JP7359869B2 - 化合物及びこれを用いた蛍光標識生体物質 - Google Patents

Description

本発明は、化合物及びこれを用いた蛍光標識生体物質に関する。

様々な刺激（病気、環境変化など）に対する生体内の変化を観察するために、目的の検出対象物質に対して結合性の生体分子（抗体等）を蛍光性化合物（色素）で標識した蛍光標識生体物質が多用されている。
例えば、タンパク質混合物から特定のタンパク質を検出するウエスタンブロッティング（以下、ＷＢとも略す。）でも、上記特定のタンパク質の有無ないし存在量を、このタンパク質に対して結合性の蛍光標識抗体を用いて検出する蛍光法が利用されている。
また、生体中の生体分子、細胞及び組織等の動態及び機能等を解析するバイオイメージング技術においては、蛍光標識により可視化した生体の特定の部位を観察する生体蛍光イメージングが、生体観察の技術の一つとして利用されている。

上記蛍光標識に用いられる蛍光色素として、シアニン色素が知られている。しかし、シアニン色素を蛍光標識に用いた場合、標識後の色素間における自己会合等の相互作用が生じやすく、蛍光量子収率が低下する傾向にある。
この問題に対処した技術として、例えば、特許文献１には、インドレニン環の３位の置換基としてスルホアルキル基またはホスフェートアルキル基を有し、さらに、目標材料との結合基を有するシアニン色素が記載されている。また、特許文献２には、インドレニン環の３位の置換基として、カルボキシアルキル基等の目標材料に化学的に反応する基又は抱合を受けた物質を含むシアニン色素が記載されている。
上記特許文献１及び２によれば、各特許文献記載のシアニン色素は、標識後の色素間における自己会合が抑制され、従来のシアニン色素に比べて高い蛍光強度を示すとされる。

国際公開第２００５／０４４９２３号 国際公開第２００２／０２６８９１号

多色ＷＢでは、可視領域から近赤外領域までの範囲内において、複数の発光色を検出する。そのため、色素を励起発光させた際に互いに干渉してクロストークが起こらないように、複数の色素の吸収発光波形が適切な波長関係となるように選択する必要がある。ある励起光では１つの色素だけが光り、他の色素が光らないように調整されるのが理想的である。この観点で、例えば、多色ＷＢの近赤外領域の発光には、７００ｎｍ付近と８００ｎｍ付近という、ある程度波長の離れた２種類の励起光源が用いられている。
近赤外光励起による蛍光検出は、可視光励起による検出に比べてメンブレンの自家蛍光、すなわちバックグラウンド蛍光を抑制できるため、シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を高めやすく、目的のタンパク質を高感度に検出することが可能となる。そのため、近年、微量タンパク質の解析研究において、近赤外領域の発光を利用した蛍光検出ＷＢの必要性が増してきている。

しかし、近赤外領域では、一般的に蛍光色素の蛍光量子収率が低く、高いシグナル量を得ることが難しい。タンパク質をより高感度に観察、検出するという要望に対しては、上記特許文献１及び２記載のシアニン色素を用いた蛍光標識でも十分な蛍光強度が得られず、依然、さらなる向上が求められている。
本発明は、シアニン色素骨格を有し、近赤外領域の発色用として適した吸収波長ピークと優れた蛍光強度を示す化合物を提供することを課題とする。また本発明は、この化合物と生体物質とを結合してなる蛍光標識生体物質を提供することを課題とする。

