CN1660811A - 1，4－二取代苯类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可作为亲环素A的小分子非肽类配体的1，4－二取代苯类化合物，其具体结构如通式I所示。经生物活性试验表明本发明化合物与亲环素A有较强的结合能力，从而应证了其诱导免疫抑制的作用机制。本发明还提供了该化合物的制备方法。

Description

1，4-二取代苯类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一类1，4-二取代苯类化合物，具体涉及一类作为亲环素A的小分子非肽类配体的1，4-二取代苯类化合物，该类化合物可作为免疫抑制剂，用作防治移植排斥反应、由移植引起的宿主疾病和自身免疫疾病的药物。本发明还涉及该类化合物的制备方法。
背景技术
免疫抑制剂的研究由来已久。1936年Vorony开始进行人的同种肾移植，由于未认识免疫学的个体特异性，病人在48小时后死亡。1944年Medawa发现“二次排斥”，认识到移植免疫的存在。1954年12月美国医生默里成功地做了世界上第一例同卵双胞胎之间的肾移植手术，但还不能长期存活。此后，器官移植作为挽救人类生命的手段日益引起人们的重视。然而，人体自身免疫系统虽然对因细菌、病毒等引起的疾病起一种非常有效的防御作用，但对包括移植来的脏器在内的所有经它辨识为非己之物加以排斥，使得器官移植遇到了极大的困难。于是，在人类几十年的探索研究中，各种免疫抑制剂应运而生。
1983年，经美国食品和药品管理局(FDA)核准，环孢素A(Cyclosporine A，CsA)被用作肾、肝和心脏移植的免疫抑制剂。CsA的使用使肾移植的存活率从50％提高到90％以上；使心脏移植的5年存活率超过75％，而且90％的心脏移植患者能恢复一般工作；使肝脏移植患者的一年存活率达70％，5年存活率为60％。因此，CsA的开发和应用开创了器官移植的新纪元。
免疫抑制剂发展至今似可划分为4代：
第1代：以皮质激素、硫唑嘌呤和抗淋巴细胞球蛋白(ALG)为代表，主要作用为溶解免疫活性细胞，阻断细胞的分化，其特点为非特异性、广泛的免疫抑制；第2代：以环孢素和FK506为代表，主要阻断免疫活性细胞的白细胞介素2(IL-2)的效应环节，因其以淋巴细胞为主而具有相对特异性；第3代：以单克隆抗体、西多莫司、霉酚酸脂为代表，其作用于抗原呈递和分子间的相互作用，与第2代制剂有协同作用；第4代：以抗IL-2受体单克隆抗体、FTY20等为代表，主要针对改变细胞素(cytokine)环境，如抑制TH1，增强TH2。
虽然上述免疫抑制药物广泛应用于临床，使器官移植的成功率大大的提高，但是它们还是或多或少的带来了一些难以接受的副作用，如可能引起肝、肾毒性损害及高血压并发症，并且这些广泛应用于临床的免疫抑制药物普遍具有大分子、合成困难、天然资源有限的缺点。因此，开发毒副作用低、小分子、易合成的非肽类免疫抑制药物具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一类具有免疫抑制作用的新型的1，4-二取代苯类化合物。
本发明的另一个目的是提供合成本发明化合物的方法。
本发明的再一个目的是提供本发明化合物在作为亲环素A的小分子非肽类配体，用作免役抑制剂和防治移植排斥反应、由移植引起的宿主疾病和自身免疫疾病的药物中的应用。
本发明所述化合物为具有下述通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z各自独立地选自O、S或NH；
Y选自CO或SO2；
R1选自氢；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；C3-C7环烷基、环烯基或环炔基；芳香基Ar；含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子的5-7元杂芳基或取代杂芳基，其中杂芳基可与苯基或5-7元杂环芳基形成稠环芳基，取代杂芳基中的取代基任意选自下列基团中的一个或2-5个：卤素；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；氰基；硝基；氨基；羟基；羟甲基；三氟甲基；三氟甲氧基；羧基；C1-C4烷氧基；巯基；C1-C4酰基；芳香基Ar。
R2选自以下结构基团(II、III、IV或V)：
Ar-(CH2)n-V
其中，n是0、1、2或3；
R3、R4各自独立地选自氢；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；硝基；卤素；氰基；三氟甲基；三氟甲氧基；
R5，R6各自独立地选自氢；甲基；乙基；环己基；芳香基Ar；含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子的5-7元杂芳基或取代杂芳基，其中杂芳基可与苯基或5-7元杂环芳基形成稠环芳基，取代杂芳基中的取代基任意选自下列基团中的一个或2-5个：卤素；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；氰基；硝基；氨基；羟基；羟甲基；三氟甲基；三氟甲氧基；羧基；C1-C4烷氧基；巯基；C1-C4酰基；芳香基Ar；
所述的芳香基Ar指苯基、萘基、联苯基或取代苯基，其中取代苯基中的取代基任意选自下列基团中1-4个：卤素；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；氰基；硝基；氨基；羟基；羟甲基；三氟甲基；三氟甲氧基；羧基；C1-C4烷氧基；巯基；C1-C4酰基。
所述的“药学上可接受的盐”具体地可列举为：与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。
本发明化合物的一个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z是NH；Y是SO2；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的另一个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z是NH；Y是CO；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的又一个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z是O；Y是CO；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的再一个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z是O；Y是SO2；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第五个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X是NH；Z是O；Y是SO2；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第六个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X是NH；Z是O；Y是CO；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第七个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X是O；Z是NH；Y是SO2；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第八个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X是O；Z是NH；Y是CO；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第九个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X是S；Z是O；Y是SO2；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第十个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X是S；Z是NH；Y是SO2；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第十一个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X是S；Z是NH；Y是CO；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第十二个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X是S；Z是O；Y是CO；
R1、R2的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第十三个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z是NH；Y是SO2；
R1的定义同前述化合物的定义；
R2为具有如下结构式的基团：
Figure A20041001661800111
