CN107793386B - 荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

荧光探针及其制备方法和用途。所述的荧光探针具有式I的结构。本发明的上述式I结构的荧光探针分子是基于分子内电荷转移(Intramolecular Charge Transfer,简称ICT)机理设计而成的具有优良双光子性能的长波长荧光探针。通过靶向癌细胞表面过表达的γ‑谷氨酰胺转移酶，识别位点被酶选择性的切断，从而释放出强的供电子基团，长波长处的荧光得以增强。该例荧光探针具有良好的溶解性、较强的光稳定性、不受体系酸碱性影响和双光子激发(激发波长800nm)等优点，并且能实现对癌细胞选择性地共聚焦荧光成像。

Description

荧光探针及其制备方法和用途
技术领域
本发明属精细化工领域，涉及一种用于区分正常细胞与癌细胞荧光探针的制备方法及其应用。
背景技术
随着生存环境的恶化和生活压力的增大，人类患癌症疾病人数呈现急剧增加的趋势。据统计，2015年全世界上有1410万人新增癌症患者，死亡人数高达820万人，预计将来20年新发病例将增加70％。由于诊断不及时和缺少有效的个性化治疗方案，癌症患者治疗无效率高达75％。对于一个普通家庭，往往带来灾难性的打击。尽管政府每年投入大量的研究经费，以期望攻克治疗癌症的疾病。但是就目前而言，通过“早发现、早诊断、早治疗”方案，能够有效提高治疗效果，甚至达到治愈的结果，提升患者的生存质量。
正常细胞癌变后，往往会有一些特异性的生物酶过量分泌。在卵巢癌、肝癌和宫颈癌等细胞中会出现γ-谷氨酰胺转移酶(γ-GGT)过量的表达，γ-GGT在医学分子水平上被认为是一种重要的癌症标志物。可以通过检测γ-谷氨酰胺转移酶的含量水平来对癌症的早期诊断，以达到早治疗的目的。
基于荧光探针具有灵敏度高、选择性好、实时原位和可视化无损检测等优点，并且还能克服传统方法中存在的样品预处理过程复杂、仪器价格昂贵和无法实时原位可视化等缺点，所以，荧光探针在分子生物检测领域得到广泛的应用。然而到目前为止，市面上商业化用于检测γ-谷氨酰胺转移酶的试剂盒是以香豆素为荧光基团，这种荧光探针需要用单光子激发，激发波长短，组织穿透能力低，难以用于活体肿瘤成像的应用。尤其基于靶向过表达的γ-谷氨酰胺转移酶，来区分正常细胞和癌细胞混合培养的癌细胞的荧光探针未见文献报道。因此，开发靶向γ-谷氨酰胺转移酶识别癌细胞性能优良的小分子荧光探针具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向癌细胞过表达γ-谷氨酰胺转移酶的荧光探针化合物，用以实现对癌细胞可视化的检测。
本发明首先提供一种具有式I的结构的荧光探针：
Figure GDA0001548109140000021
另一方面，本发明提供上述具有式I结构的荧光探针的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)化合物2与化合物6在(碱)哌啶或吡啶存在条件下按照摩尔比1:1～1:2反应，制备(中间体)化合物7；所述反应的溶剂是乙醇、乙腈、甲苯或N,N-二甲基甲酰胺；反应体系温度80～120℃；反应时间10～24h；
Figure GDA0001548109140000022
(2)(在反应体系中)化合物7与脱Boc保护试剂按照摩尔比1:50～1:200混合后反应得到式I的荧光探针；所述的脱Boc保护试剂为三氟乙酸或者氯化氢；所述反应的溶剂是二氯甲烷或者四氢呋喃；反应体系温度0～30℃；反应时间为10～24h。
本发明的上述式I结构的荧光探针分子是基于分子内电荷转移(IntramolecularCharge Transfer,简称ICT)机理设计而成的具有优良双光子性能的长波长荧光探针。通过靶向癌细胞表面过表达的γ-谷氨酰胺转移酶，识别位点被酶选择性的切断，从而释放出强的供电子基团，长波长处的荧光得以增强。该例荧光探针具有良好的溶解性、较强的光稳定性、不受体系酸碱性影响和双光子激发(激发波长800nm)等优点，并且能实现对癌细胞选择性地共聚焦荧光成像。
基于此，本发明进一步提供上述本发明的荧光探针在γ-谷氨酰胺转移酶检测、γ-谷氨酰胺转移酶相关癌细胞检测及制备相关检测试剂中的应用。
