CN104610959B - 一种检测硫化氢的荧光探针及其制备方法与使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测硫化氢的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用4‑羟基‑1,8‑萘酰亚胺构筑经典的ICT体系，并在4‑位直接引入对叠氮苄基部分，使其更具生物和光学稳定性。当存在硫化氢的条件下，叠氮基被硫化氢还原为氨基，进而发生1,6‑消除离去对氨基甲苯部分而得到4‑羟基‑1,8‑萘酰亚胺，本发明提供的萘酰亚胺类染料的“比率计型”硫化氢探针及其专用检测试剂盒对硫化氢溶液具有良好的响应，能够实现对细胞内硫化氢的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。

Description

一种检测硫化氢的荧光探针及其制备方法与使用方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种作为硫化氢荧光探针材料使用的萘酰亚胺-对叠氮苄醇衍生物及其制备方法与使用方法。
背景技术
硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的人体内第三大气体信号分子。在生命体内，硫化氢参与了细胞内氧化还原反应和多种信号传导过程，包括血管舒张、心肌收缩、神经传递和胰岛素分泌等。而当细胞内硫化氢处于非正常水平时将导致一系列生理疾病，例如阿尔兹海默、肝硬化、胃粘膜损伤、动脉和肺高血压等(参见B.D.Paul，andS.H.Snyder，H2S signaling through protein sulfhydration and beyond，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2012,13:499-507)。因此，有效地检测或监控生物样品或环境样品中的硫化氢已成为近年来相关领域的研究热点。
荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对生物样品的实时、在线检测而受到研究者的广泛关注。萘酰亚胺类荧光分子因其具有良好的光稳定性、高摩尔消光系数和量子产率等独特优点而成为该方法最重要的荧光母体之一，在多种待测分子的荧光检测中得到了广泛的应用。
目前已开发的用于检测硫化氢的小分子荧光探针主要基于叠氮官能团与硫化氢之间的特异性化学反应而设计的。当存在硫化氢的条件下，探针分子中的叠氮基团被硫化氢还原为氨基，导致探针分子的荧光性质发生变化，从而实现对硫化氢的特异性设别。
然而，已报道的硫化氢探针大多数是荧光“关-开”型(参见L.A.Montoya andM.D.Pluth，Selective Turn-on Fluorescent Probes for Imaging Hydrogen Sulfidein Living cells，Chem.Commun.，2012，48：4767-4769)，易受到检测环境，如检测温度、探针浓度等条件的影响；或是探针分子中存在生物易受性基团(参见X.-L.Liu,X.-J.Du,C.-G.Dai,and Q.-H.Song，Ratiometric Two-Photon Fluorescent Probes forMitochondrial Hydrogen Sulfide in Living Cells，J.Org.Chem.,2014,79:9481-9489.)，不利于其在复杂的生物体内进行检测。因此亟须一种新颖的、具有良好生物稳定性的且能实现“比率计型”检测的硫化氢荧光探针。
发明内容
为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明旨在提供一种来自萘酰亚胺和对叠氮苄醇的用于检测硫化氢的荧光探针及其制备方法和使用方法。
本发明的核心在于利用4-羟基-1,8-萘酰亚胺构筑经典的ICT体系，并在4-位直接引入对叠氮苄基部分，使其更具生物和光学稳定性。当存在硫化氢的条件下，叠氮基被硫化氢还原为氨基，进而发生1,6-消除离去对氨基甲苯部分而得到4-羟基-1,8-萘酰亚胺，通过上述方案，获得“比率计型”的荧光响应，大大提高了检测的灵敏度。
本发明一种检测硫化氢的荧光探针，结构式为式(I)或者式(II)，
式(I)为萘酰亚胺-对叠氮苄醇衍生物；
式(I)中，n为0～18的原子数，R为甲基，或羟基，或羧基，或磺酸基，或(三苯基)磷基，或中的任何一种。
II)所示化合物(Nap-S)：
一种检测硫化氢的荧光探针的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤一：在惰性气氛下，式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反应得到式(IV)所示取代的4-溴-1，8-萘酰亚胺；
式(IV)中，n为0～18的原子数，R为甲基，或羟基，或羧基，或磺酸基，或(三苯基)磷基，或中的任何一种；
步骤二：在惰性气氛下，在金属钠的存在下，式(IV)所示化合物在醇中反应得到式(V)所示取代的4-羟基-1，8-萘酰亚胺；
式(V)中，n为0～18的原子数，R为甲基，或羟基，或羧基，或磺酸基，或(三苯基)磷基，或中的任何一种；
步骤三：在惰性气氛下，在碱存在下，式(V)所示化合物与式(VI)所示对叠氮苄醇反应即得式(I)所示化合物；
步骤一中所述式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比为1～50:1；所述氨基化合物为正丁胺；所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或乙二醇单甲醚；步骤一的反应温度为50～120度；反应时间为1～20小时；
作为优选该步骤的反应温度为80度；反应时间为5小时；，4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比为10：1；
步骤二中所述醇为叔丁醇，异丙醇；式(IV)所示4-溴-1，8-萘酰亚胺和所述金属钠的摩尔比为0.1～1:1；步骤二的反应温度为0～100度；反应时间为1～20小时；
作为优选该步骤的反应温度为60度，反应时间为8小时，醇为叔丁醇；4-溴-1，8-萘酰亚胺和金属钠的摩尔比为1.5：1；
步骤三中所述碱与式(VI)所示对叠氮苄醇的摩尔比为1～10:1，所述碱为有机碱或无机碱，所述有机碱为三乙胺、吡啶或二异丙基乙基胺，所述无机碱为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾；式(V)所示4-羟基-1，8-萘酰亚胺和式(VI)所示对叠氮苄醇的摩尔比为1～0.1:1；步骤三的反应温度为0～100度；反应时间为1～20小时；步骤三反应过程在有机溶剂中进行，有机溶剂为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或丙酮。
