CN1742057A - 用于荧光诊断的亲水性硫醇反应性花青染料及其与生物分子的缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自花青染料类的新的荧光染料，尤其是在700－900nm的光谱范围内具有最大吸收和荧光的吲哚三羰菁，该染料具有硫醇特异性反应基，以及三个，优选四个磺酸基以增大水溶性，本发明涉及染料的制备。本发明还涉及这些染料与生物分子的缀合物及其用途。
Description
本发明涉及来自花青染料类的新的荧光染料，尤其是在700-900nm的光谱范围内具有最大吸收和荧光的吲哚三羰菁，该染料具有硫醇特异性反应基，以及三个，优选四个磺酸基(sulfonate group)以增加水溶性，本发明涉及染料的制备。本发明还涉及这些染料与生物分子的缀合物及其用途。
背景技术
光在医学诊断中的应用近来受到重视(参见，例如BiomedicalPhotonics Handbook(Editor：T.Vo-Dinh)，CRC Press)。在用于各种医学学科，例如内镜检查术、乳房X线照相术、外科学或妇科学的实验测试中发现了许多诊断方法。基于光的方法的仪器灵敏度高，并且使对最少量的生色团和/或荧光团进行分子检测和成像成为可能(Weissleder等人，(2001)Molecular Imaging，Radiology 219，316-333)。
作为外源性造影剂给予组织，用于荧光诊断和成像的染料，本文中具体是在700-900nm的光谱范围内(组织的诊断窗口)具有最大吸收和荧光的荧光染料，对于体内使用而言特别令人感兴趣。该波长的光子被组织吸收相对少，因此可以在吸收过程(主要被氧合血红蛋白和去氧血红蛋白吸收)结束光传输之前渗透进组织几厘米。此外，吸收可以通过引入组织的荧光染料发生，但该染料以更长波长的荧光辐射形式发射出所吸收的能量。可以通过光谱方法单独检测该荧光辐射，并使染料定位以及与染料结合的分子的结构联系起来成为可能(关于这一点，参见Licha，K.(2002)Contrast Agents for Optical Imaging(Review).In：Topics in Current Chemistry-Contrast Agents II(Editor：W.Krause)，Volume 222，Springer Heidelberg，pp.1-31)。
为了在患病结构和健康组织之间获得诊断学上的显著差异，给予的染料必须在所述组织间引起尽可能高的浓度差异。这可以根据肿瘤的生理学性质(供血、分配动力学、延误切除)实现。对于疾病特异性结构的分子标记，可以使用由带有靶分子亲合性生物分子，如蛋白质、肽和抗体的荧光染料组成的缀合物。注射后，这些缀合物的一定部分结合于分子靶结构，如受体或基质蛋白，而未结合的部分从机体排泄。以此方式，在实施荧光诊断中产生更高的浓度差异并由此产生更大的影像对比。
来自花青染料类的荧光染料落入有前景的代表类型中，且以许多不同的结构范围(structural width)得以合成。具体而言，具有吲哚羰菁、吲哚二羰菁和吲哚三羰菁骨架的羰花青具有高消光系数和良好的荧光量子产率[Licha，K.(2002)Contrast Agents for Optical Imaging(Review).In：Topics in Current Chemistry-Contrast Agents II(Editor：W.Krause)，Volume 222，Springer Heidelberg，pp.1-31，以及其中所引用的文献]。
因此，WO 96/17628记载了通过近红外辐射进行的体内诊断方法。在该例中，具有特定光物理和药物化学性质的水溶性染料及其生物分子加合物是用于荧光和透照诊断的造影剂。
具有吲哚羰菁、吲哚二羰菁和吲哚三羰菁骨架的花青染料的合成在现有技术中有充分记载。该方面的相关文献有，例如：BioconjugateChem.4，105-111，1993；Bioconjugate Chem.7，356-62，1996；Bioconjugate Chem.8，751-56，1997；Cytometry 10，11-19，1989和11，418-30，1990；J.Heterocycl.Chem.33，1871-6，1996；J.Org.Chem.60，2391-5，1995；Dyes and Pigments 17，19-27，1991，Dyes andPigments 21，227-34，1993；J.Fluoresc.3，153-155，1993；和Anal.Biochem.217，197-204，1994。另外的方法记载于专利出版物US4,981,977；US 5,688,966；US 5,808,044；WO 97/42976；WO 97/42978；WO 98/22146；WO 98/26077；以及EP 0800831中。
此外，合成了具有改变的取代基的吲哚三羰菁，并将其偶联于生物分子(记载于i.a.，Photochem.Photobiol.72，234，2000；BioconjugateChem.12，44，2001；Nature Biotechnol.19，237，2001；J.Biomed.Optics6，122，2001；J.Med.Chem.45，2003，2002)。其它实例具体记载于出版物WO 00/61194(“Short-Chain Peptide Dye Conjugates asContrast Agents for Optical Diagnostics”)、WO 00/71162、WO01/52746、WO 01/52743和WO 01/62156中。
然而，在现有技术中以前使用的已知吲哚三羰菁仍具有损害其有效使用的缺点。
在与生物分子偶联后，吲哚三羰菁经常具有低的荧光量子产率。对于可商购的染料Cy7，Gruber等人(Bioconjugate Chemn.11，696-704，2000)记载，在与生物分子偶联后，发生了荧光效率的损失。Becker等人(Photochem.Photobiol.72，234，2000)记载，吲哚三羰菁与HAS和转铁蛋白的缀合物荧光量子产率为2.9％或2.8％，且在生理介质中吸收光谱变形。
另外，染料缀合物趋于聚集。Becker等人(Photochem.Photobiol.72，234，2000)所述的吲哚三羰菁与HSA和转铁蛋白的缀合物以及Licha等人(Bioconjugate Chem.12，44-50，2001)所述的受体结合肽在生理介质中吸收光谱变形。这些变形表明形成聚集体并且作为结果发生荧光消光。在染料水溶性不足的情况下存在类似的问题。
即使具有反应基，通常也不能有效获得衍生物。因此，Gruber等人(Bioconjugate Chem.11，696-704，2000)记载了使用具有两个反应基的Cy7-双官能团NHS-酯，其可能产生两个生物分子的交联。然而，以分子中的两个羧基，合成衍生物受仅有一个反应基阻碍，并产生副产物(例如含有未活化的和双活化的Cy7分子的Cy7部分的单反应性NHS酯)。
因此持续需要这样的花青染料，其对荧光诊断而言有效并易于合成，并且减少或没有上述缺点。此外，这些染料应非常适于制备与生物分子的缀合物。
本发明的第一个目的通过制备通式(I)的吲哚三羰菁染料和该化合物的盐和溶剂化物来实现，
其中
X为O、S或C，其在两个位置被取代，其中取代基可以选自甲基、乙基、丙基、异丙基和/或丁基，Y为CH2-CH2或CH2-CH2-CH2，Z为C1-C5烷基，其中C原子任选被O或S取代，或者为
R1-R4彼此独立地为SO3H或H，条件是R1-R4中至少三个为SO3H，R5为-CO-NH-R8-R9、-NH-CS-NH-R8-R9或-NH-CO-R8-R9，其中R8选自无支链的C2-C13烷基，其中C原子任选被O或S替换，并且R9选自
