CN112062755A - 用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针、制备方法及用途 - Google Patents

用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针。该探针分子式为C35H36N3O4 +，结构式如下。该探针以N末端天冬氨酸作为响应基团检测天冬氨酰氨肽酶具有非常优异的选择性，响应效果好，并且其近红外吸收与荧光的发射的特性使其能很好的运用于活体成像，吸收和发射均在近红外区具有较强的生物体穿透性，还能减少生物体自发荧光的干扰，检测高效。
Figure DDA0002700383170000011

Description

用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针、制备方法 及用途
技术领域
本发明涉及荧光分子探针、制备方法及其用途，特别涉及用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针。
背景技术
天冬氨酰氨肽酶属于基质金属蛋白酶18家族，在生物体内广泛分布，通过水解N末端天冬氨酸来调节生物活性肽的活性，从而参与到各种生理或病理过程中，例如血管再生，水解平衡，血压等。生物体内不正常的天冬氨酰氨肽酶浓度往往与一些癌症有关，包括脑癌、直肠癌和乳腺癌等。为了弄清天冬氨酰氨肽酶在肿瘤发生、发展中的作用，就要对其体内水平进行实时监测。目前对天冬氨酰氨肽酶的检测手段主要为免疫印迹和酶联免疫吸附，这两种手段都需要提取酶之后再检测，不能实时精确反映体内天冬氨酰氨肽酶的水平。只有实时的，精确的对体内天冬氨酰氨肽酶进行监测才能促进对天冬氨酰氨肽酶在癌症中作用机理的研究。
传统检测天冬氨酰氨肽酶的方法需要提取纯化天冬氨酰氨肽酶后再检测，在提取过程中会导致酶的失活，这样检测的结果只能反应提取到的酶的量而不能体现酶的活性。此外，体内也有失活的天冬氨酰氨肽酶，而天冬氨酰氨肽酶发挥作用依靠其活性。因此检测有活性的天冬氨酰氨肽酶更能真实体现天冬氨酰氨肽酶的作用。利用天冬氨酰氨肽酶可以特异性识别N末端天冬氨酸并切除的特性，既能实现对天冬氨酰氨肽酶的特异性检测，又能真实体现其活性。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供具有选择性强、响应效果好、实时高效的用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针。
本发明另一目的是提供所述近红外荧光分子探针的制备方法和用途。
技术方案：本发明提供一种用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针，
其分子式为C35H36N3O4 +，结构式如下：
Figure BDA0002700383150000011
所述的用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针的制备方法，包括如下步骤：
Figure BDA0002700383150000021
(1)冰浴条件下，将二氯甲烷缓慢加入到N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯中，冷却后搅拌，然后缓慢加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺，搅拌；
(2)向步骤(1)中的反应液中加入化合物1，搅拌；
(3)去除冰浴条件，恢复至室温，搅拌，反应，反应结束的时机为溶液变蓝；
(4)反应液进行过滤，取滤液；
(5)冰浴条件下向滤液中加入三氟乙酸，搅拌，反应结束的时机为溶液中不溶物不再增多；
(6)去除冰浴，搅拌，恢复室温，反应；
(7)将(6)中反应液过滤，取滤渣，即得。
进一步地，所述N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯与二氯甲烷的体积比为1∶(5-10)。
进一步地，所述步骤(5)中三氟乙酸与滤液的体积比1mmol∶5-10ml。
进一步地，所述化合物1、N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺的摩尔比为1∶(2-4)∶(2-4)∶(2-4)。
所述的用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针在检测天冬氨酰氨肽酶中的用途。
进一步地，所述天冬氨酰氨肽酶为溶液中、细胞中或者活体中的天冬氨酰氨肽酶。
本发明荧光分子的结构为R-Asp，其中R为近红外荧光团
Figure BDA0002700383150000022
，能吸收近红外的光并发出波长更长的荧光。原理为：具有吸电子能力的天冬氨酸(Asp)通过酰胺键修饰到荧光团R上，形成R-Asp结构(即本发明所述探针)，产生N末端天冬氨酸。由于发生光致电子转移，使得荧光团R失去荧光效应；当N末端天冬氨酸被天冬氨酰氨肽酶识别并水解酰胺键后，荧光团R被释放，恢复荧光能力。与天冬氨酰氨肽酶反应前后的近红外荧光分子探针荧光能力的变化使得其可以精准的检测天冬氨酰氨肽酶。并且，荧光分子探针的近红外特性可以使得检测的深度以及分辨率得到提高。此外相较于传统检测方法，近红外荧光分子探针检测可以不用分离纯化天冬氨酰氨肽酶。通过细胞以及活体成像实验显著性效果，可以看到该探针应用于临床之中的潜力。
有益效果：本发明具有如下优势：
1、本发明以N末端天冬氨酸作为响应基团检测天冬氨酰氨肽酶具有非常优异的选择性，响应效果好，并且其近红外吸收与荧光的发射的特性使其能很好的运用于活体成像等。
2、本发明的近红外荧光探针吸收和发射均在近红外区具有较强的生物体穿透性，还能减少生物体自发荧光的干扰。
3、本发明的近红外荧光探针具有较小的生物毒性。
4、本发明的近红外荧光探针具有较好的细胞成像效果。
附图说明
图1是本发明近红外荧光探针的核磁氢谱表征(氘代甲醇)图；
图2是本发明近红外荧光探针与天冬氨酰氨肽酶响应的荧光变化图；
图3是本发明近红外荧光探针的MTT实验数据图(图中横坐标单位为μM)；
图4是本发明近红外荧光探针的共聚焦显微镜细胞成像图。
具体实施方式
实施例1
本实施例检测天冬氨酰氨肽酶近红外荧光探针的制备：