具体地，本发明提供一种γ-谷氨酰胺转移酶检测试剂，以及一种癌细胞检测试剂，二者均含有效剂量的上述本发明的具有式I结构的荧光探针。上所述的检测试剂用于标记并检测γ-谷氨酰胺转移酶表达量异常的癌细胞。该异常表达通常是指过表达。并适用于单双光子共聚焦荧光成像检测手段。这些试剂可以实现在正常细胞和癌细胞混合培养条件下从2D到3D尺度上对癌细胞有效的标记与荧光成像，可用于实验室或临床生物样品中癌细胞的早期检测。
附图说明
本发明附图11幅，如下所示：
图1是本发明的荧光探针在PBS缓冲溶液中的溶解度试验结果；
图1a是不同探针浓度的吸收光谱图；
图1b是最大吸收峰位处吸光度值与探针加入量的线性关系图。
图2是本发明的荧光探针在不同溶剂中的物理光谱行为结果；
图2a是探针在不同溶剂的紫外可见吸收光谱图；
图2b是探针在不同溶剂的荧光光谱图。
图3是本发明的荧光探针在PBS缓冲溶液中不同时刻的荧光光谱图；
图4是本发明的荧光探针细胞毒性测试(MTT法)结果图；
图5是本发明的荧光探针用于细胞水平上时间尺度的共聚焦荧光成像图；
图5a是探针在正常细胞(小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3 cells)共聚焦成像，其中：a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)和o)分别是2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟、12分钟、14分钟、16分钟、18分钟、20分钟、22分钟、24分钟、26分钟和28分钟的成像结果；
图5b是探针在癌细胞(人卵巢癌A2780 cells)共聚焦成像；其中：a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)和o)分别是2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟、12分钟、14分钟、16分钟、18分钟、20分钟、22分钟、24分钟、26分钟和28分钟的成像结果。
图6是本发明的荧光探针在细胞水平上的共聚焦成像；
图6a和6b是明场图；
图6c和6d是荧光图；
图6e和图6f是叠加图。
图7是验证本发明荧光探针在识别癌细胞可用性共聚焦试验结果图；
图7a和7b是本发明探针分子的共聚焦成像图；
图7c和7d是中间体化合物7的共聚焦成像图；
图7e和7f是本发明探针分子的共聚焦成像图；
图7g和7h是中间体化合物7的共聚焦成像图；
图8是本发明荧光探针在细胞水平抑制实验结果图；
图8a-c是空白对照组成像图；
图8d-f是加入本发明荧光探针组的成像图；
图8g-i是抑制实验组成像图；
图8j是提取的荧光信息强度值对比图。
图9是本发明荧光探针在人肝癌细胞HepG-2双光子荧光共聚焦成像图；
图9a是明场图；
图9b是荧光图；
图9c是叠加图；
图中，标尺长度为20μm。
图10是本发明的荧光探针在人卵巢癌A2780细胞上亚细胞器分布试验结果图；
图10a是商业化溶酶体染料染细胞效果图；
图10b是本发明荧光探针染细胞效果图；
图10c是10a和10b的叠加图；
图10d是复染的皮尔森系数图；
图中，标尺长度为20μm。
图11是本发明的荧光探针在正常细胞和癌细胞混合培养下的激光共聚焦成像图；
图11a是用商业化细胞核染料Hoechst33342染卵巢癌A2780细胞和正常细胞NIH-3T3的激光共聚焦成像图；、
图11b是商业化细胞核染料Hoechst33342和本发明的荧光探针染卵巢癌A2780细胞和正常细胞NIH-3T3的3D的激光共聚焦成像图；
图11c是商业化细胞核染料Hoechst33342和本发明的荧光探针染卵巢癌A2780细胞和正常细胞NIH-3T3的横向切面激光共聚焦成像图。
具体实施方式
本发明所述的这种荧光探针，具有如下图式I的结构：
Figure GDA0001548109140000051
为此，中间体化合物7用于与式I分子作对比，其结构如下图：
Figure GDA0001548109140000052
中间体化合物7
另一方面，本发明提供上述本发明具有式I结构的荧光探针的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)化合物1与丙二腈按照摩尔比1:2～1:4反应制备化合物2；
Figure GDA0001548109140000053
(2)化合物3与化合物4按照摩尔比1:1～1:2反应制备化合物5；