优选的是本发明的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，其中Y为CH2-CH2，Z为C1-C5烷基，其中C原子任选被O或S取代，并且其中R6和R7为CH。
更优选的是本发明的吲哚三羰菁染料，其中Z为C1-C5烷基。
更优选的是本发明的吲哚三羰菁染料，其中Z为
并且R6和R7通过C3-烷基连接于己基环。
因此，本发明的主题是来自花青染料类的荧光染料，特别是吲哚三羰菁，其在700-900nm的光谱范围内具有最大吸收和荧光，该染料具有硫醇特异性反应基和三个，优选四个磺酸基。后者用于增大水溶性。
现在令人惊奇地发现，具有上述结构(具有磺化乙基的3-4个磺酸基的紧凑位置)的本发明的吲哚三羰菁具有＞15％的高荧光量子产率，并且与生物分子偶联后荧光量子产率几乎不变(最大损失约10％)。此外，缀合物的吸收光谱在NIR范围内大约750nm处不显示染料吸收变形。因此产生了相对于具有少于三个磺酸基的常规吲哚三羰菁或Cy7衍生物，尤其是Cy7和其它已知结构而言良好的亲水性、降低的聚集和提高的荧光量子产率。
制备本发明的用于荧光诊断的花青染料的另一个重要方面涉及具有反应性官能团使得共价偶联于靶特异性生物分子成为可能的那些衍生物。适宜的衍生物为，例如，NHS酯和异硫氰酸酯(BioconjugateChem.4，105-111，1993；Bioconjugate Chem.8，751-56，1997)，其与氨基，例如马来酰亚胺反应，α-卤代酮或α-卤代乙酰胺(Bioconjugate Chem.13，387-391，2002；Bioconjugate Chem.11，161-166，2000)，其与硫醇基反应。其它双官能团连接剂可以来自亚芳基二异硫氰酸酯、亚烷基二异硫氰酸酯、双-N-羟基-琥珀酰亚胺基酯、1，6-亚己基二异硫氰酸酯和N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯。
WO 01/77229记载了花青染料，其具有磺芳基、在次甲基链中位的烷基取代基和至少一个使得与生物分子的结合成为可能的反应基的组合。然而，实施方案涉及吲哚二羰菁(由5个C原子组成的聚次甲基链)，并且该化合物在中位没有反应基。
WO 00/16810(“Near-Infrared Fluorescent Contrast Agent andFluorescence Imaging”)记载了C7-聚次甲基链的中位具有取代基的吲哚三羰菁。然而，其没有指出如何引入或产生反应基。
本发明的另一方面涉及吲哚三羰菁染料，其中R5为COOH或NH2。
所公开的衍生物主要基于Cy3-、Cy5-、Cy5.5-以及Cy7-基本结构(可从Amersham Pharmacia Biotech商购；US 5,268,486；Cy3＝吲哚羰菁，Cy5＝吲哚二羰菁，Cy7＝吲哚三羰菁)。硫醇基反应性衍生物特别令人感兴趣，因为后者可以与生物技术半胱氨酸直接缀合，该半胱氨酸在生物分子中具有特定的位置。现有技术主要集中于Cy3和Cy5衍生物。
特别优选的本发明的吲哚三羰菁染料选自式(II)至(XX)的染料，它们列于下表1中：
表1：优选的本发明的染料
本发明的另一方面涉及本发明的吲哚三羰菁染料的制备方法。在该例中，发现了通过4-取代吡啶的简单合成方法。令人惊奇地，可以通过Zincke反应(Zincke-Knig反应，参见Rmpps Chemie Lexikon[Rmpps Chemical Dictionary]，第10版，第5067页)以高收率将各种4-取代吡啶转化为(convert in)中位取代的戊烯二醛-二酰苯胺(glutaconaldehyde-dianilide)(花青染料前体)。
除了简单且有效地合成4-取代吡啶，本发明的染料的对称结构开启了在分子的对称中位具有硫醇基选择性反应基的特定衍生化的可能性。
因此进行了对硫醇基反应性化合物的进一步衍生化。硫醇基反应性官能团为，例如，马来酰亚胺、氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基、氯乙酰胺基、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺。
本发明的再一方面涉及缀合物的制备方法，其包括将本发明的吲哚三羰菁染料偶联于生物分子。在本发明的范围内，“生物分子”定义为任何生物来源的分子，其具有生物活性，特别是酶活性或结合合成或生物来源的物质，例如药物、肽、蛋白质、受体或核酸的活性。依次，优选的生物分子为蛋白质，例如酶、肽、抗体和抗体片段(例如单链、Fab、F(ab)2、微型双功能抗体(Diabody)等)、脂蛋白、核酸如来自DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸、适体、PNA，以及糖如单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
在许多出版物现有技术中记载了花青染料与生物分子，如肽、抗体及其片段以及蛋白质的用于肿瘤的体内荧光诊断的缀合物的合成和生物特征。在该方面，主要使用上述Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7(关于这一点，参见i.a.Nature Biotechnol.15，1271，1997；Cancer Detect.Prev.22，251，1998；J.Immunol.Meth.231，239，1999；NatureBiotechnol.17，375，1999；Nature Medicine 7，743，2001)。
本发明的另一方面涉及依照本发明的方法制备的本发明的吲哚三羰菁染料与生物分子的缀合物。该缀合物的特征可以在于其包含以上定义的生物分子，其中作为生物分子，更优选选自以下的至少一种生物分子：肽、蛋白质、脂蛋白、抗体或抗体片段、核酸如DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸、适体、PNA，以及糖如单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。因此，所偶联的蛋白质的特征可以在于其选自机体的骨骼蛋白质或可溶性蛋白质。特别优选的是血清蛋白(例如HAS)、抗体/抗体片段，例如scFv片段或F(ab)，以及肽、BSA、卵清蛋白或从其得到的过氧化物酶。
因此，从现有技术已知的是，例如针对在血管发生活跃组织中强烈表达，而在邻近组织中只有很低水平表达的分子的抗体(参见WO96/01653)。特别令人感兴趣的是针对血管生长因子受体、炎症介体结合的内皮细胞受体和在新血管形成中特异性表达的基质蛋白的抗体。优选的是针对基质蛋白EDB-纤连蛋白及从其得到的本发明的缀合物的其它抗体或抗体片段。EDB-纤连蛋白，也称为癌胚纤连蛋白，为纤连蛋白的剪接变体，其在新血管形成过程中特异性地在新形成的血管周围生成。特别优选的是针对EDB-纤连蛋白的抗体L19、E8、AP38和AP39(Cancer Res 1999，59，347；J Immunol Meth 1999，231，239；Protem Expr Purif 2001，21，156)。
本发明的优选的缀合物的特征在于吲哚三羰菁染料通过SH基偶联于生物分子，尤其是通过SH基偶联于半胱氨酸。任选地，更优选从其制备的是这样的抗体及它们的片段，它们通过重组技术制备，使得在C末端或N末端(在外部的1-10个氨基酸内)，它们含有半胱氨酸，该半胱氨酸不形成任何分子内S-S-桥，因此可以用于与本发明的染料偶联。
本发明的另一方面涉及诊断试剂盒，其包含本发明的吲哚三羰菁染料和/或本发明的缀合物。另外，该试剂盒可以含有用于实施体内诊断，尤其是体内肿瘤诊断的附加辅助物。这些辅助物为，例如适宜的缓冲剂、容器、检测试剂或使用说明书。该试剂盒优选含有用于静脉给予本发明的染料的所有物质。本发明的试剂盒的特定实施方案举例如下：
