CN114875108A - 一种基于葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力预测评估技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力预测评估技术。在体外受精胚胎单滴单胚培养过程中，分别于体外培养0、48和/或96小时时，利用高灵敏度微型光纤传感器对培养液中葡萄糖与谷氨酰胺含量进行测定；同时，观察并记录体外培养48h、168h与217h时卵裂胚、囊胚与孵化囊胚形成情况，研究单胚发育能力与葡萄糖、谷氨酰胺消耗水平的关联性，最终构建能预测胚胎后续发育能力优劣的能量底物评估体系。本发明创造性地将光纤传感检测技术与体外授精技术相结合，通过测定早期胚胎发育过程中两种关键能量底物葡萄糖与谷氨酰胺消耗水平，对相应胚胎后续发育能力展开评估，实现了对优质胚胎的早期筛选与生产利用。
Description
技术领域
本发明属于胚胎工程技术领域，尤其涉及一种基于葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力预测评估技术。
背景技术
动物胚胎工程技术已成为目前世界经济增长的一项重要支撑技术。近100年来，人们在动物胚胎工程技术上取得诸多突破，以及以此为基础建立的现代高新家畜繁育和人类试管婴儿产业上的巨大成功，意味着胚胎具有如“初春草籽”一样旺盛的生命力。因此，发展可靠准确的优质胚胎鉴定技术，对于促进胚胎技术在畜牧业和人类医学上的应用具有重要意义。
自动物胚胎工程技术问世以来，如何进行胚胎选择一直是一个重要课题。截至目前，用于胚胎质量评价的主要仪器还是光学显微镜，哪个胚胎被选择移植很大程度上依赖于技术人员对胚胎细胞数量、形态外观或者卵裂时间的观察，所以该方法不可避免的主观性限制了优质胚胎的鉴定和利用。因此，为了获得对发育中胚胎更为直观的认识，许多对胚胎有损伤的方法被优先使用，诸如对胚胎活体采用植入前基因诊断以及转录组或者蛋白质组鉴定等方法。这些有创技术需要从胚胎取出单个卵裂球进行分析，毫无疑问会对胚胎的进一步发育以及囊胚形成造成损害。
近年来，研究人员把研究焦点逐渐转向对胚胎无伤害的保持胚胎完整性的方法上来，其中，针对培养液进行功能成分分析为胚胎质量评估提供了有别于传统形态甄别技术的新思路和新观点。目前已成功商业化的胚胎培养液均来自于对胚胎发育环境(如输卵管与子宫)中成分的分析，以及对卵裂期胚胎营养需求的确定，其中针对胚胎消耗的成分进行综合分析，以期更好地理解胚胎整体健康，是一种较为理想的方法。但是该技术面临的最大挑战是，培养液中分泌或消耗成分复杂，多种代谢过程的不同阶段会产生各种各样的产物，所以对结果判断困难，且极易排除代表优质胚胎的数据，造成对胚胎质量的误判。因此，确定培养液中的关键成分对胚胎活力监测极为重要。
虽然研究人员在对培养液中关键成分分析方面取得了一些进展，也明确了其具有极大的临床预测价值，但是将这些发现应用于临床却面临着一项主要障碍，即：现有测定技术的局限性。1.目前采用的单一成分测定技术，无法完全满足低样本量和高灵敏度的培养液成分测定要求。待测成分在培养液中表达极其微量，需要高灵敏性的技术才能测量；同时，常用的培养体系包括两种：单胚培养滴一般15-40uL，群体培养容积可达400-500uL。虽然群体培养能够满足对分析物浓度的要求，但是无法获得单一胚胎数据。针对单胚培养滴这唯一选择，灵敏度和样本测试量成为限制技术应用的最大障碍。2.目前对培养液成分分析均基于静态样本，即从胚胎培养特定时刻获得培养液进行检测。由于胚胎发育是一个动态的充满变化的过程，以单次静态测试结果来评估经历复杂发育过程后胚胎的囊胚发育、妊娠以及出生能力，有一定片面性。3.以某单一成分作为胚胎质量预测的主要指标具有局限性，而基于多指标的综合评估体系尚未见报道。
