CN114380808B - 用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针及制备方法与应用 - Google Patents

用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针及制备方法与应用。所述分子探针为LET‑8，所述LET‑8的结构式如下所示：本发明首先制备七甲川菁染料(Cy7‑Cl)，之后Cy7‑Cl与3‑硝基苯酚发生反应制得中间产物(Cy7‑NO2)，通过还原反应得新型半花菁染料(HCyNH2)，随后HCyNH2与五氟丙酸酐反应制得分子探针(LET‑8)。本发明该分子探针LET‑8与HNE反应后荧光信号和光声信号大大增强，从而实现对HNE的特异性检测。本发明该探针检测机理简单、灵敏度高且特异性强，具有广阔的应用前景。

Description

用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针及制 备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及一种用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针及制备方法与应用。
背景技术
目前，肺癌呈现出高发病率、高死亡率和高增长率的趋势，成为人类生命健康的主要威胁之一，肺癌的早期诊断对其治疗及预后至关重要。中性粒细胞是一种重要的免疫细胞，通过特定的信号通路在炎症反应和肿瘤发展中发挥重要作用。中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)是一种典型的丝氨酸蛋白酶，通常由中性粒细胞表达和分泌。若肺部发生癌变，会促进巨噬细胞浸润肺部并过量表达HNE。同时由于HNE的高水解活性，将进一步导致肺癌细胞的增殖和转移，该过程将二次过量表达HNE，加剧免疫细胞对肺部的浸润形成恶性循环。临床研究表明，与健康个体相比，肺癌患者血清中HNE的表达量显著升高，因此，通过特异性检测HNE水平，有望实现肺癌发展过程的监测。
目前，HNE检测的常规技术主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、液相色谱-质谱联用技术。然而，ELISA的影响因素较多，易造成假阳性结果；色谱法则无法进行高通量测试，效率低下。同时，这些技术通常费时费力，而且无法在体内对HNE实现非侵入性的实时检测，因此开发能够实时体内HNE水平高特异性、高灵敏度监测的分子探针具有重要的研究意义。
发明内容
近年来，近红外荧光成像(NIRFLI)以其非侵入性、实时性和高灵敏度等优势被广泛应用于活体检测，但对于深层组织成像有限。光声成像(PAI)作为一种新兴的非侵入性和非电离成像技术，具有组织穿透深、实时监测、高空间分辨率等优势，在生物医学应用中具有巨大的应用前景。因此，本发明为弥补现有HNE检测技术的不足，开发一种同时具有荧光-光声双模态成像的分子探针对于活体检测HNE表达水平具有重要的研究和应用价值。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针，其中，所述分子探针为LET-8，所述LET-8的结构式如下所示：
本发明分子探针LET-8与HNE反应后荧光信号和光声信号大大增强，从而实现对HNE的特异性检测。本发明所述的LET-8分子探针是首例能够同时实现活体内荧光成像和光声成像的有机探针，该探针检测机理简单、灵敏度高且特异性强，具有广阔的应用前景。
本发明LET-8分子探针能够通过紫外比色、荧光与光声同步成像实现HNE的精确检测，灵敏度高且专一性强，在生物体内源性丝氨酸水解酶检测方面具有良好的应用前景。
本发明的第二方面，提供一种如上所述的用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针的制备方法，其中，包括步骤：
步骤1、制备七甲川菁染料，所述七甲川菁染料记为Cy7-Cl；
步骤2、将所述七甲川菁染料与3-硝基苯酚反应，得到中间产物，所述中间产物记为Cy7-NO2；
