CN114874639B - 一类新型半花菁近红外荧光染料，其合成方法及应用 - Google Patents

一类新型半花菁近红外荧光染料，其合成方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类新型半花菁近红外荧光染料，其合成方法及其应用。该类型可以有效地提升染料摩尔消光系数和荧光量子产率，并且相较于传统半花菁荧光染料具备更长吸收和发射波长。通过实验证明该染料具有良好的光物理性能以及具有生物荧光成像的潜力，可以用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记、DNA测序以及用于制备肿瘤的特异性识别和光动力治疗的试剂方面等，可以应用于生物和医药领域中。

Description

一类新型半花菁近红外荧光染料，其合成方法及应用
技术领域
本发明属于荧光染料领域，涉及一类新型半花菁近红外荧光染料的合成，及其在生物染色方面的应用。
背景技术
近些年来，荧光染料被广泛用于标记、检测、定量生物样品中的组分，其作用机理主要是将荧光染料通过共价键或者非共价键连接在生物配体，比如蛋白质、抗体、酶、核苷酸、核酸、以及其他分子上。染料标记配体一般具有特异性，从而保证染料对生物样品的特异性识别，以实现标记和检测等目的。
半花菁荧光染料作为菁染料的一种，已经被广泛研究。特别是氧杂蒽类型的半花菁染料，其吸收和发射波长均在近红外区，可以有效地避免生物体自荧光的干扰，并且这类半花菁染料的光稳定性相较于类似波长的染料更优，因此这类染料可以很好的用于体内和体外的生物检测应用当中。
但是，目前存在的氧杂蒽半花菁染料也具有一系列问题：1.摩尔消光系数相对较小，无法充分利用光能；2.荧光量子产率较低，限制了这类染料的应用；3.合成方法较单一，从而导致可以修饰的位点较少；4.水溶性较差，限制了体内和体外的标记与检测。因此需要针对这些问题开发新型的半花菁近红外荧光染料，从而克服目前存在的缺陷，使其具备更佳的成像、标记和检测的能力。
发明内容
为克服现有半花菁荧光染料的一系列缺陷，提供了一类新型半花菁近红外荧光染料、其合成方法和应用。本申请的技术方案如下：
本申请的第一方面在于保护一类新型半花菁近红外荧光染料，所述的染料具有通式I的结构：
Figure BDA0003641514820000011
通式I中，
R1选自氢、1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、芳基、芳基羧酸基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐的一种；更优选自氢、具有1-8个碳的烷基、具有1-8个碳的烷基磺酸根、芳基中的一种；
R2选自氢、卤素、甲氧基、氨基、硝基、羟基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸基、具有1-18个碳的酯基、具有1-18个碳的酰胺基的一种；更优选自氢、卤素、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基的一种；
R3和R4各自独立的选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸基、具有1-18个碳的烷基磺酸盐、具有1-18个碳的羟基烷基的一种；更优选自氢、具有1-8个碳的烷基、具有1-8个碳的烷基磺酸基、具有1-8个碳的羟基烷基的一种；
R5和R6各自独立的选自氢、卤素、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的羟基烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸基、具有1-18个碳的酯基、具有1-18个碳的酰胺基的一种；最优选自氢、具有1-8个碳的羧烷基、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基的一种；
X选自氧、硫、硒、硅中的一种；进一步优选自氧或硫。
Y选自卤素离子、ClO4 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-中的一种；更优选自卤素离子、ClO4 -、CH3COO-的一种。
本申请的第二方面在于保护一类新型半花菁近红外荧光染料的合成方法，包括以下步骤：