Figure GDA0001548109140000054
(3)化合物5与二氧化锰按照摩尔比1:5～1:10反应制备化合物6；
Figure GDA0001548109140000055
(4)化合物2与化合物6按照摩尔比1:1～1:2反应制备化合物7；
Figure GDA0001548109140000061
(5)化合物7与三氟乙酸按照摩尔比1:50～1:200反应制备式I的化合物；
Figure GDA0001548109140000062
具体实施方式中，上述本发明的荧光探针可以通过下述方法制备：
(1)以10ml乙醇为反应溶剂，将504mg乙醇钠小心加入乙醇中，然后，依次加入化合物1 5g和丙二腈6.72g，两者摩尔比控制在1:2～1:4，氮气保护，搅拌1h已到达均匀目的。然后在加入30ml乙醇，加热回流1h，反应完成之后冷却，用6M浓盐酸调节反应体系pH至4-5，冷却静置有大量固体生成，抽滤、洗涤得到化合物2。化合物2的结构经过核磁和普通质谱表征。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.38(s,3H),1.61(s,6H)。
MS-ESI:m/z理论值：C11H9N3O,199.07；实测值：198.17。
(2)在50mL圆底烧瓶中依次加入570mg(1.5mM)2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、229mg(1mM)Boc保护的L-焦谷氨酸和194mg(1.5mM)N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。投料后再加入5ml干燥的二甲基甲酰胺溶解，加氮气保护装置。在冰浴条件下搅拌20～30min。取246mg(2mM)对氨基苯甲醇，溶于3ml干燥的二甲基甲酰胺DMF中，用注射器缓慢滴加。搅拌过夜。然后用乙酸乙酯萃取3次，加入无水硫酸钠干燥过夜，经过柱层析分离得到乳白色化合物5。化合物5的结构经过核磁和普通质谱表征。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.85(s,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),7.16(d,J＝7.8Hz,1H),5.08(s,1H),4.44(d,J＝5.7Hz,2H),3.85(dd,J＝13.3,9.1Hz,1H),2.40(t,J＝7.5Hz,2H),2.11-1.92(m,1H),1.81(dd,J＝13.4,8.6Hz,1H),1.41(d,J＝6.6Hz,18H).
MS-ESI:m/z理论值：C21H32N2O6,408.22；实测值：409.23。
(3)称取408mg(1mM)化合物5放入50ml圆底烧瓶中，加入10mL二氯甲烷搅拌溶解。然后加入5g活化过的二氧化锰，溶液呈黑色。回流，反应4h。待反应结束后，先把二氧化锰过滤掉，用二氯甲烷洗涤几次，柱层析分离得到白色化合物6。化合物6的结构经过核磁和普通质谱表征。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.33(s,1H),9.88(s,1H),7.86(d,J＝8.6Hz,2H),7.80(d,J＝8.5Hz,2H),7.17(d,J＝7.7Hz,1H),3.86(d,J＝4.9Hz,1H),2.14–1.90(m,2H),1.88–1.72(m,2H),1.40(d,J＝8.0Hz,18H).
MS-ESI:m/z理论值：C21H30N2O6,406.21；实测值：405.40。
(4)称取化合物2 199mg(1mM)，化合物6原料332mg(1mM)和1-2滴哌啶放入50mL圆底烧瓶，加入10mL无水乙醇，搅拌溶解，氮气保护，加热回流过夜。待反应体系冷却后，直接减压真空旋干，柱层析分离得到橙红色固体化合物7。化合物7的结构经过核磁和普通质谱表征。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.32(s,1H),7.89(s,2H),7.76(s,3H),7.14(d,J＝18.1Hz,2H),4.02(s,1H),2.38(s,2H),2.00(s,2H),1.80(s,6H),1.41(s,18H).
