EP2132214A1 - Dérivés de cyanine, conjugués fluorescents les contenant et leur utilisation - Google Patents

Dérivés de cyanine, conjugués fluorescents les contenant et leur utilisation

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Publication number
EP2132214A1
EP2132214A1 EP08775696A EP08775696A EP2132214A1 EP 2132214 A1 EP2132214 A1 EP 2132214A1 EP 08775696 A EP08775696 A EP 08775696A EP 08775696 A EP08775696 A EP 08775696A EP 2132214 A1 EP2132214 A1 EP 2132214A1
Authority
EP
European Patent Office
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unsubstituted
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Withdrawn
Application number
EP08775696A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Hervé Bazin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CIS Bio International SA
Original Assignee
CIS Bio International SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CIS Bio International SA filed Critical CIS Bio International SA
Publication of EP2132214A1 publication Critical patent/EP2132214A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to cyanine derivatives which absorb light and emit fluorescence in the red and near inf ra-red These cyanine derivatives are capable of crossing cell membranes and are functionalized such that they can be easily used as fluorescent markers
  • the invention also relates to fluorescent conjugates comprising a cyanine derivative of the invention, covalently linked to a coupling agent for labeling molecules in the cell.
  • the cyanine derivatives according to the invention are particularly suitable for labeling proteins in the cells.
  • the invention also relates to fluorescent conjugates comprising a cyanine derivative of the invention, covalently bound to a substance that it is desired to enter into the cell, said substance being rendered fluorescent by coupling with the cyanine derivative.
  • the invention also relates to the use of the cyanine derivatives of the invention for labeling products present in living cells.
  • the compounds according to the invention are particularly useful for labeling biomolecules present in the intracellular medium without modifying the integrity of the plasma membrane, in particular without using products intended to permeabilize this membrane.
  • the compounds according to the invention have indeed a lipophilic character, insofar as they do not have sulphate, sulphonate, phosphate, phosphonate or carboxylate groups conventionally used in the prior art to solve the problems of aggregation. These groups have been replaced by esters (preferably diester) of phosphonate or phosphate which do not affect the lipophilic character of these compounds and allow, after hydrolysis by intracellular enzymes, to prevent aggregation phenomena in the cell
  • the invention therefore also relates to the use of cyanine derivatives according to the invention comprising a coupling agent, as fluorescent markers.
  • the invention furthermore relates to a method for labeling a biomolecule present in an intact cell, which comprises introducing into the extracellular medium a derivative according to the invention comprising a coupling agent, said biomolecule comprising a coupling domain.
  • This method is very advantageous since it makes it possible to mark compounds inside the cells without permeabilizing their membrane.
  • Fluorescent dyes that absorb and emit light in the visible and near infra-red spectral region have been widely used for a variety of biochemical, biologic and diagnostic analysis applications, including their molar absorption and / or their high fluorescence quantum yield.
  • the cyanme derivatives absorb and emit in the near infra-red region of the electromagnetic spectrum that is particularly interesting for studying living cells because this range of wavelengths makes it possible to avoid bleaching due to the photochemical decomposition of the dyes used as fluorescent markers (this phenomenon increases as a function of the energy of the photons and is therefore not pronounced in the near infra-red).
  • the biological molecules do not exhibit autofluorescence in the near infra-red, which limits the problems of nonspecific background noise.
  • cyanines due to the presence of polycyclic groups and a hydrophobic polymethine chain, is not always compatible with good performance as a fluorescent marker.
  • cyanines tend to form aggregates in solution.
  • indocyanine green has its quantum efficiency drop following a quenching of fluorescence due to the formation of aggregates when used at concentrations greater than 125 ⁇ M.
  • This phenomenon quite general (it also exists in the case of fluorescein), is particularly pronounced in the cyanine series.
  • cyanines cross very poorly, if at all, biological membranes, especially because of their high molecular weight (of the order of 700-800 daltons), while smaller molecules such as fluorescein (337 daltons) do not have this disadvantage.
  • cyanine dyes the methine residue of which is substituted, which are suitable for labeling nucleic acids and which consist of cyanine derivatives substituted in particular by sulphoalkyl or carboxyalkyl chains.
  • the international application WO 2004/039894 A2 relates to functionalized cyanine dyes and their derivatives useful as intermediates in the preparation of cyanine dyes, as well as to processes for the preparation of these dyes and to the dyes thus obtained. Cyanine derivatives all have sulfonate functions
  • the international application WO 03/082988 A1 relates to water-soluble fluorochromes of near infrared, useful for example for biomedical imaging
  • the international application WO 02/068537 A2 relates to fluorescent dyes, especially fluorescent and water-soluble cyanine dyes which contain additional sites for binding to biomolecules.
  • the solubility in water is ensured by the presence of sulphonate groups.
  • International application WO 00/66664 A1 relates to asymmetric cyanine dyes containing an aza-benzolium cyclic moiety, especially cyanine dyes substituted with a cationic side chain, monomeric and dimeric cyanine dyes, chemically reactive cyanine dyes, and conjugates of cyanine dyes.
  • chromon 546 and chromon 642 two compounds derived from cyanines, in which one of the nitrogen atoms is substituted by a phosphonate ethyl ester carried by a dimethylene arm, and the other by an N-hydroxysuccinimide reaction group carried by a polymethylene arm. It will be noted that the phosphonate group does not allow these compounds, in principle, to cross the biological membranes.
  • US Patent Application 2006/0199955 discloses cyanines having a zwitterionic phosphonate group, intended to increase the cyanine polarity and therefore its solubility; the compounds described also carry a sulphonate group and therefore can not cross the cell membranes of intact cells.
  • Fluorescent dyes in the near infra-red and possessing a carbocyanine structure as well as charged functions, such as those described above (sulphate, sulphonate, carboxyl, phosphate or phosphonate), are reported to have a low membrane permeability because of their high molecular weight (compared for example with that of rhodamine 334 Da) and the presence of multiple charges. It has also been observed that with the increase in the number of charges the fluorescent dyes remain in the extracellular compartments. [Frangioni JV, Curr Opin Chem Biol. 2003, 7 (5): 626-34. In vivo near-infrared fluorescence imaging].
  • the cyanmes according to the invention have the particularity of comprising
  • the compounds according to the invention are capable of crossing cell membranes, insofar as they contain the hydrophobic groups specific to cyanmes (polycycles, polylmethine chains), and do not comprise polar groups such as those proposed in the prior art for to overcome the problem of aggregation and solubility: the compounds according to the invention do not contain sulfates, sulfonates, phosphates, phosphonates or carboxylates groups.
  • cyanine derivatives according to the invention comprise at least one ester (preferably diester) phosphate or phosphonate • these groups have the particularity to undergo hydrolysis in the cytoplasm of the cell, catalyzed by cellular enzymes, in particular phosphodiesterases, despite the presence of the cyanine structure, the size of which could have hindered enzymatic processes.
  • the cyanme derivatives according to the invention are functionalized, which enables the person skilled in the art to couple them to any group or molecule that he wishes to label.
  • the products according to the invention may also comprise a coupling agent which will enable them to label biomolecules comprising a suitable coupling domain.
  • the fluorescent compounds according to the invention are derivatives of cyanmes of formula (I):
  • R ⁇ , R3, R4 represent independently of one another:
  • R 5 and R 6 represent independently of one another:
  • X is selected from: O, S, CR 7 R 8 ;
  • Y is selected from: O, S, CR 9 R 10 ;
  • R 7 , R 8 , R 8 , R 10 independently represent:
  • R 7 and R 8 and / or R 9 and R 10 may also together form a 5- or 6-membered ring or a 4 to 5-membered carbon atom and an oxygen atom
  • B represents a poiymethine bridge having 1 to 5 methine, wherein the methine groups are individually unsubstituted or substituted by a group selected from:
  • a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 alkyl group a substituted or unsubstituted aryl, arylalkyl or aryloxy group;
  • L 1 -W, L 2 -M, L 2 -A, L 2 -G; or two adjacent methine substituents may together form a saturated or unsaturated hydrocarbon ring with 4, 5 or 6 atoms, optionally substituted one or more times with a group chosen from:
  • a nitro group a group chosen from: L 1 -W, L 2 -M, L 2 -A, L 2 -G;
  • L1, L2 are connecting arms; G is a reaction group; A is a coupling agent; M is a conjugated molecule; W is an ester (preferably diester) of phosphate or phosphonate as defined below: with the proviso that the cyanine derivative has one or two L1-W groups and one or two groups selected from: L2-A, L2-L G and L2-M.
  • the cyanine derivatives of formula (I) of the invention comprise a "Z" counterion (not shown) which counterbalances the positive or negative charges or charges of the cyanine derivative.
  • the nature of the counter-ion is not essential according to the invention; it depends on the synthetic process used or the medium in which the cyanine derivative is found.
  • Z will be:
  • the counter-ion Z is chosen from I, Cl. Br, CF 3 COO, HCOO, Na + .
  • alkyl groups methyl, ethyl, isopropyl, n-propyl, butyl, tert-butyl, n-hexyl, n-decyl, n-dodecyl, cyclohexyl, octyl.
  • C 1 -C 6 alkoxy group linear or branched hydrocarbon chain containing from 1 to 6 carbon atoms, bonded to an oxygen atom.
  • alkoxy groups are methoxy, ethoxy, propoxy, tert-butoxy and n-butoxy.
  • C 1 -C 6 alkoxycarbonyl group • linear or branched hydrocarbon chain containing from 1 to 6 carbon atoms, linked to the oxygen of a carboxyl group -OC 1 C-.
  • C 1 -C 6 alkyl carboxyl group linear or branched hydrocarbon chain containing from 1 to 6 carbon atoms, bonded to the carbon of a carboxyl group -COO-
  • C 2 -C 12 dialkylamino group nitrogen containing two identical or different alkyl groups, linear or branched, each consisting of 2 to 12 carbon atoms.
  • C 5 -C 14 aryl group aromatic ring with 5 or 6 carbon atoms, or aromatic bicycle with 8 to 10 atoms, or a aromatic ring with 10-14 atoms.
  • the aryl group may be optionally substituted by one or more substituents selected from the group - C 1 -C 15 alkyl, chloro, fluoro, bromo, nitro, C 1 -C 6 alkoxy, amino d ⁇ - (C 1 -C 15 ) -alkyl , C 1 -C 6 alkoxycarbonyl
  • heteroaryl group whose aryl ring (s) comprise from 5 to 10 carbon atoms, at least one of which is replaced by a heteroatom selected from • N, O, S
  • a heteroaryl group may be optionally substituted by one or more substituents selected from C 1 -C 15 alkyl groups chloro, fluoro, bromo, nitro, C 1 -C 6 alkoxy d ⁇ - amino (C 1 -C 1s) -alkyl, C 1 -C 6 alkoxycarbonyl Examples of heteroaryl groups - pyrrolyl, py ⁇ dyl, thienyl, furanyl, oxazolyl, isoazolyl, oxadiazolyl, imidazolyl, benzoxazolyl, benzimidazolyl, quinolyl, benzofuranyl, indolyl, carbazolyl, couman and benzocouma ⁇ ne
  • C 6 -C 25 arylalkyl group C 5 -C 10 aryl group linked to a C 1 -C 5 alkyl group
  • link arm can be a single covalent bond or a spacer arm including from 1 to 20 atoms other than hydrogen, selected from carbon atoms, nitrogen, phosphorus, oxygen and sulfur, the linking group being linear or branched, cyclic or heterocyclic, saturated or unsaturated, and consisting of a combination of bonds selected from: carbon-carbon bonds which may be single, double, triple or aromatic; carbon-nitrogen bonds; nitrogen-nitrogen bonds; carbon-oxygen bonds; carbon-sulfur bonds; phosphorus-oxygen bonds; phosphorus-nitrogen bonds; ether bonds; ester bonds; thioether bonds; the amino bonds; amide bonds; carboxamide bonds; sulfonamide linkages; urea bonds; urethane bonds; hydrazine bonds; carbamoyl bonds.
  • Intact cell refers to a cell whose membrane integrity and intracellular integrity are conserved, for example a cell that has not been chemically treated to permeabilize its membrane.
  • the cyanine derivatives which are preferred according to the invention are the compounds corresponding to the following formulas, in which the groups R 1 -R 6 , B 1 X and Y are as defined above.
  • the compounds of the invention comprise a polymethine bridge between the cyclic structures.
  • these methines may be substituted, or adjacent methines may together form a 4-, 5- or 6-membered optionally substituted saturated or unsaturated hydrocarbon ring.
  • Preferred compounds of the invention include unsubstituted methines, or only central methine is substituted, or two central methines form a ring.
  • the bridge may consist of the following polymethine chains:
  • R 15 , R 16 are chosen from:
  • L2 are link arms
  • G is a reaction group
  • A is a coupling agent
  • M is a conjugated molecule
  • W is an ester (preferably diester) of phosphate or phosphonate
  • the polymethme bridge corresponds to one of the formulas below
  • esters (preferably diester) of phosphate or phosphonate carried by an arm, present on the cyanine derivatives according to the invention, offer several technical advantages: they do not increase the polarity of the compounds and therefore promote their passage through the lipid biological membranes; on the other hand, once inside the cell, the esters (preferably diesters) of phosphate or phosphonates are hydrolyzed by the cellular enzymes to give phosphate groups or phosphonates. These phosphate or phosphonate groups contribute to the effectiveness of the cyanines according to the invention for labeling in particular proteins, since they make it possible to remedy the aggregation phenomena generally observed when cyanines are used in this application.
  • R 11 and R 12 are identical or different and are chosen from:
  • R 13 , Ru are identical or different and are chosen from:
  • Alk is an unsubstituted or linear C 1 -C 4 alkyl or branched alkyl
  • R 11 and R 12 and / or R 13 and R 14 can also together form a phthalidyl group of formula •
  • the cyanine derivatives which are particularly preferred according to the invention, are those in which the phosphate / phosphonate esters are grafted onto the indole aromatic ring of cyanine.
  • Rn and R 12 are identical and are chosen from:
  • R 13 and R 14 are identical and are chosen from the following groups:
  • cyanine derivatives comprising the following phosphonate esters are more easily hydrolyzed by cellular enzymes than simple alkyl esters:
  • Acetoxymethyl ester the methyl group being optionally substituted with an H or C 1 -C 5 alkyl group:
  • X is CR 7 R 8 and / or Y is CR 9 Ri 0 , one or two R 1 -R 4 groups are L 1 -W; and one or two R 7 -Ri 0 groups represent L 2 -A, L 2 -G or L 2 -M;
  • X is CR 7 R 8 and / or Y is CR 9 R 10 ;
  • R 5 and / or R 6 represent a group L 1 -W; and one or two R 7 -R 10 groups represent a group L 2 -A, L 2 -G or L 2 -M;
  • R 5 and / or R 6 represent a group L 1 -W;
  • R 5 or R 16 of the polymethine bridge B represents a group L 2 -A, L 2 -G or L 2 -M.
  • R 5 or R 16 of the bridge polyméthme B represents an L2-A, L2-G or L2-M
  • a family of particularly preferred compounds of the invention is that consisting of compounds of formula:
  • R 1 , R 3 are hydrogen atoms
  • R 7 , R 8 , Rg independently represent a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 alkyl group
  • R 5 , R 6 represent, independently of each other, a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 alkyl group
  • B represents a polymethine bridge having 1 to 5 unsubstituted methines
  • R 10 represents a group selected from L 2 -M, L 2 -A, L 2 G
  • L2 is a linker
  • - G is a reaction group
  • A is a coupling agent
  • M is a conjugated molecule
  • R 2 , R 4 are identical and represent a group L1-W,
  • L1 is a linking arm selected from: a single bond, a group of formula
  • W is a phosphonate diester selected from the following groups of formulas:
  • R 11 and R 12 are identical or different and are chosen from:
  • R 13 , R 14 are identical or different and are chosen from
  • Alk is an unsubstituted or linear C 1 -C 4 linear or branched alkyl
  • R 11 and R 12 and / or R 13 and R 14 may also together form a phthalidyl group of formula:
  • Another family of particularly preferred compounds of the invention is that consisting of the compounds of formula:
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 are hydrogen atoms
  • R 7 , R 8 , R 9 independently represent a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 alkyl group
  • B represents a polymethine bridge having 1 to 5 unsubstituted methines
  • R 10 represents a group selected from L 2 -M, L 2 -A, L 2 G; L2 is a linker; G is a reaction group; A is a coupling agent; M is a conjugated molecule;
  • R 5 , R 6 are identical and represent a group L1-W,
  • L1 is a linker selected from. a simple bond, a group of formula -
  • W is a phosphonate diester of formula chosen from compounds of the following formulas
  • R 11 and R 12 are identical or different and are selected from: - a hydrogen atom;
  • Ru are identical or different and are selected from:
  • R 11 and R 12 and / or R 13 and R 14 may also together form a phthalidyl group of formula:
  • the cyanine derivatives according to the invention may comprise a coupling agent carried by a linker.
