CN113429335B - 一种溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents
一种溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及一种溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针及其制备方法和用途,以实现双光子荧光成像检测细胞溶酶体内的极性和pH变化,具有高选择性、高灵敏度、低生物毒性的优点。
背景技术
溶酶体在维持细胞结构和功能的平衡方面发挥着重要的生理作用,包括内吞作用、自噬、质膜修复和氧化应激。它们含有多种水解酶,负责在最佳酸性环境下分解各种生物大分子,溶酶体功能受损可导致神经元功能障碍和神经变性。酸性pH环境是溶酶体的关键生物标志物,其pH稳态范围4.0至5.0。溶酶体pH值的异常波动往往意味着溶酶体功能障碍。此外,溶酶体极性的反常变化与一些疾病的产生关系密切。因此,活细胞和组织中溶酶体pH和极性的检测和实时监测对于研究溶酶体相关的生理和病理过程至关重要。
自噬是一个重要的代谢过程,通过清除聚集的蛋白质、长寿命的胞质蛋白质和受损的细胞器来维持细胞内环境稳定。它涉及一系列事件,包括双膜形成、伸长、囊泡成熟以及最终将封装的物质输送到溶酶体。自噬已被证实与多种疾病有关,如神经退行性疾病、肥胖症和癌症,自噬被认为是疾病治疗的潜在目标。因此,监测自噬以评估某些病理过程中的细胞状态或筛选与自噬相关的有效治疗性化疗药物具有重要的指导价值。
与其他生物分析方法相比,荧光探针结合荧光显微成像技术由于其无创、高灵敏度、优异的特异性和响应时间短等优势已成为一种在亚细胞水平上对分析物进行可视化监测的有效方法。近年来,荧光成像的方法已经被广泛应用于检测活细胞溶酶体内极性和pH变化,报道了许多可在溶酶体内检测极性或pH的荧光探针,但同时检测溶酶体内极性和pH的荧光探针还是非常少,特别是兼具双光子性质的,因此开发一种溶酶体靶向的双响应极性和pH的双光子荧光探针是非常迫切和重要的。
发明内容
本发明旨在提供一种溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针及其制备方法和用途,所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以特异性靶向溶酶体,且具有可以分别响应极性和pH的有机小分子结构,以实现通过双光子荧光成像实时监测活细胞溶酶体内极性和pH的变化,具有选择性高、灵敏度高、光稳定性好等优点,细胞毒性测试表明本发明双光子荧光探针的细胞相容性良好。
本发明溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针,简记为Lyso-FNN,是以咔唑为母体,其结构式如下:
本发明溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:将KOH(75mmol,16.20g)溶解在丙酮(100mL)中,将3-碘咔唑(30.00mmol,8.79g)加入到混合物中,在室温下搅拌2小时活化;之后,将1,4-二溴丁烷(90.00mmol,5.05g)滴入混合体系中,搅拌12小时;反应结束后,经柱层析(石油醚/乙酸乙酯=20:1,作为洗脱液)纯化得到化合物1,7.47g,产率85%。
步骤2:在冰水浴中,将POCl3(26.09mmol,4.00g)逐滴加入DMF(62.93mmol,4.60g)中,搅拌30分钟,然后在室温下继续搅拌1.5小时;将溶解了化合物1(7.00mmol,3.00g)的1,2-二氯乙烷(10mL)溶液缓慢滴入体系中,将混合物在室温下搅拌1小时后将温度升至95℃,回流过夜;反应结束后加入氢氧化钠水溶液调节pH至7-8,然后将混合物倒入水中,用CH2Cl2(30mL)萃取3次,有机层用无水Na2SO4干燥并浓缩,得到粗产物,柱层析(石油醚/乙酸乙酯=10:1,作为洗脱液)纯化得化合物2,2.1g,产率70%。
步骤3:在30℃下将化合物2(1.0g,2.19mmol)、4-氟苯乙炔(0.32g,2.66mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(9.65mg,0.014mmol)、CuI(5.24mg,0.027mmol)、Et3N(5mL)、THF(5mL)在无水厌氧条件下搅拌12小时;反应结束后,经柱层析(石油醚:二氯甲烷=4:1,作为洗脱液)纯化得到化合物3,0.85g,产率86.48%。