将N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯加入到圆底烧瓶中，在冰浴的条件下缓慢加入二氯甲烷，然后搅拌；待冰浴10min后，维持冰浴并加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺，搅拌30min后加入化合物1。然后，维持搅拌，撤除冰浴，自然恢复至室温；室温反应一段时间后，溶液变蓝，然后用沙芯漏斗过滤，取滤液。冰浴条件下，向滤液中缓慢加入三氟乙酸，边加边搅拌。加完三氟乙酸后，撤除冰浴，自然恢复室温，反应一段时间后，溶液中出现大量不溶物，过滤，收集滤渣，得到蓝色固体。
所述N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯与二氯甲烷的比例1mmol∶5mL。
所述化合物1、N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺的摩尔比1∶4∶4∶4。
所述三氟乙酸与滤液的体积比1∶5。
所得探针经纯化处理后，经过核磁氢谱及质谱检测得图1。[M+]562.5，1H NMR(400MHz，MeOD)δ8.90(d，J＝15.1Hz，1H)，8.37(d，J＝8.5Hz，1H)，8.18(d，J＝9.0Hz，1H)，8.12(d，J＝8.2Hz，1H)，8.02(s，1H)，7.84(d，J＝8.9Hz，1H)，7.77(t，J＝7.5Hz，1H)，7.65(t，J＝7.5Hz，1H)，7.47(dd，J＝20.9，8.5Hz，2H)，7.32(s，1H)，6.65(d，J＝15.1Hz，1H)，4.58(q，J＝6.9Hz，2H)，4.26(t，J＝6.5Hz，1H)，2.84(ddt，J＝22.3，16.4，6.7Hz，6H)，2.12(s，6H)，1.99(t，2H)，1.59(t，J＝7.2Hz，3H)，1.51-1.45(m，4H)。
实施例2
本实施例检测天冬氨酰氨肽酶近红外荧光探针的制备：
将N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯加入到圆底烧瓶中，在冰浴的条件下缓慢加入二氯甲烷，然后搅拌；待冰浴10min后，维持冰浴并加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺，搅拌30min后加入化合物1。然后，维持搅拌，撤除冰浴，自然恢复至室温；室温反应一段时间后，溶液变蓝，然后用沙芯漏斗过滤，取滤液。冰浴条件下，向滤液中缓慢加入三氟乙酸，边加边搅拌。加完三氟乙酸后，撤除冰浴，自然恢复室温，反应一段时间后，溶液中出现大量不溶物，过滤，收集滤渣，得到蓝色固体。
所述N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯与二氯甲烷的比例1mmol∶10mL。
所述化合物1、N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺的摩尔比1∶2∶2∶2。
所述三氟乙酸与滤液的体积比1∶2。
实施例3
本实施例检测天冬氨酰氨肽酶近红外荧光探针的制备：
将N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯加入到圆底烧瓶中，在冰浴的条件下缓慢加入二氯甲烷，然后搅拌；待冰浴10min后，维持冰浴并加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺，搅拌30min后加入化合物1。然后，维持搅拌，撤除冰浴，自然恢复至室温；室温反应一段时间后，溶液变蓝，然后用沙芯漏斗过滤，取滤液。冰浴条件下，向滤液中缓慢加入三氟乙酸，边加边搅拌。加完三氟乙酸后，撤除冰浴，自然恢复室温，反应一段时间后，溶液中出现大量不溶物，过滤，收集滤渣，得到蓝色固体。
所述N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯与二氯甲烷的比例1mmol∶7mL。
所述化合物1、N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺的摩尔比1∶3∶3∶3。
所述三氟乙酸与滤液的体积比1∶4。
实施例4
近红外荧光探针与天冬氨酰氨肽酶体外响应荧光发射测量实验：
称取5.62mg探针溶于1mL DMSO，配置成10mM探针母液。准备8个5mL的离心管，依次在每个离心管加入3mL PBS缓冲液(pH＝7.4)后，再加入3μL的探针母液，此时每个离心管探针浓度为10μM。待充分混匀后在每个离心管中分别加入0、4、8、12、16、20、24、28μL的天冬氨酰氨肽酶溶液，37℃孵育60分钟后，依次加入比色皿中进行荧光发射的检测(激发光波长为690nm)，所得数据经origin软件处理得图2，随着酶浓度的增加，荧光逐渐增强，这表明探针在溶液中与天冬氨酰氨肽酶的响应效果好。
实施例5
近红外荧光探针与U87细胞进行MTT生物相容性实验：
在96孔板的外围一圈加入PBS溶液，在剩余内部孔中铺满U87细胞，培养12小时。称取5.62mg探针溶于5mL生物用DMSO溶液，配置成2mM生物用探针母液。配置5mg/mL MTT溶液。准备6个5mL的离心管，均加入2mL培养基，依次在离心管中加入0、2、4、6、8、10μL生物用探针母液。将6个离心管中溶液吸取190μL依次横排等浓度加入6排孔中孵育24h后，在每个孔中加入10μLMTT溶液。继续孵育3小时，倒掉液体中培养基，在每个孔中均加入100μL DMSO溶液。待充分溶解后，进行紫外吸收检测(检测波长为490nm)。用origin进行数据处理得图3，探针在0～10μL浓度范围内，细胞生存率在90％以上，表明探针的生物适用性较好，细胞毒性小。
实施例6
近红外荧光探针与天冬氨酰氨肽酶响应的共聚焦显微镜细胞实验：
在一个共聚焦皿中铺适当浓度的U87细胞，另一个共聚焦皿中铺适当浓度的L02细胞，培养至细胞状态优良，将共聚焦皿中培养基吸取干净。吸取实施例3中生物用探针母液8μL加入2mL培养基中充分混匀，并吸取1mL分别加入两个共聚焦皿中孵育60分钟后，倒掉培养基。用多聚甲醛溶液固定10分钟后，加入DAPI染色液分别进行染色5分钟，PBS缓冲液冲洗3次加入多聚甲醛溶液继续固定保存。共聚焦显微镜拍摄图片如图4，U87细胞成像效果好，而L02细胞无明显成效果，这表明探针能与细胞中的天冬氨酰氨肽酶特异性响应，对天冬氨酰氨肽酶成像效果好。