其中，R3、R4、R5的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第十四个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z是NH；Y是SO2；
R1的定义同前述化合物的定义；
R2为具有如下结构式的基团：
Figure A20041001661800112
其中，R6的定义同前述化合物的定义。
本发明化合物的第十五个优选化合物为具有通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z是NH；Y是SO2；
R1的定义同前述化合物的定义；
R2为具有如下结构式的基团：
Figure A20041001661800121
其中n是0、1、2或3；Ar的定义同前述化合物的定义。
根据如下反应通式，本发明化合物由化合物R’-X-Ph-Y-Cl经Z-酰化、脱保护基(参见计志忠主编：化学制药工艺学，北京：中国医药科技出版社，1997，p.173-175)、X-酰化(参见Giuseppe A.M.，Henry M.S.，J.Med.Chem.，1997，40，1794-1807)三步反应操作制得。
其中R’是乙酰基或苄基；X、Y、Z、R1、R2的定义同前面所述。酰化反应所用的惰性溶剂包括二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳、四氢呋喃或1，4-二氧六环。制备酰氯(Cl-R2)时所用的含氯置换物包括二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷、草酰氯、三苯磷氯化物或氰尿酰氯。反应温度和反应时间根据具体化合物的反应情况而定。每一步反应完毕后一般采用的后处理方法包括萃取、过滤、减压蒸除溶剂、提纯得到纯产物等，其中提纯的方法包括柱层析或重结晶。最终产物I用熔点、核磁共振或质谱等数据来确证。
在本发明中，分别具有下述通式IA、IB和IC结构的1，4-二取代苯类化合物及其中间体(VI、VII、VIII)的具体制备方法如下：
Figure A20041001661800131
1、IA类化合物的合成是以对-乙酰氨基苯磺酰氯为原料，分别经磺酰化、脱保护基和N-酰化制得。具体的合成过程分以下三步进行：
(1)磺胺类化合物VI制备：
室温下取代胺在碱性溶液中与对-乙酰氨基苯磺酰氯反应，所用的溶剂包括吡啶、三乙胺、4-二甲胺基吡啶(DMAP)、二异丙基乙胺或无机碱的水溶液，其中所用无机碱包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾。温度在40-45℃之间，搅拌12-36小时。将反应液倾入水中，有机溶剂提取水层，所用有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚、氯仿。分离得到的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得4-乙酰氨基-N-R1基苯磺酰胺。将此磺酰胺投入到10％的氢氧化钠水溶液中回流2小时，控制反应液温度在70-80℃之间，浓盐酸调PH＝1，析出大量固体，经抽滤、水洗、干燥得产物VI。
(2)取代喹啉-4-羧酸VII的制备：
控制外温在80-100℃之间，将取代的2，3-二酮吲哚与各种甲基酮和无机碱(如氢氧化钾)在溶剂中搅拌回流24-72小时，所用的溶剂包括乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇。减压蒸除溶剂，残余物溶于水中，用乙醚洗涤两次。水层在冰浴下，用浓盐酸调至PH＝1。析出大量固体，经抽滤、水洗、干燥、纯化得产物VII。
(3)由化合物VII与化合物VI发生酰化反应制备目标产物4-(取代喹啉-4-酰基)-氨基磺胺类化合物IA：
Figure A20041001661800142
将溶于惰性溶剂的化合物VII与过量的含氯置换物反应，其中含氯置换物包括二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷、草酰氯、三苯磷氯化物或氰尿酰氯；惰性溶剂包括二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳、四氢呋喃、1，4-二氧六环。控制外温在80-120℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于惰性溶剂中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到化合物VI的吡啶溶液中，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时。将反应液倾入水中，有机溶剂提取水层，所用有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚、氯仿。分离得到的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得目标物4-(取代喹啉-4-酰基)-氨基-N-取代苯磺酰胺IA。
2、IB类化合物的合成是以α-溴代甲基酮为原料，分别经缩合成环，扩环，卤化、N-酰化制得。具体的合成过程分以下三步进行：
(1)磺胺类化合物VI制备；
(2)2-取代吡啶-4-羧酸VIII的制备：
控制外温在110-120℃之间，将α-溴代甲基酮与甲酸铵和甲酸回流搅拌2-10小时。反应液倾入水中，用浓氢氧化钠水溶液调至pH＝10，乙醚提取，有机层水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得4-取代噁唑。4-取代噁唑与马来酸混合，搅拌加热至110℃，反应15-30分钟。冷却至室温，所得到的固体用乙醚分散成粉末，抽滤，得到的固体悬浮于甲醇水溶液中，用盐酸酸化至PH＝1。减压蒸除溶剂，固体先用乙酸乙酯洗，然后重结晶纯化得化合物VIII。
(3)由化合物VIII与化合物VI发生酰化反应制备目标产物4-(2-取代吡啶-4-酰基)-氨基磺胺类化合物IB：
将溶于惰性溶剂的化合物VIII与过量的含氯置换物反应，其中含氯置换物包括二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷、草酰氯、三苯磷氯化物或氰尿酰氯；惰性溶剂包括二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳、四氢呋喃、1，4-二氧六环。控制外温在80-120℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于惰性溶剂中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到化合物VI的吡啶溶液中，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时。将反应液倾入水中，有机溶剂提取水层，所用有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚、氯仿。分离得到的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得目标物4-(取代吡啶-4-酰基)-氨基-N-取代苯磺酰胺IB。
IC类化合物的合成是以各种芳烷基羧酸为原料，分别经卤化，N-酰化制得。具体的合成过程分以下两步进行：
(1)磺胺类化合物VI制备；
(2)是由化合物VI与各种酰氯连接制备目标产物4-取代酰氨基磺胺类化合物IC：
Figure A20041001661800161
将溶于惰性溶剂的芳烷基羧酸与过量的含氯置换物反应，其中含氯置换物包括二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷、草酰氯、三苯磷氯化物或氰尿酰氯；惰性溶剂包括二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳、四氢呋喃、1，4-二氧六环。控制外温在80-120℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于惰性溶剂中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到化合物VI的吡啶溶液中，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时。将反应液倾入水中，有机溶剂提取水层，所用有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚、氯仿。分离得到的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得目标物4-芳烷基酰氨基-N-取代苯磺酰胺IC。
本发明化合物可作为亲环素A的小分子非肽类配体，通过阻断免疫活性细胞的白细胞介素2(IL-2)的效应环节，而被用于诱导免疫抑制作用和治疗移植排斥反应，治疗由移植引起的宿主疾病和自身免疫疾病。
本发明化合物诱导免疫抑制的作用机制为：首先与亲环素A(CypA)结合成复合物CypA-CsA，该复合物与其效应蛋白钙神经素(Calcineurin)结合，抑制该蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，由此阻断了一些细胞因子的产生，包括白细胞介素2。
运用BIAcore实时测量本发明化合物与亲环素A的结合常数(Kd)，其结果证明本发明化合物与亲环素A具有较强的结合能力，从而应证了其诱导免疫抑制的作用机制。有益效果
