CN110201189A - 白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物 - Google Patents
白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及白蛋白结合型近红外荧光染料‑马来酰亚胺共轭物。所述的白蛋白结合型近红外荧光染料‑马来酰亚胺共轭物具体是用含有马来酰亚胺的基团取代花菁类染料共轭链中的氯，通过分子内电荷转移效应对其光学性质进行改造，使其能够被作为蓝色生物染料使用。其次，共轭物中的马来酰亚胺基团可与血浆白蛋白上34位半胱氨酸的游离巯基通过迈克尔加成反应共价结合，从而具有了优良的淋巴结靶向性。这种近红外荧光生物成像剂克服了临床前哨淋巴结导航手术中所用的成像方法的缺陷，安全可靠、定位准确、成像效率高，将两种成像模式——蓝染肉眼识别和近红外荧光成像融为一体，使其在体内可以实现淋巴结的定位双成像功能。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，包括以内源性血浆白蛋白为载体，设计并合成可在体内共价结合白蛋白并靶向淋巴结的近红外荧光染料马来酰亚胺共轭物，及其在前哨淋巴结肿瘤转移诊断方面的应用。
背景技术
癌症严重威胁着全人类的健康，大约90％癌症相关的死亡都是由于癌症转移引起的，其中淋巴转移是肿瘤转移的一个主要途径，因此，转移淋巴结的发现与诊断对于患者来说至关重要。前哨淋巴结是肿瘤转移发生的第一道关卡，前哨淋巴结导航手术(SNNS)是临床常用的早期乳腺癌淋巴结转移分期方法。传统的淋巴结导航方法是蓝染法和核素示踪法，但是均有一定程度的缺陷而限制临床普及。近红外荧光成像是一种新兴的光学成像方法，其组织干扰低、安全性高、非侵入式和仪器便携等优点，使得其在生物成像领域占有相当的优势。
目前最常用的近红外荧光染料是以吲哚菁绿(ICG)为代表的花菁类染料。目前有许多课题组将花菁类近红外染料作为成像剂进行生物成像。其成像效果显著，分辨率高，成像定位准确。其载药方式主要有两类，一是将染料包埋于聚合物纳米颗粒中，二是将染料与白蛋白进行孵育形成非共价复合物。美中不足的是，这些递送手段均有成像模式单一和包载稳定性差的缺点。
白蛋白是血浆中含量最多的蛋白质，拥有体内半衰期长(19天)、低免疫原性和肿瘤靶向性等特点。目前，白蛋白在药学研究领域作为药物载体的应用非常广泛。经文献证明，白蛋白及与白蛋白复合物具有优良的淋巴结靶向性，因此，将成像剂与白蛋白相连可以大大提高其成像效率。
发明内容
本发明所解决的技术问题是为了克服现有的前哨淋巴结导航手术中所用的成像方法的缺陷，提供了一种安全性好、淋巴结靶向性强、成像分辨率高的成像材料。
本发明的目的是设计和合成一种安全可靠、成像定位准确的近红外荧光生物成像剂，旨在将两种成像模式——蓝染肉眼识别和近红外荧光成像融为一体，使其在体内可以实现淋巴结的定位双成像功能。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物，所述的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物为近红外荧光染料和马来酰亚胺的盐通过连接臂相连得到；
所述的近红外荧光染料为含有氯苯环的吲哚菁绿衍生物，选自含有氯苯环的吲哚菁绿衍生物如新吲哚菁绿(IR820)、IR780和IR808中的一种或几种；
所述的连接臂为同时含有氨基和羧基的C2-C10直链烷烃，优选为C2-C6直链烷烃；
所述的马来酰亚胺源自含有马来酰亚胺基团和氨基的强酸盐或含有马来酰亚胺基团和羟基的化合物，选自N-(3-羟丙基)马来酰亚胺、N-(6-氨基己基)马来酰亚胺盐酸盐、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐中的一种或几种。
进一步地，本发明优选新吲哚菁绿和N-(6-氨基己基)马来酰亚胺盐酸盐通过连接臂相连得到的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物。
更进一步地，本发明优选新吲哚菁绿和马来酰亚胺通过6-氨基己酸相连得到的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物。
本发明所述的新吲哚菁绿和马来酰亚胺通过连接臂相连得到的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物中，选择新吲哚菁绿(IR820)作为模型染料，并将其通过6-氨基己酸和N-(6-氨基己基)马来酰亚胺盐酸盐相连。其结构式为：
本发明所述的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物是用6-氨基己酸取代花菁类染料共轭链中的氯，合成含有羧基的反应中间体，然后与含有马来酰亚胺基团和氨基的强酸盐形成酰胺键，得到最终产物。
具体的合成路线及方法如下：
(a)IR820和6-氨基己酸以1:1～1:5的比例溶于无水DMF中，加入三乙胺，充入氮气保护，将反应体系加热到70～90℃，避光搅拌反应1～5小时，观察到反应物由绿色变为蓝色。减压旋蒸除去溶剂，通过柱层析(甲醇:乙酸乙酯＝1:1～1:3等度洗脱)分离得到中间产物(IR820-COOH)。该步反应中，三乙胺可以替换为N-甲基吗啉或N-乙基二异丙胺。