  • this coupling agent is capable of crossing the cell membrane
  • This coupling agent has the function of allowing the covalent or non-covalent coupling of the cyanme with a target molecule, for example present in a cell.
  • the target molecule must have the appropriate coupling domain
  • the coupling agent is itself able to cross the plasma membrane
  • the coupling agent A can thus be an antibody, an antibody fragment or a peptide aptamer specific to the target molecule
  • These antibodies, antibody fragments or aptarnomme can recognize a naturally occurring domain in the target molecule, or a Domain introduced into this molecule by the techniques well known to those skilled in the art, in particular molecular biology techniques allowing the introduction into a biomolecule of a protein label.
  • the agent and the coupling domain may be members of a pair of binding partners, the two members being capable of binding non-covalently, for example the following pairs:
  • avidin or streptavidene
  • beetle this pair can be used to label a protein of interest expressed by the cell as a fusion protein with the binding domain of avidin or streptavidin.
  • the cyanine derivatives according to the invention are conjugated to biotin as coupling agent.
  • the avidin / beetle (strept) pair is known to a person skilled in the art who will have no trouble coupling the cyanine derivatives according to the invention with biotin.
  • bi-arsenic compounds / tetracysteine motif This couple of binding partners was originally described by Adams et al., ("New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protem labeling in vitro and in vivo synthesis and biological applications", J Am Chem, Soc., 2002 May 29; (21): 6063-76).
  • a cyanine derivative according to the invention, conjugated to a bi-arsenic unit makes it possible to label a protein of interest expressed by the cell in the form of a fusion protein with a tetracysteine domain capable of binding with the biarsenic motif.
  • Methodhotrexate (or tremethop ⁇ me) / hydrofolate reductase (DHFR) The high affinity binding between DHFR and compounds such as methotrexate or t ⁇ méthop ⁇ me is described in particular by Miller et al. ("Methotrexate conjugates with molecular in vivo protem tag", Angew Chem Int Edn Engl, 43, 1672-1675 (2004)) Cyanine derivatives according to the invention, conjugated to methotrexate or tetrmethopme as a coupling agent, will be able to label a protein of interest expressed by the cell as a fusion protein with DHFR,
  • Cyanine derivatives according to the invention conjugated to SLF 'as a coupling agent, will be capable of labeling a protein of interest expressed by the cell in the form of fusion protein with FKBP (F36V).
  • the coupling agent A of cyanine derivatives according to the invention may also be an agent allowing coupling by covalent bonding with a coupling domain present on the molecule of interest which it is desired to label.
  • the coupling agent may be the substrate of an enzyme called "suicide" present in the cell.
  • the coupling domain is therefore a suicide enzyme and is expressed by the cell in the form of a fusion protein consisting of the suicide enzyme and the protein of interest that it is desired to label.
  • Suicide enzymes are proteins that have enzymatic activity modified by specific mutations that give them an ability to bind a substrate quickly and covalently. These enzymes are called suicides because each can bind only one fluorescent molecule, the activity of the enzyme being blocked by the attachment of the substrate.
  • Suicide enzymes have recently been used in protein labeling methods: these methods involve making a fusion protein comprising a protein to be labeled and a suicide enzyme, and contacting this fusion protein with, for example, for example, a marker fluorophore covalently bound to the substrate of said suicide enzyme.
  • the mutant of an alkylguanine-DNA alkyltransferase (or "SnapTag” sold by the company Covalys, described in the application WO 02/083937 A2), the substrate of which is benzylguanine or a benzylguanine derivative.
  • benzylguanine derivative is meant a modified benzylguanine but which is nevertheless recognized by the suicide enzyme.
  • substrates are described in applications WO 2005/085470 and WO 2004/031405;
  • HaloTag haloalkane dehalogenase
  • suicide type enzymatic reaction technique described in WO 2004/072232 A2
  • substrate of which is a haloalkane, preferably a chloroalkane.
  • Substrates are described in US Pat. WO 2004/072232 and WO 2006/093529
  • said cyanine will comprise the coupling agent which will be a benzylguanine group (or one of its derivatives), or a haloalkane (from preferably a chloroalkane) bound to the cyanine via a linker
  • the coupling agent A of cyanine derivatives according to the invention may be a member of a pair of non-covalent binding partners or a member of a pair of covalent link partners.
  • A may be chosen from the following compounds: an antibody, an antibody fragment, a peptide aptamer, biotin, a bi-arsenic compound, tetrametine, methotrexate, SLF ', a benzylguanine group, a chloroalkane
  • the cyanine derivatives according to the invention may contain a reaction group G, which is a group capable of reacting with a functional group present on another substance or molecule, to form a covalent bond.
  • the reaction group G will react with a functional group present on the substance or the molecule that it is desired to conjugate with the cyanine derivative according to the invention
  • the reaction group is an electrophilic or nucleophilic group that can form a covalent bond when brought into contact with a suitable nucleophilic or electrophilic group, respectively.
  • the conjugation reaction between the cyanine derivative having a reaction group and a molecule to conjugate M carrying a functional group results in the formation of a covalent bond having one or more atoms of the reaction group.
  • the pairs of electrophilic / nucleophilic groups and the type of covalent bond formed when they are brought together are listed below.
  • activated ester groups of the formula COY, wherein Y is
  • a leaving group chosen from succinimidyloxy (-C 4 H 4 O 2 ) and sulpho succinimidyloxy groups (-OC 4 H 3 Oz-SO 3 H);
  • An aryloxy group which may or may not be substituted by at least one electrophilic substituent such as the nitro, fluoro, chloro, cyano or trifluoromethyl groups, thereby forming an activated aryl ester;
  • a carboxylic acid activated with a carbodermide group forming an anhydride -OCOR 3 or -OCNR a NHR b , in which R 3 and R b are identical or different and are chosen from C 1 -C 6 alkyl groups, perfluoroalkyl groups; C 1 -C 6 alkoxy, C 1 -C 6 alkyl, cyclohexyl;
  • the substance or molecule to be conjugated M comprises at least one of the following functional groups, with which the reaction group G will react: amines, amides, thiols, aldehydes, ketones, hydrazines, hydroxylamines, secondary amines, halides epoxides, carboxylate esters, carboxylic acids, groups having double bonds, or a combination of these functional groups.
  • the functional group borne by the molecule M which will react with the reaction group G will be, for example, an amino, thiol, alcohol, aldehyde or ketone group.
  • the reaction group G will react with an amine or thiol functional group.
  • the reaction group G is a group derived from one of the following compounds : an acrylamide, an activated amine (for example a cadaverine or an ethylenediamine), an activated ester, an aldehyde, an alkyl halide, a anhydride, aniline, azide, azindine, carboxylic acid, diazoalkane, haloacetamide, halotnazine, such as monochlorotnazine, dichlorotnazine, hydrazine (including hydrazides), imido ester, isocyanate, isothiocyanate , a maleimide, a sulfonyl halide, or a thiol, a ketone, an amine, an acid halide, a hydroxysuccimmidyl ester, a hydroxysulfosuccinimidyl ester, an azidonitrophenyl, an azidophenyl,
  • the reaction group G is a carboxylic acid, a succinimidyl carboxylic acid ester, a haloacetamide, a hydrazin ⁇ , an isothiocyanate, a maleimide group or an aliphatic amine.
  • cyanine derivatives according to the invention are particularly advantageous for the fluorescent labeling of compounds found in the cell, they can be coupled to any type of molecule by conventional conjugation techniques, and the use of reaction groups such as described below.
  • the conjugated molecule M can be, for example, a biomolecule.
  • biomolecule means a molecule present in a living organism, and in particular the molecules constituting the structure of an organism, those involved in the production and transformation of energy or in the transmission of biological signals. This definition includes nucleic acids, proteins, sugars, lipids, peptides, oligonucleotides, metabolic intermediates, enzymes, hormones and neurotransmitters.
  • the cyanine derivatives according to the invention comprise a reaction group G, a coupling agent A, a conjugated molecule M or else an ester (preferably diester) of phosphate or phosphonate W. Each of these groups is linked to cyanine via a connecting arm.
  • these groups may be carried by identical or different arms.
  • the linking arm L carrying the groups G, M, A or W can be a single covalent bond or a spacer arm comprising from 1 to 20 different atoms of hydrogen, chosen from carbon atoms, nitrogen, phosphorus, oxygen and sulfur, this linking arm being linear or branched, cyclic or heterocyclic, saturated or unsaturated, and consisting of a combination of bonds selected from: carbon-carbon bonds which may be single, double, triple or aromatic; carbon-nitrogen bonds; nitrogen-nitrogen bonds; carbon-oxygen bonds; carbon-sulfur bonds; phosphorus-oxygen bonds; phosphorus-nitrogen bonds; ether bonds; ester bonds; thioether bonds; amine bonds, amide bonds; carboxamide bonds; sulfonamide bonds; urea bonds; urehane bonds; hydrazine bonds, carbamoyl bonds
  • the linking arm L comprises from 1 to 20 different atoms of hydrogen and chosen from C, N, O, P and S and may comprise combinations of ether, thioether, carbox
  • L consists of a combination of carbon-carbon single bonds and carboxamide or thioether bonds.
  • L may be chosen from the following chains: polymethylene, arylene, alkylarylene, arylenealkyl, or arylthio.
  • the linking arm L is constituted by a divalent organic radical chosen from linear or branched C 1 -C 20 alkylene groups optionally containing one or more double or triple bonds and / or optionally containing one or more several heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s); cycloalkylene groups and C 5 -C 8 arylene groups, C 6 - Ci 4, said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted by alkyl, aryl or sulfonate groups.
  • a divalent organic radical chosen from linear or branched C 1 -C 20 alkylene groups optionally containing one or more double or triple bonds and / or optionally containing one or more several heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s); cycloalkylene groups and C 5 -C 8 arylene groups, C 6
  • linking group L is chosen from the groups:
  • n and m are integers from 2 to 16, preferably from 2 to 8;
  • p and r are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5.
  • the linking groups 1) to 9) are particularly suitable when the reaction group is a carbamoyl group and the functional group on the substance or molecule M is an amide, thioether group.
  • the linking groups 2), 6), 7), and 10) to 12) are particularly suitable when the reaction group is an ether group and the functional group on the substance or molecule M is an amide or thioether group
  • Cyanine synthesis is generally based on the use of 3 starting reagents. the polycyclic groups and the methine chain These 3 reagents are modified before or after their condensation to bring them the desired substituents
  • DIPEA Dnsopropylethylamine TSTU: N, N, N ', N "-Tetramethylsuccinediouronium tetrafluoroborate
  • TBTU 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate
  • DY647 Fluorophore marketed by the company Dyomics, soluble in water, methanol,
  • DMEM acronym for the culture medium known as the Anglosaxon "dulbecco modified essential medium"
  • DAPI 4 ', 6-d ⁇ -2-phenylindole dye nuclei
  • the desired product is eluted by an acetonitrile / water gradient ranging from 1: 2 to 3: 2 (each solvent containing 2% by volume of 3M HCl).
  • the solution containing the desired product is neutralized with sodium bicarbonate, the mixture is concentrated and then deposited on a short RP-18 silica column. After removing the inorganic salts by washing with water the product in the form of sodium salt is eluted with methanol.
  • a primary amine group is introduced.
  • the cyanine in the bis-diethylphosphono ester form obtained in Example 4 (1.5 mg, 1.79 ⁇ mol) is dissolved in 70 ⁇ l of anhydrous DMF and 1.25 ⁇ l of DIPEA and 0.55 mg of DIPEA are added.
  • Example 11 Cell Permeability Test of Conjugates of Benzylguanine with DY647, CY5 and Cyanine 1 in the Form of Bis-Diethylphosphono Ester
  • the cells used come from a stable CHO line expressing SnapTag at the nuclear level using the NLS sequence.
  • the compounds are added to the culture medium (DMEM medium supplemented with 10% inactivated FCS 30 min at 60 ° C.) at a concentration of 5 ⁇ M and left in contact for one hour with the cells. After the incubation, three washes are carried out with culture medium. An additional hour of incubation only in medium is made to allow the SnapTag to be labeled by the substrate. Staining of the nucleus is then performed with the DAPI before the microscopic analysis.
  • N-BOC derivative (21) (3 mg, 4.7 ⁇ mol) is taken up in anhydrous DMF (550 ⁇ l), anhydrous tetramethylamine (distilled over calcium hydride, 14 ⁇ l, 100 ⁇ mol) is added to the methyl bromoacetate.
  • Method B The monoglycolic phosphono ester derivative (22) in DMF is treated with BOP in the presence of methanol to give the product 23
  • MS (ES +) m / z 985.6 (100%) calculated for C 49 H 71 N 4 OIqP 2.
  • Cyanine di- (methyl and aminoglycolic phosphonodiester) functionalized amine (24): Cyanine d ⁇ - (methyl and methylglycolic phosphonodester) 23 is treated with trifluoroacetic acid in dichloromethane (30 min at 20 ° C.); after evaporation of the solvent, the product is purified by RP-HPLC. The aminated functionalized cyanine tetraester 24 is thus obtained.
  • the cyanine 24 thus obtained is taken up by DMF containing DIPEA and treated with the NHS ester [obtained by reacting an excess of DSS (di-succimidyl suberate) with O 6 - [4- (amino) methyl) -benzyl] guanine (Keppler, S. et al. (2003) Nature Biotechnology 21 (1): 86-89) in DMF, the product is purified by RP-HPLC under conditions similar to those used for purification of cyanines in the preceding examples].
  • the desired compound 26 bearing two mixed phosphono methyl and methylglycolic functions and functionalized with a benzylguanine group is obtained after purification by RP-HPLC (Vydac 218TP510 column, A: H 2 O containing 0.1% TFA B • acetonitrile. ml / min linear gradient from 5% ACN to 100% acetonitrile in 40 min). Yield 46%.
  • MS (ES +) m / z 1293.8 (MH) + calculated for
  • the monoglyecolic phosphono ester derivative (22) in DMF is treated with BOP in the presence of methyl glycolate to give the product.
  • MS (ES +) m / z 1102 Calc'd for C 53 H 75 N 4 O 17 P 2 .
  • the derivative 27 is treated for 15 min in pure trifluoroacetic acid to remove the BOC protecting group, and then, after evaporation in vacuo and coevaporation with toluene, the resulting product 28 is obtained is taken up in DMF containing DIPEA and treated with the ester of NHS obtained by reacting an excess of DSS (di-succinimidyl suberate) on O 6 - [4- (aminomethyl) -benzyl] guanine in DMF (the product is purified by RP-HPLC in similar conditions to those used for the purification of cyanines in the preceding examples)
  • the product 29 is obtained after evaporation of the fractions from the HPLC purification and coevaporation with toluene, it is then taken up in DMSO and stored at -2O 0 C. Yield 70%.
  • MS (ES +) m / z 1409.6 (MH) + calcd for C 69 H 10 O 18 N 9I P 2.
  • the phosphate / phosphonate ester functions of the cyanine derivatives according to the invention are hydrolysed in the cell by the cellular enzymes in phosphate / phosphonate function;
  • the quantum yields of cyanine derivatives bearing phosphonate groups, corresponding to the compounds according to the invention as they are present in the cell, after hydrolysis of the ester functions, were measured in order to determine whether the position of the ester groups of phosphate / phosphonate has an influence on the photophysical properties of the compounds.
  • the monoglycol phosphono ester derivative (22), described in Example 14, is treated for 15 min in pure trifluoroacetic acid to remove the BOC protecting group and then, after evaporation under vacuum and coevaporation with toluene, the product thus obtained is taken up with DMF containing DIPEA and treated with the NHS ester prepared as described in Example 16.
  • the desired compound 3J is taken up with DMF containing DIPEA and treated with the NHS ester prepared as described in Example 16.
  • This example aims to show that the compounds according to the invention comprising a phosphonate ester and conjugated to a substrate (Benzylguanine, BG) of a suicide enzyme "snaptag" (ST26) are able to cross the cell membrane, and to mark a fusion protein expressed by the cell and comprising the snaptag enzyme (ST12), as opposed to the use of cyanine lacking phosphonate esters (DY-647)
  • the HTRF technique is used to test the intracellular labeling of a protein by the cyanine derivatives according to the invention, on living cells, by using the recombinant GST-ST26-Flag protein produced by the cells and indirectly labeled via an anti-human antibody.
  • -GST conjugated with europium t ⁇ s-Bipy ⁇ dine cryptate (anti-GST-EuTBP) is used to test the intracellular labeling of a protein by the cyanine derivatives according to the invention, on living cells, by using the recombinant GST-ST26-Flag protein produced by the cells and indirectly labeled via an anti-human antibody.