第一容器含有具有自由SH基的抗体(生物分子)以及标准缓冲剂/添加剂，其为溶液或冻干物质。另一容器含有本发明的染料，其为溶液(常规添加剂)或冻干物质，摩尔比为0.1-1(与等摩尔量相比差10倍)。将含有染料的容器与缓冲剂或蒸馏水任选混合，并加入含有生物分子的容器中，温育1-10分钟，直接用作注射溶液。
在另一实施方案中，该试剂盒以两室体系(例如注射器)存在，其中在一个室中含有抗体溶液，其在含有溶液或固体物质染料的第二室内通过可破裂的壁物理分隔。该壁破裂后，进行注射溶液的混合和制备。
本发明的最后一方面涉及本发明的缀合物作为用于体内肿瘤诊断的荧光造影剂的用途。就此而言，Cy7的最大吸收位于745nm，因此特别适宜较深组织层荧光的体内检测(参见上述)。然而，具有硫醇基选择性反应基的Cy7衍生物尚未有记载。另外，用于检测肿瘤边缘区域的抗体缀合物的用途在WO 01/23005(Antibody DyeConjugates for Binding to Target Structures of Angiogenesis in Order toIntraoperatively Depict Tumor Peripheries)已有记载，但没有使用本发明的有益的染料。
现在根据以下实施例和附图对本发明进行进一步描述，然而本发明并不限于此。
图1示出缀合物K11(A)和K15(B)(参见表2)在PBS中的标准化吸收和荧光光谱，并且
图2示出实施例24的本发明的缀合物的成像性质的结果：物质：缀合物K15；肿瘤：在鼠的右后肋腹的F9畸胎癌；剂量：50nmol/kg体重(相对于染料的数据)；激发波长：740nm(二极管激光)；检测：CCD-照相机(Hamamatsu)，具有802.5±5nm通带滤波器；时间：注射前、注射后1小时、6小时和24小时。肿瘤的位置用箭头标示。
实施例
实施例1-16：合成具有马来酰亚胺基团的吲哚三羰菁染料
实施例1：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式II)
a)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸，内盐
将10g(0.04mol)2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(BioconjugateChem 1993，4，105)、6.8g(0.04mol)2-氯乙磺酰氯和4.2g(0.04mol)三乙胺在200ml乙腈中回流6小时。将沉淀抽吸并干燥。收率：5.0g(理论值的35％)。Anal Biochem 1994，217，197
b)3-吡啶-4-基-丙酸-叔丁酯
在0℃下，将在50ml THF中的20g(89mmol)叔丁基-P，P-二甲基膦酰基乙酸酯滴加入3.9g(98mmol)氢化钠(60％，在矿物油中)在250ml THF中的悬浮液中。在0℃下搅拌1小时后，滴加在50ml四氢呋喃中的10g(93mmol)吡啶-4-carbaldehyde，并将反应混合物在0℃下搅拌1小时，在室温下搅拌18小时。过滤除去沉淀的固体，蒸发浓缩溶液。加热下将残余物溶于异丙醇中，过滤除去不溶的部分，并将溶液冷却至0℃进行结晶。过滤产生的固体，与己烷一起搅拌，过滤并干燥。在150ml乙醇中用0.15g 10％钯/活性炭将中间产物(15.3g)氢化6小时。过滤除去催化剂，蒸发浓缩溶液，通过硅胶(乙醚作为流动溶剂)过滤残余物，得到13.0g浅黄色油状物(理论值的71％)。
c)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐
将10g(48mmol)3-吡啶-4-基-丙酸-叔丁酯在150ml乙醚中的溶液与8.9g(96mmol)苯胺混合，然后在0℃下与5.4g(48mmol)溴化氰在2ml乙醚中的溶液混合。在0℃下搅拌3小时后，过滤生成的红色固体，用乙醚洗涤并真空干燥。收率：20.3g(理论值的92％)。d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-羧乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将1.0g(2.2mmol)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐(实施例1c)和1.5g(4.4mmol)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(实施例1a)在20ml乙酸酐和5ml乙酸中的悬浮液与0.75g(9.1mmol)乙酸钠混合，并在120℃下搅拌1小时。冷却后，将其与乙醚混合，过滤沉淀的固体并进行色谱纯化(RP-C18-硅胶，流动相：水/甲醇)，将该产品冷冻干燥(0.5g)。通过将中间产物在4ml二氯甲烷/1ml三氟乙酸中搅拌1小时将保护基裂解。蒸发浓缩和色谱纯化(RP-C18-硅胶，流动相：水/甲醇)后，得到0.45g蓝色冻干物(理论值的23％)。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将0.4g(0.45mmol)实施例1d)的标题化合物和45mg(0.45mmol)三乙胺溶于10ml二甲基甲酰胺中，在0℃下与0.15g(0.45mmol)TBTU混合，并搅拌10分钟。然后，加入0.17g(0.68mmol)N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐(Int JPept Protein Res 1992，40，445)和68mg(0.68mmol)三乙胺在0.5ml二甲基甲酰胺中的溶液，并在室温下将其搅拌1小时。加入10ml乙醚后，将固体离心，干燥，并进行色谱纯化(RP C-18硅胶，梯度甲醇/水)。收率：0.30g蓝色冻干物(理论值的65％)。
元素分析：计算值：C 47.24 H 4.26 N 5.51 S 12.61 Na 6.78
测定值：C 47.74 H 4.47 N 5.40 S 11.99 Na 7.02
实施例2：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式III)
合成从0.4g(0.45mmol)实施例1d)的标题化合物与0.21g(0.68mmol)N-(6-氨基己基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐(Int J Pept Protein Res1992，40，445)以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.38g蓝色冻干物(理论值的81％)。
元素分析：计算值：C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
测定值：C 48.96 H 4.92 N 5.32 S 11.88 Na 6.56
实施例3：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式IV)
合成从0.4g(0.45mmol)实施例1d)的标题化合物与0.28g(0.68mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐(Int J Pept Protein Res 1992，40，445)以与实施例1e)相似的方式进行。
收率：0.27g蓝色冻干物(理论值的51％)。
元素分析：计算值：C 48.97 H 5.05 N 4.76 S 10.89 Na 5.86
