。
以经初步筛查(例如微生物抑制试纸法)含有抗生素的鸡饲料为样品，检测其5种磺胺类抗生素药物(磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺对甲基嘧啶、磺胺甲基异噁磺胺喹噁啉)残留的具体含量，来介绍本发明的实施过程和效果。
1.样品液A制备
1.1提取步骤
利用粉碎机将鸡饲料加水制成匀浆液，称取5g匀浆液于离心管中，加入0.3g的聚氧乙烯聚氧丙烯聚醚，超声振荡30分钟后，加入20mL甲醇，分散均匀后，加入30mL的磷酸盐缓冲溶液，超声提取20分钟，经7000r/min离心10分钟后，移取5mL上清液，加5mL磷酸盐缓冲溶液混匀后，待净化；
1.2纯化步骤
将步骤1.1中的待净化液转移至HLB固相萃取柱中，依次用5mL水，5mL甲醇水溶液淋洗，弃去流出液，减压抽干后，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液。在50℃水浴中用氮气吹至近干，加入5.0mL乙腈水溶液，在涡旋混合器上混合后，过0.22微米的微孔滤膜后滤液待测。
上述步骤中，磷酸盐缓冲溶液浓度为0.1mol/L，制备过程为：溶解12.2g磷酸二氢钠于950mL水中，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，最后用水稀释至1L。甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为3∶7。乙腈水溶液中乙氰与水体积比为2∶8。
2.样品液B制备
为了对比，在上述制备样品液A的步骤1.1中不加入聚氧乙烯聚氧丙烯聚醚，其它步骤完全与样品液A相同。
3.标准液制备
准确称取适量各标准物质(磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺对甲基嘧啶、磺胺甲基异噁磺胺喹噁啉)分别置于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为10mg/L的储备液。
用乙腈水溶液将储备液逐级稀释得到磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺对甲基嘧啶、磺胺甲基异噁磺胺喹噁啉为10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、800μg/L的系列混合标准工作液。
4.液相色谱-质谱检测
4.1液相色谱的工作条件
a)色谱柱：C18柱，100mm×2.1mm(i.d.)，5μm。
b)流动相：A：乙腈，B：0.2％甲酸溶液，梯度洗脱，梯度条件见表1。
c)柱温：30℃。
d)进样量：10μL。
表1梯度洗脱程序表
4.2串联质谱工作条件
a)电离方式：电喷雾电离，正离子模式；
b)喷雾电压：3.0kV；
c)雾化温度：300℃；
d)毛细管温度：350℃；
e)鞘气压力：50Arb(1Arb＝1psi)；
f)辅助气压力：20Arb(1Arb＝0.3L/min)；
g)碰撞气、鞘气和辅助气：氩气(99.999％)；
h)扫描模式：多反应监测(MRM)模式，5种磺胺类抗生素的质谱参数见表2。
表2质谱参数
*定量离子
4.3测定步骤
先对混合标准工作液按浓度由低到高进行检测，以定量离子峰面积对质量浓度作图，做出标准曲线回归方程。
在对样品液进行检测，得到的离子峰面积与标准曲线对照得到各抗生素的浓度。样品液检测次数为5次，取平均值为结果。
如果样品液中有组分的响应值超过标准曲线的线性范围，则稀释后再进样测定。
测试结果如表3所示。
表3样品液中5种磺胺类抗生素含量检测结果
上述结果显示，样品液B中检测出的各种抗生素含量均大于样品液A中的含量，特别对于在样品A中未检出的磺胺对甲基嘧啶和磺胺甲基异噁却在样品液B检测出微小含量。从而表明，在样品液的提取过程中，加入一定量的破乳剂进行破乳处理，抗生素的提取率能够提高20％以上，大大提高了饲料中抗生素残留检测的准确度。
上述实施例以经初步筛查含有抗生素的鸡饲料为样品进行检测，仅为了更好地理解本发明。本领域技术人员应该理解，本发明的检测方法可以适用于未经初步筛查的各类动物饲料。检测项目也不限于磺胺类抗生素，也可以是检测其它种类的抗生素。

Claims (4)

1.一种检测饲料中抗生素残留的方法，包括以下步骤：
(1)利用粉碎机将饲料加水制成匀浆液，称取3-5g匀浆液于离心管中，加入0.3-0.5g的破乳剂，超声振荡15-30分钟后，加入10-20mL甲醇，分散均匀后，加入10-30mL的磷酸盐缓冲溶液，超声提取10-20分钟，离心后，移取5mL上清液，加5mL磷酸盐缓冲溶液混匀后，待净化；
(2)将步骤(1)中的待净化液转移至固相萃取柱中，依次用5mL水，5mL甲醇水溶液淋洗，弃去流出液，减压抽干后，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液。在50℃水浴中用氮气吹至近干，加入5mL乙腈水溶液，在涡旋混合器上混合后，过微孔滤膜后滤液待测；
(3)用液相色谱-串联质谱法测定和确证，外标法定量。
2.根据权利要求1所述的检测饲料中抗生素残留的方法，所述破乳剂聚氧乙烯聚氧丙烯聚醚或聚氧乙烯聚氧丙烯十八醇醚。
3.根据权利要求1所述的检测饲料中抗生素残留的方法，所述固相萃取柱为HLB萃取柱。
4.根据权利要求1所述的检测饲料中抗生素残留的方法，所述微孔滤膜规格为0.22μm。
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