作为优选该步骤的反应温度为80度，反应时间为10小时，式(V)所示4-羟基-1，8-萘酰亚胺和式(VI)所示对叠氮苄醇的摩尔比为0.8：1；碱与式(VI)所示对叠氮苄醇的摩尔比为2.2：1，有机溶剂为乙腈。
一种检测硫化氢的荧光探针的使用方法；该方法具体包括以下步骤：
步骤1：向不同浓度硫化氢的缓冲溶液中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少3种不同硫化氢含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；
所示缓冲溶液以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠缓冲溶液；
所示标准溶液的pH值为5～11；
所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～1μM；
所示标准溶液中硫化氢的含量为0.1nM～1mM；
步骤2：分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为410nm，以硫化氢浓度为横坐标，以I539/I444或I444/I539为纵坐标，建立标准曲线；
I539表示所述标准溶液在波长为539nm处的荧光发射峰强度值；
I444表示所述标准溶液在波长为444nm处的荧光发射峰强度值；
步骤3：向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为410nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的硫化氢含量。
本发明具有如下特点：
1)本发明提供的荧光探针是白色固体，分子结构的中醚键保证了探针的结构和光学稳定性。
2)本发明提供的荧光探针，其溶液对硫化氢的浓度敏感，随着硫化氢浓度的增加，紫外灯下观察到其水溶液的荧光由蓝色变为黄色。
3)本发明提供的荧光探针，其发射波长为444nm和539nm，为双波长响应，能大大消除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。
4)本发明提供的荧光探针对硫化氢浓度呈线性关系，以用于硫化氢的精确测量。
本发明提供的萘酰亚胺类染料的“比率计型”硫化氢探针及其试剂盒对硫化氢溶液具有良好的响应，能够实现对细胞内硫化氢的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
附图说明
图1为实施例1制备的荧光探针Nap-S的合成路线。
图2为实施例6制备的Nap-S试剂盒对硫化氢水溶液的颜色响应图。
图3为实施例6制备的Nap-S试剂盒对不同硫化氢水溶液的荧光响应图。
图4为实施例6制备的Nap-S试剂盒在波长444nm和539nm下的荧光发射强度的比值I539/I444与硫化氢浓度关系曲线。
图5为实施例6制备的Nap-S试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。
图6为实施例6制备的Nap-S试剂盒对细胞内硫化氢的荧光成像图；其中，(a)为未加Nap-S之前的细胞荧光成像图；(b)为加入Nap-S后的细胞荧光成像图；(c)为加入Nap-S和硫化氢后细胞荧光成像图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
如图1所示，实施例1、荧光探针Nap-S的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水乙醇中，再注入2.5mL正丁胺，在50℃的反应温度下，回流反应5小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺4.20g(产率为80％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将2.00g金属钠剪成细丝加入到100mL无水叔丁醇中，待钠丝溶解后，再向体系中加入3.72g N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，在0℃的反应温度下，回流反应10小时。反应完全后，向体系中加入500mL 1N冷的稀盐酸，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥得，N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺0.6g(产率为30％)，黄色固体。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.48(d,J＝8.1Hz,1H),8.42(d,J＝7.2Hz,1H),8.28(d,J＝8.2Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),4.08–3.96(m,2H),1.63-1.52(m,2H),1.39-1.27(m,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤c)：在惰性气氛下，将0.1g N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.1g碳酸钾，加入到15mL丙酮中回流15min。再向体系中加入0.07g对叠氮苄氯和0.06g碘化钾，在0℃的反应温度下，回流反应12小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-S 104mg(产率为69％)，白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.44(dt,J＝17.6,8.3Hz,3H),7.58(q,J＝7.7Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,3H),6.97(d,J＝7.7Hz,0H),5.22(d,J＝3.6Hz,2H),4.05(t,J＝7.3Hz,2H),1.67-1.55(m,2H),1.45-1.29(m,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ163.35,162.78,158.46,139.41,132.11,131.15,130.49,128.27,127.46,124.99,122.50,121.46,118.39,114.44,105.28,69.22,39.06,29.23,19.38,12.83；HRMS(ESI-TOF):m/z 401.1618[M+H]+,calc’d.401.1614。