(b)将中间产物IR820-COOH、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于无水DMF中，室温搅拌30min～2h，向反应溶液中加入N-6-氨基马来酰亚胺盐酸盐，室温下避光搅拌反应12～36h。最后，最终产物经反复加入乙醚沉淀纯化得到。催化剂HATU可以替换为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、二环己基碳二亚胺、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基-碳二亚胺、1-羟基苯并三唑等缩合剂。
本发明中所述的花菁类近红外染料可以用其他含有氯苯环的吲哚菁绿衍生物如IR780，IR808等所替代。连接臂可以用不同链长的同时含有氨基和羧基的烷烃替代。功能基团N-6-氨基马来酰亚胺盐酸盐可以用其他两端含有马来酰亚胺和氨基或羟基的分子替代，如N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐。
本发明具有以下有益效果：经过对IR820的修饰，共轭链上的吸电子基团氯原子被供电子基团仲胺所取代，由于分子内电荷转移(ICT)效应，该染料颜色由绿色变为蓝色，因此具有了蓝色染料的特点，实际应用中具备了蓝染法的简单便捷、肉眼可见的优点。虽然连接了马来酰亚胺基团，但该分子的光学性质并未受到影响，依旧具备近红外区的荧光成像功能，因此可以作为荧光成像剂加以应用。由于修饰了马来酰亚胺，该分子因此可以在体内与白蛋白进行共价结合，结合稳定，因此具备了淋巴靶向能力，提高了淋巴成像的分辨率和成像效率。本发明为开发安全、高效、便捷的前哨淋巴结导航成像剂提供了新的策略和更多的选择，满足了临床中对肿瘤淋巴转移诊断成像剂的迫切需求。
附图说明
图1为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的1H NMR核磁谱图。
图2为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的质谱图。
图3为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的白蛋白结合凝胶结果图。
图4为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的白蛋白结合动力学结果图。
图5为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的圆二色谱结果图，用以证明蛋白结合稳定性。
图6为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的白蛋白复合物(BSA-IR-Mal)冻干前后荧光发射谱图，用以证明蛋白复合物的冻干稳定性。
图7为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)经过不同时长光照后的荧光发射谱图。
图8为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的白蛋白复合物(BSA-IR-Mal)经过不同时长光照后的荧光发射谱图。
图9为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)与等浓度IR820溶液的照片。
图10为IR820、IR-Mal、BSA和BSA-IR-Mal复合物溶液的紫外-可见光吸收光谱。
图11为不同浓度IR-Mal和BSA-IR-Mal复合物溶液的荧光发射光谱。
图12为相同浓度IR-Mal和BSA-IR-Mal复合物及BSA溶液的照片及荧光成像结果。
图13为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的4T1细胞毒性图。
图14为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的3T3细胞毒性图。
图15为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的主要器官的H&E染色图，用以证明IR-Mal对个体器官的长短期安全性。
图16为本发明实施例1的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的小鼠肝肾功能结果图，用以证明IR-Mal对肝肾功能的长短期安全性。
图17为IR-Mal对正常前哨淋巴结和肿瘤转移前哨淋巴结的蓝染结果。
图A为正常前哨淋巴结蓝染后在体及离体照片。
图B为肿瘤转移前哨淋巴结蓝染后在体及离体照片。
图18为IR-Mal给药不同时间后对肿瘤转移前哨淋巴结的荧光成像结果。
图19为IR-Mal经皮下给药后不同时间在血液和前哨淋巴结中的浓度比较。