MS-ESI:m/z理论值：C32H37N5O6,587.27；实测值：610.30。
(5)称取58mg(0.1mM)化合物7放于20ml圆底烧瓶中，加入2mL干燥的二氯甲烷，冰浴搅拌20min，然后逐渐滴加1mL二氯甲烷和1mL三氟乙酸混合液，滴加完毕之后，氮气保护，常温搅拌过夜。然后，直接柱层析分离得到式I化合物。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.85(d,J＝16.4Hz,1H),7.74(s,4H),7.11(d,J＝16.4Hz,1H),4.06(t,J＝6.5Hz,1H),2.74(t,J＝7.0Hz,2H),2.27(dd,J＝13.0,6.6Hz,2H),1.79(s,6H).化合物I的结构经过核磁和高分辨质谱表征。
HRMS-ESI:m/z理论值：C23H21N5O4,431.1594；实测值：432.1672。
下面的实施例可以使本领域的普通技术人员更加全面地理解本发明的内容，但不加以任何方式限制本发明。如无特殊说明，下述实施例中所述及的荧光探针即是采用上述方法合成得到并经结构鉴定的符合结构式I的荧光探针。
实施例1
荧光探针在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中的溶解度测试。
将荧光探针的先用二甲基亚砜溶剂在容量瓶中配成母液。然后用微量进样器取样，配成0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、80μM浓度的溶液，在紫外可见吸收光谱仪器分别进行扫描，得到如图1a紫外可见吸收光谱图。取最大吸收峰位置的吸收强度(Abs)为纵坐标，浓度为横坐标作图(图1b)。发现随着浓度的不断增加，浓度与吸收强度呈现很强的线性关系(R2＝0.9999)，表明本发明的荧光探针在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中具有良好的溶解性。
实施例2
考察荧光探针在常见不同溶剂的紫外可见吸收与荧光发射实验。
将5μM荧光探针分别加入到二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中分别扫描其紫外可见吸收光谱(图2a)和荧光光谱(图2b)。在大多数溶剂中探针吸收峰位置基本不变，只有在DMF中吸收峰发生明显的蓝移。荧光探针在DMSO溶液中发光最强。
实施例3
考察荧光探针在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中稳定性实验。将5μM本发明的荧光探针加入到PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，分别在0、10、20、30、40、50、60、70min扫描其荧光光谱(图3)。荧光强度基本上不随着时间变化，发明本发明的荧光探针在模拟的生理环境下具有优良的稳定性。
实施例4
考察荧光探针的细胞毒性试验。取人乳腺癌细胞(MCF-7)置于培养基(DMEM)中。培养基中含有胎牛血清(FBS)10％，FBS经过加热处理，已经失活。培养基中另有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素用来杀灭杂菌。将培养基放入培养箱中培养，温度37℃，气体含5％CO2，95％O2。在实验之前将细胞接种到培养皿中，分别加入不同浓度的荧光探针(浓度分别为0、1、5、10、20μM)，放入培养箱中培养24个小时，在每个培养皿中加入MTT溶液(5.0mg/mL，100μL)，在37℃下培养4小时，除去多余MTT溶液，在培养皿中加入100μL二甲基亚砜，将蓝紫色甲瓒(Formazan)晶体溶解。用酶联免疫检测仪测定其吸光度，从而测定出细胞的存活率，如图4。通过计算得出本发明的荧光探针浓度在20μM条件下，孵育24h细胞存活率在85％左右，表明该探针可以用于细胞共聚焦成像。
实施例5
考察荧光探针可以通过靶向癌细胞表面过表达的活性酶，从而实现区分正常细胞与癌细胞的目的。选取正常细胞小鼠成纤维细胞NIH-3T3和人卵巢癌细胞A2780，分别加入本发明荧光探针5μM孵育，每2分钟进行一次荧光共聚焦成像。如图5a所示，30分钟后，正常细胞NIH-3T3没有观察到荧光信号；相对比而言，图5b，随着时间的推延，人卵巢癌细胞A2780中的荧光信号越来越强，大约16min左右达到最强值。这可以说明该发明的荧光探针可以实现区分正常细胞与癌细胞的作用。
实施例6
为了更好的说明该发明的荧光探针可以实现区分正常细胞与癌细胞的功能，我们将荧光探针5μM孵育的卵巢癌细胞A2780和正常细胞小鼠成纤维细胞NIH-3T3放在一起对比。图6a和6b是明场图；图6c和6d是荧光图；图6e和图6f是叠加图。标尺长度为20μm。通过图6a和6b是明场图，发现两种细胞状态良好；通过图6c和6d是荧光图，发现癌细胞荧光信号很强，正常细胞荧光信号很弱或者没有，进一步表明本发明的荧光探针具有区分正常细胞与癌细胞的功能。
实施例7