  • -GST conjugated with europium t ⁇ s-Bipy ⁇ dine cryptate anti-GST-EuTBP
  • CHO-K1 cells are transfected in the presence of lipofectamine 2000 (0.8 .mu.l for 50 .mu.l of transfection solution, Lipofectamine TM Transfection Reagent
  • the plasmid used for the transfection is a pSEM-GST-ST26-Flag plasmid (80 ng / well) obtained by introducing the GST and Flag sequences into the plasmid pSEMS-SNAP26m-Gateway following the protocol of the Covalys commercial kit (Mammalian Expression
  • the cells are incubated with BG-DY647 or compound 29 (prepared according to Example 16) added in the form of a solution in DMSO in 50 ⁇ l of culture medium and so as to have a final substrate concentration of 5%. ⁇ fvl The cells are incubated for 3 h at 20 ° C. and then washed with the aid of a culture medium.
  • the substrate On a part of the wells used to determine the "100% labeling", the substrate is added at a final 10 nM (BG-DY647 or 29 upstream of the well) in a lysis buffer (cAMP kit, Cisbio) also containing a anti-GST antibody coupled to europium cryptate (EuTBP), anti-GST-EuTBP (1 nM final, GST tag check kit ref 62GSTPEB, Cis beep).
  • a lysis buffer cAMP kit, Cisbio
  • EuTBP europium cryptate
  • GST tag check kit ref 62GSTPEB Cis beep
  • Wells containing cells transfected with an "empty" plasmid, that is to say not coding for the sequence of interest, to form control wells are also prepared.
  • the fluorescence at 665 nm is measured on a HTRF reader (RUBYstar, BMG Labtechnologies)
  • the percentage of intracellular labeling, obtained by dividing the 665 nm signal obtained by passive marking by the 665 nm signal obtained in total labeling, is represented in FIG. 2.
  • This example therefore confirms that the compound 29 crosses the cell membrane and that it allows the labeling of an intracellular protein, which is not the case for the compound BG-DY-647 not carrying phosphate or phosphonate esters. .

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Abstract

L'invention a pour objet des dérivés de cyanines de formule (I): dans laquelle les lignes en pointillés représentent les atomes nécessaires à la formation d'un ou deux cycles aromatiques fusionnés, chaque cycle comportant 5 ou 6 atomes de carbone; R1, R2, R3, R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H; alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué; alkoxy en C1-C6; C2-C12 dialkylamino; C1-C6 alkoxycarbonyle; C2-C12 dialkylamido; un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué; un atome d'halogène; un nitro; un groupe L1 -W, L2-M, L2-A ou L2-G; R5, R6 représentent indépendamment l'un de l'autre : alkyle en C1-C15 substitué ou non- substitué; un groupe aryle ou arylalkyle substitué ou non-substitué; un groupe L1 -W, L2-M, L2- A ou L2-G; X est choisi parmi : O, S, CR7R8; Y est choisi parmi : O, S, CR9R10; R7, R8, R9, R10 représentent indépendamment : alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué; aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué; un groupe L1 -W, L2-M, L2-A ou L2-G; R7 et R8 et/ou R9 et R10 peuvent également former ensemble un cycle à 5 ou 6 atomes ou un hétérocycle comprenant 4 à 5 atomes de carbone et un atome d'oxygène; B représente un pont polyméthine comportant 1 à 5 groupes méthine, lesdits groupes étant notamment individuellement non-substitués ou substitués par un alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué; un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué; un nitro; un groupe L1 -W, L2-M, L2-A ou L2-G, L1, L2 sont des bras de liaison; G est un groupe réactionnel; A est un agent de couplage; M est une molécule conjuguée, W est un ester (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate, sous réserve que le dérivé de cyanine comporte au moins un groupe L1 -W et au moins un groupe L2-A, L2-G ou L2-M. Application • composés fluorescents pour le marquage de biornolécules dans les cellules.

Description

Dérivés de cyanine, conjugués fluorescents les contenant et leur utilisation
Domaine de l'invention
La présente invention a pour objet des dérivés de cyanine qui absorbent la lumière et émettent de la fluorescence dans le rouge et le proche inf ra-rouge Ces dérivés de cyanine sont capables de traverser les membranes cellulaires et sont fonctionnalisés de telle sorte qu'ils puissent être aisément utilisés comme marqueurs fluorescents
L'invention concerne également des conjugués fluorescents comprenant un dérivé de cyanine de l'invention, lié de manière covalente à un agent de couplage permettant le marquage de molécules dans la cellule. Les dérivés de cyanine selon l'invention sont particulièrement adaptés au marquage de protéines dans les cellules.
Enfin l'invention concerne également des conjugués fluorescents comprenant un dérivé de cyanine de l'invention, lié de manière covalente à une substance que l'on souhaite faire rentrer dans la cellule, ladite substance étant rendue fluorescente par le couplage avec le dérivé de cyanine.
L'invention a également pour objet l'utilisation des dérivés de cyanine de l'invention pour marquer des produits présents dans les cellules vivantes.
Les composés selon l'invention sont particulièrement utiles pour marquer des biomolécules se trouvant dans le milieu intracellulaire sans modifier l'intégrité de la membrane plasmique, en particulier sans utiliser de produits destinés à perméabiliser cette membrane.
Les composés selon l'invention ont en effet un caractère lipophile, dans la mesure où ils ne possèdent pas de groupes sulfates, sulfonates, phosphates, phosphonates ou carboxylates classiquement utilisés dans l'art antérieur pour résoudre les problèmes d'agrégation. Ces groupes ont été remplacés par des esters (de préférence diester) de phosphonate ou phosphate qui n'affectent pas le caractère lipophile de ces composés et permettent, après hydrolyse par les enzymes intracellulaires, de prévenir les phénomènes d'agrégation dans la cellule
L'invention concerne donc également l'utilisation de dérivés de cyanine selon l'invention comportant un agent de couplage, en tant que marqueurs fluorescents
L'invention concerne en outre une méthode de marquage d'une biomolécule présente dans une cellule intacte, qui consiste a introduire dans le milieu extracellulaire un dérivé selon l'invention comportant un agent de couplage, ladite biomolécule comportant un domaine de couplage Cette méthode est très avantageuse puisqu'elle permet de marquer des composés à l'intérieur des cellules sans perméabiliser leur membrane
Domaine technique
Les colorants fluorescents qui absorbent et émettent de la lumière dans la région spectrale du visible et du proche infra-rouge ont été couramment utilisés pour diverses applications d'analyse dans le domaine de la biochimie, de la biologie et du diagnostic, notamment en raison de leur absorption molaire et/ou de leur rendement quantique de fluorescence élevé.
En particulier, seuls les dérivés de cyanme absorbent et émettent dans le proche infra-rouge, région du spectre électromagnétique particulièrement intéressante pour étudier les cellules vivantes car cette gamme de longueurs d'onde permet d'éviter le blanchiment («bleaching») dû à la décomposition photochimique des colorants utilisés comme marqueurs fluorescents (ce phénomène augmente en fonction de l'énergie des photons et est donc peu prononcé dans le proche infra-rouge). De plus, les molécules biologiques ne présentent pas d'autofluorescence dans le proche infra-rouge, ce qui limite les problèmes de bruit de fond non spécifique.
Malgré ces avantages, le caractère lipophile des cyanines, dû à la présence de groupes polycycliques et d'une chaîne polyméthine hydrophobe, n'est pas toujours compatible avec de bonnes performances en tant que marqueur fluorescent. Par exemple les cyanines ont tendance à former des agrégats en solution. Ainsi le vert d'indocyanine voit son rendement quantique chuter suite à une extinction de fluorescence due à la formation d'agrégats lorsqu'il est utilisé à des concentrations supérieures à 125 μM. Ce phénomène, assez général (il existe aussi dans le cas de la fluorescéine), est particulièrement prononcé dans la série des cyanines.
Par ailleurs, et malgré ce caractère lipophile, les cyanines traversent très mal, voire pas du tout, les membranes biologiques, notamment en raison de leur masse moléculaire élevée (de l'ordre de 700-800 daltons), alors que des molécules plus petites comme la fluorescéine (337 daltons) ne présentent pas cet inconvénient.
Les solutions techniques pour parer au problème de solubilité et d'agrégation des cyanines ne sont pas très satisfaisantes. Des conjugués de cyanines avec des peptides hydrophiles, des polyéthylèneglycols ou des oligosacchandes ont été utilisés et plusieurs études ont été consacrées à l'utilisation de colorants pour le proche infrarouge ainsi que sur leurs conjugués avec des biomolécules. Cette approche a l'inconvénient de nécessiter des synthèses multi- étapes, ce qui implique des rendements modestes D'autre part dans le cas de l'utilisation d'oligosacchaπdes ou d'oligopeptides hydrophiles le coût de revient peut être élevé et la purification de ces conjugués nécessite des techniques de purification autres que celles utilisées dans la synthèse organique classique
L approche la plus utilisée pour améliorer les propriétés photophysiques et donc les performances analytiques en tant que traceur fluorescent a été de limiter le phénomène d'agrégation en augmentant le caractère hydrophile par l'introduction de groupes chimiques portant une charge négative sur les noyaux indoles, tels que des sulfonates et/ou des groupes alkylesulfonates (sulfoalkyle) ainsi que des groupes carboxyliques Ainsi, les dérivés non- sulfonés d'indocyanine (comme le produit connu sous la dénomination commerciale IR-786 de Sigma) ont des solubilités inférieures à 10 μM, et leur utilisation en milieu aqueux nécessite l'utilisation d'adjuvants. La tétra-sulfonation de ces dérivés permet d'augmenter la solubilité en milieu aqueux jusqu'à plus de 10 mM. En revanche, la sulfonation n'a qu'un faible impact sur le rendement quantique de fluorescence qui en moyenne est inférieur à 15% pour un composé tétra-sulfoné.
Art antérieur
La demande internationale WO 2005/056689 A2 concerne des composés colorants à pH physiologique possédant un squelette cyanine et comportant un substituant chargé négativement.
La demande internationale WO 2005/061456 A1 concerne un milieu de contraste fluorescent proche infrarouge contenant un composé de cyanine qui présente un groupe soluble dans l'eau.
La demande internationale WO 2005/089813 A2 concerne des colorants de cyanine, ainsi que des conjugués biologiques de ceux-ci, utilisés dans l'imagerie diagnostic et en thérapie. Les conjugués consistent notamment en plusieurs colorants de cyanine avec une variété d'homologues d'acide bis- et tétrakis carboxylique.
La demande internationale WO 2005/056687 A2 a pour objet des colorants de cyanine dont le reste méthine est substitué, qui conviennent au marquage des acides nucléiques et qui consistent en des dérivés de cyanine substitués notamment par des chaînes sulfoalkyle ou carboxyalkyle
La demande internationale WO 2004/039894 A2 porte sur des colorants de cyanine fonctionnalisés et sur leurs dérivés utiles comme intermédiaires dans la préparation de colorants de cyanine, ainsi que sur des procédés de préparation de ces colorants et sur les colorants ainsi obtenus Les dérivés de cyanine comportent tous des fonctions sulfonates La demande internationale WO 03/082988 A1 a trait a des fluorochromes hydrosolubles de proche infrarouge, utiles par exemple pour l'imagerie biomédicale
La demande internationale WO 02/068537 A2 concerne des colorants fluorescents notamment des colorants de cyanine fluorescents et solubles dans l'eau qui contiennent des sites supplémentaires de fixation à des biomolécules La solubilité dans l'eau est assurée par la présence de groupes sulfonates.
La demande internationale WO 02/24815 A1 décrit des dérivés de cyanine comportant des groupes sulfonates,
La demande internationale WO 01/77229 A2 concerne des colorants de cyanine qui présentent des substituants alkyle en position méso de la chaîne méthine, des groupes sulfoaryle ainsi qu'au moins un groupe réactif permettant la liaison à une substance cible.
La demande internationale WO 01/52746 A1 concerne des conjugués colorant-peptide qui conviennent pour l'imagerie médicale et la thérapie. Ces conjugués colorant-peptide comprennent plusieurs colorants à base de cyanine avec une variété d'homologues bis- et tétrakis (acide carboxylique).
La demande internationale WO 00/66664 A1 concerne des colorants cyanines asymétriques contenant un fragment cyclique aza-benzolium, notamment des colorants cyanines substitués par une chaîne latérale cationique, des colorants cyanines monomères et dimères, des colorants cyanines réactifs au plan chimique et des conjugués de colorants cyanines.
La demande internationale WO 01/57237 A2 décrit des cyanines non fluorescentes, comportant un groupe NO2 et des esters d'acides carboxyliques.
Une tentative a été faite d'utiliser une fonction phosphonate (acide phosphonique) dans le but de réduire le phénomène d'agrégation des cyanines. [Oswald B., et al Novel diode laser- compatible fluorophores and their application to single molécule détection, protein labelmg and fluorescence résonance energy transfer immunoassay. Photochem Photobiol. (2001 )74(2):237- 45].
La demande internationale WO 01/36973 A2 concerne un procédé d'amélioration de la solubilité dans l'eau de marqueurs optiques consistant à introduire des restes d'acide phosphoπque ou des restes d'acide phosphonique, ou leurs sels ou monoesters, dans les marqueurs. Ces marqueurs sont utiles pour le marquage de biomolécules, de polymères et d'agents pharmaceutiques Cette demande décrit, en particulier, une cyanine pentaméthine portant un alkyl-phosphonate-monoester sur l'azote du cycle indole Gruber et al (Journal of Fluorescence, Vol. 15, No 3, May 2005, 207-214), décrivent deux composés dérivés de cyanines (dénommés chroméon 546 et chroméon 642), dans lesquels un des atomes d'azote est substitué par un éthyl ester de phosphonate porté par un bras diméthylène, et l'autre par un groupe réactionnel N-hydroxysuccinimide porté par un bras polyméthylène. On notera que le groupe phosphonate ne permet pas, à priori, à ces composés de traverser les membranes biologiques
Mazières et al (Dyes and Pigments, 74 (2007) pp 404-409) décrit des cyanines symétriques substituées au niveau des azotes des cycles indoles par des groupes diéthoxy-phosphoryl- propyle Ces composés, après hydrolyse, conduisent à des cyanines portant des groupes acides phosphoniques solubles dans l'eau.
La demande de brevet US 2006/0199955 divulgue des cyanines comportant un groupe phosphonate zwittenonnique, destiné à augmenter la polarité de la cyanine et donc sa solubilité ; les composés décrits sont également porteurs d'un groupe sulfonate et ne peuvent donc pas traverser les membranes cellulaires de cellules intactes.
Les colorants fluorescents dans le proche infra-rouge et possédant une structure carbocyanine ainsi que des fonctions chargées, tels que ceux décrits ci-dessus (sulfate, sulfonate, carboxyle, phosphate ou phosphonate), sont rapportés comme présentant une faible perméabilité membranaire à cause de leur masse moléculaire élevée (comparé par exemple à celle de la rhodamine = 334 Da) et de la présence de charges multiples. On a également observé qu'avec l'augmentation du nombre de charge les colorants fluorescents restent dans les compartiments extra-cellulaires. [Frangioni JV, Curr Opin Chem Biol. 2003, 7(5):626-34. In vivo near-infrared fluorescence imaging]. Enfin, lorsque plusieurs composés fluorescents de ce type sont fixés à une même biomolécule une extinction de fluorescence a été observée [Lm Y. et al. Bioconjug. Chem. 2002 13(3):605-10. Novel near-infrared cyanine fluorochromes: synthesis, properties, and bioconjugation].
II existe donc un besoin pour des dérivés de cyanines capables de traverser les membranes cellulaires, ne présentant pas de propension à l'agrégation, et pouvant être utilisés comme marqueurs fluorescents. Il est important de noter que les solutions de l'art antérieur pour pallier l'agrégation (ajout de groupes chargés négativement), s'opposent à une bonne perméabilité membranaire A l'inverse, les cyanines lipophiles susceptibles de traverser les membranes ont tendance à s'agréger.
Les paramètres gouvernant la propension pour un colorant à traverser les membranes des cellules sont connus (caractère lipophile, charge et caractère polaire qui pris ensemble définissent un caractère amphiphile, taille et forme de la molécule) mais leur influence relative et leur utilisation comme outil prédictif de la faculté de traverser les membranes reste limité Maigre ces obstacles, on a maintenant mis au point de nouveaux dérivés de cyanmes capables de traverser les membranes cellulaires sans pour autant présenter de problème d'agrégation et de solubilité
Les cyanmes selon l'invention ont la particularité de comporter
• au moins un ester (de préférence diester) de phosphate ou un ester (de préférence diester) de phosphonate, greffé sur la cyanine via un bras de liaison, et
• un groupe fonctionnel, ou bien un agent de couplage, ou encore une substance conjuguée que l'on souhaite faire rentrer dans la cellule sous forme marquée, ce groupe fonctionnel, agent de couplage ou substance étant porté par un bras de liaison
Les composés selon l'invention sont capables de traverser les membranes cellulaires, dans la mesure où ils comportent les groupements hydrophobes propres aux cyanmes (polycycles, chaînes polylméthines), et ne comportent pas de groupes polaires tels que ceux proposés dans l'art antérieur pour pallier au problème d'agrégation et de solubilité : les composés selon l'invention ne comportent pas de groupes sulfates, sulfonates, phosphates, phosphonates ou carboxylates.