图20为IR820经皮下给药后不同时间在血液和前哨淋巴结中的浓度比较。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的合成
IR820(100mg,0.118mmol)和6-氨基己酸(45mg,0.353mmol)以1:3的比例溶于3.3ml无水DMF中，加入三乙胺(67μl,0.473mmol)，充入氮气保护，将反应体系加热到85℃，避光搅拌反应3h，观察到反应物由绿色变为蓝色。减压旋蒸除去溶剂，通过柱层析分离得到中间产物(IR820-COOH)。取84mg中间产物IR820-COOH、40.6mg2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、35.3μl N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于20ml无水DMF中，室温搅拌30min后，向反应溶液中加入提前溶于5ml无水DMF中的N-6-氨基马来酰亚胺盐酸盐42mg，反应体系在室温下避光搅拌24h。最后，向反应溶液中反复加入乙醚沉淀过滤数次，得到纯化的产物IR-Mal。
采用高分辨质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中共轭物的结构，结果如图1所示。核磁共振选用的溶剂为d-DMSO，波谱解析结果如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.17(d,J＝8.5Hz,2H),7.96(dd,J＝8.3,5.7Hz,4H),7.78–7.70(m,3H),7.60–7.53(m,4H),7.40–7.35(m,2H),7.01–6.94(m,2H),5.85(s,2H),4.10(dt,J＝10.8,5.4Hz,6H),3.73(d,J＝5.7Hz,2H),2.98(dd,J＝12.8,6.6Hz,2H),2.54(d,J＝5.9Hz,4H),2.09(t,J＝7.4Hz,2H),2.05–1.94(m,4H),1.88(d,J＝22.2Hz,12H),1.82–1.70(m,14H),1.60–1.56(m,2H),1.38(dd,J＝14.3,7.4Hz,4H),1.34–1.27(m,4H).ESI-MS:m/z＝1098.5[M-Na]-.
实施例2：近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)与牛血清白蛋白的体外结合实验
称取适量的IR-Mal加入到牛血清白蛋白(BSA)的pH7.4磷酸盐缓冲液中，使得共轭物和牛血清白蛋白浓度分别为81μM和35μM。随后将混合溶液置于37℃恒温振荡器中孵育，6h后取样，用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)考察结合情况。为了验证IR-Mal与白蛋白结合系马来酰亚胺基团与白蛋白34位半胱氨酸的游离巯基所为，另设一组对照，向等量白蛋白溶液中加入过量的6-马来酰亚胺己酸孵育12h，将白蛋白游离巯基事先阻断掉，然后加入等量IR-Mal，与上述相同步骤进行体外结合。电泳结束后，将剥离的凝胶板用考马斯亮蓝染液染色，清洗后置于荧光成像仪下观察荧光情况(激发波长680nm，发射波长790nm)。
另将适量IR-Mal加入到牛血清白蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液中，使得共轭物和牛血清白蛋浓度分别为10μM和30μM。随后将混合溶液置于37℃恒温振荡器中孵育，在特定的时间点取样，用10％SDS-PAGE考察结合动力学，后续处理方式同上。
结果如图3所示，在考马斯亮蓝染色结果中，含有白蛋白的组在63-75kDa范围内出现了蓝色条带；在荧光成像结果中，出现蛋白条带的相同位置只有IR-Mal+BSA组出现了荧光条带，其他组均因为IR-Mal没有与BSA共价结合而没有荧光信号，IR-Mal由于分子量远远小于白蛋白而出现在凝胶板的最底端。以上结果说明前药和白蛋白的结合的确是通过其结构中的马来酰亚胺环与白蛋白34-半胱氨酸游离巯基特异性结合所致。IR-Mal与BSA的结合动力学结果如图4所示，孵育30min后IR-Mal与BSA开始有结合，18h以后，结合基本完全。该结果说明IR-Mal与白蛋白结合呈现一定的时间依赖性。
实施例3：近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的蛋白结合稳定性、蛋白复合物冻干稳定性及光稳定性研究
IR-Mal在体内与白蛋白共价结合后，白蛋白需要保持其生物活性才能发挥淋巴靶向功能，因此对共价结合后的蛋白稳定性进行了考察。首先将180mg BSA溶解于3ml 300μM的IR-Mal pH7.4磷酸盐缓冲溶液中，混匀后将混合物置于37℃恒温振荡器中孵育18h，然后将混合溶液冻干得到BSA-IR-Mal复合物冻干粉。取适量BSA和BSA-IR-Mal复合物冻干粉适量，溶于pH7.4磷酸盐缓冲液中，使得蛋白浓度为0.5mg/ml，用圆二色谱仪(CD)比较两种溶液中蛋白的二级结构。