1、本发明化合物具有小分子、非肽类、易合成、毒性低等优点。
2、本发明化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点。
3、本发明化合物与亲环素A具有较大的结合常数KD，证明两者具有较强的结合能力，因此本发明化合物存在良好的诱导免疫抑制的作用机制，可用于制成免役抑制剂和防治移植排斥反应、由移植引起的宿主疾病和自身免疫疾病的药物。
附图说明
图1表示化合物IA-1与CypA结合的动力学曲线图，其中a1为IA-1浓度为1×10-5M时的动力学曲线，b1为IA-1浓度为5×10-6M时的动力学曲线，c1为IA-1浓度为2.5×10-6M时的动力学曲线，d1为IA-1浓度为1.25×10-6M时的动力学曲线，e1为IA-1浓度为6.25×10-7M时的动力学曲线，f1为IA-1浓度为3.125×10-7M时的动力学曲线，g1为工作基线。
图2表示化合物IC-3与CypA结合的动力学曲线图，其中a2为IC-3浓度为1×10-5M时的动力学曲线，b2为IC-3浓度为5×10-6M时的动力学曲线，c2为IC-3浓度为2.5×10-6M时的动力学曲线，d2为IC-3浓度为1.25×10-6M时的动力学曲线，e2为IC-3浓度为6.25×10-7M时的动力学曲线，f2为IC-3浓度为3.125×10-7M时的动力学曲线，g2为工作基线。
图3表示DMSO对CypA荧光的影响图，其中CypA浓度保持为6μM，a3为DMSO浓度0μM时CypA的荧光强度曲线、b3为DMSO浓度2μM时CypA的荧光强度曲线、c3为DMSO浓度4μM时CypA的荧光强度曲线、d3为DMSO浓度8μM时CypA的荧光强度曲线、e3为DMSO浓度16μM时CypA的荧光强度曲线、f3为DMSO浓度32μM时CypA的荧光强度曲线、g3为DMSO浓度64μM时CypA的荧光强度曲线。
图4表示无关化合物对CypA荧光的影响图，其中CypA浓度保持为6μM，a4为该化合物浓度0μM时CypA的荧光强度曲线、b4为该化合物浓度2μM时CypA的荧光强度曲线、c4为该化合物浓度4μM时CypA的荧光强度曲线、d4为该化合物浓度8μM时CypA的荧光强度曲线、e4为该化合物浓度16μM时CypA的荧光强度曲线、f4为该化合物浓度32μM时CypA的荧光强度曲线、g4为该化合物浓度64μM时CypA的荧光强度曲线。
图5表示化合物IA-1对CypA的荧光淬灭影响图，其中CypA浓度保持为6μM，a5为IA-1浓度0μM时CypA的荧光强度曲线、b5为IA-1浓度2μM时CypA的荧光强度曲线、c5为IA-1浓度4μM时CypA的荧光强度曲线、d5为IA-1浓度8μM时CypA的荧光强度曲线、e5为IA-1浓度16μM时CypA的荧光强度曲线、f5为IA-1浓度32μM时CypA的荧光强度曲线、g5为IA-1浓度64μM时CypA的荧光强度曲线。
图6表示化合物IA-1对CypA的荧光淬灭实验得到的ΔFc对ΔFc/C(×106)的线性拟合图。
图7表示化合物IA-2对CypA的荧光淬灭影响图，其中CypA浓度保持为6μM，a6为IA-2浓度0μM时CypA的荧光强度曲线、b6为IA-2浓度2μM时CypA的荧光强度曲线、c6为IA-2浓度4μM时CypA的荧光强度曲线、d6为IA-2浓度8μM时CypA的荧光强度曲线、e6为IA-2浓度16μM时CypA的荧光强度曲线、f6为IA-2浓度32μM时CypA的荧光强度曲线、g6为IA-2浓度64μM时CypA的荧光强度曲线。
图8表示化合物IA-2对CypA的荧光淬灭实验得到的ΔFc对ΔFc/C(×106)的线性拟合图。
图9表示化合物IC-3对CypA的荧光淬灭影响图，其中CypA浓度保持为6μM，a7为IA-3浓度0μM时CypA的荧光强度曲线、b7为IA-3浓度2μM时CypA的荧光强度曲线、c7为IA-3浓度4μM时CypA的荧光强度曲线、d7为IA-3浓度8μM时CypA的荧光强度曲线、e7为IA-3浓度16μM时CypA的荧光强度曲线、f7为IA-3浓度32μM时CypA的荧光强度曲线、g7为IA-3浓度64μM时CypA的荧光强度曲线。
图10表示化合物IA-3对CypA的荧光淬灭实验得到的ΔFc对ΔFc/C(×106)的线性拟合图。
图11表示化合物IA-4对CypA的荧光淬灭影响图，其中CypA浓度保持为6μM，a8为IA-4浓度0μM时CypA的荧光强度曲线、b8为IA-4浓度2μM时CypA的荧光强度曲线、c8为IA-4浓度4μM时CypA的荧光强度曲线、d8为IA-4浓度8μM时CypA的荧光强度曲线、e8为IA-4浓度16μM时CypA的荧光强度曲线、f8为IA-4浓度32μM时CypA的荧光强度曲线、g8为IA-4浓度64μM时CypA的荧光强度曲线。
图12表示化合物IA-4对CypA的荧光淬灭实验得到的ΔFc对ΔFc/C(×106)的线性拟合图。
图13表示化合物IC-1对CypA的荧光淬灭影响图，其中CypA浓度保持为6μM，a9为IC-1浓度0μM时CypA的荧光强度曲线、b9为IC-1浓度2μM时CypA的荧光强度曲线、c9为IC-1浓度4μM时CypA的荧光强度曲线、d9为IC-1浓度8μM时CypA的荧光强度曲线、e9为IC-1浓度16μM时CypA的荧光强度曲线、f9为IC-1浓度32μM时CypA的荧光强度曲线、g9为IC-1浓度64μM时CypA的荧光强度曲线。
图14表示化合物IC-1对CypA的荧光淬灭实验得到的ΔFc对ΔFc/C(×106)的线性拟合图。
图15表示化合物IC-3对CypA的荧光淬灭影响图，其中CypA浓度保持为6μM，a10为IC-3浓度0μM时CypA的荧光强度曲线、b10为IC-3浓度2μM时CypA的荧光强度曲线、c10为IC-3浓度4μM时CypA的荧光强度曲线、d10为IC-3浓度8μM时CypA的荧光强度曲线、e10为IC-3浓度16μM时CypA的荧光强度曲线、f10为IC-3浓度32μM时CypA的荧光强度曲线、g10为IC-3浓度64μM时CypA的荧光强度曲线。
图16表示化合物IC-3对CypA的荧光淬灭实验得到的ΔFc对ΔFc/C(×106)的线性拟合图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量为说明依据的。
下述制备例中，熔点采用SGW-X-4显微熔点仪(南京科捷仪器应用研究所)测定，温度未经校正；核磁共振由Bruker AMX-400型核磁共振仪(Bruker公司)测定，TMS(四甲基硅烷)为内标；质谱由MAT-711型和MAT-95型质谱仪(Finnigan公司)测定。产品纯化主要用柱层析法，硅胶为200-300目(青岛海洋化工厂生产)。
实施例1 4-[2-(2-甲基苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)苯磺酰胺(IA-1)的制备
(1)4-氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)-苯磺酰胺(VI-1)的制备
将1.09克2-氨基-4-甲基嘧啶溶于5毫升吡啶中，室温搅拌下，缓慢滴加对-乙酰氨基苯磺酰氯的吡啶溶液(2.34g/10ml)。滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌12小时。将反应液倾入100毫升水中，乙酸乙酯提取(30ml×3)，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物用硅胶柱层析纯化，洗脱液为乙酸乙酯/石油醚(1∶1，v/v)，得到4-乙酰氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)-苯磺酰胺1.5克。将此磺酰胺投入到15毫升10％的氢氧化钠水溶液中回流2小时，控制反应液温度在70-80℃之间，36-38％的浓盐酸调PH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥得产物4-氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)-苯磺酰胺1.2克，收率45.5％(以对-乙酰氨基苯磺酰氯计算)。
(2)2-(2-甲基苯基)喹啉-4-羧酸(VII-1)的制备
将2.74克2，3-二酮吲哚、3.01克邻甲基苯乙酮、3.14克85％的氢氧化钾片投入到25毫升无水乙醇中，控制外温在80-100℃之间，搅拌回流48小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于100毫升水中，用乙醚洗两次(20ml×2)。水层在冰浴下，用36-38％的浓盐酸调至PH＝1。析出大量固体，抽滤，水洗，干燥。乙醇重结晶得2-(2-甲基苯基)喹啉-4-羧酸2.3克，为浅黄色固体，mp226-228℃，收率46.7％。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ2.39(3H，s)，7.33-7.42(3H，m)，7.55(1H，d，J＝7.2)，7.75(1H，m)，7.87(1H，m)，8.02(1H，S)，8.13(1H，d，J＝8.1)，8.71(1H，d，J＝8.5)。MS-EI 262(M-1)，218(100％)。
(3)4-[2-(2-甲基苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)苯磺酰胺(IA-1)的制备
