CN104945322A - 检测肿瘤乏氧的化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种下式I所示的检测肿瘤乏氧的化合物、其制备方法、用途及含有该化合物的试剂盒,式中各基团如文中所述。本发明所述的化合物可用于肿瘤组织的乏氧检测,可以对局部组织氧分压和还原性的变化做出响应,为癌症的早期检测提供了条件。本发明具有结构新颖、合成简便、检测灵敏、荧光增强倍数大、无创伤性及可用于细胞检测甚至活体检测等优势。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针领域。具体而言,本发明涉及以1,8-萘酰亚胺偶氮苯为母体用于肿瘤乏氧检测的荧光探针及其制备和检测方法。
背景技术
荧光分子成像是光学成像中最具有发展前景、研究最热、最主要的一个方向之一。它主要是利用荧光分子探针对活体内靶细胞或靶标分子进行特异性标记,在外界光源的激发下被标记的靶标部位发出荧光信号,通过系列图像后处理技术,将活体组织在分子和细胞水平上的生物学过程动态、实时示踪。而将分子之间的相互作用通过荧光信号传导出来的分子(包括小分子、聚合物和纳米颗粒)被称为荧光分子探针或荧光分子传感器。作为一种灵敏度高、选择性好、检测方便、检出限低的微量分析技术,近几十年来,荧光分子探针技术得以迅速发展,并广泛应用于各个领域。
乏氧是所有实体瘤的内在特征,绝大多数的实体瘤氧分压低于其他正常组织。当肿瘤较小时,乏氧现象不是很明显,但是当肿瘤细胞不断扩散时,乏氧和局部缺血就成为导致一些重大疾病的重要因素。乏氧癌细胞具有侵犯性和转移性,预测起来较为困难,并且对传统的放疗、化疗和传统的免疫疗法都有抵制性,因此普及对乏氧肿瘤的理解及研究合理实用的检测方法变得尤为重要。同时对乏氧的检测为疾病的早期诊断(特别是实体肿瘤)提供了条件。已报道的乏氧探针可以大致分为两类:一是针对乏氧特殊化学环境的,如较低的pH值、较低的氧分压和较强的还原性
(Bioconjugate Chem.,2012,23:324-329;Bioorg.Med.Chem.,2008,16:3255-3260);二是通过检测乏氧条件下过表达的酶来间接检测细胞乏氧,如硝基还原酶和碳酐酶等(Organic Letters,2011,13:928-931;Chem.Commun.,2011,47:8301-8303)。这些荧光探针都可以一定程度的区分乏氧细胞和正常细胞,但同时存在乏氧/有氧荧光变化倍数不大、探针合成较复杂等问题。2010年,Nagano等人报道了一种新型的乏氧探针(J.Am.Chem.Soc.,2010,132(45):15846-15848),他们将Cy5.5与BHQ3通过Linker连接在一起,在乏氧条件下,BHQ3的偶氮键被还原断裂,使淬灭基结构破坏,荧光释放出来。
在本发明中,我们基于偶氮键在乏氧条件下可以被还原机理,设计合成了一系列以萘酰亚胺偶氮苯为母体的荧光探针,之后又以该荧光探针作为淬灭基通过FRET作用淬灭其他荧光团。该方法合成简便,可以实现荧光off-on检测,对肿瘤乏氧有较好的检测效果。
发明内容
本发明的目的在于合成一系列新型的乏氧探针,可以通过荧光变化实现对肿瘤乏氧的检测,其设计理念如图1所示。
本发明中探针的母体结构为1,8-萘酰亚胺,4位通过共价键与偶氮苯或其衍生物相连。反应机理为偶氮键在乏氧条件下被还原成氨基,荧光释放出来。
本发明中的探针可以包含一种荧光团,也可以包含双荧光团,通过FRET(fluorescence resonance energy transfer,荧光共振能量转移)作用实现荧光的增强。
本发明中的荧光探针结构如下式I所示:
式中,
R1选自-NR3R4;
R3选自-(CH2)mR6或-(CH2)nR5;
R4选自-(CH2)mR6;
R5和R6各自独立选自-CH3、-OH、-Br、-Cl、-C≡CH、-N3;
R2选自-(CH2)pCH3、-(CH2)pCH2-、-(CH2O)qCH3、-(CH2O)qCH2-、-(CH2O)rH、-(CH2O)r-、-CH2(CH2OCH2)sCH2OH、-CH2(CH2OCH2)sCH2O-、-CH2(CH2OCH2)tCH3和-CH2(CH2OCH2)tCH2-;
