CN108956795B - 用于刑侦目的生物体液中咪唑啉类药物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于刑侦目的生物体液中咪唑啉类药物的检测方法，包括如下步骤：生物体液预处理；生物体液中咪唑啉类药物的提取和检测。建立了生物体液中四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉、羟甲唑啉五种常见咪唑啉类药物的前处理方剂及液相色谱质谱分析方法，平均回收率达70％以上，检出限小于1ng/mL。

Description

用于刑侦目的生物体液中咪唑啉类药物的检测方法

技术领域

本发明涉及法医毒物分析领域。更具体地，涉及一种生物体液中咪唑啉类药物的检测方法。

背景技术

关于咪唑啉类药物的分析研究较少，国内只有关于药品中咪唑啉类药物有效成分的检测研究，没有生物体液中此类药物检测的报道；国外的研究也主要集中在药物质量控制上，对于生物样品中咪唑啉类药物的分析研究虽有涉及，但现有方法还远不能满足实际案件检验的需要。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种重复性好、灵敏度高、操作简便的提取和检测生物体液中咪唑啉类药物的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：用于刑侦目的生物体液中咪唑啉类药物的检测方法，包括如下步骤：

(1)生物体液预处理：生物体液为血液或尿液；咪唑啉类药物为四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉和羟甲唑啉中的一种或多种；

(2)咪唑啉类药物的检测：使用液相色谱质谱LC-MS/MS检测咪唑啉类药物。

本发明的有益效果如下：

本发明建立了生物体液中四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉、羟甲唑啉五种常见咪唑啉类药物的前处理方法及液相色谱质谱分析方法，平均回收率达70％以上，检出限小于1ng/mL。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1四氢唑啉的结构示意图；图2赛洛唑啉的结构示意图；

图3萘甲唑啉的结构示意图；图4安他唑啉的结构示意图；

图5羟甲唑啉的结构示意图；

图6使用50％甲醇-50％0.1％甲酸水等度洗脱所得到的液相色谱图；

图7 10ng/mL咪唑啉类药物混合标准溶液的HPLC-MS/MS图；(四氢唑啉：1.40min；萘甲唑啉：1.74min；安他唑啉：2.68min；羟甲唑啉：2.95min；赛洛唑啉：3.26min)

图8空白血样咪唑啉类药物LC-MS/MS图；

图9添加血样咪唑啉类药物LC-MS/MS图；

图10空白尿样咪唑啉类药物LC-MS/MS图；

图11添加尿样咪唑啉类药物LC-MS/MS图；

图12鼠空白血进行LC-MS/MS分析所得谱图；

图13鼠空白尿进行LC-MS/MS分析所得谱图；

图14体外给药3小时后指尖血进行LC-MS/MS分析所得谱图；

图15体外给药1小时后所取尿液进行LC-MS/MS分析所得谱图；

图16体外给药3小时后所取尿液进行LC-MS/MS分析所得谱图；

图17体外给药6小时后所取尿液进行LC-MS/MS分析所得谱图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

第一部分生物体液中四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉、羟甲唑啉的检测 方法

一、实验方法

1.1试剂、材料及仪器

1.1.1试剂与材料：四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉均购自美国药典(USP)，纯度99.9％；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵、乙酸铵(色谱纯，Fisher Scientific公司)；乙醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、氨水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(分析纯，北京化学试剂公司)；0.22μm 微孔有机滤膜(北京八方公司)；去离子水经由Milliporesimplicity纯水系统制备；Oasis MCX(60mg，3cc)和Oasis HLB(60mg，3cc)固相萃取柱，均购自Waters公司。

1.1.2生物样品：空白人全血购自北京市红十字血液中心；空白尿采自一周内未服用任何药物的健康志愿者。

1.1.3标准溶液的配制

1.1.3.1储备液的配制：

四氢唑啉储备液的配制：精确称取四氢唑啉标准品10.0mg于10mL容量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，配制成含1.0mg/mL四氢唑啉储备液，4℃冰箱中保存，备用。赛洛唑啉、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉储备液的配制同四氢唑啉储备液的配制。