步骤4:将化合物3(0.6g,1.34mmol)、2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.18g,1.13mmol)、NaH(0.15g,6.25mmol)、THF(10mL)在60℃下在无水厌氧条件下搅拌过夜;反应结束后,经柱层析(石油醚:乙酸乙酯=10:1,作为洗脱剂)纯化得到化合物4,0.40g,产率60.02%。
步骤5:将化合物4(0.2g,0.34mmol)、吗啉(0.17g,1.95mmol)、K2CO3(0.07g,0.51mmol)、KI(5.6mg,0.06mmol)、DMF(10mL)在100℃下在无水厌氧条件下搅拌24h;反应结束后,经柱层析(石油醚:乙酸乙酯=5:1,作为洗脱剂)得探针Lyso-FNN,0.15g,产率74.29%。
本发明溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针的合成过程如下:
本发明双响应双光子荧光探针的用途,是用于制备检测活细胞溶酶体内的极性和pH变化时的检测试剂。检测方法如下:
将本发明Lyso-FNN溶于DMSO(5mL)中制得2mM的母液,取15μL Lyso-FNN母液加入到3mL不同配比的THF/H2O体系混合溶剂(极性参数设置为Δf)中,得到最终浓度为10μM的测试液。Lyso-FNN的单光子激发波长为370nm,检测375-600nm范围内的荧光光谱变化,可以明显观察到从水含量10%(Δf≈0.25)到80%(Δf≈0.31),在434nm处荧光强度降低了15.6%,溶液极性和荧光强度呈现良好的线性关系(R2=0.9852)。
为了测试Lyso-FNN对于环境pH的响应情况,取15μL Lyso-FNN母液加入到3mL不同pH的B-R缓冲溶液中,得到最终浓度为10μM的测试液。单光子激发波长同上,检测375-700nm范围内的荧光光谱变化,可以观察到当环境的pH值从4变化到7.5(生物系统中常见的pH范围)时,Lyso-FNN的荧光强度和环境pH之间呈正相关且具有良好的线性关系(R2=0.9758)。探针对pH的循环响应能力是评价pH荧光探针的重要指标,采用相同浓度的测试液测试了Lyso-FNN在pH分别为4和7时的循环响应能力。发现Lyso-FNN在5次循环过程中表现出稳定的荧光响应性,具有可逆性且能瞬间响应。还探究了Lyso-FNN在HaLa细胞中的光学稳定性,因为在细胞自噬的过程中,细胞内环境发生明显变化,这会影响探针的光稳定性。此外,利用Lyso-FNN测试了雷帕霉素诱导细胞自噬过程中溶酶体内极性和pH的变化趋势。
本发明溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针,在溶液和细胞中都对极性和pH具有良好响应能力。细胞毒性测试表明Lyso-FNN的细胞相容性良好,双光子共聚焦荧光显微成像实验表明Lyso-FNN可以有效定位溶酶体(定位系数为0.91),适用于溶酶体双光子荧光成像和原位检测,可以原位监测雷帕霉素诱导细胞自噬过程中溶酶体内极性和pH变化趋势。
附图说明
图1是Lyso-FNN在不同体积比的四氢呋喃/水混合体系中的(a)紫外吸收光谱图(b)荧光发射光谱图及荧光强度(I434nm)和Δf之间的线性关系图。
图2是Lyso-FNN在不同pH的B-R缓冲溶液的(a)紫外吸收光谱图(b)荧光发射光谱图(c)荧光强度(I521nm)和pH之间的曲线图及pH在4-7.5范围内荧光强度与pH的线性关系图。
图3是Lyso-FNN分别在pH=4和pH=7条件下的荧光循环图。
图4是Lyso-FNN在(a)不同比例的THF-H2O体系中和(b)在不同pH的B-R缓冲溶液中的有效双光子吸收截面。
图5是在不同浓度(0μM、10μM、20μM和30μM)的Lyso-FNN的作用下的HeLa细胞存活率图。
图6是Lyso-FNN(10μM)和0.5μM商用溶酶体探针(LTDR)同时共染HeLa细胞的溶酶体共聚焦荧光成像图。探究Lyso-FNN的溶酶体靶向能力。
图7是Lyso-FNN(10μM)的共聚焦荧光成像图,探究Lyso-FNN的光学稳定性。
图8是Lyso-FNN(10μM)在5μM雷帕霉素诱导的HeLa细胞自噬共聚焦荧光成像图。
图9是Lyso-FNN(10μM)在5μM雷帕霉素及3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬抑制剂)共同孵育的HeLa细胞自噬共聚焦荧光成像图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1:Lyso-FNN的合成