实施例2、荧光探针Nap-S的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水甲醇中，再注入5.0mL正丁胺，在80℃的反应温度下，回流反应1小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺4.00g(产率为76％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将4.00g金属钠剪成细丝加入到100mL无水叔丁醇中，待钠丝溶解后，再向体系中加入3.72g N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，在50℃的反应温度下，回流反应1小时。反应完全后，向体系中加入500mL 1N冷的稀盐酸，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥得，N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺0.65g(产率为32％)，黄色固体。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.48(d,J＝8.1Hz,1H),8.42(d,J＝7.2Hz,1H),8.28(d,J＝8.2Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),4.08–3.96(m,2H),1.63-1.52(m,2H),1.39-1.27(m,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤c)：在惰性气氛下，将0.1g N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.15g碳酸氢钾，加入到15mL乙腈中回流15min。再向体系中加入0.14g对叠氮苄氯和0.06g碘化钾，在50℃的反应温度下，回流反应20小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-S 124mg(产率为82％)，白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.44(dt,J＝17.6,8.3Hz,3H),7.58(q,J＝7.7Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,3H),6.97(d,J＝7.7Hz,0H),5.22(d,J＝3.6Hz,2H),4.05(t,J＝7.3Hz,2H),1.67-1.55(m,2H),1.45-1.29(m,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ163.35,162.78,158.46,139.41,132.11,131.15,130.49,128.27,127.46,124.99,122.50,121.46,118.39,114.44,105.28,69.22,39.06,29.23,19.38,12.83；HRMS(ESI-TOF):m/z 401.1618[M+H]+,calc’d.401.1614。
实施例3、荧光探针Nap-S的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水乙二醇单甲醚中，再注入5.0mL正丁胺，在120℃的反应温度下，回流反应20小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺4.50g(产率为86％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将8.00g金属钠剪成细丝加入到100mL无水异丙醇中，待钠丝溶解后，再向体系中加入3.72g N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，在100℃的反应温度下，回流反应20小时。反应完全后，向体系中加入500mL 1N冷的稀盐酸，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥得，N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺0.70g(产率为34％)，黄色固体。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.48(d,J＝8.1Hz,1H),8.42(d,J＝7.2Hz,1H),8.28(d,J＝8.2Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),4.08–3.96(m,2H),1.63-1.52(m,2H),1.39-1.27(m,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤c)：在惰性气氛下，将0.1g N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.10g氢氧化钠，加入到15mL DMF中回流15min。再向体系中加入0.20g对叠氮苄氯和0.06g碘化钾，在100℃的反应温度下，回流反应1小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-S 96mg(产率为63％)，白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.44(dt,J＝17.6,8.3Hz,3H),7.58(q,J＝7.7Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,3H),6.97(d,J＝7.7Hz,0H),5.22(d,J＝3.6Hz,2H),4.05(t,J＝7.3Hz,2H),1.67-1.55(m,2H),1.45-1.29(m,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ163.35,162.78,158.46,139.41,132.11,131.15,130.49,128.27,127.46,124.99,122.50,121.46,118.39,114.44,105.28,69.22,39.06,29.23,19.38,12.83；HRMS(ESI-TOF):m/z 401.1618[M+H]+,calc’d.401.1614。