将0.5克2-(2-甲基苯基)喹啉-4-羧酸溶于10毫升二氯甲烷中，加入2毫升二氯亚砜，控制外温在80-90℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于5毫升1，2-二氯乙烷中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到4-氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)-苯磺酰胺的吡啶溶液中(0.5g/5ml)，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时。将反应液倾入50毫升水中，二氯乙烷提取(20ml×3)，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化，洗脱液为乙酸乙酯/石油醚(1∶2，v/v)，得到目标物4-[2-(2-甲基苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)苯磺酰胺0.15克，为浅黄色固体，收率15.5％。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.32(3H，s)，2.45(3H，s)，6.91(1H，d，J＝5.1)，7.35-7.39(3H，m)，7.60(1H，d，J＝6.7)，7.70(1H，m)，7.87(1H，m)，7.89(1H，S)，7.95(2H，d，J＝8.8)，8.02(2H，d，J＝8.8)，8.13(1H，d，J＝8.4)，8.18(1H，d，J＝8.4)，8.33(1H，d，J＝5.1)。MS-EI 509(M)，336(100％)。
实施例2 4-(2-苯基吡啶-4-酰基)-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IB-1)的制备
(1)4-苯基噁唑的制备
将20克α-溴代苯乙酮、22克甲酸铵投入到106.5ml甲酸中，回流搅拌2.5小时，反应物被倾入到200ml水中，用6N的NaOH中和至PH＝10，乙醚提取(50ml×3)，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化，洗脱液为乙酸乙酯/正己烷(3∶7，v/v)，得4-苯基噁唑2.3克，为黄色油状物，收率16.0％。1H-NMR(400Hz，CDCl3)δ：7.33(1H，dd，J＝7.5，7.5)，7.42(2H，dd，J＝7.5，7.5)，7.75(2H，d，J＝7.5)，7.94(2H，m)。
(2)2-苯基吡啶-4-羧酸(VIII-1)的制备
将2克4-苯基噁唑，1.65克马来酸混合加热至110℃，搅拌10分钟，冷至室温，所得固体用乙醚分散成粉末，抽滤，滤饼悬浮于20毫升80％的甲醇水溶液中，用20％的盐酸酸化至PH＝1，减压蒸除溶剂，残余固体先用乙酸乙酯洗(10ml×3)，然后用95％乙醇重结晶纯化得2-苯基吡啶-4-羧酸(VIII-1)0.5克，为类白色固体，收率18.0％。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：7.71(1H，d，J＝4.0)，7.45-8.35(5H，m)，8.20(1H，s)，8.76(1H，d，J＝4.0)。
(3)4-(2-苯基吡啶-4-酰基)-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IB-1)的制备
将0.5克2-苯基吡啶-4-羧酸(VIII-1)溶于10毫升二氯甲烷中，加入2毫升二氯亚砜，控制外温在80-90℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于5毫升1，2-二氯乙烷中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)-苯磺酰胺的吡啶溶液中(0.67g/5ml)，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时。将反应液倾入50毫升水中，二氯乙烷提取(20ml×3)，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化，洗脱液为乙酸乙酯/石油醚(1∶2，v/v)，得目标物4-(2-苯基吡啶-4-酰基)-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺。
实施例3 4-(4-氯苯乙酰基)氨基-N-(2-喹喔啉基)苯磺酰胺(IC-1)的制备
根据实施例1中步骤(1)所述的方法，由2.34克对-乙酰氨基苯磺酰氯与1.45克2-氨基-喹喔啉制得4-氨基-N-(2-喹喔啉基)-苯磺酰胺1.08克，为浅黄色固体，收率31.6％。
将0.19克4-氯苯乙酸溶于5毫升二氯甲烷中，加入2毫升二氯亚砜，控制外温在80-90℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于5毫升1，2-二氯乙烷中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到4-氨基-N-(2-喹喔啉基)-苯磺酰胺的吡啶溶液中(0.3g/3ml)，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时。将反应液倾入50毫升水中，二氯乙烷提取(30ml×3)，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化，洗脱液为乙酸乙酯/石油醚(1∶2，v/v)，得到目标物4-(4-氯苯乙酰基)氨基-N-(2-喹喔啉基)苯磺酰胺0.15克，为浅黄色固体，收率33.1％。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.65(2H，s)，7.29-7.35(4H，m)，7.61(1H，m)，7.73(1H，m)，7.74-7.77(3H，m)，7.92(1H，d，J＝8.2)，8.03(2H，d，J＝8.8)，8.61(1H，s)。MS-EI 452(M)，387(100％)。
实施例4  4-[2-(3-溴苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-2)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的3-溴苯乙酮的反应产物2-(3-溴苯基)喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到白色固体IA-2。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.71(3H，s)，2.10(3H，s)，7.57(1H，t，J＝7.9)，7.68-7.75(2H，m)，7.84(2H，d，J＝8.8)，7.90(1H，m)，8.04(2H，d，J＝8.8)，8.22(2H，m)，8.40(1H，m)，8.48(1H，s)，8.58(1H，t，J＝1.8)。MS-EI 578(M+1)，203(100％)。
实施例5 4-[2-(2，4-二甲基苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(2-嘧啶基)苯磺酰胺(IA-3)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的2，4-二甲基苯乙酮的反应产物2-(2，4-二甲基苯基)喹啉-4-羧酸和1当量的2-氨基嘧啶与1.2当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(2-嘧啶基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到白色固体IA-3。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.35(3H，s)，2.43(3H，s)，7.05(1H，t，J＝5.0)，7.16-7.18(2H，m)，7.52(1H，d，J＝8.9)，7.69(1H，m)，7.83-7.87(2H，m)，7.96(2H，d，J＝9.1)，8.02(2H，d，J＝9.1)，8.10-8.16(2H，m)，8.51(1H，d，J＝5.0)。MS-EI 509(M)，232(100％)。
实施例6 4-[2-(2-甲氧基苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(5-甲基-3-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-4)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的2-甲氧基苯乙酮的反应产物2-(2-甲氧基苯基)喹啉-4-羧酸和1当量的3-氨基-5-甲基异噁唑与1.2当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(5-甲基-3-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到浅黄色固体IA-4。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.31(3H，s)，3.85(3H，s)，6.13(1H，s)，7.16(1H，m)，7.23(1H，d，J＝8.2)，7.52(1H，m)，7.68(1H，m)，7.82-7.88(4H，m)，7.98(2H，d，J＝8.1)，8.08(1H，s)，8.15(1H，t，J＝8.6)。MS-EI 514(M)，234(100％)。