测定值：C 49.22 H 5.16 N 4.62 S 10.67 Na 5.66
实施例4：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式V)
a)(3-叔丁氧羰基-丙基)-三苯基-溴化鏻
在-40℃下，将50g(0.30mol)4-溴丁酸在400ml THF中与187g(0.89mol)三氟乙酸酐逐滴混合。在-40℃下搅拌30分钟后，在1小时内滴加400ml叔丁醇/30ml THF。在室温下搅拌16小时后，将反应混合物倾入冰冷的碳酸钠溶液中，用乙醚萃取水相三次，用硫酸钠干燥有机相，蒸发浓缩。真空蒸馏残余物(沸点72℃/0.9mbar；收率：41g)。通过将41g(0.18mol)中间产物、44.6g(0.17mol)三苯基膦和32.5g(0.36mol)碳酸氢钠在250ml乙腈中加热回流20小时来进行形成鏻盐的反应。过滤反应混合物，蒸发浓缩，并通过与乙醚一起搅拌使残余物结晶。收率：58.5g白色固体(理论值的40％，相对于4-溴丁酸)。
b)5-吡啶-4-基-戊酸-叔丁酯
在-40℃下在无空气的环境中，20分钟内将14g(28mmol)(3-叔丁氧羰基丙基)-三苯基-溴化鏻(实施例4a)在100ml无水THF中的溶液与17.5ml(28mmol)丁基锂(1.6M，在己烷中)混合，并在-40℃下搅拌1小时。滴加2.78g(26mmol)4-吡啶carbaldehyde在20ml THF中的溶液，并在室温下搅拌16小时，然后倾入冰水中，用乙醚萃取水相三次，用硫酸钠干燥有机相，蒸发浓缩。色谱纯化(硅胶，流动相：己烷/乙酸乙酯)后，得到的产物为E，Z-混合物(1H-NMR鉴定为4∶1；5.0g)。为了氢化双键，将中间产物溶于200ml甲醇中，并与100mgPtO2催化剂一起在室温下氢气中搅拌。过滤并蒸发浓缩后，得到黄色油状物。收率：4.9g(理论值的74％)。
c)3-[4-(叔丁氧羰基)丁基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐
将4.0g(17mmol)5-吡啶-4-基-戊酸-叔丁酯在35ml乙醚中的溶液与3.2g(34mmol)苯胺混合，然后在0℃下与1.9g(17mmol)溴化氰在8ml乙醚中的溶液混合。在0℃下搅拌3小时后，过滤生成的红色固体，用乙醚洗涤并真空干燥。收率：7.8g(理论值的95％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-羧基丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
合成从实施例4c)的标题化合物(2.5mmol)与1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(5mmol)以与实施例1d)相似的方式进行。收率：0.85g蓝色冻干物(理论值的37％)。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
合成从0.4g(0.43mmol)实施例4d)的标题化合物以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.31g蓝色冻干物(理论值的69％)。
元素分析：计算值：C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60
测定值：C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81
实施例5：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式VI)
合成从0.4g(0.43mmol)实施例4d)的标题化合物与0.20g(0.66mmol)N-(6-氨基己基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.35g蓝色冻干物(理论值的74％)。
元素分析：计算值：C 50.17 H 5.03 N 5.09 S 11.65 Na 6.26
测定值：C 49.83 H 4.89 N 5.34 S 12.05 Na 6.42
实施例6：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式VII)
合成从0.4g(0.43mmol)实施例1d)的标题化合物与0.30g(0.72mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.27g蓝色冻干物(理论值的52％)。
元素分析：计算值：C 49.83 H 5.27 N 4.65 S 10.64 Na 5.72
测定值：C 49.45 H 5.19 N 4.66 S 10.85 Na 5.80
实施例7：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式VIII)
a)(3-叔丁氧羰基-戊基)-三苯基-溴化鏻
如实施例4a)所述进行制备，其中中间产物6-溴己酸叔丁酯以粗产物进行反应。由50g 6-溴己酸得到79g粘稠无色油状物产物(理论值的69％)。
b)7-吡啶-4-基-庚酸-叔丁酯
如实施例4b)所述进行制备。由25g(48.7mmol)(3-叔丁氧羰基-戊基)-三苯基-溴化鏻(实施例7a)得到7.5g 7-吡啶-4-基-庚酸-叔丁酯黄色油状物(理论值的65％)。
c)3-[6-(叔丁氧羰基)己基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐
将5.0g(19mmol)7-吡啶-4-基-庚酸-叔丁酯在30ml乙醚中的溶液与3.6g(38mmol)苯胺混合，然后在0℃下与2.1g(19mmol)溴化氰在5ml乙醚中的溶液混合。在0℃下搅拌2.5小时后，过滤生成的红色固体，用乙醚洗涤并真空干燥。收率：8.9g(理论值的91％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
合成从实施例7c)的标题化合物(3mmol)与1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(6mmol)以与实施例1d)相似的方式进行。收率：1.5g蓝色冻干物(理论值的54％)。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
合成从0.4g(0.43mmol)实施例7d)的标题化合物以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.31g蓝色冻干物(理论值的69％)。
元素分析：计算值：C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
测定值：C 48.98 H 4.86 N 5.12 S 11.76 Na 6.77
实施例8：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式IX)
合成从0.5g(0.53mmol)实施例7d)的标题化合物与0.23g(0.75mmol)N-(6-氨基己基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.42g蓝色冻干物(理论值的70％)。
元素分析：计算值：C 51.05 H 5.27 N 4.96 S 11.36 Na 6.11
测定值：C 50.74 H 5.55 N 4.76 S 11.38 Na 6.35
实施例9：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式X)