(5)在60-120℃下，将R2取代的Y-1和3-甲基-2-丁酮加入到有机溶剂I中，其中Y-1和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1:1-5，搅拌3-12h后，蒸发溶剂，将残留物加入到酸溶液中，在80-150℃之间搅拌0.5-4h，用碱溶液调节pH至碱性，萃取、浓缩、纯化，得到含有R2取代的中间产物Y-2；
(6)在有机溶剂II中，在40-100℃下，将Y-2与R1取代的N烷基化试剂反应3-24h，经过重结晶得到R1、R2取代的中间体Y-3，其中，化合物Y-1和N烷基化试剂的摩尔比为1:1-10；更优选为1:3-8；
(7)在有机溶剂III中，在60-120℃下，将R1和R2取代的Y-3与S-1搅拌反应0.5-5h，经过重结晶得到中间体S-2；
(8)在60-120℃下，将S-2与R3、R4、R5、R6、X取代的S-3溶解在有机溶剂Ⅳ中，在碱的催化下发生缩合反应，经过重结晶和硅胶柱纯化，得到新型半花菁近红外荧光染料Ⅰ。
Figure BDA0003641514820000021
进一步地，在上述步骤(1)中，所述的有机溶剂I选自甲苯、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃中的任意一种或几种组合的混合溶剂；所述的酸选自乙酸、盐酸、硫酸、聚磷酸中的任意一种或几种组合的混合溶剂；碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠中的至少一种；
进一步地，在上述步骤(2)中，有机溶剂II选自丙酮、乙腈、甲醇、甲苯、邻二氯苯、DMF的任意一种或几种组合的混合溶剂；
进一步地，在上述步骤(3)中，有机溶剂III选自乙醇、乙酸、乙酸酐、异丙醇、原甲酸三乙酯的一种或几种的混合溶剂；
进一步地，在上述步骤(4)中，有机溶剂Ⅳ选自DMF、乙醇、异丙醇、乙酸酐中的任意一种或几种组合的混合溶剂；
进一步地，在上述步骤(6)中，所述的N烷基化试剂选自卤素取代的烷基、芳基、苄基、磺酸内酯中的任意一种；
进一步地，在上述步骤(2)、(3)、(4)中，重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂。
本申请的第三方面在于保护所述的具有通式I结构的新型半花菁近红外荧光染料的活化产物，该活化产物是具有通式I结构的新型半花菁近红外荧光染料的羧基经活泼酰亚胺基活化而得。
本申请的第四方面在于保护所述的新型半花菁近红外荧光染料的应用，所述的半花菁染料用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记、DNA测序以及制备用于肿瘤的特异性识别和光动力治疗的试剂方面的应用。
进一步地，本发明所述的染料在应用时荧光成像发射波长为650-1000nm。
与现有技术相比，本申请的有益效果：
1.本发明所述的新型半花菁近红外荧光染料，通过改变季铵氮的位置和供电子基的类型从而增大分子电荷分离程度和电子流动性，使其具有更长的吸收和发射波长。
本发明所述的新型半花菁近红外荧光染料相较于传统半花菁染料的最大吸收波长和发射波长均有一定红移，由本申请实施例可知，新型半花菁染料化合物2和5相较于对比分子传统半花菁染料化合物7而言，吸收光谱分别红移了32nm和56nm，发射光谱红移了30nm和55nm。
2.本发明所述的新型半花菁近红外荧光染料，具有更高的摩尔消光系数和荧光量子产率。
本发明所述的新型半花菁近红外荧光染料相较于传统半花菁染料的摩尔消光系数和荧光量子产率均有一定提升，由本申请实施例可知，新型半花菁染料化合物2和5在甲醇中的摩尔消光系数均高于对比分子传统半花菁染料化合物7，并且化合物2和5的荧光量子产率分别为0.29和0.24，也高于对比分子化合物7的0.20。
3.本发明所述的新型半花菁近红外荧光染料，可以在活化后成功标记L-赖氨酸，并且通过细胞毒性试验验证，其具有良好的生物相容性，可以很好的应用于生物体内和体外的细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记、DNA测序以及肿瘤的特异性识别和光动力治疗方面。
附图说明
图1是化合物2、5和7以及活化的化合物2在甲醇中的归一化吸收光谱；
图2是化合物2、5和7以及活化的化合物2在甲醇中的归一化荧光发射光谱；
图3是化合物2活化产物及其与L-赖氨酸反应后的液相色谱图；
图4是化合物2和化合物5的MTT实验图；
具体实施方式
以下，进一步对本发明进行详细说明。
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本发明中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。