Claims (7)

1.一种用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针，其分子式为C35H36N3O4 +，结构式如下：
Figure FDA0002700383140000011
2.权利要求1所述的用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
Figure FDA0002700383140000012
(1)冰浴条件下，将二氯甲烷缓慢加入到N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯中，冷却后搅拌，然后缓慢加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺，搅拌；
(2)向步骤(1)中的反应液中加入化合物1，搅拌；
(3)去除冰浴条件，恢复至室温，搅拌，反应；
(4)反应液进行过滤，取滤液；
(5)冰浴条件下向滤液中加入三氟乙酸，搅拌；
(6)去除冰浴，搅拌，恢复室温，反应；
(7)将(6)中反应液过滤，取滤渣，即得。
3.根据权利要求1所述的用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针，其特征在于：所述N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯与二氯甲烷的体积比为1mmol∶(5-10mL)。
4.根据权利要求1所述的用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针，其特征在于：所述步骤(5)中三氟乙酸与滤液的体积比1∶(2-5)。
5.根据权利要求1所述的用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针，其特征在于：所述化合物1、N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸1-叔丁酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺的摩尔比为1∶(2-4)∶(2-4)∶(2-4)。
6.权利要求1所述的用于检测天冬氨酰氨肽酶的近红外荧光分子探针在检测天冬氨酰氨肽酶中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述天冬氨酰氨肽酶为溶液中、细胞中或者活体中的天冬氨酰氨肽酶。
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