其中n、m、p、q、r、s、t=0-18的整数;
A不存在,或为苯环;
B不存在,或为荧光团。
在一具体实施方式中,B为选自罗丹明B或氟硼吡咯的荧光团。
在一个具体实施方式中,B选自:
在一具体实施方式中,B不存在。
在一具体实施方式中,所述R3或R4各自为C1-C4烷基。
在一具体实施方式中,所述R3和R4各自为甲基或乙基。
在一具体实施方式中,所述R5和R6各自为-CH3。
在一具体实施方式中,所述R2选自-(CH2)pCH3、-(CH2O)rH、或-CH2(CH2OCH2)sCH2OH。
在一具体实施方式中,所述n、m、p、q、r、s、t各自为0、1、2、3、4或5。
在一具体实施方式中,所述A不存在。
在一具体实施方式中,所述A为苯环。
在一具体实施例中,所述化合物选自:
本发明提供本发明荧光探针的制备方法,包括:
(1)在溶剂和催化剂的存在下,由4-硝基萘酐制备4-氨基萘酐;
(2)在溶剂的存在下,由4-氨基萘酐及R2-NH2制备得到下式II的化合物:
(3)使式II化合物在盐酸和亚硝酸钠的存在下在冰浴中反应;
(4)在步骤(3)的反应溶液中加入下式III的化合物在冰浴中进行反应:
(5)撤去步骤(4)的冰浴,以将pH调节至6左右,继续反应,从而制备得到本发明式I的不含有B的化合物。
在一个具体实施方式中,所述方法还包括:
(6)在二氯甲烷、三乙胺和HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)的存在下,使步骤(5)所得产物先在冰浴中、然后在室温下与B反应,从而制备得到含B的式I化合物。
在一个具体实施方式中,步骤(1)在无水乙醇、氯化亚锡和浓盐酸的存在下进行。
在一个具体实施方式中,步骤(2)所用的溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)和正丁胺。
在一个具体实施方式中,步骤(3)中,先将式II化合物加到去离子水和浓盐酸中,冰浴下搅拌大约30分钟;然后将溶于去离子水的亚硝酸钠加入上述溶液中,冰浴下继续反应约30分钟。
在一个具体实施方式中,步骤(4)中,加入式III化合物反应大约30分钟。
在一个具体实施方式中,步骤(4)结束后撤去冰浴,然后将溶液pH调节到大约6,继续反应大约60分钟。
在一个具体实施方式中,通过加入饱和乙酸钠溶液而将pH调节到6左右。
在一个具体实施方式,步骤(6)中,使步骤(5)所得产物先在冰浴中与B反应大约60分钟,然后在室温下与B反应大约10小时。
在一具体实施方式中,用于上述步骤的反应溶剂选自冰醋酸,二甲基甲酰胺,二氯甲烷,甲苯,乙醇,盐酸,水或其混合溶液。
本发明还包括本发明所述的探针分子在肿瘤乏氧检测中的用途。
本发明还包括本发明所述的探针分子在制备用于肿瘤乏氧检测的试剂盒中的用途。
本发明还包括一种检测试剂盒,所述检测试剂盒含有权利要求1-5中任一项所述的化合物,作为荧光探针分子,用于检测肿瘤乏氧状态。
在一个具体实施例中,本发明的检测试剂盒还含有使用说明书以及其它的适于检测肿瘤乏氧状态所需的试剂。
本发明还提供一种检测肿瘤乏氧的方法,所述方法包括使本发明所述的探针分子与细胞接触以使所述探针分子透过细胞膜进入细胞内,比较接触前、后荧光的变化,其中,荧光增强指示肿瘤乏氧。
附图说明
图1显示探针分子设计思想。
图2显示探针分子P1的吸收(---)和发射光谱(—)(Ex:340nm)。
图3显示探针分子P1的荧光发射光谱(—)及使用盐酸、氯化亚锡还原后的荧光发射光谱(---)(Ex:440nm)。
图4显示探针分子P5的荧光发射光谱(—)及使用盐酸、氯化亚锡还原后的荧光发射光谱(---)(Ex:440nm)。
图5显示探针分子P1在不同条件下的细胞荧光强度(Hela细胞株,左侧为有氧,右侧为乏氧)。
图6显示探针分子P1在不同条件下的细胞荧光强度对比值(A549细胞株)。
具体实施方式
本文所用“烃基”包括长1-10个碳原子的直链和支链烷基、长2-10个碳原子的直链和支链烯基和炔基,包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基和异丁基等。优选烷基含有1-6个碳原子。
具体而言,本发明的R2优选为长1-6个碳原子的烷基或含1-6个碳原子和1-4个氧原子的长醚链。