En revanche, les dérivés de cyanmes selon l'invention comportent au moins un ester (de préférence diester) de phosphate ou phosphonate • ces groupes ont la particularité de subir une hydrolyse dans le cytoplasme de la cellule, catalysée par les enzymes cellulaires, en particulier les phosphodiesterases, et ce malgré la présence de la structure cyanine, dont la taille aurait pu gêner les processus enzymatiques.
Par ailleurs, les dérivés de cyanmes selon l'invention sont fonctionnalisés, ce qui permet à l'homme du métier de les coupler à tout groupe ou molécule qu'il souhaite marquer. Les produits selon l'invention peuvent également comporter un agent de couplage qui va leur permettre de marquer les biomolécules comportant un domaine de couplage approprié.
Ces caractéristiques font des dérivés de cyanine selon l'invention des composés particulièrement adaptés au marquage de molécules biologiques intracellulaires par des composés fluorescents excitables et émettant dans le rouge et le proche infra-rouge, et ce sans forcément perméabiliser les cellules Description de l'invention
Les composés fluorescents selon l'invention sont des dérivés de cyanmes de formule (I):
dans laquelle les lignes en pointillés représentent les atomes nécessaires à la formation d'un ou deux cycles aromatiques fusionnés, chaque cycle comportant 5 ou 6 atomes de carbone ;
Ri> R≥, R3, R4 représentent indépendamment l'un de l'autre :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe alkoxy en CrC6 ;
- un groupe C2-C12 dialkylamino ;
- un groupe C1-C6 alkoxycarbonyle ;
- un groupe C2-C12 dialkylamido ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ;
- un atome d'halogène ;
- un groupe nitro ;
- un groupe choisi parmi : L1 -W, L2-M, L2-A, L2-G ;
R5, R6 représentent indépendamment l'un de l'autre :
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle ou arylalkyle substitué ou non-substitué ;
- un groupe choisi parmi : L1 -W, L2-M, L2-A, L2-G ;
X est choisi parmi : O, S, CR7R8 ; Y est choisi parmi : O, S, CR9R10 ;
R7, R8, Rg, R10 représentent indépendamment :
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ,
- un groupe choisi parmi : ι_1 -W, L2-M, L2-A, L2-G ;
R7 et R8 et/ou R9 et R10 peuvent également former ensemble un cycle a 5 ou 6 atomes ou un néterocyele comprenant 4 a 5 atomes de carbone et un atome d'oxygène , B représente un pont poiyméthine comportant 1 à 5 méthine, dans lequel les groupes méthine sont individuellement non-substitués ou substitués par un groupe choisi parmi :
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ; - un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ;
- un groupe nitro ;
- un groupe choisi parmi : L1 -W, L2-M, L2-A, L2-G ; ou bien deux substituants de méthines adjacentes peuvent former ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé à 4, 5 ou 6 atomes, éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupe choisi parmi :
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ;
- un atome d'halogène ;
- un groupe nitro ; - un groupe choisi parmi : L1 -W, L2-M, L2-A, L2-G ;
L1 , L2 sont des bras de liaison ; G est un groupe réactionnel ; A est un agent de couplage ; M est une molécule conjuguée ; W est un ester (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate tel que défini ci-après : sous réserve que le dérivé de cyanine comporte un ou deux groupes L1 -W et un ou deux groupes choisis parmi : L2-A, L2-G et L2-M.
Les dérivés de cyanine de formule (I) de l'invention comportent un contre-ion « Z » (non représenté) qui contrebalance la ou les charges positives ou négatives du dérivé de cyanine.
La nature du contre-ion n'est pas essentielle selon l'invention ; elle dépend du procédé de synthèse mis en œuvre ou du milieu dans lequel se trouve le dérivé de cyanine.
Par exemple, Z sera :
I dans le cas d'une alkylation par un lodure, tel que par exemple CH3CH3I ; Cl si on réalise une hydrolyse avec HCI ;
CF3COO ou HCOO dans le cas d'une purification par HPLC en phase inverse en présence respectivement de l'acide tπfluoroacétique (CF3COOH) ou de l'acide formique
(HCOOH).
Avantageusement, le contre-ion Z est choisi parmi I , Cl . Br , CF3COO , HCOO , Na+. Définitions
Dans la présente description, les groupes ont les significations suivantes •
• groupe alkyle en C1-Ci5 chaîne hydrocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique (dans ce cas éventuellement interrompue par un hétéroatome tel que O, S, N) comportant de 1 à 15 atomes de carbone, éventuellement substituée par un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes : chloro, fluoro, bromo, nitro, C1-C6 alkoxy, C2-Ci2 dialkylamino, C1-C6 alkoxycarbonyle, C1-C6 alkylcarboxylate, N, N-dι(C2-C12)alkylamιdo, amido Exemples de groupes alkyle : méthyle, éthyle, isopropyle, n-propyle, butyle, tertio-butyle, n- hexyle, n-décyle, n-dodécyle, cyclohexyle, octyle.
• groupe alcoxy en C1-C6 : chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbones, liée à un atome d'oxygène. Des exemples de groupes alcoxy sont les groupes : méthoxy, éthoxy, propoxy, tertio-butoxy et n-butoxy.
• groupe alkoxycarbonyle en C1-C6 • chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbones, liée à l'oxygène d'un groupe carboxyle -OC1C-.
• groupe alkyl carboxyl en C1-C6 : chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbones, liée au carbone d'un groupe carboxyle -COO-
• groupe dialkylamino en C2-C12 : azote comportant deux groupes alkyles identiques ou différents, linéaires ou ramifiés, constitués chacun de 2 à 12 atomes de carbone.
• groupe N,N-dιalkylamιdo en C2-C12' groupe dialkylamino en C2-C12 lié au carbone d'un groupe carbonyle -CO-.
• groupe aryle en C5-C14 : cycle aromatique à 5 ou 6 atomes de carbone, ou bicycle aromatique à 8 à 10 atomes, ou un tπcyle aromatique à 10-14 atomes. Le groupe aryle peut être éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes - C1-C15 alkyle, chloro, fluoro, bromo, nitro, C1-C6 alkoxy, amino dι-(Ci-C15)-alkyle, C1-C6 alkoxycarbonyle
• groupe hétéroaryle à 5 -10 éléments groupe aryle dont le(s) cycle(s) comprennent de 5 à 10 atomes de carbone dont l'un au moins est remplacé par un hétéroatome choisi parmi • N, O, S Un groupe hétéroaryle peut être éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes C1-C15 alkyle chloro, fluoro, bromo, nitro, C1-C6 alkoxy amino dι-(C1-C1s)-alkyle, C1-C6 alkoxycarbonyle Des exemples de groupes hétéroaryles - pyrrolyle, pyπdyle, thienyle, furanyle, oxazolyle, isoazolyle, oxadiazolyle, imidazolyle, benzoxazolyle, benzimidazolyle, quinolyle, benzofuranyle, indolyle, carbazolyle, coumanne et benzocoumaπne
• groupe arylalkyle en C6-C25 : groupe aryle en C5-C10 lié à un groupe alkyle en C1-Ci5
• un halogène • chloro-, fluoro-, lodo-, bromo-
• B bras de liaison • peut être une liaison covalente simple ou un bras d'espacement comprenant de 1 à 20 atomes différents de l'hydrogène, choisis parmi les atomes de carbone, azote, phosphore, oxygène et soufre, ce groupe de liaison étant linéaire ou ramifié, cyclique ou hétérocyclique, saturé ou insaturé, et constitué d'une combinaison de liaisons choisies parmi : les liaisons carbone-carbone qui peuvent être simples, doubles, triples ou aromatiques; les liaisons carbone-azote; les liaisons azote-azote; les liaisons carbone-oxygène; les liaisons carbone-soufre; les liaisons phosphore-oxygène; les liaison phosphore-azote ; les liaisons éther ; les liaisons ester ; les liaisons thioéther; les liaisons aminés ; les liaisons amides ; les liaisons carboxamide; les liaisons sulfonamide; les liaisons urée; les liaisons uréthane ; les liaisons hydrazine; les liaisons carbamoyle.
• Cellule intacte : désigne une cellule dont l'intégrité membranaire et l'intégrité intracellulaire sont conservées, par exemple une cellule qui n'a pas fait l'objet d'un traitement chimique destiné à perméabiliser sa membrane.
Composés préférés de l'invention
Les dérivés de cyanines préférés selon l'invention sont les composés répondant aux formules suivantes, dans lesquelles les groupes R1-R6, B1 X et Y sont tels que définis ci-dessus .
Le pont polyméthine B
Les composés de l'invention comportent un pont polyméthine entre les structures cycliques. Comme indiqué plus haut, ces méthines peuvent être substituées, ou encore des méthines adjacentes peuvent former ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé à 4, 5 ou 6 éléments, éventuellement substitué.
Les composés préférés de l'invention comportent des méthines non substituées, ou bien seule la méthine centrale est substituée, ou encore 2 méthines centrales forment un cycle.
A titre illustratif et non limitatif, le pont peut être constitué des chaînes polyméthmes suivantes :
dans lesquelles R15, R16 sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué
- un atome d'halogène ;
- un groupe nitro ;
- un groupe choisi parmi : L2-M, L2-A, L2-G, L1 -VV. L1 , L2 sont des bras de liaison,
G est un groupe réactionnel,
A est un agent de couplage,
M est une molécule conjuguée,
W est un ester (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate De préférence, le pont polyméthme répond à l'une des formules ci-après
L'ester (de préférence diester) de phosphate ou phosphonate
Les esters (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate portés par un bras, présents sur les dérivés de cyanme selon l'invention, offrent plusieurs avantages techniques : ils n'augmentent pas la polarité des composés et favorisent donc leur passage à travers les membranes biologiques lipidiques ; d'autre part, une fois à l'intérieur de la cellule, les esters (de préférence diesters) de phosphate ou de phosphonates sont hydrolyses par les enzymes cellulaires pour donner des groupes phosphates ou phosphonates. Ces groupes phosphates ou phosphonates contribuent à l'efficacité des cyanines selon l'invention pour marquer en particulier des protéines, puisqu'ils permettent de remédier aux phénomènes d'agrégation généralement observés lorsque les cyanines sont utilisées dans cette application
Ces groupes peuvent être greffés sur la cyanme selon des méthodes de synthèse connues de l'homme du métier. Par exemple, l'introduction d'un ester de phosphonate sur un noyau aromatique est réalisée à partir d'un dérivé brome, tel que le 5-bromo-2,3,3-trιméthyl-3H-ιndole comme décrit dans l'exemple 13 en suivant le protocole décrit dans la littérature [A Novel Synthests of Dialkyl Arenephosphonates, Hirao, T. et al. Synthesis, (1), 56-57 (1981 )]. La partie expérimentale ci-après illustre des voies de synthèse de dérivés de cyanines comportant des esters de phosphates ou de phosphonates.
Dans le cas où des esters de phosphate sont introduits au niveau des cycles aromatiques de la cyanme, ces groupes doivent obligatoirement être portés par un bras de liaison Les groupes W ester (de préférence diester) de phosphate ou de phosphonate ont pour formules :
O O
o- CHR11 R13 O- O- CHR1 1 R13
O CHR12R14 o- CHR12R14
O O
O- CHR1 1R13 -O- O- CHR1 1 R13
OH OH
dans lesquelles :
R11 et R12 sont identiques ou différents et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C5 non-substitué ;
R13, Ru sont identiques ou différents et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C15 non-substitué ,
- un groupe alkoxycarbonyle en C1-C6 ;
- un groupe alkylcarboxyle en C1-C6 ;
- un groupe N,N-dιalkylamιdo en C2-C12 ;
- un groupe amido ;
- un groupe de formule -C-S-CO-AIk,
AIk étant un alkyle linéaire ou ramifié non substitué, en C1-C4 ;
R11 et R12 et/ou R13 et R14 peuvent également former ensemble un groupe phtalidyle de formule •
Les dérivés de cyanine, particulièrement préférés selon l'invention, sont ceux dans lesquels les esters de phosphates/phosphonates sont greffés sur le cycle aromatique indole de la cyanine.
Les diesters de phosphonates de formule générale suivante sont préférés :
O
CHR1 1R13
o- CHR12R14 dans laquelle :
Rn et R12 sont identiques et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C5 non-substitué ;
R13 et R14 sont identiques et sont choisis parmi les groupes suivants :
- méthylcarboxyl (= -0-CO-CH3 = ester d'acétoxyméthyl) ;
- tertiobutylcarboxyl (= -O-CO-C(CH3)3 ≈ ester de tπméthylacétoxyméthyl) ;
- méthyloxycarbonyl (= -CO-OCH3 = ester de méthyl glycolate) ;
- méthanamido (= -CO-NH2 = ester de glycolamide) ;
- N,N-dιméthylméthanamιde (= -CO-N(CH3)2 =ester de glycolamide substitué)
- N-méthylméthanamide.
En particulier, les dérivés de cyanine comportant les esters de phosphonate suivants, sont plus facilement hydrolyses par les enzymes cellulaires que les simples esters d'alkyle :
Ester d'acétoxyméthyle
Ester d'acétoxyméthyle, le groupe méthyle étant éventuellement substitué par un groupe H ou alkyle en C1-C5 :
Ester de triméthylacétoxyméthyle :
Ester de méthyl-glycolate ou éthyl-glycolate (acide glycolique = HOCH2COOH, méthyl glycolate HOCH2COOMe)
Ester de glycolamide non substitue (glycolamide HOCH2CONH2
Ester de glycolamide substitué (N-methyl-glycolamide HOCH2CONHCH3 OU N,N-dιméthyl- glycolamide
Parmi les composés de formule (I) ci-dessus ou les composés préférés de l'invention, on préfère tout particulièrement :
1 ) les composés dans lesquels :
X est le groupe CR7R8 et/ou Y est le groupe CR9Ri0 , un ou deux groupes R1-R4 représentent un groupe L1-W ; et un ou deux groupes R7-Ri0 représentent L2-A, L2-G ou L2-M ;
2) les composés dans lesquels :
X est le groupe CR7R8 et/ou Y est le groupe CR9R10 ;
R5 et/ou R6 représentent un groupe L1 -W ; et un ou deux groupes R7-R10 représentent un groupe L2-A, L2-G ou L2-M ;
3) les composés dans lesquels :
R5 et/ou R6 représentent un groupe L1 -W ;
Ri5 ou R16 du pont polyméthine B représente un groupe L2-A, L2-G ou L2-M.