本文中使用Y-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括无机负离子和有机负离子，可举例但不限于卤素离子、ClO4 -、PF6 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-。
本文中所述的染料的盐形式可直接用于生物样品的染色。或者，在一个实施方案中，本发明化合物可作为式I或式Ⅱ化合物的衍生物的形式使用。
实施例中所采用的仪器和设备：
本发明柱层析过程中，采用购于青岛美高集团有限公司的200-300目、100-200目柱色谱硅胶和购于天大化学试剂厂的20-40目分析纯石英砂。反相纯化色谱仪为博纳艾杰尔科技公司产的CHEETAH快速纯化制备色谱。
染料吸收和发射光谱用Agilent公司的Cary 60紫外可见分光光度计和CaryEclipse荧光分光光度计测得。染料的绝对荧光量子产率使用滨松光子学商贸(中国)有限公司的C11347绝对荧光量子产率仪测得。
细胞毒性试验用美国Thermofisher公司的Varioskan LUX MultimodeMicroplate Reader仪器测得。
实施例1制造化合物1
化合物1的结构式：
Figure BDA0003641514820000041
实施例1.1
Figure BDA0003641514820000042
在室温下，向溶解在60mL甲苯中的2-肼基吡啶(2.182g,20mmol)中添加3-甲基-2-丁酮(3.445g,40mmol)。在氮气保护下搅拌加热回流，反应12h后停止反应。冷却至室温。除去大部分甲苯，在残留物中加入12mL多聚磷酸，在140℃下加热搅拌反应1h，将该混合物倒入150mL冰水中，滴加氨水，调节pH为弱碱性，用乙酸乙酯萃取并用无水Na2SO4干燥，蒸发溶剂后用硅胶柱提纯，得一种氮黄色固体化合物1.1(1.280g,8mmol,Y＝40％)。
实施例1.2
Figure BDA0003641514820000051
向将化合物1.1(0.500g,3.12mmol，1.0eq)加入到15mL的乙腈中，加入溴化苄(1.07g,6.24mmol,2.0eq)，在70℃下反应12h，停止反应，冷却至室温，加入到100mL乙酸乙酯中，收集沉淀，得到化合物1.2(0.710g,2.14mmol,Y＝68.7％)。
实施例1.3
Figure BDA0003641514820000052
将化合物1.2(0.331g,1.00mmol，1.0eq)加入到10mL乙醇中，加入N,N'-二苯甲脒(0.196g,1.00mmol，1.0eq)，加入10mL原甲酸三乙酯，在80℃下反应2h，带冷却至室温后将反应液缓慢滴加到100mL冰乙醚中，过滤析出的固体，干燥得到棕红色中间体化合物1.3(0.230g,0.053mmol，Y＝53.0％)。
实施例1.4
Figure BDA0003641514820000053
将环己酮(9.65mmol,1.00mL)缓慢滴加至至14.0mL浓硫酸中，将反应混合物冷却至0℃。加入2-(4-二乙基氨基-2-羟基苯甲酰)苯甲酸(2g,7.01mmol)，用力搅拌。之后将反应混合物加热至90℃搅拌2小时。冷却反应混合物，将反应混合物倒入100.0g冰上，向混合物中加入高氯酸(70％，1.4mL)，过滤掉产生的沉淀物，用冷水(50.0mL)洗涤沉淀物，得到红色固体化合物1.4(1.63g,4.33mmol，Y＝61.8％)。
制造化合物1
在100℃下，将化合物1.3(0.150g,0.345mmol,1eq)和化合物1.4(0.156g,0.414mmol,1.2eq)溶解在10mL乙酸酐中，加入0.2mL三乙胺催化反应，搅拌2h后停止反应，待反应液降至室温后将其逐滴滴加到150mL乙酸乙酯中重结晶，得到的粗产品经HPLC纯化，得到化合物1(0.09g,0.126mmol,Y＝36.4％)。
制造活化的化合物1
Figure BDA0003641514820000061
在室温下，向3mL的化合物1(0.044g,0.062mmol,leq)的DMF溶液中中加入N,N,N’,N’,-四甲基-0-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.025g,0.074mmol,1.2eq)，随后加入三乙胺(0.2mL)，反应2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯中，用9000转/min离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物1(0.039g,0.048mmol,Y＝77.3％)。