实施例7 4-[2-(3-溴苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(2-喹喔啉基)苯磺酰胺(IA-5)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的3-溴苯乙酮的反应产物2-(3-溴苯基)喹啉-4-羧酸和1当量的2-氨基喹喔啉与1当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(2-喹喔啉基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到浅黄色固体IA-5。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：7.54(1H，t，J＝8.0)，7.60-7.67(2H，m)，7.70-7.76(2H，m)，7.82-7.87(2H，m)，7.95(1H，d，J＝8.4)，8.01(2H，d，J＝8.8)，8.12-8.18(4H，m)，8.35(1H，m)，8.41(1H，s)，8.53(1H，t，J＝1.8)，8.66(1H，broad)。
实施例8 4-[2-(4-吡啶基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-6)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的4-乙酰基吡啶的反应产物2-(4-吡啶基)喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1.2当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到类白色固体IA-6。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.85(3H，s)，2.34(3H，s)，7.77(1H，m)，7.87-7.94(3H，m)，8.12(2H，d，J＝8.8)，8.27(1H，m)，8.32(2H，d，J＝6.0)，8.39(1H，m)，8.57(1H，s)，8.81(2H，d，J＝6.0)。
实施例9 4-[2-(2-萘基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-7)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的2-萘乙酮的反应产物2-(2-萘基)喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1.2当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到浅黄色固体IA-7。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.71(3H，s)，2.10(3H，s)，7.60(2H，m)，7.70(1H，m)，7.81-7.88(3H，m)，8.00(1H，m)，8.05(2H，d，J＝8.0)，8.11(2H，d，J＝8.0)，8.19(1H，d，J＝8.4)，8.24(1H，d，J＝8.0)，8.55-8.59(2H，m)，8.95(1H，s)。
实施例10 4-[2-(4-溴苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-8)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的4-溴苯乙酮的反应产物2-(4-溴苯基)喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到白色固体IA-8。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.70(3H，s)，2.10(3H，s)，7.70(1H，m)，7.78(2H，d，J＝8.4)，7.82(2H，d，J＝8.4)，7.88(1H，m)，8.02(2H，d，J＝8.4)，8.18(2H，d，J＝8.4)，8.33(2H，m)，8.42(1H，s)。
实施例11 4-[2-(2-溴苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-9)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的2-溴苯乙酮的反应产物2-(2-溴苯基)喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到浅黄色固体IA-9。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.69(3H，s)，2.09(3H，s)，7.47(1H，m)，7.58(1H，m)，7.70(1H，m)，7.75(1H，m)，7.82(3H，m)，7.91(1H，m)，8.00(3H，m)，8.17(1H，d，J＝8.4)，8.22(1H，d，J＝7.6)。
实施例12  4-[2-(3-氟苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-10)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的3-氟苯乙酮的反应产物2-(3-氟苯基)喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1.2当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到浅黄色固体IA-10。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.72(3H，s)，2.12(3H，s)，7.40(1H，m)，7.67(1H，m)，7.73(1H，t，J＝8.0)，7.84(2H，d，J＝8.3)，7.91(1H，m)，8.05(2H，d，J＝8.3)，8.22(3H，m)，8.25(1H，d，J＝7.6)，8.47(1H，s)。
实施例13 4-(2-环己基喹啉-4-酰基)氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-11)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的环己基甲基酮的反应产物2-环己基喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1.2当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到白色固体IA-11。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.34(1H，m)，1.48(2H，m)，1.76(6H，m)，1.87(2H，m)，1.99(2H，m)，2.09(3H，s)，2.97(1H，m)，7.61(1H，m)，7.66(1H，s)，7.82(3H，m)，7.99(2H，d，J＝8.8)，8.04(1H，d，J＝8.4)，8.07(1H，d，J＝8.8)。
实施例14  4-[2-(3-氯苯基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-12)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的3-氯苯乙酮的反应产物2-(3-氯苯基)喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1.2当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到白色固体IA-12。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.70(3H，s)，2.10(3H，s)，7.60-7.63(2H，m)，7.71(1H，m)，7.83(2H，d，J＝8.6)，7.88(1H，m)，8.03(2H，d，J＝8.6)，8.21(2H，m)，8.35(1H，m)，8.43(1H，s)，8.47(1H，s)。
实施例15  4-[2-(2-噻唑基)喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-13)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮吲哚与1.2当量的2-乙酰噻唑的反应产物2-(2-噻唑基)喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1.2当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到浅黄色固体IA-13。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.70(3H，s)，2.10(3H，s)，7.25(1H，t，J＝4.4)，7.64(1H，t，J＝7.6)，7.76(1H，d，J＝4.8)，7.82(3H，m)，8.02(2H，d，J＝8.8)，8.11(3H，m)，8.34(1H，s)。