4) les composés dans lesquels un ou deux R1-R4 représentent une groupe L1 -W , et
R.5 ou R16 du pont polyméthme B représente un groupe L2-Â, L2-G ou L2-M Une famille de composés particulièrement préférés de l'invention est celle constituée par les composés de formule :
dans laquelle :
R1, R3 sont des atomes hydrogène ;
R7, R8, Rg représentent indépendamment un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non- substitué ;
R5, R6 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
B représente un pont polyméthine comportant 1 à 5 méthines non-substituées ;
R10 représente un groupe choisi parmi L2-M, L2-A, L2G
L2 est un bras de liaison ; - G est un groupe réactionnel ;
A est un agent de couplage ; M est une molécule conjuguée ;
R2, R4 sont identiques et représentent un groupe L1-W ,
L1 est un bras de liaison choisi parmi : une liaison simple, un groupe de formule
(CH2)n-, n étant un nombre entier compris entre 2 et 8 ;
W est un diester de phosphonate choisi parmi les groupes de formules suivantes :
dans laquelle :
R11 et R12 sont identiques ou différents et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C5 non-substitué ,
R13, R14 sont identiques ou différents et sont choisis parmi
- un atome d'hydrogène ,
- un groupe alkyle en C1-C15 non-substitué ; - un groupe alkoxycarbonyle en C1-C6 ;
- un groupe alkylcarboxyle en C1-C6 ;
- un groupe N,N-dιalkyIamido en C2-Ci2 ;
- un groupe amido ;
- un groupe de formule -C-S-CO-AIk, AIk étant un alkyle linéaire ou ramifié non substitué en C1- C4 ;
R11 et R12 et/ou R13 et R14 peuvent également former ensemble un groupe phtaltdyle de formule :
Une autre famille de composés particulièrement préférés de l'invention est celle constituée par les composés de formule :
dans laquelle :
R1, R2, R3, R4 sont des atomes hydrogène ;
R7, R8, R9 représentent indépendamment un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non- substitué ;
B représente un pont polyméthine comportant 1 à 5 méthines non-substituées
R10 représente un groupe choisi parmi L2-M, L2-A, L2G ; L2 est un bras de liaison ; G est un groupe réactionnel ; A est un agent de couplage ; M est une molécule conjuguée ;
R5, R6 sont identiques et représentent un groupe L1-W ,
L1 est un bras de liaison choisi parmi . une liaison simple, un groupe de formule -
(CH2)n-, n étant un nombre entier compris entre 2 et 8 ,
W est un diester de phosphonate de formule choisie parmi les composés de formules suivantes
dans laquelle :
R11 et R12 sont identiques ou différents et sont choisis parmi : - un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C5 non-substitué,
R13. Ru sont identiques ou différents et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ; - un groupe alkyle en C1-C15 non-substitué ;
- un groupe alkoxycarbonyle en C1-C6;
- un groupe alkylcarboxyle en C1-C6 ;
- un groupe N.N-dialkylamido en C2-C12 ;
- un groupe amido ; - un groupe de formule -C-S-CO-AIk, AIk étant un alkyle linéaire ou ramifié non substitué, en C1-C4 ;
R11 et R12 et/ou R13 et R14 peuvent également former ensemble un groupe phtalidyle de formule :
Agent de couplage A
Les dérivés de cyanines selon l'invention peuvent comporter un agent de couplage porté par un bras de liaison. De préférence, cet agent de couplage est capable de traverser la membrane cellulaire
Cet agent de couplage a pour fonction de permettre le couplage covalent ou non-covalent de la cyanme avec une molécule cible, par exemple présente dans une cellule. Pour cela, la molécule cible doit comporter le domaine de couplage approprié Dans le cas où la molécule cible est présente dans une cellule, il est nécessaire que l'agent de couplage soit lui-même capable de traverser la membrane plasmique
L'agent de couplage A peut ainsi être un anticorps, un fragment d'anticorps ou encore un aptamère peptidique spécifique de la molécule cible Ces anticorps, fragments d'anticorps ou aptarnères peuvent reconnaître un domaine naturellement présent dans la molécule cible, ou encore un domaine introduit dans cette molécule par les techniques bien connues de l'homme du métier, en particulier les techniques de biologie moléculaire permettant I introduction dans une biomolécule d'une étiquette protéique.
L'agent et le domaine de couplage peuvent être des membres d'un couple de partenaires de liaison, les deux membres étant capables de lier de manière non-covalente, comme par exemple les couples suivants :
• avidine (ou streptavιdιne)/bιotιne . ce couple peut être utilisé pour marquer une protéine d'intérêt exprimée par la cellule sous forme de protéine de fusion avec le domaine de liaison de l'avidine ou de la streptavidine. Dans ce cas, les dérivés de cyanine selon l'invention sont conjugués à la biotine en tant qu'agent de couplage. Le couple (strept)avιdιne/bιotιne est connu de l'homme du métier qui n'aura aucun mal à coupler les dérivés de cyanine selon l'invention avec la biotine.
• composés bi-arsenic/motif tétracystéine . Ce couple de partenaires de liaison a été initialement décrit par Adams et al., (« New biarsenical ligands and tétracystéine motifs for protem labeling m vitro and in vivo' synthesis and biological applications », J Am Chem. Soc. 2002 May 29;124(21):6063-76). Un dérivé de cyanine selon l'invention, conjugué à un motif bi-arsenic, permet de marquer une protéine d'intérêt exprimée par la cellule sous forme de protéine de fusion avec un domaine tétracystéine capable de se lier avec le motif biarsenic. La séquence du domaine tétracystéine est : Cys-Cys-aa1-aa2-Cys-Cys (dans laquelle aa1 et aa2 sont tout acide aminé naturel, et de préférence aa1 = Pro et aa2 = GIy).
« méthotrexate (ou trιméthopπme)/dιhydrofolate reductase (DHFR) : La liaison de haute affinité entre la DHFR et des composés tels que le méthotrexate ou la tπméthopπme est décrite notamment par Miller et al. (« Méthotrexate Conjugates a molecular in vivo protem tag », Angew. Chem Int Edn. Engl , 43, 1672-1675 (2004)) Des dérivés de cyanines selon l'invention, conjugués au méthotrexate ou à la tπméthopπme comme agent de couplage, seront capables de marquer une protéine d'intérêt exprimée par la cellule sous forme de protéine de fusion avec la DHFR,
• SLF7FKBP(F36V) Clakson et al ont décrit le couple composé d'un ligand artificiel SLF' se liant a un mutant de la protéine FKBP (« Redesigning an FKBP-ligand interface to générale chemical dimeπzers with novel specificity », Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Sep
1 ,95(18) 10437-42)
Des dérivés de cyanines selon l'invention, conjuguées au SLF' comme agent de couplage, seront capable de marquer une protéine d'intérêt exprimée par la cellule sous forme de protéine de fusion avec la FKBP(F36V)
L'agent de couplage A des dérivés de cyanine selon l'invention peut également être un agent permettant un couplage par liaison covalente avec un domaine de couplage présent sur la molécule d'intérêt que l'on souhaite marquer
En particulier, l'agent de couplage peut être le substrat d'une enzyme dite « suicide », présente dans la cellule Dans ce cas, le domaine de couplage est donc une enzyme suicide et est exprimé par la cellule sous la forme d'une protéine de fusion constituée de l'enzyme suicide et de la protéine d'intérêt que l'on souhaite marquer. Les enzymes suicides sont des protéines qui ont une activité enzymatique modifiée par des mutations spécifiques qui leur confèrent une capacité à lier rapidement et de façon covalente un substrat. Ces enzymes sont dites suicides car chacune ne peut lier qu'une seule molécule fluorescente, l'activité de l'enzyme étant bloquée par la fixation du substrat.
Les enzymes suicides ont été récemment utilisées dans des méthodes de marquage de protéines : ces méthodes consistent à fabriquer une protéine de fusion comprenant une protéine que l'on souhaite marquer et une enzyme suicide, et en mettant en contact cette protéine de fusion avec, par exemple, un fluorophore marqueur lié de manière covalente au substrat de ladite enzyme suicide.
Actuellement, deux familles d'enzymes suicides connues permettent ce type de marquage •
Le mutant d'une alkylguanine-DNA alkyltransférase (ou « SnapTag » commercialisé par la société Covalys, décrite dans la demande WO 02/083937 A2), dont le substrat est la benzylguanine ou un dérivé de benzylguanine. Par dérivé de benzylguanine on entend une benzylguanine modifiée mais qui est néanmoins reconnue par l'enzyme suicide. De tels substrats sont décrits dans les demandes WO 2005/085470 et WO 2004/031405 ;
Le mutant d'une haloalcane déhalogénase (« HaloTag » commercialisé par Promega) qui génère également une réaction enzymatique du type suicide (technique décrite dans WO 2004/072232 A2), dont le substrat un haloalcane, de préférence un chloroalcane Des substrats sont décrits dans WO 2004/072232 et WO 2006/093529
Dans le cas ou l'on souhaite marquer de telles enzymes suicides par un dérivé de cyanine selon l'invention, ladite cyanine comportera l'agent de couplage qui sera un groupe benzylguanine (ou un de ses dérivés), ou encore un haloalcane (de préférence un chloroalcane) lié à la cyanine via un bras de liaison Pour résumer, l'agent de couplage A des dérivés de cyanines selon l'invention peut être un membre d'un couple de partenaires de liaison non-covalente ou un membre d'un couple de partenaires de liaison covalente
En particulier, A peut être choisi parmi les composés suivants un anticorps, un fragment d'anticorps, un aptamère peptidique, la biotine, un composé bi-arsenic, le tπmétropine, le méthotrexate, le SLF', un groupe benzylguanine, un chloroalcane
Groupe réactionnel G
Les dérivés de cyanines selon l'invention peuvent contenir un groupe réactionnel G, qui est un groupe capable de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur une autre substance ou molécule, pour former une liaison covalente En l'occurrence, le groupe réactionnel G réagira avec un groupe fonctionnel présent sur la substance ou la molécule que l'on souhaite conjuguer au dérivé de cyanine selon l'invention
Typiquement, le groupe réactionnel est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. La réaction de conjugaison entre le dérivé de cyanine comportant un groupe réactionnel et une molécule à conjuguer M portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactionnel. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous
• par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est
• un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-C4H4O2), sulfo succinimidyloxy (-OC4H3Oz-SO3H) ;
• un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tels que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, tπfluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ;
• un acide carboxylique activé par un groupe carbodnmide, formant un anhydride -OCOR3 ou -OCNRaNHRb, dans lesquels R3 et Rb sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes alkyles en C1-C6, perfluoroalkyles en C1-C6, alkoxy en C1-C6, cyclohexyle ;
• 3-dιméthylamιnopropyle, N-morpholinoéthyle.
A titre d'exemple non limitatif, la substance ou molécule à conjuguer M comprend au moins un des groupes fonctionnels suivants, avec lequel réagira le groupe réactionnel G : aminés, amides, thiols, aldéhydes, cétones, hydrazines, hydroxylamines, aminés secondaires, halogénures, époxydes, esters de carboxylate, acides carboxyliques, des groupes comportant des doubles liaisons, ou une combinaison de ces groupes fonctionnels.
Le groupement fonctionnel porté par la molécule M qui réagira avec le groupe réactionnel G sera par exemple un groupe aminé, thiol, alcool, aldéhyde ou cétone. De manière préférée le groupement réactionnel G réagira avec un groupe fonctionnel aminé ou thiol.
Des méthodes d'introduction de ces groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C Kessler, Nonisotopic probmg, Blottmg and Sequencing, 2πd édition, LJ. Kπcka (1995), Ed. Académie press Ltd., Londres, p 66-72
De préférence, le groupement réactionnel G est un groupe dérivé d'un des composés ci-après • un acrylamide, une aminé activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamme), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une azindine, un acide carboxylique, un diazoalcane, une haloacétamide, une halotnazine, telle que la monochlorotnazine, la dichlorotnazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une aminé, un halogénure d'acide un hydroxysuccimmidyi ester, un hydroxysulfosuccinimidyl ester, un azidonitrophényl, un azidophényl, une 3-(2-pyrιdyl dithio)- propionamide, glyoxal et en particulier les groupes de formule :
H2)n -NH - Ar
SH
où n varie de O à 8 et p est égal à O ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène De manière préférée, le groupement réactionnel G est un acide carboxylique, un succinimidyl ester d'acide carboxylique, un haloacétamide, une hydrazinβ, un isothiocyanate, un group maléimide, une aminé aliphatique.
Molécule conjuguée M
Bien que les dérivés de cyanine selon l'invention soient particulièrement avantageux pour le marquage fluorescent de composés se trouvant dans la cellule, ils peuvent être couplés à tout type de molécules par les techniques de conjugaison classique, et l'utilisation de groupes réactionnels tels que décrits ci-dessous.
La molécule conjuguée M peut être par exemple une biomolécule. Par biomolécule, on entend une molécule présente dans un organisme vivant, et en particulier les molécules constituant la structure d'un organisme, celles impliquées dans la production et la transformation d'énergie ou dans la transmission des signaux biologiques. Cette définition englobe les acides nucléiques, les protéines, les sucres, les lipides, les peptides, les oligonucléotides, les intermédiaires métaboliques, les enzymes, les hormones et les neurotransmetteurs.
Bras de liaison
Les dérivés de cyanines selon l'invention comporte un groupe réactionnel G, un agent de couplage A, une molécule conjuguée M ou encore un ester (de préférence diester) de phosphate ou phosphonate W. Chacun de ces groupes est lié à la cyanine via un bras de liaison.
Dans le cas où la cyanine comporte plusieurs de ces groupes, par exemple 2 groupes phosphonates et un agent de liaison, ces groupes peuvent être portés par des bras identiques ou différents.
Le bras de liaison L qui porte les groupe G, M, A ou W, peut être une liaison covalente simple ou un bras d'espacement comprenant de 1 à 20 atomes différents de l'hydrogène, choisis parmi les atomes de carbone, azote, phosphore, oxygène et soufre, ce bras de liaison étant linéaire ou ramifié, cyclique ou hétérocyclique, saturé ou insaturé, et constitué d'une combinaison de liaisons choisies parmi : les liaisons carbone-carbone qui peuvent être simples, doubles, triples ou aromatiques; les liaisons carbone-azote; les liaisons azote-azote; les liaisons carbone- oxygène; les liaisons carbone-soufre; les liaisons phosphore-oxygène; les liaison phosphore- azote ; les liaisons éther ; les liaisons ester ; les liaisons thioéther; les liaisons aminé , les liaisons amide ; les liaisons carboxamide; les liaisons sulfonamid; les liaisons urée; les liaisons uréîhane ; les liaisons hydrazme, les liaisons carbamoyle De préférence, le bras de liaison L comprend de 1 à 20 atomes différents de l'hydrogène et choisis parmi C, N, O, P et S et peut comprendre des combinaisons de liaisons éther, thioéther, carboxamide, sulfonamide, hydrazine, aminé, ester et des liaisons aromatiques ou hétéroaromatiques.
De manière préférée, L est constitué d'une combinaison de liaisons simples carbone-carbone et de liaisons carboxamide ou thioéther.
A titre d'exemple, L peut être choisi parmi les chaînes suivantes : polyméthylène, arylène, alkylarylène, arylènealkyle, ou arylthio.
Selon un aspect avantageux, le bras de liaison L est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1-C2O, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6- Ci4, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate.
En particulier, le groupe de liaison L est choisi parmi les groupes :
D — (CH2V
O O
2) — (CH2)n— NH-C-(CH2)^-C-
3) -(CH2X1- 0-(CH2L- 0-(CH2),
O
5) -(CH2Jn-NH-C-(CH2)-
S— (CH2).-
10) -(CH2Jn-NH-
O
H) (CH2)n— NH-C-(CH2),
12) "(CH2)n- -NH (CH2)p
dans lesquels
- n et m sont des nombres entiers de 2 à 16, de préférence de 2 à 8 ;
- p et r sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5.
Les groupes de liaison 1) à 9) sont particulièrement appropriés lorsque le groupe réactionnel est un groupe carbamoyle et le groupe fonctionnel sur la substance ou molécule M est un groupe amide, thioéther.
Les groupes de liaison 2), 6), 7), et 10) à 12) sont particulièrement appropriés lorsque le groupe réactionnel est un groupe éther et le groupe fonctionnel sur la substance ou molécule M est un groupe amide ou thioéther
Parmi les composés de l'invention, on préfère tout particulièrement l'un des groupes de composés ci-après " composés de formule (I) dans laquelle X est le groupe CR7R8 et/ou Y est le groupe CR9R10, un ou deux groupes R1-R4 représentent un groupe L1-W, et un ou deux groupes R7-R10 représentent L2-A, L2-G ou L2-M ; composés de formule (I) dans laquelle X est le groupe CR7R8 et/ou Y est le groupe CR9R10, R5 et/ou R6 représentent un groupe L1-W, et un ou deux groupes R7-R10 représentent un groupe L2-A, L2-G ou L2-M ; composés de formule (I) dans laquelle R5 et/ou R6 représentent un groupe L1-W et le pont polyméthine B est choisi parmi les formules ci-dessus dans lesquelles R15 ou R16 représente un groupe L2-A, L2-G ou L2-M , - composés de formule (I) dans laquelle un ou deux R1-R4 représentent un groupe L1-W et le pont polyméthine B est choisi parmi les formules ci-dessus dans lesquelles R15 ou R16 représente un groupe L2-A, L2-G ou L2-M
Parmi ces composés, on préfère tout particulièrement ceux dans lesquels les lignes en pointillés représentent le groupe phényl et dans lesquels le pont polyméthine répond à l'une des formules ci-après :
Procédés de synthèse
La synthèse de dérivés de cyanine est largement décrite dans la littérature et l'homme du métier peut s'y référer pour préparer les dérivés selon l'invention. La synthèse de cyanine repose en général sur l'utilisation de 3 réactifs de départ . les groupes polycycliques et la chaîne méthine Ces 3 réactifs sont modifiés avant ou après leur condensation pour leur faire porter les substituants voulus
Des informations sur la synthèse des intermédiaires utilisés dans la fabrication des cyanines de l'art antérieur sont disponibles notamment dans les publications suivantes
Mujumdar et al (1993) " Cyanine dye labelmg reagents sulfoindocyanme succinimidyl esters " Bioconjug Chem 4(2) 105-1 1 Mujumdar et al. (1996). "Cyanine-Labeling Reagents: Sulfobenzindocyanine Succinimidyl
Esters." Bioconjugate Chem. 7(3): 356 - 362. Ces articles permettent à l'homme de l'art de synthétiser les intermédiaires nécessaires à la synthèse des cyanines. Hung, S.-C. et al. (1996). "Cyanine Dyes with High Absorption Cross Section as Donor Chromophores in Energy Transfer Pπmers" Analytical Biochemistry 243( 1 ): 15-27
Les exemples de la partie expérimentale illustrent par ailleurs la synthèse de quelques dérivés selon l'invention.