故此，针对目前由于相关研究空白以及技术上的限制造成培养液成分分析难以被应用于生产的现状，本发明利用能够高灵敏度检测谷氨酰胺和葡萄糖水平的微型光纤传感器，采用微孔单滴单胚的体外胚胎培养系统，建立一种新型的能标识胚胎发育质量的两类物质综合预测评估体系，其中本发明依据的项目编号：2020-科技兴蒙-国创中心-12。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力预测评估技术，该技术具有快速检测、高灵敏度与不损伤胚胎分毫等优点，通过对早期发育胚胎质量进行预测评估，实现了对优质胚胎的早期筛选与生产利用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
提供一种基于葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力预测评估技术，包括以下步骤：
1)建立体外受精胚胎单滴单胚培养体系；
2)利用微型光纤传感器分别实时测定步骤1)所得胚胎体外培养0h、48h和/或96h时葡萄糖与谷氨酰胺含量，确定胚胎体外培养48h和/或96h时葡萄糖与谷氨酰胺消耗指标；
3)在步骤2)中对培养液成分进行抽取与测量的同时，相应胚胎持续培养，观察并记录体外培养48h、168h(D7)与217h(D9)时卵裂胚、囊胚与孵化囊胚形成情况；胚胎发育能力评定为：优等-三指标达成；中等-仅卵裂胚与囊胚指标达成，无孵化囊胚；差等-囊胚与孵化囊胚两项指标均未达成；
4)选择胚胎发育能力评定等级为优等、中等与差等胚胎，根据其体外培养48h和/或96h时时各等级胚胎的葡萄糖或谷氨酰胺消耗指标，形成与评定等级相对应的葡萄糖或谷氨酰胺消耗量变化区间值，建立与体外培养48h和/或96h时相对应的可标识胚胎质量等级的葡萄糖与谷氨酰胺消耗水平标准；
5)取体外胚胎，重复步骤1)和2)，测定体外培养48h和/或96h时葡萄糖或谷氨酰胺消耗指标，基于步骤4)所得标准，对体外胚胎发育潜力进行预测评估。
按上述方案，所述步骤1)中，所述建立体外受精胚胎单滴单胚培养体系具体为：利用96孔板来建立：40μL/滴/孔，每孔(每滴)放入1枚胚胎。
按上述方案，体外受精胚胎单滴单胚培养方式为：每隔48小时半量替换新鲜培养液的半量换液法，或者胚胎体外培养全程不需换液的序贯培养法。
更优选地，所述步骤2)中，当步骤1)选择序贯培养法进行胚胎体外培养时，可以将原来两个测试时段缩减为一个，仅测试48或者96小时；或者将培养方式修改为半量换液法，将抽取量由原来的10μL扩大为20μL以提高测试灵敏度。
按上述方案，所述步骤2)中，测量具体步骤为：
吸取步骤1)中体外培养0h时的培养液，利用胚胎培养水稀释为n倍体积，利用微型光纤传感器分别实时测定葡萄糖与谷氨酰胺含量，分别乘以n即得两类物质含量，即得培养时间为0时葡萄糖与谷氨酰胺的初始含量；同样方法检测体外培养48h和/或96h时的葡萄糖与谷氨酰胺含量，再分别减去培养时间为0时的初始含量，即得胚胎体外培养48h和/或96h时的葡萄糖与谷氨酰胺消耗指标。
优选地，吸取步骤1)中所得特定培养阶段的培养液10μL，利用胚胎培养水稀释为30μL体积，利用微型光纤传感器分别实时测定葡萄糖与谷氨酰胺含量，测试量各5μL/次/3次，将所得含量分别乘以3，即得对应阶段葡萄糖与谷氨酰胺含量。
按上述方案，所述步骤4)中，选择胚胎发育能力评定等级为优等、中等、差等的胚胎各6～10枚。
本发明同时检测体外胚胎发育过程中葡萄糖和谷氨酰胺的消耗值，其中葡萄糖是细胞正常生命活动必需的能量底物；谷氨酰胺可在细胞内被转化为还原性谷胱甘肽，后者可增强细胞修复与抗氧化能力，故培养液中两类营养物质的总体消耗情况能够更为全面地反映胚胎发育质量，避免单一指标检测的片面性。本发明通过研究单胚发育能力与葡萄糖、谷氨酰胺消耗水平的关联性，最终构建能预测胚胎后续发育能力优劣的能量底物评估体系。同时，利用光纤传感器实现了单胚培养滴中葡萄糖和谷氨酰胺的精准测量，克服了单胚培养滴中待测成分含量低、样本测试量小的技术障碍，使得动态监控单胚胚胎发育中葡萄糖和谷氨酰胺的消耗成为可能。