1.1.3.2工作液的配制：

单一标准工作液的配置：分别移取各标准储备液一定量，用甲醇稀释为 100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL浓度的四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉的单一标准工作溶液，4℃冰箱中保存。

混合标准物质工作液的配置：移取1.0mg/mL四氢唑啉储备液1mL、1.0 mg/mL赛洛唑啉储备液1mL、1.0mg/mL萘甲唑啉储备液1mL、1.0mg/mL安他唑啉储备液1mL及1.0mg/mL羟甲唑啉储备液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成5种咪唑啉类药物浓度均为100ng/mL的混合标准工作液。分别移取上述混合标准工作液一定量，用甲醇稀释为10ng/mL、1ng/mL、 0.1ng/mL的混合标准工作液，4℃冰箱中保存。

1.1.3.3pH 6的磷酸盐缓冲液的配制

量取1mol/L的磷酸二氢钠溶液877mL和1mol/L的磷酸氢二钠溶液，混匀，得到pH为6的磷酸盐缓冲液。

1.1.4仪器：超高效液相色谱-质谱联用仪：岛津LC-30AD(日本)，AB Sciex Qtrap5500(美国)；吉尔森GX-274ASPEC四通道自动固相萃取仪(美国)；BP210s电子天平(德国Sartorius公司)；Millipore SimLicity纯水净化系统(法国)；Scientific Industries漩涡振荡器(USA)；SORVALL高速冷冻离心机(德国)；EYELA高速振荡器(日本)；DSY-Ⅱ自动快速浓缩仪(北京精华苑科技有限公司)；EYELA CUTE MIXER CM100振荡器(日本京东)； 10～100μL，10～1000μL自动移液枪(德国Eppendorf)

1.2样品前处理方法

本发明用乙腈沉淀蛋白、液-液萃取和固相萃取等三种方法对血液、尿液中五种常见咪唑啉类药物的提取进行了比较，具体操作如下：

1.2.1乙腈沉淀蛋白法：取血液或尿液1mL于15mL塑料离心管中，加入 2mL乙腈，振荡10min、离心(8000r/min，10min)，取上清液过0.22μm的有机系微孔滤膜，供LC-MS/MS分析。

1.2.2液-液萃取法

取血液或尿液1mL，用氢氧化钠溶液调pH＝10，5mL丙酮振荡提取，高速离心(8000r/min，10min)，转移有机相至尖底玻璃试管中，再用5mL丙酮重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用200μL甲醇溶解定容，过0.22μm的有机系微孔滤膜，供LC-MS/MS分析。

1.2.3固相萃取法

1.2.3.1HLB柱固相萃取方法

血样预处理：取1mL血液(尿液)，加入1mL pH6的磷酸盐缓冲液，混旋1分钟，高速离心(10min，8000r/min)后取上清液待过柱；柱活化：取HLB 固相萃取柱，依次以2mL甲醇、2mL水活化；过柱：上清液分别过柱，流速1.0mL/min；淋洗：2mL 5％甲醇-水淋洗(甲醇和水的体积比为5:95)；洗脱：用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液；挥干定容：50℃空气吹干仪上吹干，残留物用200μL甲醇溶解，过0.22μm的有机系微孔滤膜，供LC-MS/MS分析。

1.2.3.2MCX柱固相萃取方法

血样预处理：取1mL血液(尿液)，加入1mL pH6的磷酸盐缓冲液，混旋1分钟，高速离心(10min，8000r/min)后取上清液待过柱；柱活化：取 MCX固相萃取柱，依次以2mL甲醇、2mL水活化；过柱：上清液分别过柱，流速1.0mL/min；淋洗：2mL 2％甲酸-水和2mL 100％甲醇依次淋洗(甲酸和水的体积比为2:98)；洗脱：1mL 2％氨水-甲醇洗脱(氨水和甲醇的体积比为2:98)，收集洗脱液；挥干定容：50℃空气吹干仪上吹干，残留物用200μL 甲醇溶解定容，过0.22μm的有机系微孔滤膜，供LC-MS/MS分析。