EXEMPLES
Dans ces exemples, les abréviations ci-après sont utilisées :
DIPEA : Dnsopropyléthylamine TSTU : N,N,N',N"-Tétraméthylsuccιnιmιdouronιum tétrafluoroborate
TBTU = 2-(1 H-benzotrιazole-1-yl)-1 ,1 ,3,3-tétraméthyluronιum tétrafluoroborate
HPLC : chromatographie liquide haute performance
RP-HPLC : chromatographie liquide haute performance en phase inverse
TFA : acide tπfluoroacetique MS : Spectroscopie de Masse
DMF : Diméthylformamide
TR : temps de rétention
DY647 : Fluorophore commercialisé par la société Dyomics, soluble dans l'eau, le méthanol, le
DMSO, et dont les propriétés spectrales sont similaires à celles de Cy5 DY647-NHS : dérivé N-hydroxysuccinimide du DY647
DMEM : acronyme du milieu de culture connu sous le terme anglosaxon « dulbecco modified essential médium »
DAPI : 4',6-dιamιdιno-2-phénylιndole colorant des noyaux
ACN : Acétonitπle NHS : N-hydroxysuccinimide
BG : Benzylguanine
BG-CY5 : conjugué benzylguanme-cyanine CY5
CY5 : indocyanine dont le pont polyméthine comporte cinq méthines, commercialisée par la société AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH. BG-DY647 : conjugué benzylguanine - DY647. Exemple 1 : Synthèse du bromure de 1-[2-(Diéthoxyphosphoryl)-éthyl]-2,3,3-triméthyl-3W- indolium
1 ,59 g (10,0 mmol) de 2,3,3-triméthyl-3H-indole et 2,94 g (12,0 mmol) de bromoéthyl-diéthyl- phosphonate sont mélangés et chauffés à 7O0C pendant 40 h sous agitation. Après refroidissement du mélange réactionnel, 10 ml de méthanol sont ajoutés puis ensuite 30 ml d'eau. Le composé recherché est isolé par chromatographie sur colonne (silice RP-18) avec un gradient de méthanol/eau allant de 1 :1 to 5:1. MS (ESI+): 324,2 .Rendement: 775 mg (19 %).
Exemple 2 : Synthèse du chlorure de 3-(3-Carboxypropyl)-1-[2-(diéthoxyphosphoryl)- éthyl]-2,3-diméthyl-3H-indolium
2,31 g (10,0 mmol) de 3-(3-Carboxypropyl)-2,3-diméthyl-3W-indole et 2,94 g (12,0 mmol) de bromoéthyl-diéthylphosphonate sont dissous dans 10 ml d'éthanol et agités à 7O0C pendant 64 h. Après retour à température ambiante, le liquide restant est extrait par deux fois avec 20 ml d'eau. Les deux phases aqueuses réunies sont extraites deux fois par 20 ml de diéthyléther. Le produit désiré resté dans la phase aqueuse est isolé par chromatographie sur colonne (silice RP-18) avec un gradient de méthanol/eau allant de 1 :3 to 3:2 (chaque solvant contenant 2% en volume d'acide chlorhydrique 3M). La solution contenant le produit désiré est neutralisée par du bicarbonate de sodium, le mélange est concentré puis déposé sur une colonne courte de silice RP-18. Après avoir éliminé les sels inorganiques par lavage à l'eau, le produit sous forme de sel de sodium est élue avec du méthanoi. MS (ESI+): 396,2. Rendement: 575 mg (12 %) Exemple 3 : Synthèse du chlorure de 1-[2-(diéthoxyphosphoryl)-éthyI]-3,3-diméthyl-2-
((1 E,3E)-4-phénylamino-buta-1 ,3-diényl)-3W-indolium
404 mg (1 ,0 mmol) de bromure de 1-[2-(diéthoxyphosphoryl)-éthyl]-2,3,3-triméthyl-3H-indolium et 285 mg (1 ,1 mmol) de chlorhydrate du dianilide de l'aldéhyde malonique sont dissous dans 10 ml d'un mélange d'acide acétique et d'anhydride acétique (v/v = 3:2) et le mélange est agité 8 h à 60 0C. After retour à température ambiante 150 ml water d'eau sont ajoutés. La solution est déposée sur une colonne de silice RP-18. After lavage avec 200 ml d'eau, le produit recherché est élue par un gradient acétonitrile/eau allant de 1:2 à 3:2 (chaque solvant contenant 2% en volume d'HCI 3M), La solution contenant le produit désiré est neutralisée par du bicarbonate de sodium, le mélange est concentré puis déposé sur une colonne courte de silice RP-18. Après avoir éliminé les sels inorganiques par lavage à l'eau le produit sous forme de sel de sodium est élue avec du méthanol. MS (ESI+): 453,2 Rendement: 76 mg (14 %).
Exemple 4 : Synthèse du chlorure de 2-{(1 E,3E)-5-[3-(3-Carboxypropyl)-1-[2- (diéthoxyphosphoryl)-éthyl]-3-méthyl-1 ,3-dihydro-indol-(2E)-ylidène]-penta-1 ,3-diényl}-1- [2-(diéthoxyphosphoryl)-éthyl]-3,3-dirnéthyl-3W-indoliurn (cyanine 1 sous forme de diéthylphosphono ester)
48 mg (100 μmol) chlorure de 3-(3-carboxypropyl)-1 -[2-(dιéthoxyphosphoryl)-éthyl]-2,3- dιméthyl-3/-/-ιndolιum obtenu à l'exemple 2, et 53 mg (100 μmol) de chlorure de 1 -[2- (dιéthoxyphosphoryl)-éthyl]-3,3-diméthyl-2-((1 E,3E)-4-phénylamιno-buta-1 ,3-dιényl)-3H- indolium obtenu à l'exemple 3, et 25 mg (300 μmol) d'acétate de sodium sont dissouts dans 5 ml d'un mélange d'acide acétique et d'anhydride acétique (v/v = 3:2) et le mélange est agité 3 h à 60 0C. Après concentration sous vide, le résidu est d'abord dissous dans 1 ml de méthanol, et 2 ml d'eau sont ajoutés. Le composé recherché est isolé par chromatographie sur une colonne de silice RP-18 en éluant par un gradient méthanol/eau, gradient allant de 1 :1 à £M MS (ESI+)- 755,3. Rendement: 32 mg (38 %).
Exemple 5 : Synthèse du dérivé aminoéthylamide de la cyanine 1 sous forme de bis- diéthylphosphono ester.
Afin de pouvoir greffer une molécule d'intérêt tel qu'un substrat d'une enzyme permettant un marquage intra-cellulaire, on introduit un groupement aminé primaire.
Une solution de la cyanine 1 sous forme de bis-diéthylphosphono ester obtenu à l'exemple 4 (160 nmol) dans 100 μl de DMF est traitée par 5 équivalents de dnsopropyléthylamine, 2,5 équivalents de tert-butyl N-(2-amιnoéthyl)carbamate (N-boc-éthylènediamine) et 2 équivalents de TBTU après 24 h à température ambiante le produit de départ (tR = 15,7 mn) est transformé en un nouveau produit (tR = 16,8 mn).
Conditions HPLC : colonne Lichrospher* 100, RP18, 5 μm, 125mm x 4mm ; gradient d'acétonitπle (ACN) dans l'acide trifluoracétique (TFA) à 0,1% dans l'eau à 1 ml/mn. Isocratique
5% ACN 3 min, gradient linéaire de 5% à 100% en 12 min.
Le produit intermédiaire obtenu, dissous dans de l'acétonitrile, est traité par l'acide tπfluoroacétique (ACN/TFA : 2/1 (v/v)). Le produit possédant Pamine déprotégée (tR=1 1 ,5 mn) est isolé par HPLC semi-préparative (colonne Grace-Vydac Protein & Peptide C18, 218TP510) débit 4 ml/mn avec un gradient ACN / TFA à 0,1% dans l'eau identique au gradient analytique. Exemple 7 : Synthèse du dérivé N-Hydroxysuccinimide de la cyanine 1 sous forme de bis-diéthylphosphono ester.
La cyanine sous forme de bis-diéthylphosphono ester obtenue dans l'exemple 4 (1 ,5 mg ,1 ,79 μmole) est dissoute dans 70 μl de DMF anhydre et on ajoute 1 ,25 μl de DIPEA et 0,55 mg de
TSTU Par analyse en HPLC (colonne Lichrospher" 100, RP18, 5 μm, 125mm x 4mm , gradient d'acétonitnle (ACN) dans l'acide tnfluoracétique (TFA) à 0,1% dans l'eau a 1 ml/mn , Isocratique
0% ACN 5 min, gradient linéaire de 0% à 85% en 13 min puis de 85% à 100% en 2 min) on observe la formation d'un pic présentant un temps de rétention plus long (tR=17,8 mn) que le produit de départ (tR= 17,3 mn). Ce produit est isolé par HPLC semt-préparative (colonne
Grace-Vydac Protem & Peptide C18, 218TP510) débit 5 ml/mn avec un gradient ACN/TFA à
0,1% dans l'eau, identique au gradient analytique Rendement 1 ,1 μmole 60%
Exemple 8 : Synthèse d'un dérivé benzylguanine de la cyanine 1 sous forme de bis- diéthylphosphono ester.
La O6-[4-(13-Amιno-2,5,8,11 -tétraoxa-tπdécyl)-oxyméthyl-benzyl]guanιne préparée selon le protocole de la littérature [Gendreizig S et al (2003) "Induced protem dimenzation in vivo through covalent labeling " J Am Chem Soc 125(49). 14970] (0 46 μmole) dans 70 μl de DMF anhydre est traitée par 0 3 μl de DIPEA et 0 46 μmole de dérivé N-Hydroxysuccinimide de la cyanine bis-diethylphosphono ester préparée selon l'exemple 7. Par analyse en HPLC (colonne Lichrospher® 100, RP18, 5 μm, 125mm x 4mm ; gradient d'acétonitπle (ACN) dans l'acide tnfluoracétique (TFA) à 0,1% dans l'eau à 1 ml/mn. Isocratique 0% ACN 5 min, gradient linéaire de 0% à 70% en 13 min puis de 85% à 100% en 2 min, détection à 280 nm) on observe la disparition du pic correspondant au dérivé guanine de départ (tR=12,1 mn) et formation d'un pic présentant un temps de rétention plus long (tR=16,4 mn). Ce produit est isolé par HPLC semi- préparative (colonne Grace-Vydac Protem & Peptide C18, 218TP510) débit 5 ml/mn avec un gradient linéaire ACN/TFA à 0,1% dans l'eau identique au gradient analytique. Rendement 0 30 μmole (66%). UV(H2O) 643 (180 000 M 1.cm 1), 280 nm 16 800 M 1 cm 1) MS . (MALDI-TOF)/IDAA (matrice = acide frans-lndole-aerylique) m/z = 1 185,3 (cale. 1185,36).
Exemple 9 : Synthèse d'un dérivé Benzylguanine du DY647.
La O6-[4-(amιno-méthyl)-benzyl]guanιne préparée selon la littérature (Keppler, S et al (2003) "A gênerai method for the covalent labeling of fusion proteins with small molécules in vivo" Nature Biotechnology 21 (1 ) 86 - 89) (0,9 mg, 3,3 μmole) dans 200 μl de DMF anhydre est traitée par 2,5 μmole de dérivé N-hydroxysuccinimide du DY647 (analogue sulfoné de cyanine / Dyomics) pendant 16h a température ambiante Par analyse en HPLC (colonne X-bndge, C18, 5 μrn, 250 mm x 4,6 mm , gradient d'acétonitπle (ACN) dans l'acide tπfluoracétique (TFA) a
0,05% dans l'eau à 1 ml/mn Isocratique 10% ACN 5 min, gradient linéaire de 10% à 40% en 24 min, détection à 280 nm) on observe la disparition du pic correspondant au dérivé guanine de départ (tR=5,8 mn) et formation d'un nouveau pic présentant un temps de rétention intermédiaire (tB = 19,8 mn) plus court que le pic correspondant au réactif DY647-NHS Ce produit est isolé par HPLC semi-préparative (colonne X-bπdge C18, 10 mm x 250 mm) débit 5 ml/mn avec un gradient linéaire ACN/TFA à 0,05% dans l'eau identique au gradient analytique Rendement 1 ,60 μmole (64%) par rapport au DY647-NHS engagé. UV(H2O) 643 (250 000 M 1 cm 1), 280 nm 16 200 M 1.cm 1). LC-MS . (ES+-TOF) m/z = 895,4 (cale. 895,10).
Exemple 10 : Synthèse d'un dérivé Benzylguanine de Ia cyanine CY5.
La O6-[4-(Amιno-methyl)-benzyl]guanιne 0.8 mg (3,3 μmole) est traitée par le dérivé N-hydroxysuccinimide de la cyanine CY5 (2,65 μmol) monoréactive (Munjumdar R .B. et al
Bioconjug. Chem 1993, 4(2), 105-11 1 ) et 3 μmole de DIPEA dans 400 μl de DMF anhydre pendant 90 mn à température ambiante Par analyse en HPLC (colonne Lichrospher* 100,
RP18, 5 μm, 125mm x 4mm; gradient d'acétonitπle (ACN) dans l'acide tπfluoracétique (TFA) à
0,05% dans l'eau à 1 ml/mn. Isocratique 5% ACN 5 min, gradient linéaire de 5% à 55% en 14 min, détection à 600 nm) on observe la disparition du pic correspondant au dérivé CY5-NHS (tR
= 15,5 mn) et formation d'un pic présentant un temps de rétention plus court (tp = 14,9 mn) correspondant au conjugué qui est isolé par HPLC semi-préparative (colonne Grace-Vydac
Protein & Peptide C18, 218TP510) débit 5 ml/mn avec un gradient linéaire ACN/TFA à 0,05% dans l'eau identique au gradient analytique) UV(H2O) 647 (250 000 M 1 cm 1), 280 nm (14 000 M 1.cm 1). LC-MS : (ES+-TOF) m/z = 909,15 (cale. 909,10)
Exemple 11 : Test de perméabilité cellulaire de conjugués de la Benzylguanine avec le DY647, le CY5 et la cyanine 1 sous forme de bis-diéthylphosphono ester.
Les cellules utilisées sont issues d'une lignée stable CHO exprimant le SnapTag au niveau nucléaire grâce à la séquence NLS. Les composés sont ajoutés dans le milieu de culture (milieu DMEM complémenté par 10% de SVF inactivé 30mιn à 600C) à une concentration de 5 μM et laissés en contact une heure avec les cellules. Après l'incubation, trois lavages sont effectués avec du milieu de culture. Une heure supplémentaire d'incubation uniquement dans milieu est faite pour permettre le marquage du SnapTag par le substrat Une coloration du noyau est ensuite réalisée avec le DAPI avant l'analyse microscopique. L'incubation des cellules avec les conjugués BG-DY647 et BG-CY5 produisent des images peu intenses , en augmentant le gain on observe de la fluorescence uniquement sous forme d'un bruit de fond ce qui montre que les conjugues testés n'on pas traverse la membrane plasmique des cellules Au contraire l'incubation des cellules avec le conjugue BG-CEP (BG-Cyanine Ethyl Phosphonate), préparé selon l'exemple 8, produit une fluorescence intense localisée à l'intérieur des cellules montrant que le composé a traversé la membrane plasmique. Les images ci-dessus sont représentées sur la figure 1
Exemple 12 : Synthèse du bromure de 2-{(1 E,3E,5E)-5-[3-(3-Carboxypropyl)-1-[2- (éthoxyphosphoryI)-éthyl]-3-méthyl-1 ,3-dihydro-indoI-2H-ylidène]-penta-1 ,3-diènyl}-1 -[2- (éthoxyphosphoryl)-éthyI]-3,3-diméthyl-3H-indolium (cyanine 1 sous forme d'éthylphosphono ester)
Cyanine diethylphosphono ester Cyanine éthylphosphono ester
La cyanine 1 sous forme de diethylphosphono ester de l'exemple 4 (100 nmol) est dissoute dans
100 μl de dichlorométhane (exempt d'éthanol), plus on ajoute du bromure de tnméthylsilyle (12 μmol) [McKenna CE. et al. Letrahedron Lett 18, 2 (1977), 155-158.] ; après 1 h30 on observe un précipité, on évapore la solution, reprend le résidu dans un mélange d'eau et d'acétonitnle et purifie par RP-HPLC (détecteur barette de diodes Shimadzu SPD-M10A, Pompe Merck L6200A, colonne Vydac 218TP510) A : H2O contenant 0 1% TFA B acétonitπle. Débit = 4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitnle en 15 min. Le produit de départ (tR=11 ,9 min) donne majoritairement le composé recherché portant deux fonctions éthylphosphono ester (tR= 0,1 min) On observe également des pics à tR=10,6 min et à tR=9,7 min correspondant respectivement à la diphosphono cyanine portant trois groupes éthyle et un groupe éthyle. Exemple 13 : Préparation des dérivés 2-{(1£,3E,5£)-5-[3-(5-carboxypentyl)-4-éthyl-3- méthyI-5-phophono-1 ,3-dihydro-2W-indol-2-ylidène]penta-1,3-dienyl}-5-phosphono-3,3- diméthyl-1-(4-éthyl)-3W-indolium.