本发明创造性地将光纤传感检测技术与体外授精技术相结合，通过测定早期胚胎发育过程中两种关键能量底物葡萄糖与谷氨酰胺消耗水平，对相应胚胎后续发育能力展开评估，实现了对优质胚胎的早期筛选与生产利用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种基于培养液中葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力的预测评估技术，通过综合可痕量测定培养液中葡萄糖与谷氨酰胺水平的光纤传感器与体外授精技术，对体外培养特定时刻的胚胎培养液成分与相应胚胎发育能力进行动态评估，通过早期发育胚胎质量进行预测评估，实现对优质胚胎的早期筛选与生产利用。该方法具有快速检测、高灵敏度与不损伤胚胎分毫等优点，旨在解决目前普通体式显微镜下进行形态学观察的主观性、有创技术对胚胎后续的人为伤害以及目前单一成分测定无法满足低测试量与高灵敏性的培养液测试要求等问题。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例中基于葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力预测评估技术，包括以下步骤：
步骤一，牛体外受精胚胎的获得：
从屠宰场被屠宰母牛卵巢中收集未成熟卵母细胞，经体外成熟与体外授精处理，获得牛体外受精胚胎。具体过程为：从屠宰场屠宰母牛体内取出卵巢，置于30～35℃的生理盐水带回实验室。用带有18#针头的注射器抽取卵巢表面直径为2-8mm大小的卵泡内容物，置于灭菌的培养皿内，在体式显微镜下选择卵丘完整包被且卵胞质基本均匀的牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，进行体外成熟培养；将种公牛冷冻细管精液在37℃的水浴中解冻，用含有10mM咖啡因钠(Sigma)的BO(受精A液)离心洗涤(2000r/min)两次，每次5min。第二次离心之后，静置2～3min，小心吸取上浮精子，加入同等体积的受精B液(BO+3mg/mlBSA+8μl/ml肝素)制成精子悬浮液，光镜下细胞计数使终浓度达到1×107mL-1。用精子悬浮液做受精小滴(100μl)，每小滴放入10～15枚成熟后的卵母细胞。精卵共孵育6～20小时(孵育时间按照不同的受精程序调整)后，振荡去除卵丘细胞，收集体外受精胚胎(受精卵)。
上述步骤也可采用体内成熟卵母细胞，经体外授精程序，获得牛体外受精胚胎。
步骤二，建立牛体外受精胚胎单滴单胚培养体系：
将获得的牛体外受精胚胎转入单滴单胚培养体系进行后续培养。胚胎发育培养液可以采用常规或者任意商品化胚胎发育液。单滴单胚培养体系的建立过程：在培养皿(直径为33mm)中制作4～6个培养液小滴，40μL/滴，每滴放入1枚胚胎，上覆石蜡油，转入5％CO2、39～39.5℃与100％湿度的培养环境下，持续培养。
上述步骤容易造成下列不利影响：同一培养皿中的多个培养小滴在操作过程中发生相混；培养液上层石蜡油给后续测量带来可能干扰。为了规避上述影响，单滴单胚培养体系也可以利用96孔板来建立：40μL/滴/孔，每孔(每滴)放入1枚胚胎，无需覆盖石蜡油。目前常规体外发育培养方式有两种：第一种为每隔48小时半量替换新鲜培养液的半量换液法；第二种为胚胎体外培养全程不需换液的序贯培养法。
步骤三，培养液中葡萄糖与谷氨酰胺含量动态测定：
吸取新鲜培养液10μL，利用胚胎培养水稀释为30μL体积，利用微型光纤传感器分别实时测定葡萄糖与谷氨酰胺含量，测试量各5μL/次/3次，将测得的两类物质初始平均含量分别乘以3，标记为：葡萄糖-X0与谷氨酰胺-Y0。随后，分别于胚胎体外培养不同阶段-体外培养48与96h，抽取原有胚胎培养液10μL/次，利用胚胎培养水稀释为30μL体积，进行葡萄糖与谷氨酰胺含量测试，测试量各5μL/次/3次。将测得的两类物质平均含量分别乘以3，标记为：葡萄糖-X48、X96与谷氨酰胺-Y48、Y96。随后，确定胚胎体外培养不同时段葡萄糖与谷氨酰胺消耗指标，以培养48小时后葡萄糖消耗值计算为例：葡萄糖消耗值(48h)＝葡萄糖-X0—葡萄糖-X48，其他时段葡萄糖与谷氨酰胺消耗值计算方式同上。单胚培养体系初始体积为40μL，两次液体收集总量为20μL，最终剩余培养液体积为20μL。剩余培养液体积与胚胎培养过程中两次液体抽取操作，对胚胎持续培养无不良影响。