实施例2制造化合物2
化合物2的结构式:
Figure BDA0003641514820000062
实施例2.1
Figure BDA0003641514820000063
将化合物1.1(0.640g,4mmol，1.0eq)加入到15mL的邻二氯苯中，加入1,3-丙磺酸内酯(0.977g,8mmol,2.0eq)，在65℃下反应12h，停止反应，冷却至室温，加入100mL乙酸乙酯，收集沉淀，得到化合物2.1(0.960g,3.4mmol,Y＝85％)。
实施例2.2
Figure BDA0003641514820000071
将化合物2.1(0.300g,1.06mmol，1.0eq)加入到10mL乙醇中，加入N,N'-二苯甲脒(0.208g,1.06mmol，1.0eq)，加入10mL原甲酸三乙酯，在80℃下反应2h，带冷却至室温后将反应液缓慢滴加到100mL冰乙醚中，过滤析出的固体，干燥得到棕红色中间体化合物2.2(0.270g,0.700mmol，Y＝65.9％)。
制造化合物2
在100℃下，将化合物2.2(0.150g,0.389mmol,1eq)和化合物1.4(0.176g,0.467mmol,1.2eq)溶解在10mL乙酸酐中，加入0.2mL三乙胺催化反应，搅拌2h后停止反应，待反应液降至室温后将其逐滴滴加到150mL乙酸乙酯中重结晶，得到的粗产品经HPLC纯化，得到化合物2(0.145g,0.217mmol,Y＝55.8％)。
制造活化的化合物2
Figure BDA0003641514820000072
在室温下，向3mL的化合物1(0.050g,0.049mmol,leq)的DMF溶液中中加入N,N,N’,N’,-四甲基-0-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.025g,0.074mmol,1.2eq)，随后加入三乙胺(0.2mL)，反应2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯中，用9000转/min离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物2(0.041g,0.053mmol,Y＝71.6％)。
实施例3化合物3
化合物3的结构式:
Figure BDA0003641514820000073
实施例3.1
Figure BDA0003641514820000081
将环己酮(9.65mmol,1.00mL)缓慢滴加至至14.0mL浓硫酸中，将反应混合物冷却至0℃。加入2-(4-二甲基氨基-2-羟基苯甲酰)苯甲酸(2g,7.01mmol)，用力搅拌。之后将反应混合物加热至90℃搅拌2小时。冷却反应混合物，将反应混合物倒入100.0g冰上，向混合物中加入高氯酸(70％，1.4mL)，过滤掉产生的沉淀物，用冷水(50.0mL)洗涤沉淀物，得到红色固体化合物3.1(1.74g,4.99mmol，Y＝71.2％)。
制造化合物3
在100℃下，将化合物2.2(0.150g,0.389mmol,1eq)和化合物3.1(0.162g,0.447mmol,1.2eq)溶解在10mL乙酸酐中，加入0.2mL三乙胺催化反应，搅拌2h后停止反应，待反应液降至室温后将其逐滴滴加到150mL乙酸乙酯中重结晶，得到的粗产品经HPLC纯化，得到化合物3(0.121g,0.189mmol,Y＝48.6％)。
制造活化的化合物3
Figure BDA0003641514820000082
在室温下，向3mL的化合物3(0.050g,0.078mmol,leq)的DMF溶液中中加入N,N,N’,N’,-四甲基-0-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.025g,0.074mmol,1.2eq)，随后加入三乙胺(0.2mL)，反应2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯中，用9000转/min离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物3(0.045g,0.061mmol,Y＝78.1％)。
实施例4化合物4