步骤3、将所述中间产物还原得到半花菁染料，所述半花菁染料记为HCyNH2；
步骤4、将所述半花菁染料与五氟丙酸酐反应，得到所述分子探针，所述分子探针记为LET-8；
上述制备路线如下所示：
本发明首先制备七甲川菁染料(Cy7-Cl)，之后Cy7-Cl与3-硝基苯酚发生反应制得中间产物(Cy7-NO2)，通过还原反应得新型半花菁染料(HCyNH2)，随后HCyNH2与五氟丙酸酐反应制得新型分子探针(LET-8)，并设计一系列对照探针(Probe 1,3,4)用于检测性能对比。其中，分子探针LET-8与HNE反应后荧光信号和光声信号大大增强，从而实现对HNE的特异性检测，见图1所示。本发明所述的LET-8分子探针是首例能够同时实现活体内荧光成像和光声成像的有机探针，该探针检测机理简单、灵敏度高且特异性强，具有广阔的应用前景。
本发明所提供的分子探针的合成方法简单，操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。同时，本发明方法制备的LET-8能够通过紫外比色、荧光与光声同步成像实现HNE的精确检测，灵敏度高且专一性强，在生物体内源性丝氨酸水解酶检测方面具有良好的应用前景。
本发明中，所述七甲川菁染料为Cy7-Cl，该染料具有良好的光学性能，是一种理想的近红外母体结构。
半花菁染料HCyNH2具有显著的荧光信号和光声信号，而分子探针LET-8以及三种对照探针Probe-1、Probe-3与Probe-4的荧光信号和光声信号非常微弱。
分子探针LET-8与HNE特异性反应后结构转换为荧光信号和光声信号非常显著的HCyNH2，从而实现双模态成像的信号开启与放大，同时其余三种对照探针对HNE的响应性能弱于LET-8。
分子探针LET-8与HNE特异性反应后发生明显的颜色变化，溶液由湖蓝色变为天蓝色。
分子探针LET-8与HNE的特异性反应存在动力学关系。
分子探针LET-8的荧光成像信号随着溶液中HNE浓度的增加而明显增强，且发射波长在725nm处(激发波长为700nm)。当探针浓度为5μM时，荧光强度与溶液中HNE的浓度在0～0.6μg/mL范围内具有良好的线性关系。
分子探针LET-8在700nm处的光声成像信号随着溶液中HNE浓度的增加而明显增强。当探针浓度为10μM时，光声强度与溶液中HNE的浓度在0～0.6μg/mL范围内具有良好线性关系。
分子探针LET-8对HNE具有专一性，不会被酶如羧肽酶B、羧肽酶A、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、酯酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、糜蛋白酶、溶菌酶等干扰。
步骤2中，所述将所述七甲川菁染料与3-硝基苯酚反应，得到中间产物的步骤，可以具体包括：
将3-硝基苯酚和碳酸钾溶解于第一预定溶剂中，在惰性气体(如氮气)保护下以第一预定温度反应第一预定时间，得到第一混合液；
将所述七甲川菁染料溶解于第一预定溶剂中，得到第二混合液；
将所述第二混合液加入所述第一混合液中，在第一预定温度下反应第二预定时间，经纯化处理，获得中间产物。
进一步地，通过注射器将所述第二混合液注入所述第一混合液中。
进一步地，所述纯化处理的步骤，具体包括：减压旋蒸除去溶剂，将沉淀溶于二氯甲烷，水洗3次，用硫酸钠干燥；通过减压旋蒸除去溶剂，获得所述中间产物。
进一步地，所述第一预定溶剂为乙腈。
进一步地，所述第一预定温度为室温(如25℃)。
进一步地，所述第一预定时间为20～40min(如30min)。
进一步地，所述第二预定时间为3～5h(如4h)。
步骤3中，所述将所述中间产物还原得到半花菁染料的步骤，可以具体包括：
将氯化亚锡溶解于浓盐酸中，得到氯化亚锡溶液；
将所述中间产物溶解于第二预定溶剂中，得到中间产物溶液；
在惰性气体(如氮气)保护下将所述中间产物溶液和氯化亚锡溶液混合，在第二预定温度下反应第三预定时间，经纯化处理，得到半花菁染料。
进一步地，所述纯化处理的步骤，具体包括：通过饱和碳酸钠中和并过滤除去沉淀物，用二氯甲烷洗涤，洗涤液用水萃取3次并用无水硫酸钠干燥；减压蒸发除去溶剂，得到的粗产物经硅胶层析柱纯化，得到所述半花菁染料。