合成从0.5g(0.53mmol)实施例7d)的标题化合物与0.44g(1.06mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.24g蓝色冻干物(理论值的37％)。
元素分析：计算值：C 50.64 H 5.48 N 4.54 S 10.40 Na 5.59
测定值：C 50.30 H 5.56 N 4.34 S 10.15 Na 5.73
实施例10：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-3-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XI)
a)3-氧杂-6-(4-吡啶基)己酸-叔]酯
将75g(0.4mol)3-(4-吡啶基)-1-丙醇在400ml甲苯/50ml THF中的溶液与10g四丁基硫酸铵和350ml 32％氢氧化钠溶液混合。然后，滴加123g(0.68mol)溴乙酸叔丁酯并在室温下搅拌18小时。分离有机相，用乙醚萃取水相三次。用NaCl溶液洗涤合并的有机相，用硫酸钠干燥并蒸发浓缩。色谱纯化(硅胶，流动相：己烷/乙酸乙酯)后，得到56g棕色油状物产物(理论值的41％)。
b)3-[4-氧杂-5-(叔丁氧羰基)戊基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐
将5.0g(20mmol)3-氧杂-6-(4-吡啶基)己酸-叔丁酯在60ml乙醚中的溶液与3.7g(40mmol)苯胺混合，然后在0℃下与2.2g(20mmol)溴化氰在8ml乙醚中的溶液混合。在0℃下搅拌1小时后，混合50ml乙醚，过滤生成的红色固体，用乙醚洗涤并真空干燥。收率：8.5g紫色固体(理论值的85％)。
c)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基-4-氧杂己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将3.0g(6mmol)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐(实施例10b))和4.2g(12mmol)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(实施例1a))在50ml乙酸酐和10ml乙酸中的悬浮液与2.5g(30mmol)乙酸钠混合，并在120℃下搅拌50分钟。冷却后，将其与乙醚混合，过滤沉淀的固体，在丙酮中吸附性地沉淀，不在高真空下干燥。色谱纯化(RP-C18-硅胶，流动相：水/甲醇)后，真空除去甲醇，冷冻干燥，立即得到标题化合物。收率：2.3g蓝色冻干物(理论值的41％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-3-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
合成从1.0g(1.1mmol)实施例10c)的标题化合物以与实施例1c)相似的方式进行。收率：0.85g蓝色冻干物(理论值的73％)。
元素分析：计算值：C 47.54 H 4.46 N 5.28S 12.09 Na 6.50
测定值：C 47.97 H 4.65 N 5.10S 12.02 Na 6.68
实施例11：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}-3-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XII)
合成从0.5g(0.55mmol)实施例10c)的标题化合物与0.23g(0.75mmol)N-(6-氨基己基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.42g蓝色冻干物(理论值的68％)。
元素分析：计算值：C 49.46 H 4.96 N 5.01 S 11.48 Na 6.17
测定值：C 48.95 H 5.21 N 5.22 S 11.23 Na 6.60
实施例12：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}-4-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XIII)
合成从0.5g(0.55mmol)实施例10c)的标题化合物与0.46g(1.06mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.34g蓝色冻干物(理论值的56％)。
元素分析：计算值：C 49.17 H 5.20 N 4.59 S 10.50 Na 5.65
测定值：C 49.34 H 5.32 N 4.45 S 10.28 Na 5.56
实施例13：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]亚环己-1-烯-3-基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XIV)
a)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-氯-环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将5.0g(14.4mmol)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(实施例1a))和2.6g(7.2mmol)N-[(3-(苯胺亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐(Aldrich Company)与2.5g(30mmol)无水乙酸钠在100ml甲醇中一起回流1小时，冷却，与150ml乙醚混合，并搅拌过夜。将沉淀抽吸并干燥，进行色谱纯化(硅胶，梯度：二氯甲烷/甲醇)。收率：3.8g蓝色固体(理论值的58％)。
b)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将0.37g(2.2mmol)3-(4-羟基苯基)丙酸在30ml二甲基甲酰胺中的溶液与0.18g(4.5mmol)氢化钠(60％矿物油分散液)混合。在室温下搅拌30分钟后，将其冷却至0℃，滴加2.0g(2.2mmol)实施例12a)的标题化合物在100ml二甲基甲酰胺中的溶液，并在室温下搅拌2小时。用干冰使混合物骤冷，并真空除去溶剂。将残余物溶于甲醇中，与200ml乙醚一起搅拌，过滤沉淀的固体。进行色谱纯化(硅胶，梯度：乙酸乙酯/甲醇)。收率：1.9g蓝色固体(理论值的83％)
c)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
在三乙胺存在下，使0.1mg(0.10mmol)实施例12b)的标题化合物与TBTU和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐如实施例1e)中所述反应，所得产物用色谱纯化。收率：93mg蓝色冻干物(理论值的81％)。
元素分析：计算值：C 51.21 H 4.47 N 4.88 S 11.16 Na 6.00
测定值：C 51.50 H 4.55 N 4.95 S 10.93 Na 6.15
实施例14：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XV)