实施例16 4-[2-(3-溴苯基)-6-氟-喹啉-4-酰基]氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺(IA-14)的制备
根据实施例1所述的相同方法，由1当量的2，3-二酮-5-氟吲哚与1.2当量的3-溴苯乙酮的反应产物2-(3-溴苯基)-6-氟-喹啉-4-羧酸和1当量的3，4-二甲基-5-氨基异噁唑与1当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(3，4-二甲基-5-异噁唑基)苯磺酰胺发生酰化反应制备得到浅黄色固体IA-14。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.70(3H，s)，2.10(3H，s)，7.57(1H，t，J＝4.0)，7.74(1H，m)，7.88(3H，m)，7.96(1H，m)，8.03(2H，d，J＝8.6)，8.29(1H，m)，8.38(1H，m)，8.56(2H，m)。
实施例17 4-(2，4-二氯苯乙酰基)氨基-N-(2-喹喔啉基)苯磺酰胺(IC-2)的制备
根据实施例3所述的相同方法，由1当量的2，4-二氯苯乙酸与过量的二氯亚砜的反应产物2，4-二氯苯乙酰氯和1当量的2-氨基-喹喔啉与1当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(2-喹喔啉基)苯磺酰胺连接制备得到浅黄色固体IC-2。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.83(2H，s)，7.38(1H，m)，7.42(1H，d，J＝8.4)，7.55(1H，d，J＝2.0)，7.62(1H，m)，7.69-7.76(4H，m)，7.92(1H，d，J＝8.0)，8.04(2H，d，J＝8.8)，8.63(1H，broad)。
实施例18 4-(2，4-二氯苯甲酰基)氨基-N-(2-喹喔啉基)苯磺酰胺(IC-3)的制备
根据实施例3所述的相同方法，由1当量的2，4-二氯苯甲酸与过量的二氯亚砜的反应产物2，4-二氯苯甲酰氯和1当量的2-氨基-喹喔啉与1当量的对-乙酰氨基苯磺酰氯的反应产物4-氨基-N-(2-喹喔啉基)苯磺酰胺连接制备得到浅黄色固体IC-3。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：7.51(1H，m)，7.60-7.68(3H，m)，7.77(1H，m)，7.90(1H，m)，7.94-7.99(3H，m)，8.21(2H，d，J＝8.8)，8.72(1H，s)。
实施例19 生物活性测定实验
一、利用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)生物传感技术研究本发明1，4-二取代苯类化合物与人源重组CypA的相互作用。
1.实验内容：采用文献方法(李芳秋等，微生物学报，1998，38，193)进行重组人源CypA蛋白的表达和纯化。利用表面等离子共振原理研究化合物与CypA的结合情况。
2.仪器和材料：
(1)Ni-NTA亲和柱(Novagen公司)
(2)含CypA cDNA的质粒(南京军区南京总医院全军医学检验中心)和E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)
(3)DMSO(Fisher公司)
(4)HBS-EP缓冲液(10mM Hepes，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％(v/v)表面活性剂P20，pH7.4)
(5)缓冲液：N-乙基-N’-二甲基-氨丙基-含炭硝化甘油(N-ethyl-N’-(dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide，EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、乙醇胺(Ethanolamine)等(Biacore AB公司，Uppsala，Sweden)
(6)CM5芯片，购自BIACORE AB公司(Uppsala，Sweden)
(7)BIAcore3000(利用表面等离子共振技术的生物传感器)(BIACORE AB公司，Uppsala，Sweden)
(8)待测化合物：IA-1、IA-2、IA-3、IA-4、IC-1、IC-3
3.操作步骤：CypA采用氨基偶联法偶联到CM5芯片上(氨基偶联法：EDC和NHS等体积混合后活化CM5芯片表面的羧甲基成为易于与氨基反应的中间态，然后再将纯化的CypA注射到芯片表面，蛋白质N末端的氨基通过缩水反应与羧基中间态共价结合，从而将CypA偶联在芯片表面)，芯片上的CypA用阳性化合物环孢素CSA检测其生物活性。待测化合物用二甲亚砜(DMSO)溶解，再用HBS-EP缓冲液稀释到1×10-5-1×10-7M的工作浓度(具体浓度根据化合物设定)。化合物的工作液中DMSO浓度保持为0.1％。用BIAcore3000的动力学分析wizard进行动力学实验(BIAcore3000仪器自带控制软件，按照BIAcore3000实验手册操作)。将收集的数据，按照稳态模型进行数据分析，得到相关的热力学参数(平衡解离常数Kd)。
4.实验结果：
待测化合物与人源重组CypA的相互作用的测定结果见图1、图2和表1。
图1和图2结果表明随着化合物浓度升高，结合反应值也随之升高，也就是说结合到CypA上的化合物增加。化合物与CypA的结合迅速达到平衡，并且与浓度成对应关系。根据BIAcore分析软件中的稳态模型进行数据分析，就可得到下表的数值。
表1：待测化合物与CypA结合的数据分析结果
    序号   化合物编号   解离常数Kd(μM)
    123456     IA-1IA-2IA-3IA-4IC-1IC-3     43.1±0.818.5±0.497.0±2.517.5±0.3630±4.313.0±0.07
表1结果表明：IA-1、IA-2、IA-3、IA-4、IC-1和IC-3与CypA的平衡解离常数Kd值都较小，即与CypA均有较强的结合能力。
二、利用荧光淬灭的方法研究本发明本发明化合物与人源重组CypA的平衡解离常数(Kd)。
1.实验原理：通常情况下，蛋白中的Trp所处环境和状态会影响Trp的荧光特性，包括荧光强度和出峰位置，而使整个蛋白的荧光特性发生变化。当化合物与CypA结合后，CypA中的Trp所处环境的极性发生了变化，甚至化合物能够直接与CypA的121号Trp残基结合，这样导致了Trp荧光特性的变化，从而引起了CypA蛋白整体荧光强度的变化。CypA荧光变化值和与CypA结合的化合物浓度相关，因此荧光变化值能间接反应和CypA结合的化合物浓度，进而通过公式算出化合物与CypA相互作用的平衡解离常数。
2.仪器和材料：
(1)荧光分光光度计HITACHI(F-2500)(日本日立公司)；
(2)人源重组CypA(南京军区南京总医院全军医学检验中心)；
(3)待测化合物：IA-1、IA-2、IA-3、IA-4、IC-1、IC-3，待测化合物用DMSO溶解，浓度为10mM；
(4)阴性对照品：二甲亚砜(DMSO)；其他无关化合物，即与本发明化合物分子量近似的针对其他疾病靶点设计的化合物
(5)Tris-HCl缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.4；100mM NaCl
3.操作步骤：
在3000μL含有6μM CypA的溶液中，分别加入0、0.6μL、1.2μL、2.4μL、4.8μL、9.6μL、19.2μL10mM的待测化合物。以280nm作激发光，扫描300-380nm的发射光，将峰值作为特征值。测定在化合物浓度分别为0μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM时CypA的荧光值，同时加入与待测化合物体积相同的DMSO作平行对照实验。将扣除了DMSO影响的荧光变化值进行整理，以ΔFc/C(加入化合物后蛋白的荧光变化值与化合物浓度的比值)为横坐标，ΔFc(加入化合物后蛋白的荧光变化值)作为纵坐标，拟合线性方程，所得的斜率就是CypA和小分子化合物的平衡解离常数Kd。
4.实验结果：
(1)阴性对照实验：
①DMSO对CypA荧光的影响
本实验中CypA浓度保持为6μM，测定在DMSO浓度分别为0μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM时CypA的荧光值。DMSO对CypA荧光的影响结果见图3。
由图3可以看出，DMSO对CypA荧光的影响是很小的。
②其他无关化合物对CypA荧光值的影响
实验中，CypA浓度保持为6μM，测定在化合物浓度分别为0μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM时CypA的荧光值。该化合物对CypA荧光的影响结果见图4。
由图4可见，该化合物对CypA的荧光变化几乎无影响，说明了荧光淬灭测定方法的特异性。
(2)待测化合物IA-1对CypA荧光的影响