化合物4的结构式：
Figure BDA0003641514820000091
实施例4.1
Figure BDA0003641514820000092
将环己酮(9.65mmol,1.00mL)缓慢滴加至至14.0mL浓硫酸中，将反应混合物冷却至0℃。加入2-二乙基氨基苯酚(1g,6.05mmol,1eq)和3-羧基苯甲醛(0.908g,6.05mmol,1eq)用力搅拌。之后将反应混合物加热至90℃搅拌2小时。冷却反应混合物，反应混合物倒入100.0g冰上，向混合物中加入高氯酸(70％，1.4mL)，过滤掉产生的沉淀物，用冷水(50.0mL)洗涤沉淀物，得到红色固体化合物4.1(1.07g,2.84mmol，Y＝46.9％)。
制造化合物4
在100℃下，将化合物2.2(0.150g,0.389mmol,1eq)和化合物4.1(0.162g,0.447mmol,1.2eq)溶解在10mL乙酸酐中，加入0.2mL三乙胺催化反应，搅拌2h后停止反应，待反应液降至室温后将其逐滴滴加到150mL乙酸乙酯中重结晶，得到的粗产品经HPLC纯化，得到化合物4(0.118g,0.176mmol,Y＝45.4％)。
制造活化的化合物4
Figure BDA0003641514820000093
在室温下，向3mL的化合物4(0.050g,0.075mmol,leq)的DMF溶液中中加入N,N,N’,N’,-四甲基-0-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.025g,0.074mmol,1.2eq)，随后加入三乙胺(0.2mL)，反应2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯中，用9000转/min离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物4(0.048g,0.063mmol,Y＝73.8％)。
实施例5化合物5
化合物5的结构式：
Figure BDA0003641514820000101
实施例5.1
Figure BDA0003641514820000102
在室温下，向溶解在20mL甲苯中的2-肼基-4-溴吡啶(1.00g,5.32mmol,1.0eq)中添加3-甲基-2-丁酮(0.92g,10.64mmol,2.0eq)。在氮气保护下搅拌加热回流，反应12h后停止反应。冷却至室温。除去大部分甲苯，在残留物中加入12mL多聚磷酸，在140℃下加热搅拌反应45min，将该混合物倒入200mL冰水中，滴加氨水，调节pH为弱碱性，用乙酸乙酯萃取并用Na2SO4干燥，蒸发溶剂后用硅胶柱提纯，得一种氮黄色固体化合物5.1(0.760g,3.18mmol,Y＝59.8％)。
实施例5.2
Figure BDA0003641514820000103
将化合物5.1(0.500g,2.09mmol，1.0eq)加入到15mL的邻二氯苯中，加入1,3-丙磺酸内酯(0.510g,4.18mmol,2.0eq)，在65℃下反应12h，停止反应，冷却至室温，加入100mL乙酸乙酯，收集沉淀，得到化合物5.2(0.479g,1.33mmol,Y＝63.4％)。
实施例5.3
Figure BDA0003641514820000104
将化合物5.1(0.300g,0.83mmol，1.0eq)加入到10mL乙醇中，加入N,N'-二苯甲脒(0.162g,0.83mmol，1.0eq)，加入10mL原甲酸三乙酯，在80℃下反应2h，带冷却至室温后将反应液缓慢滴加到100mL冰乙醚中，过滤析出的固体，干燥得到棕红色中间体化合物5.3(0.266g,0.572mmol，Y＝68.9％)。
制造化合物5
在100℃下，将化合物5.3(0.150g,0.323mmol,1eq)和化合物1.4(0.145g,0.387mmol,1.2eq)溶解在10mL乙酸酐中，加入0.2mL三乙胺催化反应，搅拌2h后停止反应，待反应液降至室温后将其逐滴滴加到150mL乙酸乙酯中重结晶，得到的粗产品经HPLC纯化，得到化合物5(0.132g,0.176mmol,Y＝54.7％)。
制造活化的化合物5
Figure BDA0003641514820000111