本发明R2优选长醚链为连接臂,更优选以1个碳或2个碳为循环单元的醚链,这样的基团包括但不限于-(CH2O)qCH2-、-(CH2O)r-、-CH2(CH2OCH2)sCH2O-和-CH2(CH2OCH2)tCH2-,其中,q、r、s和t各自可以是取自1、2、3、4、5或6的数值。
在本发明优选的实施例中,R2为-CH2(CH2OCH2)tCH2-,其中,t为1。
在本发明的具体实施例中,R3和R4是乙基。
应理解,本发明所用的偶氮苯结构包括1,4-二取代苯基和1,4-二取代萘基,同时也可以为多取代的苯基或萘基,如卤素取代,氰基取代等。
本发明荧光探针的制备方法包括:
(1)在溶剂和催化剂的存在下,由4-硝基萘酐制备4-氨基萘酐;
(2)在溶剂的存在下,由4-氨基萘酐及R2-NH2制备得到下式II的化合物:
(3)使式II化合物在盐酸和亚硝酸钠的存在下在冰浴中反应;
(4)在步骤(3)的反应溶液中加入下式III的化合物在冰浴中进行反应:
(5)撤去步骤(4)的冰浴,以将pH调节至6左右,继续反应,从而制备得到本发明式I的不含有B的化合物。
若要制备含B的化合物,所述方法还包括:
(6)在二氯甲烷、三乙胺和HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)的存在下,使步骤(5)所得产物先在冰浴中、然后在室温下与B反应,从而制备得到含B的式I化合物。
步骤(1)可在无水乙醇、氯化亚锡和浓盐酸的存在下进行;步骤(2)所用的溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)和正丁胺。
步骤(3)中,先将式II化合物加到去离子水和浓盐酸中,冰浴下搅拌大约20-45分钟(例如30分钟),然后将溶于去离子水的亚硝酸钠加入上述溶液中,冰浴下继续反应20-45分钟(例如30分钟)。
步骤(4)中,加入式III化合物反应大约20-45分钟(例如30分钟),结束后撤去冰浴,然后将溶液pH调节到大约5.5-6.5(例如6左右),继续反应大约50-70分钟(例如60分钟)。可通过加入饱和乙酸钠溶液而调节pH。
步骤(6)中,使步骤(5)所得产物先在冰浴中与B反应大约50-70分钟(例如60分钟),然后在室温下与B反应大约8-12小时(例如10小时)。
当本发明的探针分子包含荧光团B时,分子内发生FRET作用。荧光团B作为能量供体,无荧光发射。当在体内乏氧条件下,偶氮键被还原为氨基断开,能量受体结构遭到破坏,荧光团B转而成为能量受体,使荧光团释放出荧光。
应理解,本发明中FRET机理的双荧光团探针使用了罗丹明B和对甲苯乙烯基氟硼吡咯,包括但不限于此,其他发射在500nm-600nm的荧光团都可以作为FRET能量供体。
本发明中的探针用于肿瘤的乏氧检测。
应理解,该类探针用于肿瘤的乏氧检测,所述细胞实验用到的细胞株都为癌细胞株,包括Hela、A549、Siha、MCF-7、V79,但不限于此。
应理解,细胞乏氧培养的时间决定细胞内氧分压的高低,氧分压越低细胞内还原性就越强,探针反应越迅速。在一实施例中细胞乏氧培养的时间从1h到10h不等,但不限于此。
应理解,本发明中的探针后期将用于人体肿瘤的早期检测。即将探针分子与辅料混合制成无菌的注射用诊断剂,静注给药(0.5mg/kg)。经过半小时的运输与分布,使用活体荧光成像仪对局部组织进行荧光成像。当局部组织荧光强度超过背景荧光强度一倍以上时,即可认为该局部组织癌变可能非常大。
下文将以具体实施例的方式描述本发明,其目的在于更好的理解本发明的内容。应理解,这些实施例仅仅是阐述性的,而非限制性的。实施例中所使用的试剂,除非特殊说明,否则都是从市场上常规购得。其用法和用量都可根据常规的用法和用量使用。
实施例1:4-氨基萘酐的合成
在25mL烧瓶中分别加入4-硝基萘酐(980mg,4mmol)、10mL无水乙醇、氯化亚锡(5.4g,24mmol)和6mL浓盐酸,磁力搅拌下加热回流反应5h。反应结束后停止加热,自然冷却至室温,抽滤,用5%稀盐酸洗涤,水洗,红外干燥,得黄色固体560mg,产率65%。溶解性太差,未做核磁。HRMS(ES-)calcd.for C12H7NO3[M-H]-212.0348,found212.0344.