实验中，CypA浓度保持为6μM，加入不同浓度的化合物后的荧光值F为图5中的峰值。由于化合物中含有DMSO，它对蛋白荧光值可能造成影响，在数据分析时必须扣除DMSO的影响。由此必须引入只加入DMSO的平行实验，F’为加入相应量DMSO的蛋白荧光测定值，ΔF’表示DMSO背景的荧光变化值，即加入不同量DMSO与不加DMSO时的蛋白荧光差值；Fc为扣除DMSO背景后蛋白自身的荧光值，数值上等于F+ΔF’；ΔFc表示加入化合物后蛋白的荧光变化值，即加入化合物后的Fc值与不加化合物的Fc的差值；ΔFc/C为加入化合物后蛋白的荧光变化值与化合物浓度的比值。
待测化合物IA-1对CypA的荧光淬灭实验结果见表2和图5。
表2：化合物IA-1对CypA的荧光淬灭实验结果(λex＝280nm，λem＝340nm)
  化合物浓度C(μM) 荧光测定值F DMSO对照荧光测定值F’ ΔF’ Fc(F+ΔF’) ΔFc ΔFc/C
    0248163264     160.3146.8136.2121.798.6667.2433.83     153.8151.5150.2149.5148.2146.9146.6   02.33.64.35.66.97.2     160.3149.1139.8126104.2674.1441.03     011.220.534.356.0486.16119.27 5.65.1254.28753.50252.69251.863594
从表2和图5所示的结果可以看出，待测化合物IA-1对CypA荧光值有良好的淬灭效果，随着待测化合物IA-1的浓度增大，CypA荧光值下降。其ΔFc值与ΔFc/C(×106)值呈较好的线性关系。其拟合结果如图6所示，所得到拟合线性方程为ΔF＝-28.564×10-6×(ΔF/C)+164.41，R2＝0.9714；Kd值为2.86×10-5M。
(3)待测化合物IA-2对CypA荧光的影响
实验中，CypA浓度保持为6μM，
待测化合物IA-1对CypA的荧光淬灭实验结果见表3和图7。
表3：化合物IA-2对CypA的荧光淬灭实验结果(λex＝280nm，λem＝340nm)
  化合物浓度C(μM) 荧光测定值F DMSO对照荧光测定值F’ ΔF’ Fc(F+ΔF’) ΔFc ΔFc/C
    01248163264   167.2155.8148.1132.3109.379.0542.8712.67     172.1171169.1168166.1165.6164.4163.4     01.134.166.57.78.7     167.2156.9151.1136.4115.385.5550.5721.37   010.316.130.851.981.65116.63145.83 10.38.057.76.48755.1031253.6446882.278594
从表3和图7所示的结果可以看出，待测化合物IA-2对CypA荧光值有良好的淬灭效果，随着待测化合物IA-2的浓度增大，CypA荧光值下降。其ΔFc值与ΔFc/C(×106)值呈良好的线性关系。其拟合结果如图8所示，所得到拟合线性方程为ΔF＝-21.991×10-6×(ΔF/C)+195.73，R2＝0.9975；Kd值为2.20×10-5M。
(4)待测化合物IA-3对CypA荧光的影响
实验中，CypA浓度保持为6μM，
待测化合物IA-3对CypA的荧光淬灭实验结果见表4和图9。
表4：化合物IA-3对CypA的荧光淬灭实验结果(λex＝280nm，λem＝340nm)
  化合物浓度C(μM) 荧光测定值F DMSO对照荧光测定值F’ ΔF’ Fc(F+ΔF’) ΔFc ΔFc/C
    01248163264   170.6162.2156.3145.112698.7660.8325.34     172.1171169.1168166.1165.6164.4163.4   01.134.166.57.78.7   170.6163.3159.3149.2132105.2668.5334.04     07.311.321.438.665.34102.07136.56 7.35.655.354.8254.083753.1896882.13375
从表4和图9所示的结果可以看出，待测化合物IA-3对CypA荧光值有良好的淬灭效果，随着待测化合物IA-3的浓度增大，CypA荧光值下降。其ΔFc值与ΔFc/C(×106)值呈良好的线性关系。其拟合结果如图10所示，所得到拟合线性方程为ΔF＝-36.164×10-6×(ΔF/C)+214.63，R2＝0.9988；Kd值为3.61×10-5M。
(5)待测化合物IA-4对CypA荧光的影响
实验中，CypA浓度保持为6μM，
待测化合物IA-4对CypA的荧光淬灭实验结果见表5和图11。
表5：化合物IA-4对CypA的荧光淬灭实验结果(λex＝280nm，λem＝340nm)
  化合物浓度C(μM) 荧光测定值F DMSO对照荧光测定值F’ ΔF’ Fc(F+ΔF’) ΔFc ΔFc/C
    01248163264     171.8162.8155.2143.3121.388.1449.3117.07     172.1171169.1168166.1165.6164.4163.4     01.134.166.57.78.7     171.8163.9158.2147.4127.394.6457.0125.77   07.913.624.444.577.16114.79146.03 7.96.86.15.56254.82253.5871882.281719
从表5和图11所示的结果可以看出，待测化合物IA-4对CypA荧光值有良好的淬灭效果，随着待测化合物IA-4的浓度增大，CypA荧光值下降。其ΔFc值与ΔFc/C(×106)值呈较好的线性关系。其拟合结果如图12所示，所得到拟合线性方程为ΔF＝-31.086×10-6×(ΔF/C)+221.12，R2＝0.9885；Kd值为3.11×10-5M。
(6)待测化合物IC-1对CypA荧光的影响
实验中，CypA浓度保持为6μM，
待测化合物IC-1对CypA的荧光淬灭实验结果见表6和图13。
表6：化合物IC-1对CypA的荧光淬灭实验结果(λex＝280nm，λem＝340nm)
化合物浓度C(μM) 荧光测定值F DMSO对照荧光测定值F’ ΔF’ Fc(F+ΔF’) ΔFc ΔFc/C
    0248163264   159.9144.4133115.289.5656.4324.21     153.8151.5150.2149.5148.2146.9146.6   02.33.64.35.66.97.2     159.9146.7136.6119.595.1663.3331.41   013.223.340.464.7496.57128.49 6.65.8255.054.046253.0178132.007656
从表6和图13所示的结果可以看出，待测化合物IC-1对CypA荧光值有良好的淬灭效果，随着待测化合物IC-1的浓度增大，CypA荧光值下降。其ΔFc值与ΔFc/C(×106)值呈较好的线性关系。其拟合结果如图14所示，所得到拟合线性方程为ΔF＝-25.533×10-6×(ΔF/C)+174.09，R2＝0.9846；Kd值为2.55×10-5M。
(7)待测化合物IC-3对CypA荧光的影响
实验中，CypA浓度保持为6μM，
待测化合物IC-3对CypA的荧光淬灭实验结果见表7和图15。
表7：化合物IC-3对CypA的荧光淬灭实验结果(λex＝280nm，λem＝340nm)
  化合物浓度C(μM) 荧光测定值F DMSO对照荧光测定值F’ ΔF’ Fc(F+ΔF’) ΔFc ΔFc/C
    0248163264     159.4141.2127.810778.6244.716.31     153.8151.5150.2149.5148.2146.9146.6   02.33.64.35.66.97.2     159.4143.5131.4111.384.2251.623.51   015.92848.175.18107.8135.89 7.9576.01254.698753.368752.123281
从表7和图15所示的结果可以看出，待测化合物IC-3对CypA荧光值有良好的淬灭效果，随着待测化合物IC-3的浓度增大，CypA荧光值下降。其ΔFc值与ΔFc/C(×106)值呈良好的线性关系。其拟合结果如图16所示，所得到拟合线性方程为ΔF＝-21.065×10-6×(ΔF/C)+177.85，R2＝0.9938；Kd值为2.10×10-5M。

Claims (19)

1、具有下述通式I结构的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐：
其中X、Z各自独立地选自O、S或NH；
Y选自CO或SO2；
R1选自氢；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；C3-C7环烷基、环烯基或环炔基；芳香基Ar；含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子的5-7元杂芳基或取代杂芳基，其中杂芳基可与苯基或5-7元杂环芳基形成稠环芳基，取代杂芳基中的取代基任意选自下列基团中的一个或2-5个：卤素；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；氰基；硝基；氨基；羟基；羟甲基；三氟甲基；三氟甲氧基；羧基；C1-C4烷氧基；巯基；C1-C4酰基；芳香基Ar；
R2选自以下结构基团(II、III、IV或V)：
其中，n是0、1、2或3；