Le procédé de synthèse de ce composé est représenté sur le schéma réactionnel 1.
13.1. 5-bromo-2,3,3-trιméthyl-3H-ιndole (14a):
Le 4-bromophénylhydrazιne.HCI 13 (6,5 g) et la 3-méthyl-2-butanone (6,4 ml) sont dissous dans du benzène contenant une quantité catalytique d'acide acétique et le mélange est porté à reflux (16h) avec entraînement azeotropique de l'eau. Le mélange concentré est repris par de l'acide acétique (70 ml) et chauffé au bain d'huile (1200C) pendant 12 heures ; on observe la formation d'un produit solide. L'analyse par HPLC (RP-18 gradient acétonitπle dans l'eau à 1 % de TFA) montre la formation d'un nouveau produit. Après évaporation sous vide le résidu est repris par de l'acétate d'éthyle et lavé avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, et la phase organique est séchée (MgSO4) et évaporée, le produit brut est purifié par chromatographie-Flash sur silice en éluant par un gradient d'acétate d'éthyle dans l'hexane. On obtient 5,5 g (80%) de produit pur. 1H-RMN (CDCI3)O= 7,5(1 H,d) , 7,2-7,3 (2H, m), 2,3 (3H,s) , 1 ,3 (6H, s).[Letcher, R.M. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1 (1993) 939-944].
13.2. 5-(dιéthoxyphosphono)-2,3,3-trιméthyl-3H-ιndole (15a) :
Le 5-bromo-2,3,3-tπméthyl-3/-/-ιndole 14a (5g , 21 mmol) est dissous dans du toluène (5ml) ; on dégaze puis on ajoute de la tπéthylamine (3,2 ml), du diethylphosphite (3ml) et du tétrakιs(tπphénylphosphιne)-palladιum(0) (1 ,2 g) ; on chauffe à 800C pendant 3h sous azote et sous agitation. On chromatographie (chromatographie flash) sur silice en éluant avec un gradient d'acétate d'éthyle dans l'hexane. On obtient 3 g (48%) de produit pur. 1H-RMN (CDCI3) δ = 7,7 (2H,m) , 7,6 (1 H, m), 4,13 (4H, m), 2,3 (3H,s) , 1 ,3 (9H, m).
13.3. 5-(dιéthoxyphosphono)-1 -éthyl-2,3,3-trιméthyl-3/-/-ιndolιum iodure (16a):
Le 5-(dιéthoxyphosphono)-2,3,3-trιméthyl-3/-/-ιndole 15a (3g) est traité par de l'iodure d'éthyle (10 ml) à reflux 16h sous azote. L'iodure d'éthyle est évaporé sous vide et le résidu est trituré avec de l'hexane, collecté par centπfugation et séché. Il est utilisé tel quel pour la réaction suivante.
13.4. 5-(phosphono)-1-éthyl-2,3,3-trιmethyl-3W-ιndolιum bromure : Le 5-(dιéthoxyphosphono)-2,3,3-trιméthyl-3H-ιndolιum 16a est traité par un excès de bromure de tnméthylsilyle dans le dichlorométhane (5 ml) selon le protocole de la littérature [McKenna CE. et al. Letrahedron Lett 18, 2 (1977), 155-158.]. On obtient ainsi le dérivé complètement déprotégé sous la forme « acide phosphonique » 17a. 13.5. Préparation du 3,3-dιméthyl-i -éthyl-2-((1 E,3E)-4-phénylamιno-buta-1 ,3-dιényl)-5-
(phosphono)-3H-ιndolium chlorure (18):
Le bromure de 1 -éthyl-5-(phosphono)-2,3,3-trιméthyl-3W-ιndolιum 17a (10 mmol) est traité par de l'anhydride acétique (10 ml) et du dianilide de l'aldéhyde malonique (20 mmol) ; on laisse réagir 8h à 600C. On refroidit, ajoute de l'éther (50 ml) et de l'hexane (50 ml), puis on sépare le produit huileux (qui est l'ami recherché) par décantation, on purifie par chromatographie (RP-18 exemple 3) pour donner l'ami 18. Rendement: g (40%).
13.6. Préparation du 5-bromo-3-(5-carboxypentyl)-2,3-dιméthyl-3W-ιndole (14b) : Le 4-Bromophénylhydrazιne, HC1 1_3 (6,5 g) et l'acide 7-méthyl-8-oxo-nonanoιque (6,7 g)
[préparé à partir du 2-méthylacetoacetate d'éthyle et du 6-bromohexanoate d'éthyle selon le procédé décrit par LEUNG, Wai-Yee dans le WO 02/26891] sont portés à reflux dans de l'acide acétique (50 ml) pendant 5 heures. Après évaporation le produit est purifié par chromatographie-Flash sur silice, (rendement 1 1g).
13.7. Préparation du 3-(5-Carboxypentyl)-5-(dιéthoxyphosphono)-2,3-dιméthyl-3H-ιndole
Le 5-bromo-3-(5-carboxypentyl)-2,3-dιméthyl-3H-ιndole (14b) est traité par le diéthylphosphite comme décrit dans l'exemple 13.2 pour donner le dérivé 15b.
13.8. Préparation du iodure de 3-(5-Carboxypentyl)-5-(dιéthoxyphosphono)-2,3-dιméthyl-1- éthyle-3H-ιndolιum (16b) :
Le 3-(5-Carboxypentyl)-5-(dιéthoxyphosphono)-2,3-dιméthyl-3H-ιndole (15b) est traité par Piodure d'éthyle (voir exemple 13.3) pour donner le composé 16b.
13.9. Préparation du bromure de 3-(5-Carboxypentyl)- 2,3-dιméthyl-1-éthyl-5-(phosphono)- 3H-ιndolιum (17b) :
Le iodure de 3-(5-Carboxypentyl)-5-(dιéthoxyphosphono)-2,3-dιméthyl-1 -ethyle-3H-ιndolιum (16b) est traité par le bromure de tπméthylsilyl (voir exemple 13.4) pour donner le composé 17b.
13.10. Diphosphonocyanine fonctionnalisée carboxylate (19)
2-{(1 E,3E,5£)-5-[3-(5-carboxypentyl)-3-méthyl-4-éthyl-5-phophono-1 ,3-dιhydro-2/-/-ιndol-2- ylιdène]penta-1 ,3-dιényl}-5-phosphono-3,3-dιméthyl-1 -(4-éthyl)-3W-ιndolιum : L'ami 1J3 (g, 7 mmol), et le bromure de 3-(5-Carboxypentyl)- 2,3-dιméthyl-1 -éthyl-5- (phosphono)-3H-ιndolιum (17b) sont dissous dans le diméthylformamide (10 ml), on ajoute de la tπethylamine (1 ml) et de l'anhydride acétique (1 ml) et chauffe à 60° C pendant 1 heure. On refroidit, ajoute de l'éther éthylique (50 ml), et le précipité est collecté repris par de l'acide chlorhydπque dilué (2 N) puis purifié par chromatographie (Lichroprep Merck C18) en éluant avec 1 °) une solution d'acétate de sodium (1 ,5 m M) 2") de l'eau distillée , le produit recherché 19 est ensuite élue par un mélange éthanol-eau (4/6). On obtient ainsi la diphosphonocyanine
19 sous la forme de sel de sodium. A côté de la diphosphonocyanine 19 recherchée on observe aussi la présence d'une diphosphocyanine non fonctionnalisée 20 provenant du couplage de |8 sur le composé 17a contaminant 1§, ces deux composés étant séparables par chromatographie en phase inverse. HPLC (détecteur barette de diodes Shimadzu SPD-M10A, Pompe Merck L6200A, colonne Vydac 218TP510) A : H2O contenant 0 1% TFA B : acétonitπle. Débit = 4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 60% acétonitnle en 23 min. Composé 19 : tR=14,8 min. (N.B. le composé 20 présente un tR = 14 min dans les mêmes conditions) Rendement: 0,5 g (8%). Masse (ES-) m/z = 669,3 (100%) (ES+) m/z = 671 ,2 (60%). Spectre U V- Vis : λmax (tampon PO4 0,1 M pH 7) = 649 nm (ε649 98 000 M 1.cm ~1) ratio A649ZA604 = 2,6.
Spectre de fluorescence : Mesure sur appareil Perkin-Elmer LS50 , les échantillons ont été dilués dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7 contenant 0.1 % BSA (absorbance maximum = 0,04 à la longueur d'onde d'excitation). Excitation : 600 nm (10nm). Emission (max) = 670, 5nm (rendement quantique = 13%).
Exemple 14 : Diphosphonocyanine tetraester fonctionnalisée aminé (24): (voir schéma réactionnel 2)
14.1. Dérivé N-Boc (21) :
La Diphosphonocyanine fonctionnalisée carboxylate Jj) (24 mg, 32.6 μmol) est dissoute dans le DMF (2 ml) et on ajoute 9 μl de DIPEA et une solution de TSTU (35 mg dans 500μl de DMF). Après 20 min on ajoute le dérivé mono-BOC de Péthylène diamine. Après 1 h de réaction on purifie par RP-HPLC comme décrit dans l'exemple 12. On obtient ainsi le dérivé N-BOC 2J.. MS (ES+) m/z = 81 1 ,6 (100%) calculé pour C41H55N4O9P2 .
14.2. Dérivé N-Boc de la Cyanine di-(phosphono-mono-ester méthylglycolique) (22) :
Le dérivé N-BOC (21) (3 mg, 4,7 μmol) est repris par du DMF anhydre (550 μl), on ajoute de la tπéthylamine anhydre (distillée sur hydrure de calcium, 14 μl, 100μmol) du méthyl bromoacétate
(1 Oμl, 105μmol). On chauffe à 700C pendant 16h sous argon. Le mélange réactionnel est purifié par RP-HPLC comme décrit dans l'exemple 12 (colonne Vydac 218TP510 , A : H2O contenant
0.1% TFA B : acétonitπle. Débit = 4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitnle en 40 mm). Le produit de départ (IR= W mm) a donné majoritairement le composé recherché 22 portant deux fonctions phosphono ester glycolique (tR = 22.6 min) Rendement 15 %. MS (ES+) m/z = 957,5 (100%) calculé pour C47H66N4O13P2. 14.3. Dérivé N-Boc de la Cyanine dî-(phosphonodiester méthylique et méthylglycolique)
(23) :
Méthode A. Le dérivé phosphono ester monoglycolique (22) est traité par Piodure de méthyle, on obtient ainsi le dérivé 23 portant ayant chaque groupe phosphonate sous la forme phosphono diester méthyle et méthyle glycolique
Méthode B. Le dérivé phosphono ester monoglycolique (22) dans le DMF est traité par du BOP en présence de méthanol pour donner le produit 23 Le produit est purifié par RP-HPLC (colonne Vydac 218TP510 , A H2O contenant 0.1 % TFA B acétonitπle. Débit = 4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitπle en 40 min). On observe majoritairement le composé recherché 23 (tR = 31 ,7 min) Rendement 50 % UV(H2O/ACN , 1 :1 ) ; ?vmax = 646,5 nm, ratio A646/ A600 = 3,7. MS (ES+) m/z = 985,6 (100%) calculé pour C49H71 N4OIqP?.
14.4. Cyanine di-(phosphonodiester méthylique et méthylglycolique) fonctionnalisée aminé (24): La cyanine dι-(phosphonodιester méthylique et méthylglycolique) 23 est traitée par l'acide tπfluoracétique dans le dichlorométhane (30 min à 200C) ; après évaporation du solvant le produit est purifié par RP-HPLC On obtient ainsi la cyanine tétraester fonctionnalisée aminé 24.
Exemple 15 : Synthèse d'un dérivé benzylguanine de diphosphonocyanine tétraester (26)
(schéma réactionnel 2) :
La cyanine 24 ainsi obtenue est reprise par du DMF contenant de la DIPEA et traitée par l'ester de NHS 25 [obtenu par réaction d'un excès de DSS (di-succmimidyl suberate) sur la O6-[4- (amιno-méthyl)-benzyl]guanιne (Keppler, S. et al. (2003) Nature Biotechnology 21 (1 ): 86 - 89) dans le DMF, le produit 25 est purifié par RP-HPLC dans des conditions semblables à celles utilisées pour la purification des cyanines dans les exemples précédents]. Le composé recherché 26 portant deux fonctions mixtes phosphono esters méthylique et méthylglycolique et fonctionnalisé par un groupe benzyl-guanine est obtenu après purification par RP-HPLC (colonne Vydac 218TP510, A : H2O contenant 0.1 % TFA B • acétonitrile. Débιt=4 ml/min Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitπle en 40 min). Rendement 46 %. UV(H2O/ACN , 1 :1 ) , λmax = 650 nm, ratio A647/A600 = 3,4. MS (ES+) m/z = 1293,8 (M-H)+ calculé pour
Exemple 16. Dérivé benzyl-guanine de Ia Cyanine di-(phosphonodiester méthylglycolique) (29) : (voir schéma réactionnel 3)
Le dérivé phosphono ester monoglyeolique (22) dans le DMF est traité par du BOP en présence de méthyl glycolate pour donner le produit 27 Le produit est purifie par RP-HPLC (colonne Vydac 218TP510, A H2O contenant 0 1% TFA B acétonitπle Débit = 4 ml/mm Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitnle en 40 min) On observe le composé portant trois fonctions esters méthylglycolique (tR=29,9 min) ainsi que le composé recherché 27 portant quatre fonctions esters methylglycolique recherché Rendement 20 %. MS (ES+) m/z = 1102 Calculé pour C53H75N4O17P2.
Le dérivé 27 est traité 15 min dans l'acide tπfluoracétique pur pour enlever le groupe protecteur BOC, puis, après évaporation sous vide et coévaporation au toluène, le produit 28_aιnsι obtenu est repris par du DMF contenant de la DIPEA et traité par l'ester de NHS 25 obtenu par réaction d'un excès de DSS (di-succinimidyl suberate) sur la O6-[4-(amιno-méthyl)-benzyl]guanιne dans le DMF (le produit 25 est purifié par RP-HPLC dans des conditions semblables à celles utilisées pour la purification des cyanines dans les exemples précédents) Le composé recherché 29 portant quatre fonctions esters méthylglycolique et fonctionnalisé par un groupe benzyl-guanine est obtenu après purification par RP-HPLC (colonne Vydac 218TP510, A : H2O contenant 0,1% TFA B . acétonitnle. Débιt=4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitπle en 40 min)
Le produit 29 est obtenu après évaporation des fractions issues de la purification HPLC et coévaporation au toluène, il est ensuite repris par du DMSO et stocké à -2O0C. Rendement 70 %. UV(H2O/ACN, 1 :1 ) ; Gmax = 647 nm, ratio A647/A600 = 3,5. MS (ES+) m/z = 1409,6 (M-H)+ calculé pour C69H9IN10O18P2.
Exemple 17 : Comparaison des rendements quantiques de différents dérivés de Cyanine :
Les fonctions esters de phosphate/phosphonate des dérivés de cyanine selon l'invention, sont hydrolysées dans la cellule par les enzymes cellulaires en fonction phosphate/phosphonate ; Les rendements quantiques des dérivés de cyanine portant des groupes phosphonates, correspondant donc aux composés selon l'invention tels qu'ils sont présents dans la cellule, après hydrolyse des fonctions esters, ont été mesurés, afin de déterminer si la position des groupes esters de phosphate/phosphonate a une influence sur les propriétés photophysiques des composés.
Ces résultats montrent que les cyanines comportant des fonctions phosphonates au niveau des cycles indoles ont un rendement quantique 3 fois plus élevé que celles comportant des phosphonates au niveau des azotes des cycles indoles.
