CN109810101B - 化合物、其制备方法及含有其的荧光探针和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种化合物I，所述化合物I具有式I所示的结构，

式I，其中，R₁是含有2‑5个碳原子的酰基、苯基或烷基氧羰基；R₂是卤素原子或氢原子；R₃是含有1‑18个碳原子的烷基。本申请还公开了所述化合物I的合成方法、包括化合物I的荧光探针和应用。本申请中的荧光探针具有优秀的选择性，反应迅速，能够实现简单、快速、可视化地检测成纤维细胞激活蛋白α。

Description

化合物、其制备方法及含有其的荧光探针和应用

技术领域

本申请涉及一种荧光探针及其制备方法和应用，属于有机小分子探针领域。

背景技术

成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)是一种具有760个氨基酸的Ⅱ型穿膜糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族，具有二肽基肽酶及胶原酶活性。研究证实，FAPα特异性表达于包括乳腺癌、皮肤黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等恶性上皮性肿瘤基质，而人体正常组织除胚胎、愈合创面及生理性重建的器官之外,一般不表达。研究表明，FAPα广泛参与肿瘤发生发展中的生长，侵袭，转移，血管生成，肿瘤外基质重建，以及抗肿瘤免疫等过程。

因此，成纤维细胞激活蛋白有望成为一个新的有效靶点，在肿瘤早期检测和治疗中发挥巨大作用，目前，尽管对FAPα抑制剂的药物研究已导致许多FAPα靶向抑制剂的发现，其中包括第二阶段临床试验中的候选药物，但是目前确定组织中FAPα是否高表达的检测手段通常基于组织切片，染色确定，以及western blotting等手段，操作较为复杂，耗时较长。早期，快速，简单可视化检测FAPα相关研究不多，目前的一些关于检测FAPα的报导探针发射波长较短，体内成像应用具有一定的限制，有鉴于此，提出本申请。

发明内容

本申请的第一目的在于提供一种能够快速识别成纤维细胞激活蛋白α的荧光探针，该荧光探针具有优秀的选择性，反应迅速，能够实现简单、快速、可视化地检测成纤维细胞激活蛋白α。本申请的第二目的在于提供所述荧光探针的制备方法，所述方法能够稳定高效地合成荧光探针，实现荧光探针的批量生产。本申请的第三目的在于提供所述荧光探针在成纤维细胞激活蛋白α中的应用，所述应用包括在生物体内和/或体外检测成纤维细胞激活蛋白

为实现以上目的，本申请的一个方面提供了化合物I，所述化合物I 具有式I所示的结构，

其中，

R₁是含有2至5个碳原子的酰基、苯基或烷基氧羰基；

R₂是卤素原子或氢原子；

R₃是含有1至18个碳原子的烷基。

本申请的化合物I具有选择性好，反应迅速的特点，激发波长和发射波长均处在近红外区，具有组织穿透能力强，且可以避开生物体自发荧光波段，抗干扰性强，因此在细胞成像及体内可视化荧光成像检测应用中优势显著。

优选地，所述R₁是乙酰基、苯基或叔丁基氧羰基。

优选地，所述R₂是Cl或Br。

优选地，所述化合物I的发射波长范围是700nm～720nm。

本发明的另一个方面提供了所述的化合物I的制备方法，所述方法包括，将式II所示化学结构式的化合物II与式III所示化学结构式的化合物 III以摩尔比：

化合物II：化合物III＝1：(1～5)混合反应，得到所述化合物I，

其中，R₄是氨基。

优选地，所述反应是在O-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(简称HATU催化剂)的催化下进行的。

优选地，所述催化剂与所述化合物II的摩尔比为：催化剂：化合物II＝1：(0.5-1.5)，优选为1:1。

优选地，反应温度为室温。

优选地，反应时间为3-5h。

优选地，所述反应的溶剂选自二氯甲烷、二甲基甲酰胺中的至少一种；

优选地，所述反应的溶剂是二氯甲烷。

优选地，所述方法包括步骤：

(1)将环己酮溶解于二甲基甲酰胺(简写为DMF)与二氯甲烷的混合溶剂中，搅拌均匀，加入三氯氧磷，加热回流，产物溶液倒入冷水中，静置，抽滤，获得式VII所示化学结构式的化合物VII；

(2)将所述步骤(1)中得到的化合物VII与式VI所示化学结构式的吲哚碘化物VI按摩尔比1：(1-4)混合，将少量乙酸钠分散乙酸酐中，加热回流，得到式V所示化学结构式的化合物V；