すなわち、本発明の上記課題は、下記の手段によって解決された。

〔１〕
下記式（１）又は式（２）で表される化合物。

式中、Ｒ^１～Ｒ^４は、置換基を有していてもよいアルキル基を示す。但し、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つは置換基を有するアルキル基である。Ｒ^１とＲ^２は互いに連結して環を形成していてもよく、Ｒ^３とＲ^４は互いに連結して環を形成していてもよい。
Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７は、水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。
但し、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つがカルボキシアルキル基または生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基である場合、下記（Ｉ）又は（ＩＩ）を満たす。
（Ｉ）Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７の少なくとも１つがアルキル基もしくはアリール基である。
（ＩＩ）上記のカルボキシアルキル基または生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基に該当しないＲ^１～Ｒ^４の少なくとも１つが、スルホアルキル基を単結合又は連結基を介して有するアルキル基である。
Ｌ^１１及びＬ^１２は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。
ｎ１～ｎ４は、０～２の整数であって、ｎ１＋ｎ２≧１、ｎ３＋ｎ４≧１及びｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧３を満たす。
ｍ＝ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４－１である。
Ｘ^＋は１価のカチオンを示す。
Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくとも１つは、カルボキシ基または生体物質と結合可能な置換基を有する。
〔２〕
下記式（１－１）～式（１－６）又は式（２－１）～式（２－６）のいずれかで表される〔１〕に記載の化合物。

式中、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１１～Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２７、Ｌ^１１、Ｌ^１２及びＸ^＋は、上記の式（１）及び式（２）におけるＲ^１～Ｒ^４、Ｒ^１１～Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２７、Ｌ^１１、Ｌ^１２及びＸ^＋と同義である。
〔３〕
上記の式（１－１）、式（１－２）、式（２－１）又は式（２－２）のいずれかで表される〔２〕に記載の化合物。
〔４〕
上記のＲ^１～Ｒ^４が、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アミノカルボニル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基から選択される基を置換基として有していてもよいアルキル基であって、上記のＬ^１１及びＬ^１２が、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アミノカルボニル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基から選択される基を置換基として有していてもよいアルキル基である、〔１〕～〔３〕のいずれか１つに記載の化合物。
〔５〕
上記のＲ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２３及びＲ^２５～Ｒ^２７が水素原子であって、上記のＲ^１３及びＲ^２４が水素原子又はアルキル基である、〔１〕～〔４〕のいずれか１つに記載の化合物。
〔６〕
上記のＲ^１及びＲ^２の少なくとも１つが置換基を有するアルキル基であり、かつ、上記のＲ^３及びＲ^４の少なくとも１つが置換基を有するアルキル基である、〔１〕～〔５〕のいずれか１つに記載の化合物。
〔７〕
上記のＲ^１～Ｒ^４の少なくとも１つがスルホアルキル基である、〔１〕～〔６〕のいずれか１つに記載の化合物。
但し、上記のスルホアルキル基がスルホ基の他に置換基を有しない場合、このスルホ基のみを有するアルキル基のうち、少なくとも１つは分岐のスルホアルキル基である。
〔８〕
上記のＲ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくとも１つが、抗体と結合可能な置換基を有する〔１〕～〔７〕のいずれか１つに記載の化合物。
〔９〕
〔１〕～〔８〕のいずれか１つに記載の化合物と生体物質とが結合してなる蛍光標識生体物質。
〔１０〕
上記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである〔９〕に記載の蛍光標識生体物質。

本発明の化合物は、シアニン色素骨格を有し、近赤外領域の発色用として適した吸収波長ピークと優れた蛍光強度を示す。また、本発明の蛍光標識生体物質は本発明の化合物で標識されており、近赤外領域の発色用として適した吸収波長ピークと優れた蛍光強度を示す。

本発明において、特定の符号又は式で表示された置換基もしくは連結基等（以下、置換基等という）が複数あるとき、又は、複数の置換基等を同時に規定するときには、特段の断りがない限り、それぞれの置換基等は互いに同一でも異なっていてもよい。このことは、置換基等の数の規定についても同様である。また、複数の置換基等が近接するとき（特に、隣接するとき）には、特段の断りがない限り、それらが互いに連結して環を形成していてもよい。また、特段の断りがない限り、環、例えば脂環、芳香族環及びヘテロ環は、さらに縮環して縮合環を形成していてもよい。
本明細書において、特段の断りがない限り、二重結合については、分子内にＥ型及びＺ型が存在する場合、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。また、特段の断りがない限り、化合物としてジアステレオマー及びエナンチオマーが存在する場合には、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。