将化合物4(0.2g,0.34mmol)、吗啉(0.17g,1.95mmol)、K2CO3(0.07g,0.51mmol)、KI(5.6mg,0.06mmol)、DMF(10mL)在100℃下在无水厌氧条件下搅拌24h;反应结束后,经柱层析(石油醚:乙酸乙酯=5:1,作为洗脱剂)得探针Lyso-FNN,0.15g,产率74.29%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.75(d,J=1.7Hz,1H),8.49(d,J=1.6Hz,1H),7.99-7.90(m,1H),7.71(dd,J=8.6,2.4Hz,1H),7.68-7.61(m,3H),7.53(d,J=7.6Hz,1H),7.47(d,J=7.2Hz,1H),7.37-7.26(m,2H),7.25-7.18(m,1H),4.53-4.41(m,1H),3.54-3.48(m,2H),2.28-2.24(m,1H),1.90-1.74(m,2H),1.53-1.41(m,6H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ:183.31,162.51,160.87,153.92,146.48,141.12,140.22,138.36,133.33,133.28,129.19,127.54,126.70,124.89,124.00,123.94,122.31,122.10,121.40,120.29,119.67,119.31,116.94,116.01,115.82,112.50,110.14,109.96,90.37,86.52,66.06,57.31,53.09,52.13,42.31,26.09,23.02.ESI-MS m/z:calcd.for C40H38FN3O,Lyso-FNN,596.3032,found,596.3000.
实施例2:Lyso-FNN的光谱测试
将本发明Lyso-FNN溶于DMSO(5mL)中制得2mM的母液,取15μL Lyso-FNN母液加入到3mL不同配比的THF/H2O体系混合溶剂(极性参数设置为Δf)中,获得探针Lyso-FNN在不同极性溶剂中的紫外光谱图(图1a)。其在434nm处荧光强度随着水含量从10%(Δf≈0.25)到80%(Δf≈0.31)降低了15.6%,溶液极性和荧光强度呈现良好的线性关系(R2=0.9852)(图1b)。为了测试Lyso-FNN对于环境pH的响应情况,取15μL Lyso-FNN母液加入到3mL不同pH的B-R缓冲溶液中,获得探针Lyso-FNN在不同极性溶剂中的紫外光谱图(图2a)。当环境的pH值从4变化到7.5时,Lyso-FNN的荧光强度和环境pH之间呈正相关且具有良好的线性关系(R2=0.9758)(图2c)。采用相同浓度的测试液测试了Lyso-FNN在pH分别为4和7时的循环响应能力。发现Lyso-FNN在5次循环过程中表现出稳定的荧光响应性,具有可逆性且能瞬间响应(图3)。
实施例3:Lyso-FNN的双光子性能测试
探针Lyso-FNN在THF/H2O混合溶剂系统中在含水量为10%时,有效双光子吸收截面(Φδ)在780nm出现最大,为92GM(图4a)。同样的在pH为4的B-R缓冲溶液中,探针Lyso-FNN同样表现出了优良的有效双光子吸收截面,最大有效双光子吸收截面为150GM(图4b)。证明Lyso-FNN有能力用于细胞内极性的双光子共聚焦荧光成像。
实施例4:细胞毒性测试
在探针Lyso-FNN进行细胞成像的应用之前,需要对探针的毒性进行测试,采用MTT法进行实验。分别加入0μM、10μM、20μM和30μM的探针Lyso-FNN培养HeLa细胞24h,发现细胞存活率始终保持在90%以上(图5)。因而探针Lyso-FNN对于HeLa细胞的毒性较低,可以进行生物应用。
实施例5:细胞定位测试
为了研究Lyso-FNN的溶酶体定位性能,这里使用溶酶体的商业染料(LTDR,0.5μM)与Lyso-FNN在HeLa细胞中进行共定位研究。结果表明Lyso-FNN的蓝色通道(λem=420-480nm,λex=780nm)和LTDR(λem=640-700nm,λex=633nm)的荧光图像重叠良好,并且Lyso-FNN与LTDR的Pearson共定位系数计算为0.91(图6)。这些结果表明,Lyso-FNN可以很好地定位于活细胞的溶酶体中。
实施例6:Lyso-FNN的时间稳定性
对探针Lyso-FNN在细胞中的长时间成像进行测试,如图7,随着照射时间的延长,无论是探针Lyso-FNN的蓝色通道还是绿色通道的荧光均保持稳定。说明探针Lyso-FNN很稳定,是适合用于在细胞中的长时间成像的。