实施例2:N-正丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺的合成
在25mL烧瓶中分别加入4-氨基萘酐(430mg,2mmol)、4mL DMF和正丁胺(150mg,2mmol),磁力搅拌下加热到110℃反应5h。反应结束后停止加热,自然冷却至室温,将反应液倒入100mL的硫酸氢钾溶液(5%,m/m)中,抽滤,水洗,红外干燥。柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇=100∶1),得橘黄色固体390mg,产率74%。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.59(d,1H,J=8.4Hz),8.39(d,1H,J=7.2Hz),8.17(d,1H,J=8.0Hz),7.62(dd,1H,J1=7.6Hz,J2=8.4Hz),7.40(s,2H),6.83(d,1H,J=8.4Hz),3.99(t,2H,J=7.6Hz),1.53–1.60(m,2H),1.27–1.36(m,2H),0.90(t,3H,J=7.2Hz);HRMS(ES+)calcd.for C16H16N2O2[M+H]+269.1290,found269.1292.
实施例3:N-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)-4-氨基-1,8萘酰亚胺的合成
在25mL烧瓶中分别加入4-氨基萘酐(430mg,2mmol)、4mL DMF和二甘醇胺(210mg,2mmol),磁力搅拌下加热到110℃反应5h。反应结束后停止加热,自然冷却至室温,将反应液倒入100mL的硫酸氢钾溶液(5%,m/m)中,抽滤,水洗,红外干燥。柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇=100∶1),得橘黄色固体415mg,产率69%。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.62(d,1H,J=8.4Hz),8.43(dd,1H,J1=6.4Hz,J2=8.0Hz),8.20(d,1H,J=8.4Hz),7.66(t,1H,J=8.0Hz),7.46(s,2H),6.85(d,1H,J=8.4Hz),4.55–1.58(m,1H),4.21(t,2H,J=6.8Hz),3.62(t,2H,J=6.8Hz),3.44–1.47(m,4H);HRMS(ES+)calcd.for C16H16N2O4[M+H]+301.1188,found301.1190.
实施例4:探针P1的合成
在25mL烧瓶中分别加入4-氨基萘酰亚胺(90mg,0.3mmol)、1mL去离子水和2mL浓盐酸,冰浴下搅拌0.5h。将亚硝酸钠(30mg,0.4mmol)溶于0.5mL去离子水中加入上述溶液,继续在冰浴下反应0.5h,然后加入N,N-二乙基苯胺(60mg,0.4mmol),反应0.5h后撤去冰浴,加入饱和乙酸钠溶液调节pH=6,继续反应1h。反应结束后抽滤,滤饼用去离子水洗涤,烘干后柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇=100∶1),得棕黑色固体81mg,产率58%。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.22(dd,1H,J1=1.2Hz,J2=8.8Hz),8.62–8.66(m,2H),8.02(dd,2H,J1=2.0Hz,J2=7.2Hz),7.94(d,1H,J=8.0Hz),7.81(dd,1H,J1=7.2Hz,J2=8.4Hz),6.78(dd,2H,J1=2.0Hz,J2=7.2Hz),4.47(t,2H,J=5.6Hz),3.89(t,2H,J=6.0Hz),3.68–3.71(m,4H),3.52(q,4H,J=7.2Hz),1.29(t,6H,J=7.2Hz);13CNMR(CDCl3,100MHz)δ164.8,164.4,152.3,151.4,144.4,134.1,132.2,131.5,131.0,129.3,129.1,127.0,126.8,126.6,122.2,121.5,112.2,111.2,72.3,68.5,61.9,45.0,39.5,12.7;HRMS(ES+)calcd.for C26H28N4O4[M+H]+461.2189,found461.2177.