合成从0.7g(0.68mmol)实施例14a)的标题化合物与0.53g(1.22mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐以与实施例1e)相似的方式进行。收率：0.56g蓝色冻干物(理论值的68％)。
元素分析：计算值：C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60
测定值：C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81
实施例15：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XVI)
合成从0.7g(0.68mmol)实施例14a)的标题化合物与0.59g(1.36mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐以与实施例1e)相似的方式进行。进行两次色谱纯化。收率：0.67g蓝色冻干物(理论值的75％)。
元素分析：计算值：C 52.29 H 5.16 N 4.28 S 9.79 Na 5.27
测定值：C 51.88 H 5.40 N 4.34 S 9.53 Na 5.68
实施例16：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]-5-叔丁基-环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XVII)
a)N-[(3-(苯胺亚甲基)-2-氯-5-叔丁基-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐
在0℃下，将6.7ml(73.4mmol)三氯氧化磷滴加入8ml二甲基甲酰胺中。然后滴加5.0g(32.4mmol)4-叔丁基环己酮在30ml二氯甲烷中的溶液，将反应混合物搅拌回流3小时。冷却至0℃后，缓慢滴加在5.5ml乙醇中的6g(64.8mmol)苯胺，将混合物倾倒在200g冰上，搅拌下加入5ml浓盐酸。过滤沉淀的固体，用乙醚洗涤并干燥。收率：6.8g红色固体(理论值的50％)。
b)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-氯-5-叔丁基环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将5.0g(14.4mmol)1-(2-磺化乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(实施例1a))和3.0g(7.2mmol)N-[(3-(苯胺亚甲基)-2-氯-5-叔丁基-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐(实施例16a))与2.5g(30mmol)无水乙酸钠一起在100ml甲醇中回流1.5小时，冷却，与200ml乙醚混合，并搅拌过夜。将沉淀抽吸并干燥，进行色谱纯化(硅胶，梯度：二氯甲烷/甲醇)。收率：4.7g蓝色固体(理论值的68％)。
c)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]-5-叔丁基环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
反应从2.0g(2.1mmol)实施例16b)的标题化合物如实施例13b)中所述进行。收率：1.5g(理论值的66％)。
d)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]-5-叔丁基-环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
反应从1.0g(0.92mmol)实施例16c)的标题化合物如实施例13c)中所述进行。采用RP C-18硅胶(流动相：乙腈/水)进行两次色谱纯化。收率：0.24g(理论值的22％)。
元素分析：计算值：C 52.82 H 4.93 N 4.65 S 10.64 Na 5.72
测定值：C 52.23 H 5.20 N 4.31 S 10.30 Na 6.15
实施例17-19：合成具有溴乙酰胺基的吲哚三羰菁染料
实施例17：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(溴乙酰胺基)己基]氨基甲酰基}-4-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XIX)
a)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{(6-氨基己基)氨基甲酰基}-4-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
合成从0.5g(0.55mmol)实施例10c)的标题化合物与0.15g(0.70mmol)N-boc-己二胺(Fluka)以与实施例1e)相似的方式进行。采用色谱(RP C-18硅胶，梯度：甲醇/水)纯化反应产物，冷冻干燥后，在用冰冷却下将其在2ml三氟乙酸/8ml二氯甲烷中搅拌15分钟。在真空下离心分离(spinning-in)后，将残余物溶于甲醇中，用乙醚沉淀并分离。收率：0.26g蓝色固体(理论值的41％)。
b)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(溴乙酰胺基)己基]氨基甲酰基}-4-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将0.26g(0.23mmol)实施例18a)的标题化合物在5ml二甲基甲酰胺中冷却至-20℃，与28mg(0.28mmol)三乙胺和0.10g(0.46mmol)溴乙酰溴在0.2ml二甲基甲酰胺中的溶液混合。在最高0℃下搅拌5小时后，加入乙醚沉淀产物，通过从二甲基甲酰胺/乙醚中反复再沉淀，随后干燥得到产物。收率：0.23g蓝色固体(理论值的86％)。
元素分析：计算值：C 45.63 H 4.87 N 4.84 S 11.07 Na 5.96
测定值：C 45.13 H 4.66 N 4.67 S 10.83 Na 未测
实施例18：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(3-{[3-(溴乙酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XVIII)
合成从实施例1d)的标题化合物(0.5g，0.56mmol)和N-boc-丙烯二胺开始，以与实施例17相似的方式进行。所有阶段收率：0.22g(理论值的37％)。
元素分析：计算值：C 43.70 H 4.33 N 5.23 S 11.96 Na 6.43
测定值：C 43.21 H 4.14 N 5.53 S 10.89 Na 未测
实施例19：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺化-1-(2-磺化乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[3-(溴乙酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]环己-1-烯3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺化乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XX)
合成从实施例13b)的标题化合物(0.5g，0.49mmol)与N-boc-丙烯二胺开始，以与实施例17相似的方式进行。所有阶段的收率：0.31g(理论值的53％)。