本発明において、化合物及び置換基の表示については、化合物そのもの及び置換基そのもののほか、その塩、そのイオンを含む意味に用いる。例えば、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ_２））等は、水素原子が解離して、塩構造を取っていてもよい。すなわち、本発明において、「カルボキシ基」はカルボキシ基の塩を、「スルホ基」はスルホ基の塩を、「ホスホノ基」はホスホノ基の塩を、それぞれ含む意味で使用する。この塩構造を構成する際の１価のカチオンについては、後述のＸ^＋の記載と同義であり、好ましく適用することができる。
塩構造の場合、その塩の種類は１種類でもよく、２種類以上混在していてもよく、化合物中で塩型と遊離酸構造の基が混在していてもよく、また、塩構造の化合物と遊離酸構造化合物が混在していてもよい。また、式（１）又は（２）におけるナフタレン環上の－ＳＯ_３ ^－基以外に、解離性の置換基を有していてもよく、いずれの解離性の置換基が塩型の基を取っていてもよい。
また、本発明の効果を損なわない範囲で、構造の一部を変化させたものを含む意味である。更に、置換又は無置換を明記していない化合物については、本発明の効果を損なわない範囲で、任意の置換基を有していてもよい意味である。このことは、置換基（例えば、「アルキル基」、「メチル基」、「メチル」などのように表現される基）及び連結基（例えば、「アルキレン基」、「メチレン基」、「メチレン」などのように表現される基）についても同様である。このような任意の置換基のうち、本発明において好ましい置換基は、後述の置換基群Ｔから選択される置換基である。

また、本発明において「～」を用いて表される数値範囲は、「～」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。

本発明の化合物は、下記式（１）又は式（２）で表される。本発明の化合物が、多色ＷＢに求められる優れた蛍光強度を示す理由の詳細については定かではないが、次のように考えられる。
本発明の化合物は、いずれも、各式で示されるように、２つのベンゾインドレニン環における窒素原子がポリメチン鎖によって繋がれたシアニン骨格を有する。加えて、この２つのベンゾインドレニン環における３位に位置するＲ^１～Ｒ^４の少なくとも１つが、置換基を有するアルキル基を有し、３位に位置するＲ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくとも１つが、生体物質と結合可能な置換基を有する。このため、本発明の化合物を生体物質に結合させた物質、すなわち、本発明の蛍光標識生体物質は、シアニン色素骨格平面に対して垂直方向に置換基が存在することにより、化合物同士の相互作用が抑制され、化合物の自己会合による蛍光強度の低下を抑制することができると考えられる。また、本発明の化合物は、２つのベンゾインドレニン環上に、１つの環毎に１つ以上、化合物として合計で３つ以上のスルホ基を有するため、十分な親水性をも示すことができると考えられる。
本発明の式（１）で表される化合物は６８５ｎｍ付近に励起吸収波長を有し、本発明の式（２）で表される化合物は７８５ｎｍ付近に励起吸収波長を有する。そのため、これらの式（１）又は（２）で表される化合物は、それぞれ、励起光源として７００ｎｍ付近と８００ｎｍ付近の２種類のものを有する多色ＷＢにおいても、優れた蛍光強度を示す化合物として使用できる。この点において、式（１）又は（２）で表される化合物は従来のシアニン色素に対して利便性が高い。
以下、本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物について詳述する。

＜式（１）又は式（２）で表される化合物＞
本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物は、下記の通りである。