实施例5:探针P2的合成
在25mL烧瓶中分别加入4-氨基萘酰亚胺(78mg,0.3mmol)、1mL去离子水和2mL浓盐酸,冰浴下搅拌0.5h。将亚硝酸钠(30mg,0.4mmol)溶于0.5mL去离子水中加入上述溶液,继续在冰浴下反应0.5h,然后加入N,N-二乙基苯胺(60mg,0.4mmol),反应0.5h后撤去冰浴,加入饱和乙酸钠溶液调节pH=6,继续反应1h。反应结束后抽滤,滤饼用去离子水洗涤,烘干后柱层析分离(二氯甲烷∶石油醚=2∶1),得棕黑色固体65mg,产率51%。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.21(dd,1H,J1=1.2Hz,J2=8.4Hz),8.62–8.65(m,2H),8.01(d,2H,J=9.2Hz),7.94(d,1H,J=8.0Hz),7.81(dd,1H,J1=7.2Hz,J2=8.4Hz),6.78(d,2H,J=9.2Hz),4.20(t,2H,J=7.6Hz),3.51(q,4H,J=6.8Hz),1.70–1.78(m,2H),1.42–1.51(m,2H),1.27(t,6H,J=7.2Hz),1.00(t,3H,J=7.2Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ164.5,164.1,152.1,151.3,144.3,132.7,131.8,131.2,130.6,129.2,129.1,126.7,126.6,126.4,122.5,121.8,112.1,111.1,44.9,40.3,30.3,20.4,13.9,12.7;HRMS(ES+)calcd.for C26H28N4O2[M+H]+429.2291,found429.2279.
实施例6:探针P3的合成
在25mL烧瓶中分别加入4-氨基萘酰亚胺(100mg,0.33mmol)、1mL去离子水和2mL浓盐酸,冰浴下搅拌0.5h。将亚硝酸钠(30mg,0.4mmol)溶于0.5mL去离子水中加入上述溶液,继续在冰浴下反应0.5h,然后加入N,N-二乙基-1-萘胺(90mg,0.43mmol),反应0.5h后撤去冰浴,加入饱和乙酸钠溶液调节pH=6,继续反应1h。反应结束后抽滤,滤饼用去离子水洗涤,烘干后柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇=100∶1),得棕黑色固体76mg,产率45%。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.21(d,1H,J=8.4Hz),9.03(d,1H,J=8.4Hz),8.60(d,2H,J=7.6Hz),8.23(d,1H,J=8.4Hz),8.05(d,1H,J=8.4Hz),7.99(d,1H,J=8.0Hz),7.79(t,1H,J=8.0Hz),7.65(t,1H,J=8.0Hz),7.56(t,1H,J=7.6Hz),7.15(d,1H,J=8.4Hz),4.44(t,2H,J=5.6Hz),3.88(t,2H,J=5.6Hz),3.64–3.71(m,5H),3.41(q,4H,J=6.8Hz),1.18(t,6H,J=7.2Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ164.5,164.1,154.2,151.6,143.5,133.8,131.8,131.6,130.7,129.7,129.4,129.2,127.5,127.0,125.6,124.7,123.7,122.6,122.3,116.2,113.5,112.6,72.3,68.4,61.9,47.1,39.6,12.3;HRMS(ES+)calcd.for C26H28N4O2[M+H]+511.2345,found511.2349.
实施例7:探针P4的合成
在25mL烧瓶中分别加入4-氨基萘酰亚胺(78mg,0.3mmol)、1mL去离子水和2mL浓盐酸,冰浴下搅拌0.5h。将亚硝酸钠(30mg,0.4mmol)溶于0.5mL去离子水中加入上述溶液,继续在冰浴下反应0.5h,然后加入N,N-二乙基-1-萘胺(80mg,0.4mmol),反应0.5h后撤去冰浴,加入饱和乙酸钠溶液调节pH=6,继续反应1h。反应结束后抽滤,滤饼用去离子水洗涤,烘干后柱层析分离(二氯甲烷∶石油醚=2∶1),得棕黑色固体82mg,产率57%。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.24(d,1H,J=8.4Hz),9.05(d,1H,J=8.4Hz),8.61–8.65(m,2H),8.23(d,1H,J=8.4Hz),8.05(dd,2H,J1=8.0Hz,J2=12.8Hz),7.82(t,1H,J=8.0Hz),7.66(t,1H,J=8.0Hz),7.57(t,1H,J=8.4Hz),7.16(d,1H,J=8.4Hz),4.18(t,2H,J=7.6Hz),3.41(q,4H,J=7.2Hz),1.71–1.79(m,2H),1.42–1.50(m,2H),1.18(t,6H,J=7.2Hz),1.00(t,3H,J=7.2Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ164.3,163.9,154.2,151.6,143.5,133.8,131.5,131.3,130.5,129.8,129.4,129.2,127.4,127.0,125.6,124.7,123.7,122.9,122.5,116.2,113.3,112.6,47.2,40.3,30.3,20.5,13.9,12.4;HRMS(ES+)calcd for C30H30N4O2[M+H]+479.2447,found479.2467.