进一步地，所述第二预定溶剂为甲醇。
进一步地，所述第二预定温度为60～80℃(如70℃)。
进一步地，所述第三预定时间为24～30h(如26h)。
步骤4中，所述将所述半花菁染料与五氟丙酸酐反应，得到所述分子探针的步骤，可以具体包括：
将所述半花菁染料和吡啶溶解于第三预定溶剂中，得到第三混合液；
将五氟丙酸酐溶解于第三预定溶剂中，得到五氟丙酸酐溶液；
将所述五氟丙酸酐溶液加入到第三混合液中，于第三预定温度下进行搅拌反应，经纯化处理，得到所述分子探针。
进一步地，将所述五氟丙酸酐溶液缓慢滴加到第三混合液中。
进一步地，于第三预定温度下进行搅拌反应，通过薄层色谱监测直至所述半花菁染料几乎耗尽。
进一步地，所述纯化处理的步骤，具体包括：将反应完成的混合物用水和盐酸溶液洗涤并用二氯甲烷萃取3次，有机相通过无水硫酸钠干燥，得到的粗产物经硅胶层析柱纯化，得到所述分子探针。
进一步地，所述第三预定溶剂为无水二氯甲烷。
进一步地，所述第三预定温度为室温(如25℃)。
下面对对照探针(Probe-1、Probe-3和Probe-4)的制备过程进行介绍。
1.Probe-1的制备
将HCyNH2和吡啶溶解于第三预定溶剂中，然后将三氟乙酸酐溶于第三预定溶剂并缓慢滴加到上述混合物中。于第三预定温度搅拌所得反应混合物并通过薄层色谱监测直至HCyNH2几乎耗尽。当反应完成时，混合物用水和盐酸溶液洗涤并用二氯甲烷萃取3次，有机相通过无水硫酸钠干燥，得到的粗产物经硅胶层析柱纯化得到对照探针Probe-1。所述第三预定溶剂为无水二氯甲烷；第三预定温度为室温(如25℃)。
2.Probe-3的制备
将HCyNH2和吡啶溶解于第三预定溶剂中，然后将七氟丁酸酐溶于第三预定溶剂并缓慢滴加到上述混合物中。于第三预定温度搅拌所得反应混合物并通过薄层色谱监测直至HCyNH2几乎耗尽。当反应完成时，混合物用水和盐酸溶液洗涤并用二氯甲烷萃取3次，有机相通过无水硫酸钠干燥，得到的粗产物经硅胶层析柱纯化得到对照探针Probe-3。所述第三预定溶剂为无水二氯甲烷；第三预定温度为室温(如25℃)。
3.Probe-4的制备
将HCyNH2和吡啶溶解于第三预定溶剂中，然后将丙酰氯溶于第三预定溶剂并缓慢滴加到上述混合物中。于第三预定温度搅拌所得反应混合物并通过薄层色谱监测直至HCyNH2几乎耗尽。当反应完成时，混合物用水和盐酸溶液洗涤并用二氯甲烷萃取3次，有机相通过无水硫酸钠干燥，得到的粗产物经硅胶层析柱纯化得到对照探针Probe-4。所述第三预定溶剂为无水二氯甲烷；第三预定温度为室温(如25℃)。
本发明的第三方面，提供一种本发明所述的分子探针在制备中性粒细胞弹性蛋白酶检测试剂中的应用。
本发明将所述分子探针LET-8用于检测中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)。当所述分子探针LET-8用于检测HNE时，采用的动物模型为荷瘤裸鼠，肿瘤细胞为A549细胞。具体将分子探针LET-8分散于溶剂(如PBS与DMSO的混合溶剂)中，配制成LET-8溶液，再将所述LET-8溶液与HNE进行作用。
本发明首先制备七甲川菁染料(Cy7-Cl)，之后Cy7-Cl与3-硝基苯酚发生反应制得中间产物(Cy7-NO2)，通过还原反应得半花菁染料(HCyNH2)，随后HCyNH2分别与三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐以及丙酰氯反应，分别制得分子探针Probe-1、Probe-2(LET-8)、Probe-3以及Probe-4。上述探针与HNE进行实验筛选，结果发现分子探针LET-8与HNE特异性作用后荧光信号和光声信号大幅度增强，且对HNE检测具有最好的特异性。本发明所述的LET-8分子探针是首例能够同时实现活体内荧光成像和光声成像的HNE探针，该探针检测机理简单、灵敏度高且特异性强，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为分子探针与HNE的响应机制图。