Exemple 18 : Dérivé benzyl-guanine de la Cyanine di-(phosphonomonoester méthylglycoϋque) (31) : (voir schéma réaction nel 4)
Le dérivé phosphono ester monoglycolique (22), décrit dans l'exemple 14, est traité 15 min dans l'acide trifluoracétique pur pour enlever le groupe protecteur BOC, puis, après évaporation sous vide et coévaporation au toluène, le produit 30 ainsi obtenu est repris par du DMF contenant de la DIPEA et traité par l'ester de NHS 25 préparé comme décrit dans l'exemple 16. Le composé recherché 3J. portant deux fonctions esters méthylglycolique et fonctionnalisé par un groupe benzyl-guanine est obtenu après purification par RP-HPLC (colonne Vydac 218TP510, A : H2O contenant 0.1% TFA B : acétonitrile. Débit=4 ml/min. Gradient linéaire de 5% ACN à 100 % d'acétonitrile en 40 min). Le produit est obtenu après évaporation des fractions issus de la purification HPLC et coévaporation au toluène, il est ensuite repris par du DMSO et stocké à -200C. Rendement 53 %. UV(H2O/ACN, 1 :1) ; λmax = 648 nm, ratio A648/A600 = 3,2. MS (ES-) m/z = 1263.6 (M-2H)" calculé pour C63H82N10O14P2.
Exemple 19 : Marquage d'une protéine intracellulaire par le composé 29 ajouté sur cellule vivantes intactes, détection du marquage par mesure HTRF:
Cet exemple vise à montrer que les composés selon l'invention comportant un ester de phosphonate et conjugués à un substrat (Benzylguanine, BG) d'une enzyme suicide « snaptag » (ST26) sont capables de traverser Ia membrane cellulaire, et de marquer une protéine de fusion exprimée par la cellule et comprenant l'enzyme snaptag (ST12), par opposition à l'utilisation d'une cyanine ne comportant pas d'esters de phosphonate (DY-647)
La technique HTRF est utilisée pour tester le marquage intracellulaire d'une protéine par les dérivés de cyanine selon l'invention, sur des cellules vivantes, en utilisant la protéine recombinante GST-ST26-Flag produite par les cellules et marquée indirectement via un anticorps anti-GST conjugué avec un cryptate d'europium tπs-Bipyπdine (anti-GST-EuTBP)
Après mise en culture, des cellules CHO-K1 sont transfectées en présence de lipofectamine 2000 (0.8 μl_ pour 50 μl_ solution de transfection, Lipofectamine™ Transfection Reagent
Invitrogen, Inc., Carlsbad, Calif ) à raison de 50 000 cellules par puits dans une microplaque noires 96 puits. Les cellules transfectées sont ensuite incubées 24h à 37°C, 5% CO2. Le plasmide utilisé pour la transfection est un plasmide pSEM-GST-ST26-Flag (80ng / puits) obtenu en introduisant les séquences de la GST et du Flag dans le plasmide pSEMS- SNAP26m-Gateway en suivant le protocole du kit commercial Covalys (Mammalian Expression
Plasmid Kit pSEMSSNAP26m-Gateway® PL218), de façon à induire la synthèse d'une protéine de fusion GST-ST26-Flag par les cellules. Le protocole est semblable à celui décrit dans la littérature [Engineering Substrate Specificity of O6-Alkylguanιne-DNA Alkyltransferase for
Spécifie Protein Labehng in Living CeIIs, K. Johnsson et al. ChemBioChem. 2005, 6(7) 1263 - 1269].
Le lendemain, les cellules sont incubées avec le BG-DY647 ou le composé 29 (préparé selon l'exemple 16) ajoutés sous forme de solution dans le DMSO dans 50μl de milieu de culture et de façon à avoir une concentration finale en substrat de 5 μfvl Les cellules sont incubées 3h à 200C, puis lavées à l'aide d'un milieu de culture.
Marquage total : Sur une partie des puits servant à déterminer le « 100% de marquage» on ajoute le substrat à 10OnM final (BG-DY647 ou le composé 29_suιvant le puits) dans un tampon de lyse (cAMP kit , Cisbio ) contenant également un anticorps anti-GST couplé à un cryptate d'europium (EuTBP), l'anti-GST-EuTBP (1 nM final, GST tag check kit réf. 62GSTPEB, Cis bip).
Marquage passif Sur les autres puits servant à déterminer le pourcentage de marquage intracellulaire (qui ont donc été incubés soit avec DY647 soit avec le composé 29) on ajoute seulement l'anticorps anti-GST-EuTBP (1 nM final) dans le même tampon de lyse
On prépare également des puits contenant des cellules transfectées avec un plasmide « vide » c'est-à-dire ne codant pas pour la séquence d'intérêt, pour constituer des puits de contrôle La fluorescence à 665 nm est mesurée sur un lecteur HTRF (RUBYstar, BMG Labtechnologies)
. Le pourcentage de marquage intracellulaire, obtenu en divisant le signal à 665 nm obtenu en marquage passif par le signal à 665 nm obtenu en marquage total est représenté sur la figure 2.
On observe que le pourcentage de marquage intracellulaire en présence du substrat 29 est beaucoup plus important que le pourcentage de marquage obtenu en présence du substrat de référence DY-647 qui pénètre mal dans les cellules.
Cet exemple confirme donc que le composé 29 traverse la membrane cellulaire et qu'il permet le marquage d'une protéine intracellulaire, ce qui n'est pas le cas du composé BG-DY-647 ne portant pas d'esters de phosphates ou phosphonates.
Schéma réactionnel 1
Schéma réactionnel 2
Schéma réactionnel 3
Schéma réactionnel 4

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivés de cyanine de formule
dans laquelle les lignes en pointillés représentent les atomes nécessaires à la formation d'un ou deux cycles aromatiques fusionnés, chaque cycle comportant 5 ou 6 atomes de carbone ;
R-i, R2, R3. R4 représentent indépendamment l'un de l'autre :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe alkoxy en C1-C6 ;
- un groupe C2-C12 dialkylamino ;
- un groupe C1-C6 alkoxycarbonyle ;
- un groupe C2-C12 dialkylamido ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ;
- un atome d'halogène ;
- un groupe nitro ;
- un groupe choisi parmi : L1 -W, L2-M, L2-A, L2-G ;
R5, R6 représentent indépendamment l'un de l'autre :
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle ou arylalkyle substitué ou non-substitué ;
- un groupe choisi parmi : L1 -W, L2-M, L2-A, L2-G ;
X est choisi parmi : O, S, CR7R8 ; Y est choisi parmi : O, S, CRgR10 ;
R7, R8, Rg, R1O représentent indépendamment :
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ;
- un groupe choisi parmi . L1 -W, L2-M» L2-A, L2-G ;
R7 et R8 et/ou R9 et R10 peuvent également former ensemble un cycle à 5 ou 6 atomes ou un hétérocycle comprenant 4 à 5 atomes de carbone et un atome d'oxygène , B représente un pont polyméthine comportant 1 à 5 méthine, dans lequel les groupes méthine sont individuellement non-substitués ou substitués par un groupe choisi parmi :
- un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ;
- un groupe nitro ;
- un groupe choisi parmi L1 -W, L2-M, L2-A, L2-G, ou bien deux substituants de méthines adjacentes peuvent former ensemble un cycle hydrocarboné saturé ou insaturé à 4, 5 ou 6 atomes, éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupe choisi parmi :
- un groupe alkyle en C1-Ci5 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ;
- un atome d'halogène ;
- un groupe nitro ;
- un groupe choisi parmi : L1-W, L2-M, L2-A, L2-G, L1 , L2 sont des bras de liaison,
G est un groupe réactionnel, A est un agent de couplage, M est une molécule conjuguée,
W est un ester de phosphate ou de phosphonate choisi : O O
•o- CHR1 1R13 • O- •o- CHR1 1 R13
O - CHR12R14 o- CHR12R14
O O
O- CHR11R13 O - -o- CHR11R13
OH OH
dans lesquelles :
R11 et R12 sont identiques ou différents et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C5 non-substitué,
R13, R14 sont identiques ou différents et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C15 non-substitué ;
- un groupe alkoxycarbonyle en C1-C6,,
- un groupe alkylcarboxyle en C1-C6 ;
- un groupe N,N-dιalkylamιdo en C2-C12 ;
- un groupe amido ;
- un groupe de formule -C-S-CO-AIk, AIk étant un alkyle linéaire ou ramifié non substitué, en C1-C4 ;
R-I 1 et R12 et/ou R13 et R14 peuvent également former ensemble un groupe phtalidyle de formule :
sous réserve que le dérivé de cyanine comporte un ou deux groupes L1 -W et un ou deux groupes choisis parmi : L2-A, L2-G et L2-M.
2. Dérivés selon la revendication 1 , répondant à l'une des formules ci-après :
dans lesquelles les groupes RrRe. X, Y et B sont tels que définis dans la revendication 1
3. Dérivés selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que pont polyméthine B est choisi parmi les formules suivantes :
dans lesquelles R15, R16 sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
IO - un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
- un groupe aryle, arylalkyle ou aryloxy substitué ou non-substitué ;
- un atome d'halogène ;
- un groupe nitro ;
- un groupe choisi parmi : L2-M, L2-A, L2-G, L1 -W.
15 L1 , L2 sont des bras de liaison,
G est un groupe réactionnel,
A est un agent de couplage,
M est une molécule conjuguée,
W est un ester (de préférence diester) de phosphate ou de phophonate
20
4. Dérivé de cyamne selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que X est le groupe CR7R8 et/ou Y est le groupe CR9R10, en ce que un ou deux groupes R1-R4 représentent un groupe L1 -W, et en ce que un ou deux groupes R7-R10 représentent L2-A, L2-G ou L2-M
? <;
5. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que X est le groupe CR7R8 et/ou Y est le groupe CR9R10, en ce que R5 et/ou R6 représentent un groupe L1 -W, et en ce que un ou deux groupes R7-R10 représentent un groupe L2-A, L2-G ou L2-M,
6. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R5 et/ou R6 représentent un groupe L1 -W, et en ce que R15 ou R16 représente un groupe L2-A, L2- G ou L2-M.
7. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que un ou deux RrR4 représentent un groupe L1 -W et en ce que R15 ou R16 représente un groupe L2- A, L2-G ou L2-M.
8. Dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le groupe W est un diester de phosphonate.
9. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que W est un diester de phosphonate de formule :
O
o- CHR11 R13
o- CHR12R14
dans laquelle :
R11 et R12 sont identiques et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C5 non-substitué ;
R13 et R14 sont identiques et sont choisis parmi les groupes suivants :
- méthylcarboxyl (= -0-CO-CH3 = ester d'acétoxyméthyle) ;
- tertiobutylcarboxyl (= -O-CO-C(CH3)3 = ester de tπméthylacétoxyméthyle) ;
- méthyloxycarbonyl (= -CO-OCH3 = ester de méthyl glycolate) ;
- méthanamido (= -CO-NH2 = ester de glycolamide) ;
- N,N-dιméthylméhanamιde (= -CO-N(CH3)2 =ester de glycolamide substitué)
- N-méthylméthanamide
10. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu »ιl répond à la formule :
dans laquelle :
R1, R3 sont des atomes hydrogène ;
RT, R8, R9 représentent indépendamment un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non- substitué ;
R5, R6 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non-substitué ;
B représente un pont polyméthine comportant 1 à 5 méthines non-substituées ;
R10 représente un groupe choisi parmi L2-M, L2-A, L2G ; -L2 est un bras de liaison ; G est un groupe réactionnel ; A est un agent de couplage ; M est une molécule conjuguée ;
R2, R4 sont identiques et représentent un groupe L1 -W ;
L1 est un bras de liaison choisi parmi : une liaison simple, un groupe de formule
(CH2)n-, n étant un nombre entier compris entre 2 et 8 ;
W est un diester de phosphonate choisi parmi les groupes de formules suivantes :
dans laquelle : R11 et R12 sont identiques ou différents et sont choisis parmi •
- un atome d'hydrogène ,
- un groupe alkyle en C1-C5 non-substitué ,
R13, R14 sont identiques ou différents et sont choisis parmi - un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C15 non-substitué ;
- un groupe alkoxycarbonyle en Ci-C6 ;
- un groupe alkylcarboxyle en C1-C6 ;
- un groupe N,N-dιalkylamιdo en C2-C12 ;
- un groupe amido ;
- un groupe de formule -C-S-CO-AIk, AIk étant un alkyle linéaire ou ramifié non substitué en C1- C4 ;
R11 et R12 et/ou R13 et R14 peuvent également former ensemble un groupe phtalidyle de formule :
11. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule :
dans laquelle :
R1, R2, R3, R4 sont des atomes hydrogène ;
R7, R8, R9 représentent indépendamment un groupe alkyle en C1-C15 substitué ou non- substitué ;
B représente un pont polyméthme comportant 1 à 5 méthines non-substituées ;
R10 représente un groupe choisi parmi L2-M, L2-A, L2G ; L2 est un bras de liaison ; G est un groupe réactionnel ; A est un agent de couplage - IVI est une molécule conjuguée ;
R5, R6 sont identiques et représentent un groupe L1-W ,
L1 est un bras de liaison choisi parmi une liaison simple, un groupe de formule •
(CH2)n-, n étant un nombre entier compris entre 2 et 8 ; W est un diester de phosphonate de formule choisie parmi les composés de formules suivantes :
dans laquelle :
Rn et R12 sont identiques ou différents et sont choisis parmi
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C5 non-substitué,
R-I3, R14 sont identiques ou différents et sont choisis parmi :
- un atome d'hydrogène ;
- un groupe alkyle en C1-C15 non-substitué ; - un groupe alkoxycarbonyle en C1-C6;
- un groupe alkylcarboxyle en C1-C6 ;
- un groupe N,N-dιalkylamιdo en C2-C12 ,
- un groupe amido ;
- un groupe de formule -C-S-CO-AIk, AIk étant un alkyle linéaire ou ramifié non substitué, en C1-C4 ;
R11 et R12 et/ou R13 et R14 peuvent également former ensemble un groupe phtalidyle de formule :
12 Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 » caractérisé en ce que les bras de liaison L1 et L2 sont choisis parmi : une liaison covalente simple ou un bras d'espacement comprenant de 1 à 20 atomes différents de l'hydrogène choisis parmi les atomes de carbone, azote, phosphore oxygène et soufre, ce groupe de liaison étant linéaire ou ramifié, cyclique ou hetérocyclique, saturé ou insaturé et constitué d'une combinaison de liaisons choisies parmi • les liaisons carbone-carbone qui peuvent être simples, doubles, triples ou aromatiques, les liaisons carbones-azote, les liaisons azotes-azote; les liaisons carbone- oxygène, les liaisons carbone-soufre, les liaisons phosphore-oxygène, les liaison phosphore- azote , les liaisons éther , les liaisons ester , les liaisons thioéther, les liaisons aminé , les 5 liaisons amide ; les liaisons carboxamide, les liaisons sulfonamide, les liaisons urée; les liaisons urethane ; les liaisons hydrazine , les liaisons carbamoyle.
13. Dérivé de cyanme selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le groupe de liaison L comprend de 1 à 20 atomes, différents de l'hydrogène, choisis parmi I O les atomes de carbone, azote, phosphore, oxygène et soufre et comprend en outre au moins une liaison choisie parmi les liaisons éther, thioéther, carboxamide, sulfonamide, hydrazine, aminé, ester et des liaisons aromatiques ou hétéroaromatiques
14 Dérivé de cyanme selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce 15 que le groupe de liaison L est choisi parmi les chaînes substituées ou non substituées suivantes : polyméthylène arylène, alkylarylène, arylènealkyle, ou arylthio.
15 Dérivé de cyanme selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le groupe réactionnel G est choisi parmi les groupes dérivés des composés suivants : une 0 acrylamide, une aminé activée (par exemple une cadavenne ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziπdine, un acide carboxylique, un diazoalkane, une haloacétamide, une halotnazine, telle que monochlorotnazine, la dichlorotπazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou thiol, une5 cétone, une aminé, un halogénure d'acide, un hydroxysuccinimidyl ester, un hydroxysulfosucαnimidyl ester, un azidonitrophényl, un azidophényl, une 3-(2-pyπdyl dithio)- propionamide, glyoxal et en particulier les groupes de formule
- NH -4- (CH2)n - NH — Ar
où n varie de 0 à 8 et p est égal à O ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
16. Dérivé de cyanine selon la revendication 15, caractérisé en ce que le groupe A est choisi parmi : la benzylguanine ou un de ses dérivés substrat de Palkylguanyl transférase ; un haloalcane substrat de l'haloalcane déhalogénase en particulier un chloroalcane ; un anticorps ; un fragment d'anticorps ; un aptamère protéique ; la biotine, un composé bi-arsenic, le tnméthopnm, le méthotrexate, SLF'.
17. Dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le groupe M est une biomolécule choisie parmi . les acides nucléiques, les protéines, les sucres, les lipides, les peptides, les oligonucléotides, les intermédiaires métaboliques, les enzymes, les hormones, les neurotransmetteurs
18. Utilisation d'un dérivé de cyanine selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 en tant que marqueur fluorescent.
19. Méthode de marquage d'une biomolécule présente dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle consiste à introduire dans le milieu extracellulaire un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, comportant un agent de couplage A, ladite biomolécule comportant un domaine de couplage.
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