1.3液相色谱质谱(LC-MS/MS)分析参数

a)色谱柱：Aglient Zorbax Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)或等效柱；b)流动相为：A：甲醇，B：0.1％甲酸水溶液；0.1％甲酸水溶液是指 100mL水中加入0.1mL甲酸配制而成；c)洗脱：梯度洗脱，梯度见表1；d) 柱温：35℃；e)流速：0.4mL/min；f)离子源：电喷雾电离源(ESI)；g)检测方式：正离子；h)扫描方式：多反应离子监测(MRM)；i)雾化气、脱溶剂气：氮气；j)碰撞气：氩气；k)离子源温度：150℃；l)雾化温度：500℃；m)；毛细管电压：5.5kV；n)定性、定量离子和去簇电压、碰撞能量条件参见表2。

表1梯度洗脱条件

时间(min)	流速(mL/min)	A(V％)	B(V％)
				0.2	0.4	30	70
3	0.4	70	30
				3.8	0.4	70	30
4.0	0.4	30	70
				5.5	0.4	30	70

表2MS/MS参考条件

二结果与讨论

2.1液相色谱质谱条件的选择

2.1.1流动相的选择

本发明比较了甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸水、甲醇-5mM甲酸铵、甲醇-5mM乙酸铵、乙腈-5mM甲酸铵、乙腈-5mM乙酸铵等8种不同的流动相系统。使用甲醇-水、乙腈-水流动相系统所得5种咪唑啉药物色谱峰不对称及拖尾严重；而在流动相中加入0.1％甲酸、5mM甲酸铵或 5mM乙酸铵后色谱峰型可得到明显改善，但是使用乙腈作为流动相5种药物不能实现完全分离，而使用甲醇-0.1％甲酸水、甲醇-5mM甲酸铵、甲醇-5mM 乙酸铵的流动相均可得到较好的色谱峰型及较好的分离度。由于流动相体系中加入盐后会使液相色谱系统尤其是色谱柱较难冲洗，因此本发明中选用甲醇 -0.1％甲酸水作为流动相。

2.1.2色谱洗脱程序的选择

本发明比较了等度洗脱及不同梯度洗脱程序对5种咪唑啉类药物分离的影响。图6为使用50％甲醇-50％0.1％甲酸水等度洗脱所得到的液相色谱图，从图中可以看出，由于5种药物的化学性质相似，它们在色谱柱上的保留时间接近，使用等度洗脱不能将5种药物有效分离。为提高5种药物的分离度，课题组优化了不同的梯度洗脱程序，最后发现应用如表1所示的梯度洗脱程序时所得结果最优，如图7所示，仅需5min即可实现5种药物的完全分离。

2.1.3质谱条件的选择

取100ng/mL四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉混合标准溶液，以10μL/min的速度通过针泵进样，在正离子模式下扫描，分别对喷雾电压、毛细管温度、雾化温度、去簇电压、碰撞能等参数进行优化，通过全扫描方式观察总离子流图，得到目标化合物的分析离子峰，通过碰撞反应进行离子扫描，逐渐加大碰撞能选用丰度较大的两个子离子作为定量离子和辅助定性离子，并确定其最佳的碰撞能。优化后得到的质谱条件见表2。

2.2样品制备方法选择

2.2.1液-液萃取方法

2.2.1.1pH值的选择

药物在不同pH条件下，在有机相的溶解度差异很大，所以液-液萃取中选择合适的pH就显得至关重要，尤其是对酸碱性的物质。咪唑啉类药物属于弱碱性药物，在水中有一定的溶解度，碱性条件下以游离状态存在，溶于有机溶剂。本发明比较了水中5种咪唑啉类药物在pH 7-11条件下的回收率，以pH 10 的回收率最高。

表3不同pH值的选择(n＝3)

2.2.1.2萃取溶液的选择

液-液萃取中最关键的步骤是萃取溶剂的选择，它会直接影响到萃取效果。本课题对二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯四种萃取溶剂，在pH10条件下对1mL血液添加10ng/mL 5种咪唑啉类药物混标的样品进行了比较分析，结果表明丙酮做提取溶剂，所得回收率较高(结果见表4)且干扰杂质较少。因此，选择丙酮作为提取5种咪唑啉类药物的萃取溶剂。