图2中(1)为实施例1中分子探针的合成路线图；(2)为LET-8与HNE的响应机制图。
图3中(1)为实施例2中LET-8的HR-MS质谱图；(2)为实施例2中LET-8的核磁共振氢谱图；(3)为实施例2中Probe-1的HR-MS质谱图；(4)为实施例2中Probe-1的核磁共振氢谱图；(5)为实施例2中Probe-3的HR-MS质谱图；(6)为实施例2中Probe-3的核磁共振氢谱图；(7)为实施例2中Probe-4的HR-MS质谱图；(8)为实施例2中Probe-4的核磁共振氢谱图。
图4为实施例3中LET-8在体外与HNE特异性反应前后的(1)为颜色变化图；(2)为紫外-可见吸收光谱变化图；(3)为荧光发射光谱变化图；(4)为光声光谱变化图。
图5为实施例4中几种分子探针在体外的特异性检测的相对荧光变化率：(1)为Probe-1；(2)为LET-8；(3)为Probe-3；(4)为Probe-4。
图6为实施例5中LET-8在体外对HNE敏感性的检测：(1)为随HNE浓度变化的紫外-可见吸收光谱；(2)为随HNE浓度变化的荧光发射光谱；(3)为随HNE浓度变化的光声成像与对应的线性关系图；(4)为随加入HNE后不同时间点的紫外吸收动力学光谱；(5)为随加入HNE后不同时间点的荧光发射动力学光谱；(6)为随加入HNE后不同时间点的光声成像与动力学曲线。
图7为实施例6中LET-8在体外对HNE特异性的检测：(1)为与不同蛋白质反应后的荧光发射光谱与对应荧光强度定量图；(2)为与不同蛋白质反应后的光声成像与对应光声强度定量图；(3)为随HNE抑制剂浓度增大的荧光发射光谱；(4)为随HNE抑制剂浓度增大的光声成像以及相对抑制效率。
图8为实施例7中(1)为细胞增殖毒性结果；(2)为LET-8与HNE相互作用的细胞荧光图；(3)细胞荧光强度量化图。
图9为实施例8中LET-8在动物肿瘤内对HNE的荧光成像：(1)为注射后不同时间的LET-8与HNE抑制剂的动物肿瘤荧光成像；(2)为注射后不同时间的动物肿瘤荧光强度定量图；(3)为不同处理组的动物肿瘤荧光强度定量图。
图10为实施9例中LET-8在动物肿瘤内对HNE的光声成像：(1)为注射后不同时间的LET-8与HNE抑制剂的动物肿瘤光声成像；(2)为注射后不同时间的动物肿瘤光声强度定量图；(3)为不同处理组的动物肿瘤光声强度定量图。
具体实施方式
本发明提供一种用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针及制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如附图2中(1)所示，首先按照所示的路线制备Cy7-Cl。然后将350mg 3-硝基苯酚和350mg碳酸钾溶解于10mL乙腈中，于室温下反应30min。将740mg Cy7-Cl溶解于5mL乙腈并将该溶液通过注射器注入上述混合物中，将反应混合物在室温下反应4h。减压旋蒸除去溶剂，将沉淀溶于二氯甲烷，水洗3次，用无水硫酸钠干燥。通过减压旋蒸除去溶剂获得中间产物Cy7-NO2。
将上述中间产物Cy7-NO2溶解于30mL甲醇中，并将溶解在4mL浓盐酸中的3.8g氯化亚锡加入上述溶液。将反应溶液加热至70℃并搅拌过夜，反应溶液用饱和碳酸钠中和，过滤除去沉淀物并用二氯甲烷洗涤。收集的滤液和洗涤液用水萃取3次并用无水硫酸钠干燥。将有机相减压旋蒸除去溶剂获得粗产物，通过二氯甲烷/甲醇(99/1-95/5，v/v)作为洗脱剂进行硅胶层析，得到深蓝色固体产物为半花菁染料HCyNH2。产量：450mg(产率78％)。
LET-8：将447mg HCyNH2和158mg吡啶溶于10mL无水二氯甲烷中，然后将372mg五氟丙酸酐溶于10mL无水二氯甲烷并缓慢滴加到上述混合溶液中。于室温下搅拌所得反应混合物并通过薄层色谱监测直至HCyNH2几乎耗尽。当反应完成时，混合物用水和1.0M盐酸溶液洗涤并用二氯甲烷萃取3次，有机相通过无水硫酸钠干燥，将有机相减压旋蒸除去溶剂获得粗产物，通过二氯甲烷/甲醇(99/1-9/1，v/v)作为洗脱剂进行硅胶层析，得到蓝色固体产物为LET-8。产量：178mg(产率63％)。
