CN103013497A - 一种巯基荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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梁淑彩
刘衍斌
陈小慧
仰望
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Abstract

本发明公开了一种用于检测巯基的荧光探针，还公开了该探针的制备方法。该探针是以N-丁基-4-氨基和马来酸酐为起始原料合成获得，它以N-丁基-1,8-萘酰亚胺为荧光团，马来酰亚胺为巯基的特异性反应基团；探针自身荧光较弱，与巯基发生反应后荧光增强，可用于巯基的检测及荧光成像。该探针制备简单，在中性及弱碱性环境中对巯基反应快速，选择性好，灵敏度高，在巯基的测定及荧光成像等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种巯基荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种萘酰亚胺类巯基荧光探针，还涉及该探针的制备方法，属于有机小分子荧光探针技术领域。
背景技术
巯基(也称为硫醇，-SH)是生物体中许多蛋白质和小分子的组成部分，生物体内含巯基的物质主要有半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、硫氧还蛋白、金属硫蛋白等。巯基在细胞的氧化还原系统中具有重要的作用，其含量的变化与癌症、老年痴呆症、心血管疾病以及艾滋病等许多疾病有着直接的联系，因此对巯基的检测具有重要的意义。荧光探针在巯基检测中广泛应用(尹伶灵，陈蓁蓁，佟丽丽，徐克花，唐波，分析化学，2009,37(7),1073-1081;XiaoqiangChen,Ying Zhou,Xiaojun Peng,Juyoung Yoon,Chem.Soc.Rev.,2010,39,2120–2135)。探针分子可以在不破坏生物活性的情况下进入细胞，与活细胞内的巯基结合生成强荧光物质，借助于激光共聚焦成像技术，能实现“可视化”观测细胞内巯基的变化。1,8-萘酰亚胺衍生物具有较好的荧光性质，已广泛用于荧光染料和荧光增白剂，最近也用于多种荧光探针的开发(KenjiroHanaoka,Yasuaki Muramatsu,Yasuteru Urano,Takuya Terai,Tetsuo Nagano.Chem.Eur.J.2010,16,568-572;Raman Parkesh,T.Cl ive Leeb,Thorfinnur Gunnlaugsson.Org.Biomol.Chem.,2007,5,310-317)。马来酰亚胺类巯基荧光探针对巯基的选择性高和反应迅速，以其为反应基团的荧光探针自身往往无荧光或荧光较弱，与巯基反应后荧光大大增强，具有较好的检测灵敏度。但马来酰亚胺和N-丁基-1,8-萘酰亚胺结合得到N-丁基-4-马来酰亚胺基-1,8-萘酰亚胺及用于巯基荧光探针的应用未见报道。
近年来，以荧光素、吖啶、罗丹明、BODIPY等为荧光团的马来酰亚胺类荧光探针相继被开发利用。但常用于巯基荧光成像的探针中，荧光素马来酰亚胺、罗丹明马来酰亚胺等的斯托克斯位移较小，且其荧光易受pH影响，而BODIPY类荧光团的制备步骤较复杂。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种巯基荧光探针。
本发明还提供该探针的制备方法。
本发明为解决上述技术问题提供的技术方案为：一种巯基荧光探针，该探针为N-丁基-4-马来酰亚胺基-1,8-萘酰亚胺，具体结构如下：
上述的巯基荧光探针的制备方法为：将N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺溶于乙酸或CHCl3中，在搅拌下加入稍过量的马来酸酐，加热至反应完毕后冷却，过滤得到淡黄色固体，干燥，将干燥后的淡黄色固体与乙酸酐混合，于80℃下反应2h，然后旋干溶剂，重结晶得到巯基荧光探针。
本发明提供的荧光探针以马来酰亚胺为反应基团，萘酰亚胺为荧光团，自身荧光较弱，巯基反应后荧光明显增强。该探针制备简单，在中性及弱碱性环境中对巯基反应快速，选择性好，灵敏度高，在巯基的测定及荧光成像等方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1获得的荧光探针与Cys反应前后的荧光光谱，图中1和1’为荧光探针自身的荧光激发和发射光谱；2和2’为荧光探针与Cys反应后的荧光激发和发射光谱。
图2是不同氨基酸对实施例1获得的荧光探针荧光强度的影响，图中Gly为甘氨酸，Arg为精氨酸，Trp为色氨酸，Gln为谷氨酰胺，γ-GABA为γ-氨基丁酸。