实施例4、荧光探针Nap-S的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水丙醇中，再注入15.0mL正丁胺，在120℃的反应温度下，回流反应15小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺4.30g(产率为82％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将10.00g金属钠剪成细丝加入到100mL无水异丙醇中，待钠丝溶解后，再向体系中加入3.72g N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，在60℃的反应温度下，回流反应2小时。反应完全后，向体系中加入500mL 1N冷的稀盐酸，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥得，N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺0.50g(产率为24％)，黄色固体。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.48(d,J＝8.1Hz,1H),8.42(d,J＝7.2Hz,1H),8.28(d,J＝8.2Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),4.08–3.96(m,2H),1.63-1.52(m,2H),1.39-1.27(m,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤c)：在惰性气氛下，将0.1g N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.20g三乙胺，加入到15mL DMSO中回流15min。再向体系中加入0.20g对叠氮苄氯和0.06g碘化钾，在80℃的反应温度下，回流反应5小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-S 116mg(产率为76％)，白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.44(dt,J＝17.6,8.3Hz,3H),7.58(q,J＝7.7Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,3H),6.97(d,J＝7.7Hz,0H),5.22(d,J＝3.6Hz,2H),4.05(t,J＝7.3Hz,2H),1.67-1.55(m,2H),1.45-1.29(m,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ163.35,162.78,158.46,139.41,132.11,131.15,130.49,128.27,127.46,124.99,122.50,121.46,118.39,114.44,105.28,69.22,39.06,29.23,19.38,12.83；HRMS(ESI-TOF):m/z 401.1618[M+H]+,calc’d.401.1614。
实施例5、荧光探针Nap-S的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水正丁醇中，再注入5.0mL正丁胺，在80℃的反应温度下，回流反应13小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺4.42g(产率为84％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将4.20g金属钠剪成细丝加入到100mL无水叔丁醇中，待钠丝溶解后，再向体系中加入3.72g N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，在60℃的反应温度下，回流反应6.5小时。反应完全后，向体系中加入500mL 1N冷的稀盐酸，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥得，N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺0.56g(产率为28％)，黄色固体。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.48(d,J＝8.1Hz,1H),8.42(d,J＝7.2Hz,1H),8.28(d,J＝8.2Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),4.08–3.96(m,2H),1.63-1.52(m,2H),1.39-1.27(m,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤c)：在惰性气氛下，将0.1g N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺和0.17g二异丙基乙基胺，加入到15mL丙酮中回流15min。再向体系中加入0.20g对叠氮苄氯和0.06g碘化钾，在100℃的反应温度下，回流反应17小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-S 135mg(产率为89％)，白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.44(dt,J＝17.6,8.3Hz,3H),7.58(q,J＝7.7Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,3H),6.97(d,J＝7.7Hz,0H),5.22(d,J＝3.6Hz,2H),4.05(t,J＝7.3Hz,2H),1.67-1.55(m,2H),1.45-1.29(m,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ163.35,162.78,158.46,139.41,132.11,131.15,130.49,128.27,127.46,124.99,122.50,121.46,118.39,114.44,105.28,69.22,39.06,29.23,19.38,12.83；HRMS(ESI-TOF):m/z 401.1618[M+H]+,calc’d.401.1614。