在室温下，向3mL的化合物5(0.050g,0.067mmol,leq)的DMF溶液中中加入N,N,N’,N’,-四甲基-0-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.025g,0.074mmol,1.2eq)，随后加入三乙胺(0.2mL)，反应2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯中，用9000转/min离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物5(0.041g,0.048mmol,Y＝72.6％)。
实施例6化合物6
化合物6的结构式：
Figure BDA0003641514820000112
实施例6.1
Figure BDA0003641514820000113
将环己酮(9.65mmol,1.00mL)缓慢滴加至至14.0mL浓硫酸中，将反应混合物冷却至0℃。加入8-羟基久洛里定(1g,5.28mmol,1eq)和2-羧基苯甲醛(0.7938g,5.28mmol,1eq)用力搅拌。之后将反应混合物加热至90℃搅拌2小时。冷却反应混合物，将反应混合物倒入100.0g冰上，向混合物中加入高氯酸(70％，1.4mL)，过滤掉产生的沉淀物，用冷水(50.0mL)洗涤沉淀物，得到红色固体化合物6.1(1.13g,2.82mmol，Y＝53.4％)。
制造化合物6
在100℃下，将化合物2.2(0.150g,0.389mmol,1eq)和化合物6.1(0.187g,0.467mmol,1.2eq)溶解在10mL乙酸酐中，加入0.2mL三乙胺催化反应，搅拌2h后停止反应，待反应液降至室温后将其逐滴滴加到150mL乙酸乙酯中重结晶，得到的粗产品经HPLC纯化，得到化合物6(0.124g,0.179mmol,Y＝46.1％)。
制造活化的化合物6
Figure BDA0003641514820000121
在室温下，向3mL的化合物6(0.050g,0.073mmol,leq)的DMF溶液中中加入N,N,N’,N’,-四甲基-0-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.025g,0.074mmol,1.2eq)，随后加入三乙胺(0.2mL)，反应2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯中，用9000转/min离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物6(0.039,0.049mmol,Y＝68.4％)。
实施例7制造化合物7
化合物7的结构式如下：用于作为对比例
Figure BDA0003641514820000122
实施例7.1
Figure BDA0003641514820000123
将2,3,3-三甲基吲哚(0.700g,4.4mmol，1.0eq)加入到15mL的邻二氯苯中，加入1,3-丙磺酸内酯(1.070g,8.79mmol,2.0eq)，在65℃下反应12h，停止反应，冷却至室温，加入100mL乙酸乙酯，收集沉淀，得到化合物7.1(0.850g,3.02mmol,Y＝68.7％)。
实施例7.2
Figure BDA0003641514820000131
将化合物7.1(0.500g,1.78mmol，1.0eq)加入到10mL乙醇中，加入N,N'-二苯甲脒(0.348g,1.78mmol，1.0eq)，加入10mL原甲酸三乙酯，在80℃下反应2h，带冷却至室温后将反应液缓慢滴加到100mL冰乙醚中，过滤析出的固体，干燥得到棕红色中间体化合物7.2(0.410g,1.070mmol，Y＝60.0％)。
制造化合物7
在100℃下，将化合物7.2(0.150g,0.391mmol,1eq)和化合物1.4(0.176g,0.469mmol,1.2eq)溶解在10mL乙酸酐中，加入0.2mL三乙胺催化反应，搅拌2h后停止反应，待反应液降至室温后将其逐滴滴加到150mL乙酸乙酯中重结晶，得到的粗产品经HPLC纯化，得到化合物7(0.154g,0.230mmol,Y＝59.0％)。
制造活化的化合物7
Figure BDA0003641514820000132
在室温下，向3mL的化合物7(0.050g,0.075mmol,leq)的DMF溶液中中加入N,N,N’,N’,-四甲基-0-(N-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐(0.025g,0.074mmol,1.2eq)，随后加入三乙胺(0.2mL)，反应2h，停止反应，将反应液倒入乙酸乙酯中，用9000转/min离心，收集沉淀，经HPLC纯化得活化的化合物7(0.048,0.063mmol,Y＝83.9％)。