表4不同萃取溶剂的选择(n＝3)

2.2.2固相萃取方法

2.2.2.1固相萃取小柱的选择

选择合适的固相柱是进行固相萃取的核心，固相萃取柱的种类很多，但主要考虑的因素是对分析物的萃取能力。咪唑啉类属于碱性药物，本发明组选用了保留机理为反相柱的

HLB固相萃取柱和具有离子交换和反相双重保留模式的

MCX柱进行比较。在1mL血中添加10ng 5种咪唑啉类药物，分别按HLB柱固相萃取方法和MCX柱固相萃取方法，平行萃取3份，按照“1.3 液相色谱质谱(LC-MS/MS)分析参数”，记录回收率，结果表明HLB柱对5 种咪唑啉类药物的萃取回收率更高，且萃取液更洁净，效果比较理想。

2.2.2.2样品预处理方法的选择

本发明考察了血液(或尿液)样品上样前用水稀释和用pH6磷酸盐缓冲液稀释对固相萃取回收率的影响。取血液1mL，加入1mL去离子水或1mL pH6 磷酸盐缓冲液，振荡、混匀，高速离心(10min，8000r/min)后取上清液经固相萃取方法萃取，提取液经LC-MS/MS分析。样品经pH6磷酸盐缓冲液稀释后可得到较高的回收率。这是由于与去离子水相比，pH6磷酸盐缓冲液除将样品稀释作用外，还能够破坏药物与全血样品中蛋白质的结合，使药物更好的释放出来。

表5不同样品预处理方法的选择(n＝3)

2.2.2.3洗脱液的选择

洗脱溶剂对目标化合物应该有很好的溶解度，而且应该可以破坏目标化合物与填料之间的作用力。另外，洗脱溶剂最好能够与检测技术相匹配，以便简化仪器进样的样品前处理。对于HPLC-MS方法，首先考虑是否可以使用HPLC 流动相作为洗脱溶剂。在本发明中，HPLC-MS分析流动相为甲醇-0.1％甲酸水体系，因此选取甲醇作为洗脱溶剂，这样就可以省去了采用有机溶剂洗脱后，对收集的有机液体进行浓缩挥干及溶剂转换的步骤。

综合比较乙腈沉淀蛋白、液液 萃取、固相萃取三种不同的前处理方法，可以发现蛋白质沉淀法操作简单，但回收率相对较低；液-液提取方法回收率比蛋白沉淀法高，但需溶剂提取、挥干定容等步骤，相对耗时较长，且需要大量使用有机溶剂，毒性较大；固相萃取方法安全性高、选择性好、预处理时间短，可实现自动化，但是固相萃柱取成本较高。三种不同的前处理方法各有优缺点，在实际应用中可根据具体情况进行选择。

2.3方法确证

2.3.1方法专属性

取空白血液或尿液，加入一定量的四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉5种药物的混合标准溶液，用乙腈沉淀蛋白法进行处理，同时做空白血液或尿液的对照试验，将二者的图谱(图8-图11)进行比较。结果在 5种药物的保留时间段内，空白血及尿均未出现明显的色谱峰，表明生物体液中内源性杂质不会对此5种咪唑啉类药物的的测定造成干扰，说明本发明建立的提取方法具有较高的专属性。液液提取法及固相萃取法的专属性考察同上操作，结果表明使用液液 萃取及固相萃取法进行样品前处理同样无内源性物质干扰。

2.3.2方法线性考察

取空白的血样，分别加入适量的5种咪唑啉类药物标准液使其在每一种样品中的添加浓度分别为0.1，0.5，1，10，100ng/mL，每一样品每一浓度平行3份，以测得的添加各样品中5种咪唑啉类药物的定量离子的峰面积为纵坐标(Y)，以样品中添加5种咪唑啉类药物的浓度为横坐标(X)，进行线性回归，求得线性回归方程，见表5-16。以上结果表明，该方法对血液样本中的 5种咪唑啉类药物在0.5ng～100ng/mL范围内有着良好的线性关系。