Probe-1：将447mg HCyNH2和158mg吡啶溶于10mL无水二氯甲烷中，然后将210mg三氟乙酸酐溶于10mL无水二氯甲烷并缓慢滴加到上述混合溶液中。于室温下搅拌所得反应混合物并通过薄层色谱监测直至HCyNH2几乎耗尽。当反应完成时，混合物用水和1.0M盐酸溶液洗涤并用二氯甲烷萃取3次，有机相通过无水硫酸钠干燥，将有机相减压旋蒸除去溶剂获得粗产物，通过二氯甲烷/甲醇(99/1-9/1，v/v)作为洗脱剂进行硅胶层析，得到蓝色固体产物为Probe-1。产量：170mg(产率60％)。
Probe-3：将447mg HCyNH2和158mg吡啶溶于10mL无水二氯甲烷中，然后将410mg七氟丁酸酐溶于10mL无水二氯甲烷并缓慢滴加到上述混合溶液中。于室温下搅拌所得反应混合物并通过薄层色谱监测直至HCyNH2几乎耗尽。当反应完成时，混合物用水和1.0M盐酸溶液洗涤并用二氯甲烷萃取3次，有机相通过无水硫酸钠干燥，将有机相减压旋蒸除去溶剂获得粗产物，通过二氯甲烷/甲醇(99/1-9/1，v/v)作为洗脱剂进行硅胶层析，得到蓝色固体产物为Probe-3。产量：175mg(产率65％)。
Probe-4：将447mg HCyNH2和158mg吡啶溶于10mL无水二氯甲烷中，然后将92.5mg丙酰氯溶于10mL无水二氯甲烷并缓慢滴加到上述混合溶液中。于室温下搅拌所得反应混合物并通过薄层色谱监测直至HCyNH2几乎耗尽。当反应完成时，混合物用水和1.0M盐酸溶液洗涤并用二氯甲烷萃取3次，有机相通过无水硫酸钠干燥，将有机相减压旋蒸除去溶剂获得粗产物，通过二氯甲烷/甲醇(99/1-9/1，v/v)作为洗脱剂进行硅胶层析，得到蓝色固体产物为Probe-4。产量：170mg(产率61％)。
如附图2中(2)所示，LET-8与HNE特异性反应后生成HCyNH2，从而实现荧光成像信号和光声成像信号的同步开启。
实施例2
如附图3中(1)所示，LET-8溶于甲醇中，得到HR-MS质谱图，测得其质荷比为593.22。
如附图3中(2)所示，5mg LET-8溶于500μL氘代甲醇中，得到核磁共振氢谱图。
如附图3中(3)所示，Probe-1溶于甲醇中，得到HR-MS质谱图，测得其质荷比为543.22。
如附图3中(4)所示，5mg Probe-1溶于500μL氘代甲醇中，得到核磁共振氢谱图。
如附图3中(5)所示，Probe-3溶于甲醇中，得到HR-MS质谱图，测得其质荷比为643.21。
如附图3中(6)所示，5mg Probe-3溶于500μL氘代甲醇中，得到核磁共振氢谱图。
如附图3中(7)所示，Probe-4溶于甲醇中，得到HR-MS质谱图，测得其质荷比为503.26。
如附图3中(8)所示，5mg Probe-4溶于500μL氘代甲醇中，得到核磁共振氢谱图。
实施例3
将LET-8分散在混合溶剂(PBS/DMSO＝95/5,v/v)中，配制成5uM和10μM的LET-8溶液，分别用于荧光检测与光声检测。
如附图4中(1)所示，取两组LET-8溶液，第一组不做任何处理，第二组与0.6μg/mLHNE于37℃孵育60min，拍摄记录反应前后溶液的颜色变化情况。
如附图4中(2)所示，取10μM LET-8溶液，加入0～0.6μg/mL HNE记录其紫外-可见光谱前后变化。
如附图4中(3)，取5μM LET-8溶液，加入0～0.6μg/mL HNE记录其荧光发射光谱前后变化。
如附图4中(4)，取10μM LET-8溶液，加入0～0.6μg/mL HNE记录其光声谱图前后变化。
实施例4
如附图5中(1)所示，取十四组5μM Probe-1的溶液，第一组不做任何处理，其余十三组分别与0.6μg/mL羧肽酶B、羧肽酶A、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、酯酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、糜蛋白酶、溶菌酶及HNE于37℃孵育60min，分别测量十四组溶液的荧光发射光谱，并将725nm处的荧光强度进行量化。