(3)将所述步骤(2)中得到的化合物V与式IV所示化学结构式的苯酚衍生物IV按摩尔比1：(1-5)分散在乙腈中，加入碳酸钾，反应得到化合物II；

(4)将所述步骤(3)中得到的化合物II与化合物III按摩尔比1：(1-5) 混合反应得到化合物I，

优选地，所述步骤(1)中，所述三氯氧磷和环己酮的投料比按摩尔计，环己酮：三氯氧磷＝(2～5)：1。

优选地，所述步骤(1)中加热回流的时间为1～3h。

优选地，所述步骤(2)中加热回流的时间为0.5～1.5h。

优选地，所述步骤(3)中的反应在室温条件下进行，优选地，反应时间为2-5h。

本发明的另一个方面提供了一种荧光探针，所述荧光探针所述的化合物I、或通过本发明所述的方法制备得到的化合物I中的至少一种。

本申请的荧光探针特异性强，具有大stokes位移，发射波长处于近红外区域，生物毒性低，光毒性小，生物应用性能优异。

优选地，所述荧光探针在与成纤维细胞激活蛋白α接触时，在680nm 至800nm中至少一段波长范围内产生荧光。

优选地，所述荧光探针在激发波长λ_ex＝670nm、发射波长λ_em＝710nm 条件下，对于成纤维细胞激活蛋白α的检测浓度下限达到25ng/mL。

本发明的另一个方面涉及所述化合物I、通过本发明所述的方法制备得到的化合物I、本发明所提供的的荧光探针中的至少一种在制备用于检测成纤维细胞激活蛋白α的检测试剂和/或焦成纤维细胞激活蛋白α成像试剂中应用。

本发明的另一个方面涉及所述化合物I、通过本发明所述的方法制备得到的化合物I、本发明所提供的的荧光探针中的至少一种在制备用于检测待测细胞的检测试剂和/或对含有待测细胞的组织成像的成像剂中应用；

所述待测细胞包括癌细胞、胚胎细胞、愈合创面阶段的细胞、生理性重建阶段器官中的细胞中的至少一种。

优选地，所述癌细胞为恶性上皮性肿瘤细胞。

优选地，所述待测细胞包括乳腺癌细胞、皮肤黑色素瘤细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞中的至少一种。

本申请能产生的有益效果包括：

1)使用本申请中的化合物I制备的荧光探针选择性好，反应迅速并且具有大stokes位移，发射波长处于近红外区域，生物毒性低，光毒性小，生物应用性能优异；

2)本申请的荧光探针可以通过对特定位置的官能团进行替换来实现适应不同检测条件的需求；

3)本申请的荧光探针的制备方法稳定可靠，重现性好，反应条件较温和，后处理难度小，反应效率高；

4)本申请的荧光探针的应用范围广泛，可在生物体内或体外进行检测。

附图说明

图1为本申请实施例中的荧光探针FP1的质谱图。

图2为本申请实施例中的荧光探针FP1的核磁氢谱图。

图3为本申请实施例中的荧光探针FP1的核磁碳谱图。

图4为本申请实施例中的荧光探针FP2的紫外可见光吸收光谱图。

图5为采用本申请实施例中的荧光探针FP4检测成纤维细胞激活蛋白α时，不同浓度蛋白检测结果荧光光谱图。

图6为本申请实施例中的荧光探针FP4与肿瘤细胞的荧光共聚焦成像结果图。

图7为本申请实施例中的荧光探针FP4与MDA-MB-468细胞的荧光共聚焦成像图。

图8为本申请实施例中的荧光探针FP4与乳腺癌细胞HeLa细胞的荧光共聚焦成像图。

图9为本申请实施例中的荧光探针FP4与MHCC-97H细胞的荧光共聚焦成像图。

图10为本申请实施例中的荧光探针FP4与MHCC-97L细胞的荧光共聚焦成像图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。

实施例1

按照以下步骤制备化合物I

(1)将2g环己酮溶解于DMF与二氯甲烷的1:1溶剂中，搅拌均匀，于0℃条件下加入10g三氯氧磷，加热温度50℃，回流时间2h，产物溶液倒入冷水中，静置，抽滤，获得化合物VII，步骤(1)的反应式如下：

(2)将步骤(1)中得到的化合物VII与化合物VI以摩尔比1：3混合，将100mg乙酸钠分散乙酸酐中，70℃回流1h，得到化合物3的粗产品，溶剂旋干，硅胶柱层析提纯，获得化合物3，步骤(2)的反应式如下：

其中，R₃为CH₃；

(3)将步骤(2)中得到的化合物V与化合物IV以摩尔比1：5分散在30ml乙腈中，加入138mg碳酸钾，室温反应3h后去除溶剂，硅胶柱层析法提纯获得化合物II，步骤(3)的反应式如下：

其中，R₂为H，R₄为NH₂；

(4)化合物II与带有R₁基封端的甘氨酸脯氨酸二肽类似物III，按照摩尔比1:3分散在二氯甲烷里，加入1g HATU，室温，反应4h，溶剂旋干，硅胶柱层析，获得探针化合物I，步骤(4)的反应式如下：