实施例8:探针P5的合成
在25mL烧瓶中分别加入乏氧探针(20mg,0.042mmol)、罗丹明B(25mg,0.053mmol)、10mL二氯甲烷、2滴三乙胺和HBTU(20mg,0.053mmol),冰浴下反应1h,然后室温反应10h。反应结束后将溶剂旋干,柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇=80∶1)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.24(d,1H,J=8.4Hz),8.51–8.58(m,2H),8.18(d,1H,J=8.0Hz),8.02(d,2H,J=9.2Hz),7.91(d,1H,J=8.0Hz),7.82(t,1H,J=8.0Hz),7.75(t,1H,J=8.0Hz),7.59(t,1H,J=8.0Hz),7.25(d,1H,J=7.6Hz),6.98(d,2H,J=10.0Hz),6.78–6.81(m,6H),4.36(t,2H,J=6.4Hz),4.15(t,2H,J=4.4Hz),3.70(t,2H,J=6.0Hz),3.58(q,12H,J=7.2Hz),3.52(t,2H,J=7.2Hz),1.26–1.31(m,18H);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ164.3,12.4;HRMS(ES+)calcd.for C54H57N6O6 +[M-Cl]+885.4334,found885.4304.
实施例9:探针P6的合成
在25mL烧瓶中分别加入乏氧探针(20mg,0.042mmol)、氟硼吡咯(19mg,0.04mmol)、10mL二氯甲烷、2滴三乙胺和HBTU(20mg,0.053mmol),冰浴下反应1h,然后室温反应10h。反应结束后将溶剂旋干,柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇=80∶1)。得紫黑色固体21mg,产率为54%。HRMS(ES+)calcd.for C54H51BF2N6O5[M+H]+913.4060,found913.4054.
实施例10:探针P1的光谱测试
取一定量的探针P1溶于无水乙醇中,稀释后使溶液浓度为10μM。在紫外分光光度计和荧光分光光度计中测试该探针的吸收光谱和发射光谱(Ex:340nm),如图2所示。可以看出探针的最大吸收峰在520nm左右,相比萘酰亚胺荧光团的吸收有了近70nm的红移,而且探针几乎没有荧光发射,这就为荧光off-on检测提供了有利条件。
实施例11:探针P1的化学还原
取2mg探针溶于乙醇中,加入大大过量的浓盐酸和氯化亚锡还原,反应10min后完全退色,将溶剂旋干,二氯甲烷和水萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩。将产物溶于含1%DMSO的PBS缓冲液中,测试其荧光变化情况,荧光增强明显(如图3所示)。LC-MS监测原料反应完全,产物正确。
实施例12:探针P5的化学还原
取2mg探针溶于乙醇中,加入大大过量的浓盐酸和氯化亚锡还原,反应10min后溶液颜色由深紫色变为红色,将溶剂旋干,二氯甲烷和水萃取,有机相用水洗2次,无水硫酸钠干燥,浓缩。将产物溶于乙醇溶液中,调节浓度在微摩尔数量级,测试其荧光变化情况,可以看出荧光增强明显(如图4所示)。产物送高分辨质谱。HRMS(ES+)calcd.for C44H45N4O6 +[M-Cl]+725.3334,found725.3340.