实施例7:Lyso-FNN对雷帕霉素诱导的自噬成像
使用探针Lyso-FNN和雷帕霉素共同培养细胞30分钟,之后进行双光子共聚焦荧光成像。获得了如图8所示的一系列图片,可以观察到随着药物处理时间的延长,探针Lyso-FNN的蓝色通道的荧光强度逐渐降低,说明自噬过程中,溶酶体极性呈现出增强的趋势。与此同时,还检测到探针Lyso-FNN的绿色通道荧光强度也随着时间点增长表现出下降的趋势,说明了自噬过程中溶酶体pH的降低。证明探针Lyso-FNN可以通过双通道成像分别响应极性和pH从而被用于监测自噬。
实施例8:Lyso-FNN对3-MA抑制自噬的成像
为了进一步说明实施例7中,极性和pH的变化是由雷帕霉素诱导的自噬引起的,在探针Lyso-FNN培养细胞30分钟后,采用了加入3-甲基腺嘌呤(3-MA)作为自噬抑制剂,与雷帕霉素共同培养细胞的实验方案。结果如图9所示,无论是探针Lyso-FNN的蓝色通道还是绿色通道,荧光强度都维持着稳定的水平,说明在自噬被抑制时,溶酶体的极性和pH没有发生明显的波动。上述实验结果证明,探针Lyso-FNN可以作为一种有效的工具,通过双重响应从不同角度来评估和监测线粒体自噬,并且这种不依赖于单一参数的监控方式可以避免来自复杂生理环境的实验误差,获得更准确的结果。因此探针Lyso-FNN具有应用于评价和筛选线粒体自噬诱导/抑制剂的前景。
Claims (9)
2.一种权利要求1所述的溶酶体靶向的双响应双光子荧光探针的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤1:将KOH、KI和1,4-二溴丁烷的混合物加热至60℃,反应1小时后,加入3-碘咔唑,回流反应,反应结束后通过柱色谱法纯化得到化合物1;
步骤2:在冰水浴中,将POCl3逐滴加入DMF中,搅拌30分钟,然后在室温下继续搅拌1.5小时;将溶解了化合物1的1,2-二氯乙烷溶液滴加至体系中,在室温下搅拌1小时后将温度升至95℃,回流反应;反应结束后加入氢氧化钠水溶液调节pH至7-8,然后将混合物倒入水中,用CH2Cl2萃取,有机层用无水Na2SO4干燥并浓缩,得到粗产物,经柱层析纯化得化合物2;
步骤3:在30℃下将化合物2、4-氟苯乙炔、Pd(PPh3)2Cl2、CuI、Et3N、THF在无水厌氧条件下搅拌12小时,反应结束后经柱层析纯化得化合物3;
步骤4:将化合物3、2,3,3-三甲基-3H-吲哚、NaH、THF在60℃、无水厌氧条件下搅拌反应,反应结束后经柱层析纯化得化合物4;
步骤5:将化合物4、吗啉、K2CO3、KI、DMF在100℃、无水厌氧条件下搅拌24小时,反应结束后经柱层析纯化得目标产物Lyso-FNN;
反应路线如下所示:
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤1中,柱色谱法纯化时的洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=20:1,v/v。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤2中,柱色谱法纯化时的洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=10:1,v/v。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤3中,柱色谱法纯化时的洗脱液为石油醚:二氯甲烷=4:1,v/v。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤4中,柱色谱法纯化时的洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=10:1,v/v。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤5中,柱色谱法纯化时的洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=5:1,v/v。
8.一种权利要求1所述的双响应双光子荧光探针的用途,其特征在于:
所述双响应双光子荧光探针用于制备监测活细胞溶酶体内的极性和pH变化时的检测试剂。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:
所述检测试剂在细胞自噬过程中对于溶酶体内极性和pH变化同时具有荧光响应。
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