如附图5中(2)所示，取十四组5μM LET-8的溶液，第一组不做任何处理，其余十三组分别与0.6μg/mL羧肽酶B、羧肽酶A、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、酯酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、糜蛋白酶、溶菌酶及HNE于37℃孵育60min，分别测量十四组溶液的荧光发射光谱，并将725nm处的荧光强度进行量化。
如附图5中(3)所示，取十四组5μM Probe-3的溶液，第一组不做任何处理，其余十三组分别与0.6μg/mL羧肽酶B、羧肽酶A、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、酯酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、糜蛋白酶、溶菌酶及HNE于37℃孵育60min，分别测量十四组溶液的荧光发射光谱，并将725nm处的荧光强度进行量化。
如附图5中(4)所示，取十四组5μM Probe-4的溶液，第一组不做任何处理，其余十三组分别与0.6μg/mL羧肽酶B、羧肽酶A、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、酯酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、糜蛋白酶、溶菌酶及HNE于37℃孵育60min，分别测量十四组溶液的荧光发射光谱，并将725nm处的荧光强度进行量化。
实施例5
如附图6中(1)所示，取5μM LET-8的溶液，逐量滴加0.05μg/mL HNE，每次滴加后于37℃孵育4min，分别测量与0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55和0.60μg/mL HNE反应后的紫外光谱，证明LET-8在700nm处对于HNE具有良好的线性响应能力。
如附图6中(2)所示，取5μM LET-8的溶液，逐量滴加0.1μg/mL HNE，每次滴加后于37℃孵育4min，分别测量与0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60μg/mL HNE反应后的荧光发射光谱，证明LET-8在725nm处的荧光发射变化表明其对于HNE具有良好的响应能力。
如附图6中(3)所示，取10μM LET-8的溶液，逐量滴加0.1μg/mL HNE，每次滴加后于37℃孵育4min，分别采集LET-8与0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60μg/mL HNE反应后的光声成像图，说明LET-8在700nm处的光声信号发射变化表明其对于HNE具有良好的响应能力，并将700nm处的光声强度与HNE的浓度进行线性拟合，证明二者具有良好的线性关系。
如附图6中(4)所示，取5μM LET-8的溶液，往其中滴加0.6μg/mL HNE，从0～60min内每4min采集一次紫外吸收光谱，由图可知随着反应时间的增加，700nm处的紫外吸收强度逐渐增强，在40min左右到达平台期。
如附图6中(5)所示，取5μM LET-8的溶液，往其中滴加0.6μg/mL HNE，从0～60min内每4min采集一次荧光发射光谱，由图可知随着反应时间的增加，725nm处荧光发射强度逐渐增强，在40min左右到达平台期。
如附图6中(6)所示，取10μM LET-8的溶液，往其中滴加0.6μg/mL HNE，从0～60min内每4min采集一次光声成像图，并通过记录700nm处的光声信号强度可得到LET-8与HNE反应的光声动力学曲线，由图可知反应在40min左右到达平台期。
实施例6
如附图7中(1)所示，取十四组5μM LET-8的溶液，第一组不做任何处理，其余十三组分别与0.6μg/mL羧肽酶B、羧肽酶A、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、酯酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、糜蛋白酶、溶菌酶及HNE于37℃孵育60min，分别测量十四组溶液的荧光发射光谱，并将725nm处的荧光强度进行量化，证明LET-8对HNE具有特异选择性。