实施例13:探针P1的细胞成像实验
Hela细胞和A549细胞都培养在37℃、95%空气和5%CO2混合气体中,分别使用RPMI-1640培养基(Hyclone)和Hams F12培养基(Hyclone),同时添加10%FBS(Gibco),2mM L-Glutamine,100U/ml penicillin和100μg/ml streptomycin正常培养。以每孔1×105个细胞接种于24孔玻璃底的细胞培养板中,先进行12-24h细胞贴壁培养。然后将细胞转移到乏氧和有氧两种不同的培养箱中培养,所述乏氧条件为:1%氧气、5%二氧化碳和94%氮气组成;而有氧条件为5%二氧化碳和95%空气组成。培养8h后按不同时间(5h,4h,3h,2h,1h)及不同探针浓度(5μM,10μM,15μM,20μM)加入探针P1的DMSO溶液,继续培养,DMSO的含量为1%。培养结束后,将培养基移除,细胞用PBS溶液洗涤3次,最后浸在一定量的PBS溶液中。
使用倒置荧光显微镜分别对有氧和乏氧培养的细胞进行成像测试,倒置荧光显微镜的滤光片选自FITC:激发范围为450-480nm,发射范围为500-550nm;曝光时间选择为2s。细胞荧光强度如图5所示。使用ImageJ软件对不同探针孵化时间的细胞图进行处理,可以得到有氧和乏氧两种条件下细胞荧光强度(像素亮度)随时间的变化趋势,如图6所示(探针浓度为10μM,DMSO含量为1%)。
Claims (10)
1.一种下式I所示的化合物:
式中,
R1选自-NR3R4;
R3选自-(CH2)mR6或-(CH2)nR5;
R4选自-(CH2)mR6;
R5和R6各自独立选自-CH3、-OH、-Br、-Cl、-C≡CH、-N3;
R2选自-(CH2)pCH3、-(CH2)pCH2-、-(CH2O)qCH3、-(CH2O)qCH2-、-(CH2O)rH、-(CH2O)r-、-CH2(CH2OCH2)sCH2OH、-CH2(CH2OCH2)sCH2O-、-CH2(CH2OCH2)tCH3和-CH2(CH2OCH2)tCH2-;
其中n、m、p、q、r、s、t=0-18的整数;
A不存在,或为苯环;
B不存在,或为荧光团。
2.如权利要求1所述的化合物,其特征在于,B选自:
其中,波浪线指示B与R2连接。
3.如权利要求1或2所述的化合物,其特征在于,R3或R4各自为C1-C4烷基。
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物,其特征在于,R2选自-(CH2)pCH3、-(CH2)pCH2-、-CH2(CH2OCH2)sCH2OH和-CH2(CH2OCH2)tCH2-,其中,p为1-3的整数,s、t各自为1或2。
5.如权利要求1-4中任一项所述的化合物,其特征在于,所述化合物选自:
6.一种制备权利要求1-5中任一项所述的化合物的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)在溶剂和催化剂的存在下,由4-硝基萘酐制备4-氨基萘酐;
(2)在溶剂的存在下,由4-氨基萘酐及R2-NH2制备得到下式II的化合物:
(3)使式II化合物在盐酸和亚硝酸钠的存在下在冰浴中反应;
(4)在步骤(3)的反应溶液中加入下式III的化合物在冰浴中进行反应:
(5)撤去步骤(4)的冰浴,以将pH调节至6左右,继续反应,从而制备得到权利要求1所示的式I的不含有B的化合物。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
(6)在二氯甲烷、三乙胺和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐的存在下,使步骤(5)所得产物先在冰浴中、然后在室温下与B反应,从而制备得到含B的式I化合物。
8.如权利要求6或7所述的方法,其特征在于,
所述步骤(1)在无水乙醇、氯化亚锡和浓盐酸的存在下进行;和/或
所述步骤(2)所用的溶剂为二甲基甲酰胺(DMF);和/或
所述步骤(3)中,先将式II化合物加到去离子水和浓盐酸中,冰浴下搅拌大约30分钟;然后将溶于去离子水的亚硝酸钠加入上述溶液中,冰浴下继续反应约30分钟;和/或
所述步骤(4)中,加入式III化合物反应大约30分钟;和/或
所述步骤(4)结束后撤去冰浴,然后将溶液pH调节到大约6,继续反应大约60分钟;和/或
所述步骤(6)中,使步骤(5)所得产物先在冰浴中与B反应大约60分钟,然后在室温下与B反应大约10小时。
9.权利要求1-5中任一项所述的化合物在制备用于肿瘤乏氧检测的试剂盒中的用途。
10.一种检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒含有权利要求1-5中任一项所述的化合物,作为荧光探针分子,用于检测肿瘤乏氧状态。
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