上述步骤尤其适用序贯培养法。若上述步骤不能满足测试量与测试灵敏度的要求，备用方案为：仍沿用序贯培养法，将原来两个测试时段缩减为一个，仅测试48或者96小时，可以将待测量由原来10μL扩大为20～30μL；或者改用半量换液法，可以将抽取量由原来的10μL扩大为20μL，利用胚胎培养水稀释为30μL(1.5倍稀释)。待测物消耗指标计算，基本同上。
其中所采用微型光纤传感器属于表面等离子共振(SPR)传感器，将其传感探头(多模-无芯-多模(MNM)光纤)固定在夹具上，两端分别连接光源和光谱仪，将光源强度调节到合适值得到透射光谱。将传感探头中无芯光纤(已功能化)浸入到不同已知浓度的葡萄糖和谷氨酰胺溶液中，记录透射光谱，建立共振峰位置与葡萄糖和谷氨酰胺溶液浓度的标准曲线；根据待测共振峰位置可以反推出待测液中葡萄糖和谷氨酰胺浓度；测量精度可以达到0.001mM。
步骤四，牛体外胚胎发育能力评定：
在体外培养过程中，牛胚胎发育阶段和发育时效与其发育质量密切相关。其中，卵裂胚、囊胚与孵化囊胚的形成是衡量牛体外胚胎发育能力的三项关键标志。在对培养液成分进行抽取与测量的同时，相应胚胎持续培养，分别于体外培养特定时刻-48h、168h(D7)与217h(D9)，观察并记录48h、168h(D7)与217h(D9)时卵裂胚、囊胚与孵化囊胚形成情况；胚胎发育能力评定为：优等-三指标达成；中等-仅卵裂胚与囊胚指标达成，无孵化囊胚；差等-囊胚与孵化囊胚两项指标均未达成。
步骤五，葡萄糖消耗与胚胎发育能力相关性评估：
综合步骤三与步骤四的胚胎发育情况与培养液葡萄糖动态消耗等数据，建立胚胎发育潜力与葡萄糖消耗水平之间的关联参数指标体系。具体过程：分别选择胚胎发育能力评定等级为优等、中等、差等的胚胎各6～10枚，记录体外培养不同时段(48或96h)各等级胚胎的葡萄糖消耗指标，形成与评定等级相对应的葡萄糖消耗量变化区间值。
步骤六，谷氨酰胺消耗与胚胎发育能力相关性评估：
综合步骤三与步骤四的胚胎发育情况与培养液谷氨酰胺动态消耗等数据，建立胚胎发育潜力与谷氨酰胺消耗水平之间的关联参数指标体系。具体过程：分别选择胚胎发育能力评定等级为优等、中等、差等的胚胎各6～10枚，记录体外培养不同时段(48或96h)各等级胚胎的谷氨酰胺消耗指标，形成与评定等级相对应的谷氨酰胺消耗量变化区间值。
步骤七，建立牛体外胚胎发育潜力预测评估体系：
综合步骤五与步骤六数据，建立与体外培养特定时间相对应的可标识胚胎质量等级的葡萄糖与谷氨酰胺消耗水平标准；基于此标准，利用牛体外胚胎，重复步骤二～三，参考步骤五～六，对牛外胚胎发育潜力进行预测评估。
以下为具体实施例。
实施例1：
提供一种基于葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力预测评估技术，包括以下步骤：
1)建立体外受精胚胎单滴单胚培养体系：将经体外授精6～20h的牛胚胎放置常规或者商品化胚胎发育液中进行序贯培养，利用96孔板来建立：40μL/滴/孔，每孔(每滴)放入1枚胚胎；
2)随后在胚胎培养特定时刻0、48与96h，单次选取10μL胚胎培养液，利用胚胎培养水稀释为30μL(3倍稀释)，采用微型光纤传感器实时测定葡萄糖与谷氨酰胺含量，其测试量为各5μL/次/3次，计算48h与96h葡萄糖与谷氨酰胺消耗值；
3)同时记录胚胎的发育情况，分别于胚胎体外培养特定时刻-48h、168h与217h，观察卵裂胚、囊胚与孵化囊胚形成情况，对胚胎发育能力等级(优等、中等、差等)进行评定。具体为：当培养48h时，观察胚胎是否发育到卵裂胚，如果是，则记个A，如果否就记个A0；当培养168h时，观察胚胎是否可以发育至囊胚，如果是，则记个B，如果否，则记个B0；当培养217h时，观察胚胎是否可以发育至孵化囊胚，如果是，则记个C，如果否，则记个C0。具体胚胎发育能力等级评定为：如果同时有A、B和C，则为优等；如果只有A和B，则为中等，如果B和C均没有，则为差等。