元素分析：计算值：C 47.88 H 4.52 N 4.65 S 10.65 Na 5.73
测定值：C 48.04 H 4.43 N 4.69 S 10.72 Na 5.84
实施例20-23：合成与生物分子的缀合物和该缀合物的光物理特征
实施例20：用实施例1-16的标题化合物标记BSA(牛血清白蛋白)
一般说明：在每种情况下，将5mg(0.074μmol)BSA(SigmaCompany)在5ml磷酸盐缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4，pH 6.8)中的溶液与0.74μmol实施例1-16的标题化合物(在PBS中0.5mg/ml的储备液)混合，并在25℃下温育30分钟。通过凝胶色谱(柱：Sephadex G50，直径1.5cm，Pharmacia，洗脱剂：PBS)对缀合物进行纯化。
实施例21：用实施例17-19的标题化合物标记BSA
一般说明：在每种情况下，将5mg(0.074μmol)BSA(SigmaCompany)在5ml磷酸盐缓冲液(0.1M硼酸缓冲液，pH 8.5)中的溶液与1.10μmol实施例17-19的标题化合物(在PBS中0.5mg/ml的储备液)混合，并在25℃下温育5小时。通过凝胶色谱(柱：Sephadex G50，直径1.5cm，Pharmacia，洗脱剂：PBS)对缀合物进行纯化。
实施例22：用实施例1-16的标题化合物标记抗-ED-B-纤连蛋白scFv抗体AP39(单链片段)
AP39为具有C端半胱氨酸的scFv，并且以共价S-S-二聚体存在，其摩尔质量约为56000g/mol(Curr Opin Drug Discov Devel.2002Mar；5(2)：204-13)。通过还原二硫桥，生成具有可接近的SH基的两种单体(摩尔质量28000g/mol)。
一般说明：将0.3ml AP39在PBS中的溶液(浓度0.93mg二聚体/ml)与60μl三(羧乙基)膦(TCEP)在PBS中的溶液(2.8mg/ml)混合，并在25℃下于氮气中温育1小时。通过在NAP-5柱上进行凝胶过滤(洗脱剂：PBS)分离过量的TCEP。通过光度测定的得到的AP39-单体(OD280nm＝1.4)的量为230-250μg(体积0.5-0.6ml)。将溶液与0.03μmol实施例1-16的标题化合物(在PBS中0.5mg/ml的储备液)混合，并在25℃下温育30分钟。在NAP-5柱上通过凝胶色谱(洗脱剂：PBS/10％丙三醇)对缀合物进行纯化。通过亲和色谱(ED-B-纤连蛋白树脂)测定缀合物溶液的免疫反应性(J Immunol Meth 1999，231，239)。所获得的缀合物的免疫反应性＞80％(缀合前AP39＞95％)。
实施例23：用实施例17-19的标题化合物标记抗-ED-B-纤连蛋白scFv抗体AP39(单链片段)
一般说明：将0.3ml AP39在PBS中的溶液(浓度0.93mg二聚体/ml)与60μl三(羧乙基)膦(TCEP)在PBS中的溶液(2.8mg/ml)混合，在25℃下于氮气中温育1小时。通过在NAP-5柱上进行凝胶过滤(洗脱剂：50mmol硼酸盐缓冲液，pH 8.5)分离过量的TCEP。通过光度测定的得到的AP39-单体(OD280nm＝1.4)的量为230-250μg(体积0.5-0.6ml)。将溶液与0.06μmol实施例17-19的标题化合物(在PBS中0.5mg/ml的储备液)混合，并在25℃下温育4小时。在NAP-5柱上通过凝胶色谱(洗脱剂：PBS/10％丙三醇)对缀合物进行纯化。通过亲和色谱(ED-B-纤连蛋白树脂)测定缀合物溶液的免疫反应性(JImmunol Meth 1999，231，239)。所获得的缀合物的免疫反应性＞75％(缀合前AP39＞95％)。
实施例21和22的染料-BSA-缀合物和实施例23和24的染料-scFv抗体缀合物的光物理特征
通过光度法并基于短波吸收肩峰(约690-710nm)的消光系数75000L mol-1 cm-1测定浓度水平(degree of concentration)(染料/抗体摩尔比)；抗体吸收(AP39)用1.4的OD280nm测定；和/或蛋白质吸收(BSA)用0.58的OD277nm测定。荧光量子产率用SPEX fluorolog(通过灯和检测器校准波长依赖性灵敏度)相对于吲哚花青绿(在DMSO中Q＝0.13，JChem EngData 1977，22，379，Bioconjugate Chem 2001，12，44)测定。
表2：本发明的缀合物的性质
| 物质(生物分子/样品化合物) | 浓度水平 | 最大吸收(nm) | 最大荧光(nm) | 荧光量子产率 | |
| 实施例20 | |||||
| K1 | 实施例2的标题化合物与BSA的缀合物 | 0.5 | 766 | 790 | 0.13 |
| K2 | 实施例4的标题化合物与BSA的缀合物 | 0.6 | 767 | 792 | 0.16 |
| K3 | 实施例5的标题化合物与BSA的缀合物 | 0.7 | 765 | 790 | 0.15 |
| K4 | 实施例10的标题化合物与BSA的缀合物 | 0.5 | 766 | 789 | 未测 |
| K5 | 实施例11的标题化合物与BSA的缀合物 | 0.5 | 768 | 790 | 0.14 |
| 物质(生物分子/样品化合物) | 浓度水平 | 最大吸收(nm) | 最大荧光(nm) | 荧光量子产率 | |
| K6 | 实施例13的标题化合物与BSA的缀合物 | 0.4 | 772 | 793 | 0.11 |
| K7 | 实施例16的标题化合物与BSA的缀合物 | 0.4 | 772 | 793 | 未测 |
| 实施例21 | |||||
| K8 | 实施例17的标题化合物与BSA的缀合物 | 0.3 | 768 | 790 | 0.15 |
| 实施例22 | |||||
| K9 | 实施例1的标题化合物与AP39的缀合物 | 1.1 | 768 | 794 | 0.14 |
| K10 | 实施例2的标题化合物与AP39的缀合物 | 1.0 | 767 | 793 | 0.12 |
| K11 | 实施例4的标题化合物与AP39的缀合物 | 0.8 | 767 | 792 | 0.12 |
| K12 | 实施例5的标题化合物与AP39的缀合物 | 0.9 | 768 | 794 | 0.14 |
| K13 | 实施例6的标题化合物与AP39的缀合物 | 1.1 | 769 | 792 | 0.10 |
| K14 | 实施例7的标题化合物与AP39的缀合物 | 1.0 | 769 | 792 | 未测 |
| K15 | 实施例10的标题化合物与AP39的缀合物 | 1.1 | 767 | 790 | 0.13 |
| K16 | 实施例11的标题化合物与AP39的缀合物 | 1.1 | 767 | 789 | 0.15 |
| K17 | 实施例12的标题化合物与AP39的缀合物 | 0.9 | 766 | 790 | 0.11 |
| K18 | 实施例13的标题化合物与AP39的缀合物 | 1.2 | 771 | 795 | 0.10 |
| K19 | 实施例14的标题化合物与AP39的缀合物 | 1.1 | 772 | 796 | 0.09 |
| 实施例23 | |||||
| K20 | 实施例17的标题化合物与AP39的缀合物 | 0.7 | 767 | 790 | 0.18 |
| 物质(生物分子/样品化合物) | 浓度水平 | 最大吸收(nm) | 最大荧光(nm) | 荧光量子产率 | |
| K21 | 实施例19的标题化合物与AP39的缀合物 | 0.8 | 773 | 794 | 0.13 |