我们通过比较BSA-IR-Mal复合物冻干前后的荧光发射波谱(激发波长680nm)来探究冻干处理是否会对IR-Mal的荧光性质产生影响。简言之，将18mg BSA和100μg IR-Mal溶于5ml pH7.4磷酸盐缓冲液中，混匀后将混合物置于37℃恒温振荡器中孵育18h，取一部分置于酶标仪下扫描荧光发射波谱(激发波长680nm)，其余部分冻干。将冻干粉末重新溶解使之与之前浓度相同，在相同条件下再次扫描荧光发射波谱。
近红外荧光染料光稳定性差，因此定量探究其光稳定性对于实际应用十分必要。取适量IR-Mal和BSA-IR-Mal复合物(等量IR-Mal)，用pH7.4磷酸盐缓冲液溶解后，在日光灯下照射不同时间取样，样品置于酶标仪下扫描荧光发射波谱(激发波长680nm)。
蛋白结合稳定性结果如图5所示，CD谱图显示BSA和BSA-IR-Mal均在205-213nm和217-225nm处出现了倒峰，且峰型基本一致，该结果证明白蛋白在与IR-Mal共价结合后，其活性并未受到影响。相似地，如图6所示，冻干前后IR-Mal的荧光光谱并未发生明显的改变。光稳定性结果如图7、8所示，对于IR-Mal溶液来说，随着光照时间的延长，其发射波谱的强度逐渐减弱，证明部分IR-Mal分子降解或变性；而对于BSA-IR-Mal复合物溶液来说，光照相同时间后，IR-Mal的荧光强度变化不大，与单纯的IR-Mal溶液相比，复合物的光照稳定性大大增强。
实施例4：近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)光学性质表征
制备相同浓度的IR820和IR-Mal溶液及等摩尔浓度的BSA和BSA-IR-Mal复合物溶液，观察、测量、比较其光学性质。在自然光下观察IR820和IR-Mal溶液的颜色。用紫外-可见光分光光度计测量IR820、IR-Mal、BSA和BSA-IR-Mal复合物溶液的吸收光谱。另外制备不同浓度的IR-Mal和BSA-IR-Mal复合物溶液(等量IR-Mal)，在680nm激发波长下，记录其发射波谱。
结果如图9所示，IR820溶液呈绿色，而IR-Mal溶液呈蓝色。吸收波谱如图10所示，IR-Mal的特征峰在650nm左右，与IR820相比，发生了一定的蓝移；BSA-IR-Mal复合物由于同时含有BSA和IR-Mal，所以在IR-Mal特征波长650nm和BSA特征波长280nm处均有吸收。图11表明IR-Mal的发射波长是785nm，在一定浓度范围内荧光强度呈现浓度依赖性。与白蛋白结合后，IR-Mal的荧光强度大大增强，该结果在成像仪下也有定性证明(图12)。
实施例5：近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的细胞毒性
采用MTT法考察IR-Mal对小鼠乳腺癌细胞(4T1)和小鼠成纤维细胞(3T3)的细胞毒性。将处于对数生长期的细胞以5×103/孔/0.2ml或3×103/孔/0.2ml密度埋于含有的1640或MEM/F12培养液的96孔板中，置培养箱中孵育24小时使其贴壁。待细胞贴壁后加IR820、ICG或实施例1中制备的近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物。每孔加入100μl含药溶液，每个浓度3个平行孔，置培养箱中孵育。培养24、48和72h后，取出96孔板，每孔加入20μL的5mg/ml MTT溶液，培养箱中孵育4h，甩板，将96孔板倒扣于滤纸中充分吸干残留液体，每孔加入200μl DMSO于振荡器中振荡10min，用酶标仪测定各孔490nm处的吸光度。
MTT结果如图13、14所示，与IR820相比，在体内能与白蛋白共价结合的IR-Mal具有相当低的细胞毒性，几乎与已被FDA批准作为临床血管成像剂的ICG相近。除此以外，4T1细胞与3T3细胞相比，其对高浓度的三种染料均有较差的耐受性，因此说明IR-Mal对正常水平的细胞生物安全性较高。
实施例6：近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的组织学与毒理学研究
为了检测IR-Mal的体内安全性，随机选取18-22g健康的Balb/c小鼠分为三组，分别在第0d和第21d尾静脉注射200μl IR-Mal溶液，生理盐水作为空白对照，第21d时处死小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾、脑等器官，冷生理盐水清洗后保存于4％的多聚甲醛中。样品经石蜡包埋，切片后，进行H&E染色进行进一步分析评价。
另取9只健康Balb/c小鼠分为三组，每组3只，给药方案同上述。处死小鼠后，收集血浆，进行肝、肾功能检查。
组织学研究H&E染色结果如图15所示，在给药21d和给药2h的小鼠组织样本中，主要器官均未发生异常，证明IR-Mal对器官无长期或短期毒性。同理，在毒理学检查结果图16中，两组给药小鼠的各项肝肾功能指标均在正常水平，与空白组并无显著性差异。以上实验结果均证明IR-Mal对生物体无毒性，在个体水平具有相当高的生物安全性，从安全性的角度来讲解决了现有淋巴成像剂的安全性问题。
实施例7：近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物(IR-Mal)的淋巴结蓝染功能研究