实施例8对化合物2、5和7以及活化的化合物2的紫外可见吸收光谱和荧光光谱测定
用万分之一天平精确称量经过真空干燥后的染料，配制5mmol/L的DMSO染料母液于棕色样品瓶中，在4℃冰箱中保存备用。
测试紫外可见吸收光谱和荧光光谱时，用微量移液枪量取1.2μL的染料母液，并将其溶于含有3mL待测溶剂的石英比色皿中，混合均匀，得到染料的浓度为2.0μmol/L，用于吸收光谱和荧光发射光谱的测试。所有测试均在25℃下完成。
如图1所示，通过在甲醇里对吸收光谱的测试结果可知，化合物2和5相较于对比分子化合物7而言，吸收光谱分别红移了32nm和56nm，其最大吸收波长从700nm红移至化合物2的732nm和化合物5的756nm之间，并且活化后的化合物2的吸收波长与化合物2相比没有发生变化。
如图2所示，化合物2和化合物5在甲醇中的最大发射波长为752nm和777nm，相比较于化合物7的最大发射波长722nm分别红移了30nm和55nm，说明新型半花菁近红外荧光染料相较于之前已经报道的化合物7的最大吸收波长和最大发射波长均出现了大幅度红移，使该类染料更适合应用于长波长吸收和发射的场景，并且活化后的化合物2的最大发射波长与化合物2相比没有发生变化，证明这类染料可以应用于近红外生物荧光成像和DNA测序，蛋白质标记以及核酸检测等领域中。
实施例9对化合物1、2和活化的化合物1进行光物理性质测试
用由实施例4中的母液，配制2.0μmol/L的化合物2、5、7和活化的化合物2的甲醇溶液，经摩尔消光系数计算公式计算染料的摩尔消光系数，经绝对荧光量子产率仪(Hamamatsu，C11347)测得对应的绝对荧光量子产率，数据结果见表1。
Figure BDA0003641514820000141
由表1数据分析，证明化合物2、5和活化后的化合物2在甲醇溶液中的摩尔消光系数均高于对比例化合物7；绝对荧光量子产率均在24％以上，高于对比例化合物7的20％。证明新型半花菁近红外荧光染料相较于传统半花菁染料具有更高的摩尔消光系数和荧光量子产率。
实施例10活化的化合物2对赖氨酸的荧光标记
用PBS(pH＝7.4)配制l0 mmol/L的L-赖氨酸母液于5mL棕色样品瓶中，取50μL浓度为l0 mmol/L的L-赖氨酸母液于0.5mL离心管，再加入100mL浓度为5mmol/L的活化的化合物2的母液，在台式恒温摇床反应6h后，用甲醇和超纯水作为流动相，C18填充的反向柱为分离柱，在730nm的波长下对活化的化合物2和标记L-赖氨酸的化合物2进行液相色谱表征。
如图3所示，活化的化合物2的保留时间为14.6min，而与L-赖氨酸共同孵育之后，在相同的条件下进行液相色谱表征时可以发现，14.6min的峰几乎没有了，而出现了保留时间为17.6min的新的吸收峰，新的峰的峰面积占到了84％，这说明活化后的化合物2可以很好的与L-赖氨酸发生作用，成功的将L-赖氨酸连接到化合物2染料上，说明这类新型半花菁近红外荧光染料具备和生物大分子结合的能力，可以很好的应用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记及DNA测序等方面。
实施例11化合物2的细胞毒性实验
染料分子对细胞的毒性通过MTT测定评估。其原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在96孔板中接种4T1细胞，经过一段时间培养后分别向不同孔中加入一定浓度的化合物2或化合物5，使化合物浓度分别为0-12μmol/L，继续孵育细胞48h后通过MTT实验检测细胞活性。实验数据如图4所示，使用不同浓度的化合物2和化合物5培养4T1细胞48h后，细胞仍然显示出良好的存活率，即使浓度增加到12μmol/L，细胞的存活率仍然很高，说明这类新型半花菁近红外荧光染料具有非常好的生物相容性，在工作浓度范围内不会对细胞产生毒副作用，因此可以应用于生物和医药领域中。
以上内容是结合本发明具体的优选实施例对本发明做的进一步阐述，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的技术范围内，做出些许变动或者修饰，均将被视为涵盖在本发明的权利要求之内。

Claims (7)

1.一类新型半花菁近红外荧光染料，其特征在于：所述的染料具有如通式I的结构：
Figure QLYQS_1
通式I中，
R1选自氢、1-8个碳的烷基、芳基、具有1-8个碳的烷基磺酸根中的一种；