4)综合上述胚胎发育等级与培养液葡萄糖与谷氨酰胺动态消耗数据，确定与体外培养特定时间相对应的可标识胚胎发育等级的葡萄糖与谷氨酰胺消耗标准(参见下表1)，并进行验证。
表1
5)选择3～6枚未知胚胎，重复上述1)～3)步骤，测定各胚胎48h或96h葡萄糖与谷氨酰胺消耗值与其相应后续胚胎发育等级，对步骤4)确定的标识胚胎发育等级的葡萄糖与谷氨酰胺消耗标准进行验证。实验证明，胚胎48h或96h葡萄糖与谷氨酰胺消耗值与其相应后续胚胎发育等级与表1中标准相一致，证明了本发明体外胚胎发育潜力预测评估技术的准确性。
Claims (7)
1.一种基于葡萄糖与谷氨酰胺水平测试的体外胚胎发育潜力预测评估技术，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立体外受精胚胎单滴单胚培养体系；
2)利用微型光纤传感器分别实时测定步骤1)所得胚胎体外培养0h、48h和/或96h时葡萄糖与谷氨酰胺含量，确定胚胎体外培养48h和/或96h时葡萄糖与谷氨酰胺消耗指标；
3)在步骤2)中对培养液成分进行抽取与测量的同时，相应胚胎持续培养，观察并记录体外培养48h、168h与217h时卵裂胚、囊胚与孵化囊胚形成情况；胚胎发育能力评定为：优等-三指标达成；中等-仅卵裂胚与囊胚指标达成，无孵化囊胚；差等-囊胚与孵化囊胚两项指标均未达成；
4)选择胚胎发育能力评定等级为优等、中等与差等胚胎，根据其体外培养48h和/或96h时各等级胚胎的葡萄糖或谷氨酰胺消耗指标，形成与评定等级相对应的葡萄糖或谷氨酰胺消耗量变化区间值，建立与体外培养48h和/或96h时相对应的可标识胚胎质量等级的葡萄糖与谷氨酰胺消耗水平标准；
5)取体外胚胎，重复步骤1)和2)，测定体外培养48h和/或96h时葡萄糖或谷氨酰胺消耗指标，基于步骤4)所得标准，对体外胚胎发育潜力进行预测评估。
2.根据权利要求1所述的预测评估技术，其特征在于，所述步骤1)中，所述建立体外受精胚胎单滴单胚培养体系具体为：利用96孔板来建立：40μL/滴/孔，每孔(每滴)放入1枚胚胎。
3.根据权利要求1所述的预测评估技术，其特征在于，体外受精胚胎单滴单胚培养方式为：每隔48小时半量替换新鲜培养液的半量换液法，或者胚胎体外培养全程不需换液的序贯培养法。
4.根据权利要求3所述的预测评估技术，其特征在于，所述步骤2)中，当步骤1)选择序贯培养法进行胚胎体外培养时，可以分别选择48h或96h，将两次测试减少为一次；或者将培养方式修改为半量换液法，提高测试量以提高测试灵敏度。
5.根据权利要求1所述的预测评估技术，其特征在于，所述步骤2)中，测量具体步骤为：
吸取步骤1)中体外培养0h时的培养液，利用胚胎培养水稀释为n倍体积，利用微型光纤传感器分别实时测定葡萄糖与谷氨酰胺含量，分别乘以n即得两类物质含量，即得培养时间为0时葡萄糖与谷氨酰胺的初始含量；同样方法检测体外培养48h和/或96h时的葡萄糖与谷氨酰胺含量，再分别减去培养时间为0时的初始含量，即得胚胎体外培养48h和/或96h时的葡萄糖与谷氨酰胺消耗指标。
6.根据权利要求5所述的预测评估技术，其特征在于，吸取步骤1)中体外培养0h、48h或96h时的培养液10μL，利用胚胎培养水稀释为30μL体积，利用微型光纤传感器分别实时测定葡萄糖与谷氨酰胺含量，测试量各5μL/次/3次，将所得含量分别乘以3，即得对应阶段葡萄糖与谷氨酰胺含量。
7.根据权利要求1所述的预测评估技术，其特征在于，所述步骤4)中，选择胚胎发育能力评定等级为优等、中等、差等的胚胎各6～10枚。
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|---|---|---|---|---|
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