如附图7中(2)所示，取十四组10μM LET-8的溶液，第一组不做任何处理，其余十三组分别与0.6μg/mL羧肽酶B、羧肽酶A、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、酯酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、糜蛋白酶、溶菌酶及HNE于37℃孵育60min，分别采集十四组溶液的光声成像，并将700nm处的光声强度进行量化，证明LET-8对HNE具有特异选择性。
如附图7中(3)所示，取5μM LET-8的溶液，往其中滴加0.6μg/mL HNE，60min后滴加0、20、40、60、80、100、120nM的HNE抑制剂并采集荧光发射光谱，由图可知随着抑制剂的增加，725nm处荧光发射强度逐渐减弱，证明LET-8对于HNE的活性变化能够进行实时响应。
如附图7中(4)所示，取5μM LET-8的溶液，往其中滴加0.6μg/mL HNE，60min后滴加0、20、40、60、80、100、120nM的HNE抑制剂并采集光声成像，对700nm处的光声强度变化进行定量。由图可知随着抑制剂的增加，700nm处光声信号强度逐渐减弱，抑制效率到达90％，证明LET-8对于HNE的活性变化能够进行实时响应。
实施例7
如附图8中(1)所示，为评估LET-8对大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3)与人非小细胞肺癌细胞(A549)的细胞毒性，将细胞接种于96孔板(5×103/孔)，孵育24h。移除培养基后，在相同条件下，将细胞暴露于不同浓度的LET-8(0.00、0.25、0.50、1.00、2.00μM)下24h。然后，采用标准的细胞的增殖检测MTT法分析细胞活力，结果显示LET-8对于细胞的毒性很小，具有优良的细胞相容性。
如附图8中(2)和(3)所示，为了进行细胞内NIRF成像，将RBL-2H3细胞在DMEM培养基中孵育，培养基中添加10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)，培养箱环境为5％二氧化碳，37℃。将细胞以约3×105/mL的细胞密度接种在盖玻片上，在DMEM中培养24h。实验分为三组，第一组细胞用新鲜培养基培养，第二组用HNE抑制剂西韦司他(10μM)预孵育3h，再与LET(1μM)共孵育，第三组用分散了LET-8(1μM)的新鲜培养基孵育。孵育30min后，用PBS洗涤细胞3次，用4％多聚甲醛(体积比)固定10min。取出固定物后，细胞再次用PBS洗涤细胞三次，在细胞内NIRF成像前用Hoechst-33342测量常规核染色。将处理后的细胞进行细胞荧光成像，并将采集到的荧光信号进行半定量处理，证明LET-8在细胞层面对HNE显示着良好的响应性。
实施例8
如附图9中(1)和(2)所示，将LET-8分散在混合溶剂(PBS/DMSO＝95:5,v/v)中，配成500μM的溶液。取两组荷瘤裸鼠，一组瘤内注射LET-8(500μM，50μL)，另一组瘤内预注射西韦司他(1mM，25μL)和LET-8(500μM，50μL)，分别拍摄0、5、10、20、30、40、50、60min时裸鼠肿瘤的荧光图像，并记录725nm处的荧光强度，证实LET-8能够与肿瘤内过表达的HNE进行响应，在30～40min左右进入平台期。
如附图9中(3)为不同处理组60min后的荧光强度定量，证实LET-8能够对肿瘤内HNE的活性变化进行良好监测。
实施例9
如附图10中(1)和(2)所示，将LET-8分散在混合溶剂(PBS/DMSO＝95:5,v/v)中，配成500μM的溶液。取两组荷瘤裸鼠，一组瘤内注射LET-8(500μM，50μL)，另一组瘤内预注射西韦司他(1mM，25μL)和LET-8(500μM，50μL)，分别拍摄0、5、10、20、30、40、50、60min时裸鼠肿瘤的光声图像，并记录700nm处的光声强度，证实LET-8能够与肿瘤内过表达的HNE进行响应，在30～40min左右进入平台期。