表5血液乙腈沉淀蛋白法线性范围及检出限、定量限

表6尿液乙腈沉淀蛋白方法线性范围、检出限、定量限

表7血液乙腈沉淀蛋白方法回收率和准确度

表8尿液乙腈沉淀蛋白法方去回收率和准确度

表9血液HLB方法线性范围及检出限、定量限

表10尿液HLB方法线性范围及检出限、定量限

表11血液HLB提取法提去回收率和精密度

表12尿液HLB提取法提去回收率和精密度

表13血液液液 提取方法方法线性 范围及检出限、定量限。

表14尿液液液 提取方法线性 及检出限、定量限

表15血液液液 提取回收率及准确度

表16尿液液液 提取回收率及准确度

2.3.3方法的精密度和准确度

用标准溶液加入法对方法的精密度进行考察。取空白的血样、尿样，加入适量的四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉标准溶液使其在每一种样品中的添加浓度分别为1，5，50ng/mL，每一样品每一浓度平行3份，每份样品平行进样3次，连续测定三天，计算各组分峰面积的标准偏差，得到日内精密度与日间精密度(见表5-16)。乙腈沉淀蛋白法的精密度在92.3～107.0％之间，液液 提取法的精密度在91.2～107.1％之间，固相萃取法的精密度在 91.5～103.3％之间。三种方法的RSD均小于10％。

2.3.4方法的灵敏度

三种不同提取方法样品提取后，经LC-MS/MS分析，以信噪比3/1计5 种药物的最小检出限，以信噪比10/1计方法的最小定量限，结果见表5-表16。本发明所建立方法分析5种药物的检出限均小于1ng/mL，表明方法灵敏度高。

三、结论

本研究建立了生物体液中四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉的固相萃取方法、液-液萃取前处理方法和液质仪器方法。所建立的方法回收率高、重现性好、提取产物较干净。添加的平均回收率在70％以上，方法简便快速、灵敏度高、重现性好、结果准确可靠，为进一步研究四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、羟甲唑啉、安他唑啉在动物体内的分布及稳定性提供了技术手段。本研究方法可满足涉及此5种咪唑啉类药物中毒案件的检测。

第二部分稳定性考察

药物在不同的介质及不同的储存条件下放置过久其含量可能发生变化，为保证定量的准确，必须对药物的稳定性进行考察。在毒物分析中从现场检材的提取到送实验室检验，需要经历一定的时间段，由于药物本身的理化性质及生物样品中一些内源性物质的作用，可能导致药物在生物体液中发生分解。所以检材存放的条件和时间对药物的浓度有很大的影响，本研究对5种咪唑啉药物在血液和尿液样本中的稳定性进行了考察。

一、试剂、材料与仪器：同第一部分。

二、实验方法

2.1室温下保存24小时

在空白血液(或空白尿液)中添加5种咪唑啉类药物使其浓度均为10ng/mL，取添加血液和尿液样品各3份在室温下放置24小时后，按第一部分乙腈沉淀蛋白法对样品进行分析，并以新添加的血液和尿液样本计算被测样本中的含量。

2.2 4℃下保存1周

在空白血液(或空白尿液)中添加5种咪唑啉类药物使其浓度均为10ng/mL，取添加血液和尿液样品各3份在4℃下保存1周后，按第一部分乙腈沉淀蛋白法对样品进行分析，并以新添加的血液和尿液样本计算被测样本中的含量。

2.3-20℃冷冻保存1月

在空白血液(或空白尿液)中添加5种咪唑啉类药物使其浓度均为10ng/mL，取添加血液和尿液样品各3份在-20℃冷冻保存1月后，按第一部分乙腈沉淀蛋白法对样品进行分析，并以新添加的血液和尿液样本计算被测样本中的含量。

2.4反复冻融三个循环

在空白血液和空白尿液中添加5种咪唑啉类药物使其浓度均为10ng/mL，取添加血液和尿液样品各3份-20℃冷冻保存24h，之后将其取出置于室温下解冻。重复进行上述冷冻-解冻循环三次，取第三次解冻后的样品进行分析，分析结果与新添加的血液和尿液样品进行对比。