图3是反应时间对巯基荧光探针与Cys反应的影响。
图4是巯基荧光探针用于检测Cys的标准曲线。
图5是实施例1获得的探针对活性Hepg2细胞内巯基双光子荧光显微成像的照片，激发光波长为720nm。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而非限定本发明的范围。
实施例1：
巯基荧光探针的制备
N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺溶于CHCl3，然后加入过量马来酸酐，60℃下反应并用薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)监测反应进程。反应完全后冷却，抽滤，收集淡黄色固体并干燥。将上述淡黄色固体置于两口烧瓶中，加入乙酸酐，于80℃下加热反应2h。然后将反应溶液旋转蒸干。残留物用乙酸乙酯重结晶，得到的产品即为目标产物N-丁基-4-马来酰亚胺基-1,8-萘酰亚胺。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.67(dd,1H),7.90(d,1H),7.78(t,1H),7.63(d,1H),4.25-4.16(m,1H),1.81-1.67(m,1H),1.51-1.39(m,1H),1.26(t,1H),0.99(t,2H)。
实施例2：
巯基荧光探针与Cys反应前后的荧光光谱
将得到的N-丁基-4-马来酰亚胺基-1,8-萘酰亚胺溶于乙醇中配成1×10-3mol L-1储备液，然后用水稀释成1×10-6mol L-1的探针工作溶液。向10mL刻度管中加入pH为7.5的磷酸缓冲液2ml，探针工作溶液1ml、过量的Cys溶液，混匀并于37℃下反应30min，然后定容。同时做空白实验。用荧光分光光度计测定空白及探针与Cys反应后的荧光光谱，结果表明探针的荧光很弱，与Cys反应后荧光大大增强，如图1所示。
实施例3：
非巯基氨基酸对巯基荧光探针荧光强度的影响
在10mL刻度管中加入2ml pH为7.5的磷酸缓冲液，探针工作溶液2ml、5×10-6molL-1的Cys溶液1ml，混匀并于37℃下反应30min，然后定容至10mL。同样的方法做荧光探针与其他非硫醇氨基酸的对照试验。同时做空白实验。用荧光分光光度计测定探针与不同氨基酸反应前后的荧光变化。结果表明，探针与Cys反应后荧光大大增强，但其他非巯基氨基酸的存在对探针的荧光强度几乎无影响，如图2所示。说明该探针选择性好。
实施例4：
反应时间对巯基荧光探针与Cys反应的影响
在10mL刻度管中加入2mlpH为7.5缓冲液，探针工作溶液2ml、5×10-6mol L-1的Cys溶液1ml，混匀后在37℃水浴中反应不同的时间，定容。同时做空白实验。测定相对荧光强度。结果表明，在37℃下探针与Cys在10min即反应完全，延长反应时间至1h，相对荧光强度并无明显变化，如图3所示。
实施例5：
巯基荧光探针用于检测Cys的方法及标准曲线
在10mL刻度管中加入2ml pH为7.5的磷酸缓冲液，探针工作溶液2ml，不同量的Cys，然后定容至10ml。同样的方法制备空白溶液。在37℃下反应30min后，测定相对荧光强度，制作标准曲线(R2=0.9977，n=7)，如图4所示。巯基探针用于测定Cys的线性范围为1×10-7mol/L至7×10-7mol/L，检测限为4.839×10-9mol/L。该探针灵敏度高。
实施例6：
荧光探针用于细胞内巯基的双光子荧光成像
人肝癌细胞（Hepg2细胞）接种于含有盖玻片的培养皿中，在35℃，5%CO2的培养箱及含10%胎牛血清培养液中培养，使细胞爬片生长。将接种好的细胞爬片用PBS清洗后，用0.05mg/ml的探针溶液染色细胞30min。染色后的玻片取出，洗去多余染液，在双光子激光共聚焦荧光显微镜下(720nm激发)观察成像效果，如图5所示。

Claims (2)

1.一种巯基荧光探针，其特征在于：所述的巯基荧光探针是N-丁基-4-马来酰亚胺基-1,8-萘酰亚胺，具体结构如下：
Figure FDA00002630181900011
2.一种如权利要求1所述的巯基荧光探针的制备方法，其特征在于：将N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺溶于乙酸或CHCl3中，在搅拌下加入过量的马来酸酐，加热至反应完毕后冷却，过滤得到淡黄色固体，干燥，将干燥后的淡黄色固体与乙酸酐混合，于80℃反应2h，然后旋干溶剂，重结晶得到巯基荧光探针。
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