如附图10中(3)为不同处理组60min后的光声强度定量，证实LET-8能够对肿瘤内HNE的活性变化进行良好监测。
综上所述，本发明提供的用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针及制备方法与应用，本发明首先制备七甲川菁染料(Cy7-Cl)，之后Cy7-Cl与3-硝基苯酚发生反应制得中间产物(Cy7-NO2)，通过还原反应得新型半花菁染料(HCyNH2)，随后HCyNH2进一步与五氟丙酸酐反应制得新型分子探针(LET-8)，并设计一系列对照探针(Probe 1,3,4)用于检测性能对比。其中，分子探针LET-8与HNE反应后荧光信号和光声信号大大增强，从而实现对HNE的特异性检测。本发明所述的LET-8分子探针是首例能够同时实现活体内荧光成像和光声成像的有机探针，该探针检测机理简单、灵敏度高且特异性强，具有广阔的应用前景。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针，其特征在于，所述分子探针记为LET-8，所述LET-8的结构式如下所示：
2.一种权利要求1所述的用于中性粒细胞弹性蛋白酶双模态成像检测的分子探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：
制备七甲川菁染料，所述七甲川菁染料记为Cy7-Cl；
将所述七甲川菁染料与3-硝基苯酚反应，得到中间产物，所述中间产物记为Cy7-NO2；
将所述中间产物还原得到半花菁染料，所述半花菁染料记为HCyNH2；
将所述半花菁染料与五氟丙酸酐反应，得到所述分子探针，所述分子探针记为LET-8；
上述制备路线如下所示：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述将所述七甲川菁染料与3-硝基苯酚反应，得到中间产物的步骤，具体包括：
将3-硝基苯酚和碳酸钾溶解于第一预定溶剂中，在惰性气体保护下以第一预定温度反应第一预定时间，得到第一混合液；
将所述七甲川菁染料溶解于第一预定溶剂中，得到第二混合液；
将所述第二混合液加入所述第一混合液中，在第一预定温度下反应第二预定时间，经纯化处理，获得中间产物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一预定溶剂为乙腈；所述第一预定温度为室温；所述第一预定时间为20～40min；所述第二预定时间为3～5h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述将所述中间产物还原得到半花菁染料的步骤，具体包括：
将氯化亚锡溶解于浓盐酸中，得到氯化亚锡溶液；
将所述中间产物溶解于第二预定溶剂中，得到中间产物溶液；
在惰性气体保护下将所述中间产物溶液和氯化亚锡溶液混合，在第二预定温度下反应第三预定时间，经纯化处理，得到半花菁染料。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第二预定溶剂为甲醇；所述第二预定温度为60～80℃；所述第三预定时间为24～30h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述将所述半花菁染料与五氟丙酸酐反应，得到所述分子探针的步骤，具体包括：
将所述半花菁染料和吡啶溶解于第三预定溶剂中，得到第三混合液；
将五氟丙酸酐溶解于第三预定溶剂中，得到五氟丙酸酐溶液；
将所述五氟丙酸酐溶液加入到第三混合液中，于第三预定温度下进行搅拌反应，经纯化处理，得到所述分子探针。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第三预定溶剂为无水二氯甲烷；所述第三预定温度为室温。
9.权利要求1所述的分子探针在制备中性粒细胞弹性蛋白酶检测试剂中的应用。
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