R3、R4各自独立地选自氢；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；硝基；卤素；氰基；三氟甲基；三氟甲氧基；
R5，R6各自独立地选自氢；甲基；乙基；环己基；芳香基Ar；含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子的5-7元杂芳基或取代杂芳基，其中杂芳基可与苯基或5-7元杂环芳基形成稠环芳基，取代杂芳基中的取代基任意选自下列基团中的一个或2-5个：卤素；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；氰基；硝基；氨基；羟基；羟甲基；三氟甲基；三氟甲氧基；羧基；C1-C4烷氧基；巯基；C1-C4酰基；芳香基Ar；
所述的芳香基Ar指苯基、萘基、联苯基或取代苯基，其中取代苯基中的取代基任意选自下列基团中1-4个：卤素；C1-C6直链或支链的烷基、链烯基或炔基；氰基；硝基；氨基；羟基；羟甲基；三氟甲基；三氟甲氧基；羧基；C1-C4烷氧基；巯基；C1-C4酰基。
2、根据权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X、Z是NH；Y是SO2或CO。
3、根据权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于其中X、Z是O；Y是CO或SO2。
4、根据权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X是NH；Z是O；Y是SO2或CO。
5、根据权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X是O；Z是NH；Y是SO2或CO。
6、根据权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X是S；Z是O或NH；Y是SO2或CO。
7、根据权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X，Z是NH；Y是SO2；
R2为具有如下结构式的基团：
Figure A2004100166180003C1
8、根据权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X，Z是NH；Y是SO2；
R2为具有如下结构式的基团：
9、根据权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于其中X，Z是NH；Y是SO2；
R2为具有如下结构式的基团：
10、权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物的制备方法，其特征在于由化合物经Z-酰化、脱保护基、X-酰化三步反应制得，其中R’是乙酰基或苄基。
11、权利要求7所述的1，4-二取代苯类化合物的制备方法，其特征在于对-乙酰氨基苯磺酰氯为原料，分别经磺酰化、脱保护基和N-酰化制得，具体包括以下步骤：
(1)磺胺类化合物VI的合成：
室温下取代胺在碱性溶液中与对-乙酰氨基苯磺酰氯反应，温度在40-45℃之间，搅拌12-36小时，将反应液倾入水中，有机溶剂提取水层，所用有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚、氯仿，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得4-乙酰氨基-N-R1基苯磺酰胺，将此磺酰胺投入到10％的氢氧化钠水溶液中回流2小时，控制反应液温度在70-80℃之间，浓盐酸调PH＝1，析出大量固体，经抽滤、水洗、干燥得产物VI；
(2)取代喹啉-4-羧酸VII的合成：
控制外温在80-100℃之间，取代的2，3-二酮吲哚与各种甲基酮和无机碱在溶剂中搅拌回流24-72小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于水中，用乙醚洗涤两次，水层在冰浴下，用浓盐酸调至PH＝1，析出大量固体，经抽滤、水洗、干燥、纯化得产物VII；
(3)4-(取代喹啉-4-酰基)-氨基磺胺类化合物的合成：
将溶于惰性溶剂的化合物VII与过量的含氯置换物反应，控制外温在80-120℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于惰性溶剂中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到化合物VI的吡啶溶液中，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时，将反应液倾入水中，有机溶剂提取水层，所用有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚、氯仿，得到的有机层经干燥、过滤、减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得目标物4-(取代喹啉-4-酰基)-氨基-N-取代苯磺酰胺。
12、权利要求8所述的1，4-二取代苯类化合物的制备方法，其特征在于以α-溴代甲基酮为原料，分别经缩合成环，扩环，卤化、N-酰化制得，具体包括以下步骤：
(1)磺胺类化合物VI的合成；；
(2)2-取代吡啶-4-羧酸VIII的合成：
控制外温在110-120℃之间，α-溴代甲基酮与甲酸铵和甲酸回流搅拌2-10小时，反应液倾入水中，用浓氢氧化钠水溶液调至pH＝10，乙醚提取，有机层水洗，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得4-取代噁唑，4-取代噁唑与马来酸混合，搅拌加热至110℃，反应15-30分钟，冷却至室温，所得到的固体用乙醚分散成粉末，抽滤，得到的固体悬浮于甲醇水溶液中，用盐酸酸化至PH＝1，减压蒸除溶剂，固体先用乙酸乙酯洗，然后重结晶纯化得化合物VIII；
(3)4-(取代吡啶-4-酰基)-氨基磺胺类化合物的合成：
将溶于惰性溶剂的化合物VIII与过量的含氯置换物反应，控制外温在80-120℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于惰性溶剂中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到化合物VI的吡啶溶液中，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时，将反应液倾入水中，有机溶剂提取水层，所用有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚、氯仿，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得目标物4-(取代吡啶-4-酰基)-氨基-N-取代苯磺酰胺。
13、权利要求9所述的1，4-二取代苯类化合物的制备方法，其特征在于以各种芳烷基羧酸为原料，分别经卤化，N-酰化制得，具体包括以下步骤：
(1)磺胺类化合物VI的合成；
(2)4-取代酰氨基磺胺类化合物的合成：
将溶于惰性溶剂的芳烷基羧酸与过量的含氯置换物反应，控制外温在80-120℃之间，回流搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于惰性溶剂中，得到的溶液在室温搅拌下，缓慢滴加到化合物VI的吡啶溶液中，滴加完毕后，控制反应液温度在40-45℃之间，搅拌24小时，将反应液倾入水中，有机溶剂提取水层，所用有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚、氯仿。得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得目标物4-芳烷基酰氨基-N-取代苯磺酰胺。
14、根据权利要求10或11或12或13所述的制备方法，其特征在于酰化反应所用的惰性溶剂包括二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、氯仿、匹氯化碳、四氢呋喃或1，4-二氧六环。
15、根据权利要求10或11或12或13所述的制备方法，其特征在于酰氯制备所用的含氯置换物包括二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷、草酰氯、三苯磷氯化物或氰尿酰氯。
16、根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所用的溶剂为吡啶、三乙胺、4-二甲胺基吡啶(DMAP)、二异丙基乙胺或无机碱的水溶液，其中所用无机碱包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾；步骤(2)中所用的溶剂为乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇。
17、根据权利要求10或11或12或13所述的制备方法，其特征在于各步所得产物可分别提纯，得到纯产物，其中提纯的方法包括柱层析或重结晶。
18、权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物或其药学上可接受的盐在作为免疫抑制剂的应用。
19、权利要求1所述的1，4-二取代苯类化合物及其药学上可接受的盐在用作防治移植排斥反应、由移植引起的宿主疾病和自身免疫疾病的药物中的应用。
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