将1.8mM IR-Mal溶液以2mg/kg的给药剂量皮下注射于雌性健康Balb/c小鼠后足，相同浓度的IR820和常用蓝染剂亚甲蓝作为对照。给药30min后，处死小鼠，解剖露出给药侧腘淋巴结，观察IR-Mal对于正常小鼠SLN的染色能力。
通过向雌性健康Balb/c小鼠后足足垫皮下接种4T1细胞，建立肿瘤前哨淋巴结转移模型。将1.8mM IR-Mal溶液以2mg/kg的给药剂量皮下注射于荷瘤小鼠淋巴结肿瘤转移侧，在不同的时间点对同一只小鼠麻醉后进行活体荧光成像，观察IR-Mal在肿瘤转移淋巴结中的分布情况(激发波长680nm，发射波长790nm)。
为了考察IR-Mal的淋巴靶向能力，将肿瘤淋巴结转移小鼠分为两组，一组皮下注射IR-Mal，另一组皮下注射IR820作为对照。在不同时间点处死小鼠，收集血浆和SLN，将样品置于活体成像仪下进行观察，比较IR-Mal在血浆中和在SLN中的分布情况(IR-Mal的激发波长为680nm，发射波长为790nm；IR820的激发波长为780nm，发射波长为845nm)。
蓝染结果如图17所示，对于正常淋巴结和肿瘤转移淋巴结来说，IR-Mal均呈现出了突出的染色能力，效果远远强于IR820和亚甲蓝，表明其可以作为前哨淋巴结蓝染剂。荧光成像如图18所示，皮下注射IR-Mal10min后，腘淋巴结处开始有荧光信号出现，随着时间延长信号逐渐增强，2h后荧光强度达到顶峰，随后信号减弱，但由于白蛋白的长循环作用，直到72h仍可以看到荧光信号，此结果证明IR-Mal具有长效荧光成像能力。图19中，IR-Mal组中SLN中的药物荧光强度远远高于其在血液中的浓度，证明IR-Mal有明显的淋巴靶向性，而IR820由于缺乏靶向白蛋白的马来酰亚胺基团，因此没有淋巴靶向性，故其在血液中的浓度仅仅略低于甚至接近SLN中的浓度(图20)。
Claims (10)
1.白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物，其特征在于，近红外荧光染料和马来酰亚胺通过连接臂相连得到，所述的连接臂为同时含有氨基和羧基的NH3-Cn-COOH，其中，n＝2-10，优选为2-6。
2.如权利要求1所述的白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物，其特征在于，所述的马来酰亚胺为含有马来酰亚胺基团和氨基的强酸盐，所述的近红外荧光染料为含有氯苯环的吲哚菁绿衍生物。
3.如权利要求2所述的白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物，其特征在于，
所述的近红外荧光染料选自新吲哚菁绿IR820、IR780和IR808中的一种或几种；所述的马来酰亚胺选自N-(6-氨基己基)马来酰亚胺盐酸盐、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物,其特征在于，其结构式为：
5.如权利要求1所述的白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物的制备方法，其特征在于，采用如下步骤制备：
首先用6-氨基己酸取代近红外荧光染料共轭链中的氯，合成含有羧基的反应中间体，然后与含有马来酰亚胺基团和氨基的强酸盐形成酰胺键，得到最终产物。
6.如权利要求5所述的白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物的制备方法，其特征在于：
将近红外荧光染料IR820和6-氨基己酸溶于无水DMF中，加入三乙胺或N-甲基吗啉或N-乙基二异丙胺，反应体系加热到70～90℃，氮气保护，避光反应1～5小时，减压旋蒸除去溶剂，通过柱层析法分离得到中间产物；将中间产物、催化剂、DIPEA溶于无水DMF中，搅拌后，加入N-6-氨基马来酰亚胺盐酸盐，室温下避光搅拌12～36小时，所得产物经加入乙醚沉淀纯化即得。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为HATU、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、二环己基碳二亚胺、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基-碳二亚胺或1-羟基苯并三唑。
8.权利要求1-4任何一项所述的白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物在制备白蛋白结合型共轭物中的应用。
9.权利要求1-4任何一项所述的白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物在制备肿瘤转移诊断成像剂中的应用。
10.权利要求1-4任何一项所述的白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物作为成像剂在注射给药或皮下局部给药中的应用。
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