式中、Ｒ^１～Ｒ^４は、置換基を有していてもよいアルキル基を示す。但し、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つは置換基を有するアルキル基である。Ｒ^１とＲ^２は互いに連結して環を形成していてもよく、Ｒ^３とＲ^４は互いに連結して環を形成していてもよい。
Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７は、水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。
但し、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つがカルボキシアルキル基または生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基である場合、下記（Ｉ）又は（ＩＩ）を満たす。
（Ｉ）Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７の少なくとも１つがアルキル基もしくはアリール基である。
（ＩＩ）上記のカルボキシアルキル基または生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基に該当しないＲ^１～Ｒ^４の少なくとも１つが、スルホアルキル基を単結合又は連結基を介して有するアルキル基である。
Ｌ^１１及びＬ^１２は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。
ｎ１～ｎ４は、０～２の整数であって、ｎ１＋ｎ２≧１、ｎ３＋ｎ４≧１及びｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧３を満たす。
ｍ＝ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４－１である。
Ｘ^＋は１価のカチオンを示す。
－ＳＯ_３ ^－基が置換し得るナフタレン環上に置換基を有していてもよい。
Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくとも１つは、カルボキシ基または生体物質と結合可能な置換基を有する。

Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７が上記但書きを含む規定（（Ｉ）又は（ＩＩ））を満たすことにより、上記式（１）又は（２）で表される化合物は、多環縮環構造により得られる高い蛍光量子収率と、多環縮環構造により生じやすい分子間相互作用の抑制を両立することができ、優れた蛍光強度を示すことができると考えられる。

以下、式（１）又は式（２）における置換基等について詳述する。

（Ｒ^１～Ｒ^４）
Ｒ^１～Ｒ^４は、各々独立に、置換基を有していてもよいアルキル基を示す。Ｒ^１とＲ^２は互いに連結して環を形成していてもよく、Ｒ^３とＲ^４は互いに連結して環を形成していてもよい。
Ｒ^１～Ｒ^４として採りうるアルキル基は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基と同義である。
Ｒ^１～Ｒ^４は、これらのうち少なくとも１つが置換基を有するアルキル基である限り、その他の置換基は、各々独立に、無置換のアルキル基であっても、置換基を有するアルキル基であってもよい。
無置換のアルキル基の炭素数は、１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～２がさらに好ましい。
置換基を有するアルキル基の炭素数としては、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、２～６がさらに好ましく、３～５がさらに好ましい。また、置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数としては、３～１２が好ましく、３～１０がより好ましく、３～９がさらに好ましく、４～７が特に好ましい。
置換基を有するアルキル基が上記の好ましい炭素数又は原子数を満たすことにより、優れた水溶性と分子間相互作用の抑制とを両立することができ、優れた蛍光強度を示すことができると考えられる。
本発明において、「置換基を有するアルキル基の炭素数」とは、置換基部分を含む炭素数を意味する。ただし、後述する生体物質と結合可能な置換基部分における炭素数は含めない。
本発明において、「置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数」とは、置換基部分を含む原子数を意味する。なお、スルホ基、カルボキシ基等の解離性の水素原子を有する置換基が最長鎖を構成する場合、水素原子が解離している基については鎖長を構成する原子として解離した水素原子を含めず、解離していない基については鎖長を構成する原子として水素原子を含める。また、後述する生体物質と結合可能な置換基部分における原子数は含めない。

Ｒ^１～Ｒ^４におけるアルキル基が有していてもよい置換基としては、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アミノカルボニル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。また、後述する生体物質と結合可能な置換基を挙げることができる。
但し、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つがカルボキシアルキル基または生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基である場合、下記（Ｉ）又は（ＩＩ）を満たす。なお、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）の両方を満たしていてもよい。
（Ｉ）式（１）で表される化合物においては、Ｒ^１１～Ｒ^１５の少なくともいずれか１つがアルキル基もしくはアリール基であり、式（２）で表される化合物においては、Ｒ^２１～Ｒ^２７の少なくともいずれか１つがアルキル基もしくはアリール基である。
（ＩＩ）上記のカルボキシアルキル基または生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基に該当しないＲ^１～Ｒ^４の少なくとも１つが、スルホアルキル基を単結合又は連結基を介して有するアルキル基である。
上記（ＩＩ）における連結基としては、特に制限はないが、エーテル結合、エステル結合又はアミド結合が好ましく挙げられる。
Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つがカルボキシアルキル基または生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基であって、上記（Ｉ）又は（ＩＩ）の少なくともいずれか一方を満たさない場合、色素同士の会合が起こりやすいため、優れた蛍光強度が得られない。

Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つが有する、置換基を有するアルキル基としては、上記置換基を有するアルキル基であれば特に制限はないが、分子間相互作用の抑制の観点からは、アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基の少なくとも１つを置換基として有するアルキル基が好ましく、スルホ基を有するアルキル基であることがより好ましい。
なお、上記の置換基を有するアルキル基は、アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基以外の置換基を有していてもよい。また、アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基を、それぞれ、アルコキシアルキル基、カルボキシアルキル基、スルホアルキル基及びホスホノアルキル基アルキル基として、連結基（エーテル結合、エステル結合又はアミド結合等）を介して有するアルキル基であってもよい。
上記の他、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つが有する、置換基を有するアルキル基の炭素数及び最長鎖を構成する原子数については、上述の置換基を有するアルキル基の炭素数及び最長鎖を構成する原子数の記載を好ましく適用することができる。Ｒ^１～Ｒ^４の置換基はベンゾインドレニン骨格（平面）に対し垂直方向へ張り出すため、この置換基が大きいほど縮環部分がπ－π相互作用しにくくなり（会合抑制効果が強まり）、性能が向上すると推定している。

Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つが、スルホ基の他に置換基を有しないスルホアルキル基である場合、このスルホ基のみを有するアルキル基のうち少なくとも１つは、分岐のスルホアルキル基であることが好ましい。
ここで「分岐のスルホアルキル基」とは、スルホアルキル基を構成する原子のうち炭素原子と硫黄原子とからなる分子鎖が直鎖ではなく分岐鎖である形態を意味する。
具体的には、炭素原子からなる分子鎖が分岐鎖（ただし、環構造を有する鎖を含む。）である形態、又は、炭素原子からなる分子鎖における末端の炭素原子以外の炭素原子にスルホ基を有する形態は、分岐のスルホアルキル基に該当する。また、Ｒ^１とＲ^２が互いに連結して環を形成している形態、及び、Ｒ^３とＲ^４が互いに連結して環を形成している形態も、分岐のスルホアルキル基に該当する。
Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つがスルホアルキル基であって、かつ、このスルホアルキル基がスルホ基のみを有するアルキル基である場合には、そのうちの少なくとも１つは分岐のスルホアルキル基であるという但書きを満たすことにより、上記式（１）又は（２）で表される化合物は、分子間相互作用をさらに抑制することができ、優れた蛍光強度を示すことができると考えられる。

Ｒ^１～Ｒ^４のうち置換基を有するアルキル基の数は１つ以上であればよく、１～３つが好ましい。
Ｒ^１～Ｒ^４がカルボキシ基または生体物質と結合可能な置換基のいずれも有しない場合、Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも１つが置換基を有するアルキル基であり、かつ、Ｒ^３及びＲ^４の少なくとも１つが置換基を有するアルキル基であることが、蛍光強度をさらに向上させる観点から好ましい。

（Ｒ^１１～Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２７）
Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７は、各々独立に、水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。
Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７として採りうるアルキル基及びアリール基は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基及びアリール基と同義であり、好ましい範囲も同じである。
Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７として採りうるアルキル基及びアリール基は、各々独立に、無置換であってもよく、置換基を有していてもよい。
Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７におけるアルキル基及びアリール基が有していてもよい置換基としては、後述する置換基群Ｔにおける置換基が挙げられ、例えば、アルコキシ基又はスルホ基が好ましい。また、後述する生体物質と結合可能な置換基を挙げることができる。
また、Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７の少なくともいずれかが置換基を有するアルキル基である場合、Ｒ^１～Ｒ^４が採り得る、上述した置換基を有するアルキル基の形態も好ましく適用できる。

Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２３及びＲ^２５～Ｒ^２７は、水素原子が好ましい。
Ｒ^１３及びＲ^２４は、水素原子又はアルキル基が好ましい。

（Ｌ^１１、Ｌ^１２）
Ｌ^１１及びＬ^１２は、各々独立に、置換基を有していてもよいアルキル基を示す。
Ｌ^１１及びＬ^１２におけるアルキル基が有していてもよい置換基としては、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アミノカルボニル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。また、後述する生体物質と結合可能な置換基を挙げることができる。

Ｌ^１１及びＬ^１２として採りうるアルキル基は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基と同義である。
無置換のアルキル基の炭素数は、１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましい。
置換基を有するアルキル基の炭素数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～７がさらに好ましく、１～６がさらに好ましく、１～５がさらに好ましい。また、置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数は、３～１２が好ましく、３～１０がより好ましく、３～８がさらに好ましい。

Ｌ^１１及びＬ^１２における置換基を有するアルキル基としては、置換基を有するアルキル基であれば特に制限はないが、水溶性をより向上させる観点からは、アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基の少なくとも１つを置換基として有するアルキル基が好ましく、カルボキシ基及びスルホ基の少なくとも１つを置換基として有するアルキル基がより好ましい。なお、上記の好ましい置換基（アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基）と、これらの置換基以外の基との組合わせからなる置換基を有するアルキル基であってもよい。
また、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくともいずれかが置換基を有するアルキル基である場合、Ｒ^１～Ｒ^４が採り得る、上述した置換基を有するアルキル基の形態も好ましく適用できる。

Ｌ^１１及びＬ^１２のうち、置換基を有するアルキル基の数は特に制限はないが、１つ又は２つが好ましく、２つがより好ましい。

（Ｘ^＋）
Ｘ^＋は１価のカチオンを示す。
１価のカチオンとしては、特に制限されず、例えば、Ｎａ^＋、Ｌｉ^＋及びＫ^＋等のアルカリ金属のカチオン、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋及びＢａ^２＋等のアルカリ土類金属のカチオン、並びに、トリアルキルアンモニウムイオン、テトラアルキルアンモニウムイオン等の有機アンモニウムイオンが挙げられる。

（ｎ１～ｎ４）
ｎ１～ｎ４は、各々独立に、０～２の整数であって、ｎ１＋ｎ２≧１、ｎ３＋ｎ４≧１及びｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧３を満たす。
ｎ１及びｎ３は、各々独立に、１又は２が好ましい。
ｎ２及びｎ４は、各々独立に、０又は１が好ましい。
水溶性の向上および会合抑制の観点から、ｎ１＋ｎ２及びｎ３＋ｎ４は、各々独立に、１～３の整数が好ましく、１又は２がより好ましく、２がさらに好ましい。
ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４は３～６の整数が好ましく、３～５の整数がより好ましく、３又は４がさらに好ましく、４が特に好ましい。

（ｍ）
ｍは、式（１）又は（２）で表される化合物の電荷が全体として０となるように調整される、１価のカチオンＸ^＋の数を意味する。
すなわち、ｍは、ｍ＝ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４－１を満たす。
ただし、式（１）又は（２）で表される化合物が有する全てのカチオンをｍＸ^＋で表記するものではなく、後述する親水性基におけるカルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基が有し得るカチオンについてはこの表記とは別に化合物中に含まれる。

－ＳＯ_３ ^－基が置換し得る、ベンゾインドレニン環におけるナフタレン環部分（以下、単に「ナフタレン環」とも称す。）は、本発明の効果を損なわない限り、－ＳＯ_３ ^－基以外の置換基を有していてもよく、例えば、後述する置換基群Ｔにおける置換基が好ましく挙げられる。

Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくとも１つは、カルボキシ基または後述する生体物質と結合可能な置換基を有する。
上記式（１）又は（２）で表される化合物は、上記のカルボキシ基または生体物質と結合可能な置換基により、生体物質と結合し、目的とする蛍光標識生体物質を得ることができる。なお、カルボキシ基は、生体物質と結合可能な置換基を常法により容易に誘導することができる。
本発明において、「生体物質と結合可能な置換基」は、カルボキシ基から誘導される生体物質と結合可能な置換基を含む。
このように、上記式（１）又は（２）で表される化合物は、シアニン骨格構造中において特定の位置に有する置換基（具体的には、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１又はＬ^１２）により生体物質と結合するため、得られる蛍光標識生体物質は、上述の通り、優れた蛍光強度を示すと考えられる。
Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２のうちカルボキシ基または生体物質と結合可能な置換基を有する基の数は、合計で、少なくとも１つ以上であればよく、検出対象物質の定量の観点から、１～３つが好ましく、１つ又は２つがより好ましく、１つがさらに好ましい。

上記式（１）又は（２）で表される化合物は、化合物として十分な親水性を付与する観点から、化合物全体として親水性基を４つ以上有することが好ましく、化合物全体として親水性基を４つ～８つ有することがより好ましく、化合物全体として親水性基を６つ～８つ有することがさらに好ましい。
親水性基としては、特に制限されないが、例えば、置換基を有するアルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基が挙げられる。
すなわち、上記式（１）又は（２）で表される化合物は、ナフタレン環上の－ＳＯ_３ ^－基に加えて、親水性基を有することも好ましい形態として挙げられる。ナフタレン環上の－ＳＯ_３ ^－基以外の親水性基の位置は特に制限されないが、例えば、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくともいずれかが親水性基を有する置換基であることが好ましい。

＜式（１－１）～式（１－６）又は式（２－１）～式（２－６）のいずれかで表される化合物＞
本発明の式（１）で表される化合物は下記式（１－１）～式（１－６）のいずれかで表されることが好ましく、式（１－１）又は式（１－２）のいずれかで表されることがより好ましい。また、本発明の式（２）で表される化合物は下記式（２－１）～式（２－６）のいずれかで表されることが好ましく、式（２－１）又は式（２－２）のいずれかで表されることがより好ましい。

式中、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１１～Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２７、Ｌ^１１、Ｌ^１２及びＸ^＋は、上記の式（１）及び式（２）におけるＲ^１～Ｒ^４、Ｒ^１１～Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２７、Ｌ^１１、Ｌ^１２及びＸ^＋とそれぞれ同義であり、好ましいものも同じである。

以下に、本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物のうち、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくともいずれか１つにカルボキシ基を少なくとも有する具体例を以下に示すが、本発明はこれらの化合物に限定されない。下記具体例において、カルボキシ基及びスルホ基等の解離性の水素原子を有する基については、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。下記具体例において、Ｅｔ_３ＮＨ^＋はトリエチルアンモニウムカチオンを示す。

本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物は、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくとも１つが有する生体物質と結合可能な置換基によって、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖及び脂質などの生体物質に結合させることができ、蛍光標識生体物質として用いることができる。
生体物質と結合可能な置換基としては、生体物質に作用（付着を含む）もしくは結合するための基であれば、特に制限することなく用いることができ、特許文献２等に記載の置換基を挙げることができる。なかでも、ＮＨＳエステル構造、マレイミド構造、アジド基、アセチレン基、ペプチド構造（ポリアミノ酸構造）、長鎖アルキル基（好ましくは、炭素数１２～３０）、４級アンモニウム基が好ましく挙げられる。

本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物のうち、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくともいずれか１つに生体物質と結合可能な置換基を少なくとも有する化合物の具体例としては、例えば、後記蛍光標識生体物質における例示化合物が挙げられる。また、上記本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物における例示化合物において、生体物質と結合可能な置換基を後記蛍光標識生体物質における例示化合物として示すようにして有する形態も、具体例として挙げられる。なお、本発明はこれらの化合物に限定されない。例えば、これらの具体例において、カルボキシ基及びスルホ基等の解離性の水素原子を有する基については、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。