三、结果与讨论

表17 5种咪唑啉类药物在血液中的稳定性研究。

表18 5种咪唑啉类药物在尿液中的稳定性研究。

如表17、表18所示，5种咪唑啉类药物在室温下保存24小时、在-4℃条件下保存1周、在-20℃条件下保存1月以及反复冻融三个循环后样品浓度与新添加血液或尿液样品相比，偏差均小于10％，且差异无统计学意义，说明5 种咪唑啉类药物在血液和尿液中在室温下保存24小时、在-4℃条件下保存1 周、在-20℃条件下保存1月以及反复冻融三个循环后均保持稳定。

第三部分本发明生物体液中咪唑啉类药物的检测方法用于动物体液和人体体液 的检测试验

一、动物灌胃实验

1.1仪器、试剂与材料

1.1.1仪器(同第一部分)

1.1.2试剂：除生理盐水(国药集团化学试剂有限公司)外，其余均同第一部分。

1.1.3动物

实验用wistvar雄性大鼠，体重600.0g±30g，购于山西医科大学实验动物中心。适应性喂养2天。饲养环境：温度17℃，湿度45％～65％，通风换气良好，光照合理，笼具和垫料卫生、无毒，喂营养颗粒饲料和高压消毒灭菌水。

1.1.4药物配制

精确称取盐酸四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉、羟甲唑啉一定量，将其用生理盐水配置成含2mg/mL的混合标准溶液，置4℃冰箱保存。

1.2.动物实验方法

1.2.1四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉、羟甲唑啉灌胃给药模型及检材的采集

健康Wistar雄性大鼠6只，其中1只做空白对照，其余5只灌胃给药10mg/kg，给药后2.5h，处死，取心血和尿液，采用乙腈沉淀蛋白法前处理，经LC-MS/MS 分析。

1.2.2样品的测定

取大鼠血液(或尿液)样品1mL置于15mL塑料离心管中，加入2mL乙腈，振荡10min、离心(8000r/min，10min)，取上清液过0.22μm的有机系微孔滤膜过滤，供LC-MS/MS分析。

液相色谱质谱条件同第一部分。

1.3.结果与讨论

1.3.1工作曲线

分别在空白大鼠血液(尿液)中加四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉、羟甲唑啉混合标准溶液，使其浓度为1，5，10，50，100ng/mL，按第一部分液相色谱质谱方法进行检测，以目标物的浓度为横坐标(X)，以其定量离子峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，所得线性方程见表19。

表19血液乙腈沉淀蛋白方法线性方程及检出限、定量限

表20尿液乙腈沉淀蛋白方法线性方程及检出限、定量限

1.3.2专属性实验

取空白大鼠的血液(或尿液)1mL，加入一定量的四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉、羟甲唑啉混合标准溶液，按照第一部分液相色谱质谱方法，同时做空白对照，阳性对照及空白对照样品分别见图12和图13。通过对比二者谱图表明大鼠血液和尿液中均无内源性杂质对5中咪唑啉类药物的测定造成干扰。

1.3.3给药后大鼠血液和尿液中5种咪唑啉类药物的含量检验

取动物实验所得血液(或尿液)样本，按照2.2下方法进行样品制备及检测，以保留时间结合特征离子峰进行定性，以标准曲线法进行定量。2.5小时大鼠血液和尿液中各药物的浓度见表21。

表21药物在大鼠血液和尿液中的浓度(n＝5)

	血液(ng/mL)	尿液(ng/mL)
			四氢唑啉	3.8	24.8
萘甲唑啉	45.6	322.3
			羟甲唑啉	24.5	47.6
赛洛唑啉	8.8	85.5
			安他唑啉	8.3	3.7

二、人体外部给药实验

2.1仪器、试剂与材料

2.1.1仪器(同第一部分)

2.1.2试剂：远清盐酸羟甲唑啉滴眼液(江苏汉晨药业有限公司)

其余同第一部分。

2.1.3样品采集：志愿者为一健康成年女性，在使用盐酸羟甲唑啉滴眼液左右眼各滴2滴后，1h、3h、6h后分别取尿液，3h后取手指血滴于滤纸上。样品放置于-20℃冰箱保存待检。