γ-谷氨酰胺转移酶过表达的癌细胞主要有卵巢癌、宫颈癌和肝癌细胞。为了更好的说明该分明的探针识别位点具有专一性，我们将Boc保护的识别位点中间体化合物7在卵巢癌和宫颈癌细胞上进行验证。如图7a-b和7e-f图所以，用本发明的荧光探针5μM孵育过得癌细胞，具有荧光信号，且卵巢癌中荧光信号强度比宫颈癌细胞要强。而用Boc保护之后的荧光探针如图7c-d和7g-h癌细胞没有荧光信号。表明该例荧光探针的识别位点对癌细胞表面过表达的酶具有专一性。
实施例8
为了进一步说明该发明的荧光探针对癌细胞表面γ-谷氨酰胺转移酶具有专一的识别性，我们进行了细胞抑制性实验。如图8a-c是空白对照组，细胞内没有任何的荧光信号；图8d-f是加入本发明荧光探针孵育人卵巢癌2780后，发现细胞中具有很强的荧光信号；图8g-i是先加入50μM 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，DON抑制剂，会抑制γ-谷氨酰胺转移酶的活性。随后，再加入本发明的5μM荧光探针孵育人卵巢癌2780后，发现对比于图8d-f荧光信号强度减弱很多。为了更好量化每组的荧光信号强度，提取每组的荧光强度作图如图8j，说明该发明的荧光探针对γ-谷氨酰胺转移酶具有专一的选择性。
实施例9
为了拓展本发明的荧光探针的应用，弥补短波长激发带来的缺点。探究了该探针的双光子性能。加入本发明的5μM荧光探针孵育人肝癌细胞HepG-2后，采用激发波长800nm，采集570-630nm荧光发射波段。图9a是明场图，表明细胞状态良好；图9b是荧光图，肝癌细胞中具有强的荧光信号；图9c是叠加图。表明本发明的荧光探针具有良好的双光子性能，可以进行深层度组织活体的激光共聚焦成像。
实施例10
探究本发明的荧光在人卵巢癌2780细胞中的分布实验。用商业化溶酶体染料与本发明荧光探针进行复染对比。10a商业化溶酶体染料染细胞效果；图10b本发明荧光探针染细胞效果；图10c是10a和10b叠加图；图10d是复染的皮尔森系数。皮尔森系数0.87，表明探针分子主要在人卵巢癌2780的溶酶体内。
实施例11
本发明的荧光探针在正常细胞和癌细胞混合培养下的激光共聚焦成像。在共聚焦皿中先种上人卵巢癌2780细胞，培养24h后，用商业化细胞核染料Hoechst33342染10～15min，然后用PBS洗3～5次之后，再种上正常细胞NIH-3T3细胞，培养24h之后，用于激光共聚焦成像。图11a是用商业化细胞核染料Hoechst33342染卵巢癌A2780细胞和正常细胞NIH-3T3的情况；图10b是商业化细胞核染料Hoechst33342和本发明的荧光探针染卵巢癌A2780细胞和正常细胞NIH-3T3的3D情况；图11c是商业化细胞核染料Hoechst33342和本发明的荧光探针染卵巢癌A2780细胞和正常细胞NIH-3T3的横向切面情况。表明本发明的荧光探针可以在正常细胞和癌细胞混合培养下区分出癌细胞。

Claims (6)

1.荧光探针，具有式I的结构：
Figure FDA0001422135300000011
2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)化合物2与化合物6在哌啶或吡啶存在条件下按照摩尔比1:1～1:2反应，制备化合物7；所述反应的溶剂是乙醇、乙腈、甲苯或N,N-二甲基甲酰胺；反应体系温度80～120℃；反应时间10～24h；
Figure FDA0001422135300000012
(2)化合物7与脱Boc保护试剂按照摩尔比1:50～1:200混合后反应得到式I的荧光探针；所述的脱Boc保护试剂为三氟乙酸或者氯化氢；所述反应的溶剂是二氯甲烷或者四氢呋喃；反应体系温度0～30℃；反应时间为10～24h。
3.γ-谷氨酰胺转移酶检测试剂，含有效剂量的权利要求1所述的荧光探针。
4.癌细胞检测试剂，含有效剂量的权利要求1所述的荧光探针。
5.根据权利要求4所述的癌细胞检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂用于检测并标记γ-谷氨酰胺转移酶表达量异常的癌细胞。
6.根据权利要求5所述的癌细胞检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂用于单双光子共聚焦荧光成像检测。
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新型硫化氢供体和γ-谷氨酰转肽酶荧光探针的研究;尤旭东;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20170315(第03期);正文第6页倒数第2-3段，第13页倒数第3-5段，第30页第1-3段 *
长波长腈类荧光染料用于肿瘤的诊断与治疗;李海东;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20200115;B018-1 *

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