R2选自氢、卤素、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基中的一种；
R3和R4各自独立的选自氢、具有1-8个碳的烷基、具有1-8个碳的烷基磺酸基、具有1-8个碳的羟基烷基中的一种；
R5选自具有1-8个碳的羧烷基；
R6选自氢、具有1-8个碳的羧烷基、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基的一种；
X选自氧、硫、硒中的一种；Y选自卤素离子、ClO4 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-中的一种。
2.根据权利要求1所述的一类新型半花菁近红外荧光染料，其特征在于：所述X选自氧或硫。
3.如权利要求1所述的一类新型半花菁近红外荧光染料的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在60-120℃下，将R2取代的Y-1和3-甲基-2-丁酮加入到有机溶剂I中，其中Y-1和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1:1-5，搅拌3-12h后，蒸发溶剂，将残留物加入到酸溶液中，在80-150℃之间搅拌0.5-4h，用碱溶液调节pH至碱性，萃取、浓缩、纯化，得到含有R2取代的中间产物Y-2；
(2)在有机溶剂II中，在40-100℃下，将Y-2与R1取代的N烷基化试剂反应3-24h，经过重结晶得到R1、R2取代的中间体Y-3，其中，化合物Y-1和N烷基化试剂的摩尔比为1:1-10；
(3)在有机溶剂III中，在60-120℃下，将R1和R2取代的Y-3与S-1搅拌反应0.5-5h，经过重结晶得到中间体S-2；
(4)在60-120℃下，将S-2与R3、R4、R5、R6、X取代的S-3溶解在有机溶剂Ⅳ中，在碱的催化下发生缩合反应，经过重结晶和硅胶柱纯化，得到新型半花菁近红外荧光染料Ⅰ；
Figure QLYQS_2
其中：
R1选自氢、1-8个碳的烷基、芳基、具有1-8个碳的烷基磺酸根中的一种；
R2选自氢、卤素、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基中的一种；
R3和R4各自独立的选自氢、具有1-8个碳的烷基、具有1-8个碳的烷基磺酸基、具有1-8个碳的羟基烷基中的一种；
R5选自具有1-8个碳的羧烷基；
R6选自氢、具有1-8个碳的羧烷基、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基的一种；
X选自氧、硫、硒中的一种；Y选自卤素离子、ClO4 -、BF4 -、CH3COO-、CF3COO-或OTs-中的一种。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述的有机溶剂I选自甲苯、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃中的任意一种或几种组合的混合溶剂；所述的酸选自乙酸、盐酸、硫酸、聚磷酸中的任意一种或几种组合的混合溶剂；所述的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠中的至少一种；所述的有机溶剂II选自丙酮、乙腈、甲醇、甲苯、邻二氯苯、DMF的任意一种或几种组合的混合溶剂；所述的有机溶剂III选自乙醇、乙酸、乙酸酐、异丙醇、原甲酸三乙酯的一种或几种的混合溶剂；所述的有机溶剂Ⅳ选自DMF、乙醇、异丙醇、乙酸酐中的任意一种或几种组合的混合溶剂。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)中，重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种的混合溶剂。
6.如权利要求1所述的新型半花菁近红外荧光染料的活化产物，该活化产物是具有通式I结构的新型半花菁近红外荧光染料的羧基经活泼酰亚胺基活化而得。
7.如权利要求1所述的新型半花菁近红外荧光染料的应用，其特征在于：所述的半花菁近红外荧光染料用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记、DNA测序以及制备用于肿瘤的特异性识别和光动力治疗的试剂方面的应用；所述的半花菁近红外荧光染料在应用时的荧光成像发射波长为650-1000nm。
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