实施例6、式(I)所示化合物的光谱性质
称取4.0mg Nap-S，溶于10mL DMSO，配成母液(1mM),即得到Nap-S试剂盒。将100μL的此母液滴加到不同浓度硫化氢的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL。测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以410nm进行激发，发射峰的强度比为I539/I444或I444/I539；激发和发射的狭缝宽度分别为5/5。
图2为Nap-S试剂盒对硫化氢水溶液的颜色响应图。由图2知，当加入硫化氢水溶液后，肉眼观察到溶液的颜色由无色变为黄色，同时溶液的荧光也由蓝色荧光变为黄色荧光。证明本发明试剂盒对硫化氢具有直观的显色响应。
图3为Nap-S试剂盒对不同硫化氢水溶液的荧光响应图。由图3知，随着硫化氢浓度的增加，波长为539nm处的发射峰的荧光强度逐渐增大，而波长为444nm处的发射峰的荧光强度逐渐减小，证明本发明试剂盒对硫化氢具有灵敏的比率响应。
图4为Nap-S试剂盒在波长444nm和539nm下的荧光发射强度的比值I539/I444与硫化氢浓度关系曲线。由图4知，随着水溶液中硫化氢浓度的增加，荧光发射比值I539/I444逐渐增大。在硫化氢浓度为0～1mM的范围内，发射峰的荧光强度比值I539/I444与水溶液中硫化氢的浓度呈良好的线性关系(R2＝0.992)。证明本发明试剂盒以对硫化氢进行准确测量。
图5为Nap-S试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。由图5知，常见共存阳离子、阴离子、生物小分子的加入并不能使溶液的荧光发射比值I539/I444发生改变。证明本发明试剂盒对硫化氢具有优秀的选择性。
实施例7、细胞内硫化氢含量的测定
1)在37度和5％(v/v)CO2条件下，用含有10％(v/v)FBS(胎牛血清)、100U/mL盘尼西林、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养HeLa细胞。细胞使用前用PBS缓冲液清洗。
2)在HeLa细胞中加入PBS(pH 7.4)，再加入Nap-S(1μM)孵育30min，用PBS洗三遍后，进行共聚焦荧光成像，其中激发波长为400nm，收集波段为400-650nm。然后，向上述HeLa细胞中再加入NaHS(10μM)的磷酸缓冲盐溶液，继续孵育30min后，在激光共聚焦显微镜上进行成像，其中激发波长为400nm，收集波段为400-650nm。
由图6知，载有Nap-S的细胞在未加硫化氢之前呈现蓝光荧光，表明Nap-S以很好地透过细胞膜。而当加入硫化氢以后，细胞呈现黄色荧光发射，表明Nap-S以在细胞内与硫化氢发生特异性响应。证明本发明试剂盒以在细胞中对硫化氢进行检测。
最后应说明的是，上述实施例仅举出以Nap-S化合物为荧光试剂，其余荧光试剂由于结构与性质相近，其浓度、实验激发波段选择不一一列出，然而其并非用于限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当以作出各种修改和变更。

Claims (3)

1.一种检测硫化氢的荧光探针的制备方法，其中检测硫化氢的荧光探针的结构式为式(I)；
式(I)中，n为0～18的原子数，R为甲基，或羟基，或羧基，或磺酸基，或(三苯基)膦基，或中的任何一种；
其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤一：在惰性气氛下，式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反应得到式(IV)所示取代的4-溴-1，8-萘酰亚胺；
式(IV)中，n为0～18的原子数，R为甲基，或羟基，或羧基，或磺酸基，或(三苯基)膦基，或中的任何一种；
步骤二：在惰性气氛下，在金属钠的存在下，式(IV)所示化合物在醇中反应得到式(V)所示取代的4-羟基-1，8-萘酰亚胺；
式(V)中，n为0～18的原子数，R为甲基，或羟基，或羧基，或磺酸基，或(三苯基)膦基，或中的任何一种；
步骤三：在惰性气氛下，在碱存在下，式(V)所示化合物与式(VI)所示对叠氮苄氯反应即得式(I)所示化合物；
2.根据权利要求1所述的一种检测硫化氢的荧光探针的制备方法；其特征在于：
步骤一中所述式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比为1～50:1；所述氨基化合物为正丁胺；所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或乙二醇单甲醚；步骤一的反应温度为50～120℃；反应时间为1～20小时；
步骤二中所述醇为叔丁醇，异丙醇；式(IV)所示取代的4-溴-1，8-萘酰亚胺和所述金属钠的摩尔比为0.1～1:1；步骤二的反应温度为0～100℃；反应时间为1～20小时；
步骤三中所述碱与式(VI)所示对叠氮苄氯的摩尔比为1～10:1，所述碱为有机碱或无机碱，所述有机碱为三乙胺、吡啶或二异丙基乙基胺，所述无机碱为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾；式(V)所示取代的4-羟基-1，8-萘酰亚胺和式(VI)所示对叠氮苄氯的摩尔比为1～0.1:1；步骤三的反应温度为0～100℃；反应时间为1～20小时；步骤三反应过程在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或丙酮。
3.根据权利要求2所述的一种检测硫化氢的荧光探针的制备方法；其特征在于：
步骤一中，反应温度为80℃；反应时间为5小时；，4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比为10：1；
步骤二中，反应温度为60℃，反应时间为8小时，醇为叔丁醇；4-溴-1，8-萘酰亚胺和金属钠的摩尔比为1.5：1；
步骤三中，反应温度为80℃，反应时间为10小时，式(V)所示取代的4-羟基-1，8-萘酰亚胺和式(VI)所示对叠氮苄氯的摩尔比为0.8：1；碱与式(VI)所示对叠氮苄氯的摩尔比为2.2：1，有机溶剂为乙腈。
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