其中，R₁是叔丁氧羰基(BOC)。

将本实施例中得到的样品(化合物I)记为FP1。

实施例2

按照与实施例1中相同的步骤制备荧光探针，其中，R₃＝CH₂CH₃，R₂＝H， R₁＝CO₂CC₃H₉，将得到的产物记为FP2。

实施例3

按照与实施例1中相同的方法制备荧光探针，其中，R₃＝CH₃，R₂＝Cl， R₁＝CO₂CC₃H₉，将得到的产物记为FP3。

实施例4

按照与实施例1中相同的方法制备荧光探针，其中，R₃＝CH₂CH₃，R₂＝Cl， R₁＝CO₂CC₃H₉，将得到的产物记为FP4。

实施例5

按照与实施例1中相同的方法制备荧光探针，其中，R₃＝CH₂CH₃，R₂＝Cl， R₁＝CO₂CH₃，将得到的产物记为FP5。

实施例6

按照与实施例1中相同的方法制备荧光探针，其中，R₃＝CH₂CH₃，R₂＝Cl， R₁＝CO₂CC₃H₉，步骤(4)中化合物5和化合物6的摩尔比为1:1，将得到的产物记为FP6。

实施例7

按照与实施例1中相同的方法制备荧光探针，其中，R₃＝CH₂CH₃，R₂＝Cl， R₁＝CO₂CC₃H₉，步骤(4)中化合物5和化合物6的摩尔比为1:5，将得到的产物记为FP7。

实施例8

FP1～FP7结构表征

对FP1进行核磁检测，如图2和图3所示，可见本申请反应目标产物 FP1具有如式I所示的化合物I的结构。

¹H NMR(400MHz,298K,CD₃OD):δ8.74(d,J＝14.8Hz,1H),8.05(s,1H), 7.67-7.31(m,7H),6.56(d,J＝14.8Hz,1H),4.60(s,1H),4.11(d,J＝9.6Hz, 2H),3.88(s,3H),3.70(s,2H),2.82-2.72(m,4H),2.17-1.82(m,14H),0.90(s, 1H)

¹³C NMR(100MHz,298K,CD₃OD):δ178.58,172.31,171.89,168.50, 160.93,153.35,145.79,142.28,142.01,141.90,132.41,128.81,128.60, 127.79,127.24,122.22,118.01,116.71,114.36,112.53,105.76,104.29,61.21, 50.64,46.52,41.46,31.51,29.32,28.78,26.74,24.52,20.98,20.19

对FP1进行质谱检测，如图1所示，可见本申请的反应得到的目标产物符合；

对FP2-FP7进行相同检测，结果与FP1一致，核磁谱图能够体现化合物的关键结构，并且质谱图能够验证其分子量的正确性。

实施例9

对不同浓度的FP2进行紫外可见光吸收光谱的测定，结果如图4所示，可见FP2在500nm至700nm之间有明显吸收，且随浓度升高吸光度升高且浓度与吸收强度峰值成正比。

FP1、FP3～FP7的紫外可见光吸收光谱与图4一致。

实施例10

采用本申请中实施例部分制备的荧光探针FP4对不同浓度的成纤维细胞激活蛋白α进行检测，具体步骤为：重组成纤维细胞激活蛋白用纯水溶解，在4ml中，分别稀释到800ng/ml、600ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml，每一管2ml溶液，加入终体积5μm/L的浓度探针，孵育2h，670nm激发光下荧光检测，最强发射峰705nm左右随着蛋白浓度的增加荧光强度也随之增强。不同浓度蛋白检测结果荧光光谱见附图5。

由图5可以看出随蛋白浓度从0ng/ml-800ng/ml增加，检测光谱显示，荧光强度也随之增加，呈现一定程度正相关特性。

FP1～FP3、FP～FP7不同浓度的成纤维细胞激活蛋白α检测结果与FP4 一致。

此外，本发明的各荧光探针在激发波长λ_ex＝670nm、发射波长λ_em＝710nm条件下，对于成纤维细胞激活蛋白α的检测浓度下限可以达到 25ng/mL。

实施例11

使用FP1-7中的探针检测癌细胞内成纤维细胞激活蛋白

具体操作方法如下：

贴壁细胞用胰蛋白酶消化下来，离心去除培养液和胰酶，用PBS重悬，计数，稀释到不同细胞浓度，分别加入相同量探针，37℃，孵育1.5h，与细胞中的成纤维激活蛋白作用后，用荧光分光光度计在705处测荧光信号，所有探针检测到的荧光信号强度均与成纤维细胞激活蛋白浓度呈正相关，且有较好的线性关系，因此均可用于定量检测不同细胞浓度成纤维细胞激活蛋白。