2.2.实验方法

2.2.1血液样品分析方法

取滤纸上血斑两块，剪碎后置于15mL塑料离心管中，加入乙腈500μL，振荡10min、离心(8000r/min，10min)，取上清液过0.22μm的有机系微孔滤膜过滤，供LC-MS/MS分析。

2.2.2尿液样品分析方法：采用HLB固相萃取法进行分析，具体见第一部分。

2.3结果与讨论

取志愿者在滴入4滴羟甲唑啉滴眼液3小时后所得指尖血血斑提取液进 LC-MS/MS分析，所得谱图见图14.从图中可以看出，在给药3小时后在人血液中检出四氢唑啉。在志愿者在给药1小时、3小时、6小时后收集的尿液中同样可以检出四氢唑啉，见图15-17，其中1小时后羟甲唑啉浓度为2.7ng/mL， 3小时后浓度3ng/mL，6小时后浓度为0.8ng/mL。由此可以看出，羟甲唑啉在体内吸收快，代谢快，6小时后浓度就基本已达方法检出限浓度。

表22人尿液中羟甲唑啉药物浓度

三、结论

应用本发明建立的方法，对大鼠灌胃给药和人体外用给药后所获的血液和尿液进行分析，均可成功检测出咪唑啉类药物，证明了所建方法的可行性。

Claims (1)

1.用于刑侦目的生物体液中咪唑啉类药物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)生物体液预处理；生物体液为全血或尿液；咪唑啉类药物为四氢唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉、安他唑啉和羟甲唑啉；

生物体液预处理采用如下方法之一：液-液萃取法或HLB柱固相萃取方法；

所述液-液萃取法包括如下步骤：取生物体液1mL，用氢氧化钠溶液调pH＝10，5mL丙酮振荡提取，离心10min、转速为8000r/min，转移有机相至尖底玻璃试管中，再用5mL丙酮重复提取一次，合并有机相，50℃空气流下挥干，残渣用200μL甲醇溶解定容，过0.22μm的有机系微孔滤膜，滤液即为液-液萃取法预处理液，留待LC-MS/MS检测；

所述HLB柱固相萃取方法包括如下步骤：取生物体液1mL，加入1mL pH＝6的磷酸盐缓冲液，混旋1分钟，离心10min、转速8000r/min，后取上清液待过柱；柱活化：取HLB固相萃取柱，依次以2mL甲醇、2mL水活化；过柱：上清液过柱，流速1.0mL/min；淋洗：2mL甲醇-水淋洗，甲醇与水的体积比为5:95；洗脱：用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液；挥干定容：50℃空气吹干仪上吹干，残留物用200μL甲醇溶解，过0.22μm的有机系微孔滤膜，所得物即为HLB柱固相萃取方法预处理液，留待LC-MS/MS检测；

(2)咪唑啉类药物的检测，使用液相色谱质谱LC-MS/MS检测咪唑啉类药物；质谱为ABSciex Qtrap 5500；

步骤(2)中，利用液相色谱质谱LC-MS/MS检测咪唑啉类药物时的液相色谱条件及质谱条件如下：

a)色谱柱：Aglient Zorbax Eclipse Plus C18或等效柱，规格：2.1mm×100mm，1.8μm；

b)流动相：A相：甲醇，B相：0.1％甲酸水溶液；0.1％甲酸水溶液是指100mL水中加入0.1mL甲酸配制而成；

c)洗脱：梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：

时间/min 流速/mL/min A相/V％ B相/V％ 0.2 0.4 30 70 3 0.4 70 30 3.8 0.4 70 30 4.0 0.4 30 70 5.5 0.4 30 70

d)柱温：35℃；

e)流速：0.4mL/min；

f)离子源：电喷雾电离源(ESI)；

g)检测方式：正离子；

h)扫描方式：多反应离子监测(MRM)；

i)雾化气、脱溶剂气：氮气；

j)碰撞气：氩气；

k)离子源温度：150℃；

l)雾化温度：500℃

m)毛细管电压：5.5kV；

n)定性、定量离子、去簇电压和碰撞能量条件如下：

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