实施例24
在向荷瘤裸鼠(hairless mouse)注射本发明的缀合物后，在体内检查该缀合物的成像性质。为此目的，将该缀合物静脉内给予，在0至24小时的时间内观察其在肿瘤区域内的浓度。通过用由激光二极管(0.5W输出)产生的740nm波长的近红外光对动物进行区域照射来激发物质的荧光。通过增强CCD照相机检测荧光辐射，并对荧光图像进行数字存储。基于实施例，染料缀合物的体内有效性示于图2。
相信本领域技术人员利用之前的描述，无需付出进一步劳动即可最大范围地利用本发明。因此，优选的具体实施方案仅是说明性的，它们不以任何方式限制本发明公开的其余范围。
在实施例中，除非另有说明，所有温度均以未校准的摄氏度计，并且所有份和百分比均以重量计。
本文引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容均引入本文作参考。
通过用一般或具体描述的本发明的反应物和/或操作条件替换在以上实施例中使用的那些，可以重复以上实施例并取得类似的成功。
从以上描述，本领域技术人员可以容易地获知本发明的基本特征，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，可对本发明进行各种变化和修改使其适于各种用途和条件。
Claims (34)
1.通式(I)的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，
其中
X为O、S或C，其在两个位置被取代，其中取代基可以选自甲基、乙基、丙基、异丙基和/或丁基，
Y为CH2-CH2或CH2-CH2-CH2，
Z为C1-C5烷基，其中C原子任选被O或S取代，或者为
R1-R4彼此独立地为SO3H或H，条件是R1-R4中至少三个为SO3H，
R5为-CO-NH-R8-R9、-NH-CS-NH-R8-R9或-NH-CO-R8-R9，其中R8选自无支链的C2-C13烷基，其中C原子任选被O或S替换，并且
R9选自
或氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基、氯乙酰胺基、碘乙酰胺基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺，并且
其中R6和R7为CH或通过C3-烷基连接于己基环，其可以任选在对位被C1-C4-烷基取代。
2.根据权利要求1的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，其中
Y为CH2-CH2，
Z为C1-C5烷基，其中C原子任选被O或S取代，并且其中R6和R7为CH。
3.根据权利要求1或2的吲哚三羰菁染料，其中
Z为C1-C5烷基。
4.根据权利要求1或2的吲哚三羰菁染料，其中
Z为
并且R6和R7通过C3-烷基连接于己基环。
5.根据权利要求1-4之一的吲哚三羰菁染料，其中
R5为COOH或NH2。
6.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(II)所示，
7.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(III)所示，
8.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(IV)所示，
9.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(V)所示，
10.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(VI)所示，
11.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(VII)所示，
12.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(VIII)所示，
13.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(IX)所示，
14.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(X)所示，
15.根据权利要求2的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XI)所示，
16.根据权利要求2的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XII)所示，
17.根据权利要求2的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XIII)所示，
18.根据权利要求4的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XIV)所示，
19.根据权利要求4的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XV)所示，
20.根据权利要求4的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XVI)所示，
21.根据权利要求4的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XVII)所示，
22.根据权利要求3的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XVIII)所示，
23.根据权利要求2的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XIX)所示，
24.根据权利要求4的吲哚三羰菁染料及该化合物的盐和溶剂化物，该化合物如式(XX)所示，
25.权利要求1-24之一的吲哚三羰菁染料的制备方法，其包括
a)制备一种或多种4-取代吡啶，
b)通过Zincke-Knig反应将一种或多种4-取代吡啶转化为中位取代的戊烯二醛-二酰苯胺，其作为花青染料前体，以及
c)得到作为花青染料前体的中位取代的戊烯二醛-二酰苯胺。
26.缀合物的制备方法，其包括将权利要求1-24之一的吲哚三羰菁染料与生物分子偶联。
27.根据权利要求26制备的吲哚三羰菁染料与生物分子的缀合物。
28.根据权利要求27的缀合物，其特征在于，作为生物分子，其包含选自下列生物分子的至少一种生物分子：肽、蛋白质、脂蛋白、抗体或抗体片段、核酸如来自DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸、适体、PNA和糖如单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
29.根据权利要求28的缀合物，其中所述蛋白质选自机体的骨骼蛋白质或可溶性蛋白质。
30.根据权利要求28或29的缀合物，其中所述可溶性蛋白质为血清蛋白，如HAS、BSA、卵清蛋白、酶如过氧化物酶或抗体、scFv片段或F(ab)。
31.根据权利要求27-30之一的缀合物，其中所述可溶性蛋白质对ED-B-纤连蛋白具有亲和性。
32.根据权利要求27-31之一的缀合物，其中所述吲哚三羰菁染料通过SH基偶联于所述生物分子，特别是通过SH基偶联于半胱氨酸。
33.诊断试剂盒，其包含权利要求1-24之一的吲哚三羰菁染料和/或权利要求27-31之一的缀合物，以及用于实现体内诊断，尤其是体内肿瘤诊断的附加的辅助物。
34.根据权利要求27-31之一的缀合物作为用于体内肿瘤诊断的荧光造影剂的用途。
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