实施例12

将FP4应用在不同肿瘤细胞中实现共聚焦成像。具体步骤：种植一定数目细胞在共聚焦培养皿中，24h小时后加入探针，进行荧光共聚焦成像，具有很好的效果。共聚焦成像结果见附图6。

FP1～FP3、FP～FP7在肿瘤细胞中实现共聚焦成像结果与FP4一致。

实施例13

使用荧光探针FP4对肿瘤细胞、MDA-MB-468细胞、乳腺癌细胞HeLa 细胞、MHCC-97H细胞和MHCC-97L细胞进行荧光共聚焦成像，结果如图7-图10所示，从图中可以看出，由于不同类型的癌细胞表达FAP含量不同，因此在相同实验条件，可根据细胞与探针作用后的荧光强度，判断成纤维细胞激活蛋白表达量，从而确定肿瘤细胞的类型，如图乳腺癌细胞 MDA-MB-468高表达FAP，因此轮廓较为清晰，且亮度更强，而低表达 FAP的MHCC-97H/L细胞，亮度较低，因此一定程度上可利用该探针检测分辨细胞类型。

FP1～FP3、FP～FP7对同种细胞的荧光共聚焦成像情况与FP4一致。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (23)

1.化合物I，其特征在于，所述化合物I具有式I所示的结构，

其中，

R₁是含有2至5个碳原子的酰基、苯基或烷基氧羰基；

R₂是卤素原子或氢原子；

R₃是含有1至18个碳原子的烷基；

所述化合物I的发射波长范围是700nm～720nm。

2.根据权利要求1所述的化合物I，其特征在于，所述R₁是乙酰基、或叔丁基氧羰基。

3.根据权利要求1所述的化合物I，其特征在于，所述R₂是Cl或Br。

4.权利要求1至3中任意一项所述的化合物I的制备方法，其特征在于，所述方法包括，将式II所示化学结构式的化合物II与式III所示化学结构式的化合物III以摩尔比：

化合物II：化合物III＝1：(1～5)混合反应，得到所述化合物I，

其中，R₄是氨基；

R₁、R₂、R₃如权利要求1至3任一项所定义。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应是在O-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯催化剂的催化下进行的。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂与所述化合物II的摩尔比为：

催化剂：化合物II＝1：(0.5～1.5)。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂与所述化合物II的摩尔比为：

催化剂：化合物II＝1：1。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，反应温度为室温。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，反应时间为3-5h。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应的溶剂选自二氯甲烷和二甲基甲酰胺中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述反应的溶剂是二氯甲烷。

12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)将环己酮溶解于二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合溶剂中，搅拌均匀，加入三氯氧磷，加热回流，产物溶液倒入冷水中，静置，抽滤，获得式VII所示化学结构式的化合物VII；

(2)将所述步骤(1)中得到的化合物VII与式VI所示化学结构式的吲哚碘化物VI按摩尔比1：(1-4)混合，将少量乙酸钠分散于乙酸酐中，然后再加入至上述混合后的物料中，加热回流，得到式V所示化学结构式的化合物V；

(3)将所述步骤(2)中得到的化合物V与式IV所示化学结构式的苯酚衍生物IV按摩尔比1：(1-5)分散在乙腈中，加入碳酸钾，反应得到化合物II；

(4)将所述步骤(3)中得到的化合物II与化合物III按摩尔比1：(1-5)混合反应得到化合物I，

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述三氯氧磷和环己酮的投料比按摩尔计，环己酮：三氯氧磷＝(2～5):1。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中加热回流的时间为1-3h。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加热回流的时间为0.5-1.5h。

16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的反应在室温条件下进行；反应时间为2-5h。

17.一种荧光探针，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的化合物I。

18.根据权利要求17所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针在与成纤维细胞激活蛋白α接触时，在680nm至800nm中至少一段波长范围内产生荧光。

19.根据权利要求17所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针在激发波长λ_ex＝670nm、发射波长λ_em＝710nm条件下，对于成纤维细胞激活蛋白α的检测浓度下限达到25ng/mL。

20.权利要求1至3任一项所述的化合物I、权利要求17至19任一项所述的荧光探针中的至少一种在制备用于检测成纤维细胞激活蛋白α的检测试剂和/或成纤维细胞激活蛋白α成像试剂中应用。

21.权利要求1至3任一项所述的化合物I、权利要求17至19任一项所述的荧光探针中的至少一种在制备用于检测待测细胞的检测试剂和/或对含有待测细胞的组织成像的成像剂中应用；

所述待测细胞为表达成纤维细胞激活蛋白α的癌细胞、胚胎细胞、愈合创面阶段的细胞、生理性重建阶段器官中的细胞中的至少一种。

22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为恶性上皮性肿瘤细胞。

23.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述待测细胞为乳腺癌细胞、皮肤黑色素瘤细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞中的至少一种。

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