本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物は、化合物構造を式（１）又は式（２）で規定する構造とすること以外は、公知の方法で合成できる。例えば、特許文献１、特許文献２等に記載の方法が挙げられる。
生体物質に結合可能な置換基を有する化合物は、化合物構造を式（１）又は式（２）で規定する構造とすること以外は、公知の方法で合成できる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著）を参照することができる。

＜＜蛍光標識生体物質＞＞
本発明の蛍光標識生体物質は、本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物と生体物質とが結合した物質である。本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物は蛍光性を有し、近赤外領域の発色用として適した吸収波長ピークと優れた蛍光強度を示すため、蛍光標識生体物質に好ましく用いることができる。式（１）又は式（２）で表される化合物と生体物質との結合は、式（１）又は式（２）で表される化合物と生体物質とが直接結合した形態でもよいし、連結基を介して連結した形態でもよい。

上記生体物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖及び脂質が好ましく挙げられる。タンパク質としては抗体が好ましく挙げられ、脂質としてはリン脂質、脂肪酸及びステロールが好ましく挙げられ、リン脂質がより好ましい。
上記生体物質のうち、臨床病理的に有用な物質としては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｉｇ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の免疫グロブリン、補体、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、フェリチン、α_１マイクログロブリン、β_２マイクログロブリン等の血漿タンパク及びそれらの抗体、α－フェトプロテイン、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立線性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）１９－９、ＣＡ‐１２５等の腫瘍マーカー及びそれらの抗体、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）、エストロゲン、インスリン等のホルモン類及びそれらの抗体、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）関連抗原（ＨＢｓ、ＨＢｅ、ＨＢｃ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のウイルス感染関連物質及びそれらの抗体、等が挙げられる。
さらに、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ、梅毒トレポネーマ等のバクテリア及びそれらの抗体、トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニア、トリバノゾーマ、マラリア原虫等の原虫類及びそれらの抗体、ＥＬＭ３、ＨＭ１、ＫＨ２、ｖ６．５、ｖ１７．２、ｖ２６．２（由来マウス１２９、１２９／ＳＶ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ）等のＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）及びそれらの抗体、フェニトイン、フェノバルビタール等の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキニシン等の心血管薬、テオフィリン等の抗喘息薬、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン等の抗生物質等の薬物類及びそれらの抗体、その他の酵素、菌体外毒素（スチレリジンＯ等）及びそれらの抗体等も挙げられる。また、Ｆａｂ’２、Ｆａｂ、Ｆｖ等の抗体断片も用いる事ができる。

本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物（以下、化合物（１）又は（２）とも略す。）と生体物質が相互作用して結合した具体的な形態としては、例えば、下記に記載する形態が挙げられる。
ｉ）化合物（１）又は（２）中のペプチドと生体物質中のペプチドとの非共有結合（例えば、水素結合、キレート形成を含むイオン結合）又は共有結合、
ｉｉ）化合物（１）又は（２）中の長鎖アルキル基と生体物質中の脂質二重膜及び脂質などとのファンデルワールス力、
ｉｉｉ）化合物（１）又は（２）中のＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）と生体物質中のアミノ基との反応によるアミド結合、
ｉｖ）化合物（１）又は（２）中のマレイミド基と生体物質中のスルファニル基（－ＳＨ）との反応によるチオエーテル結合、
ｖ）化合物（１）又は（２）中のアジド基と生体物質中のアセチレン基とのＣｌｉｃｋ反応又は化合物（１）又は（２）中のアセチレン基と生体物質中のアジド基とのＣｌｉｃｋ反応によるトリアゾール環の形成、
が挙げられる。
上記ｉ）～ｖ）の形態以外にも、例えば、Lucas C. D. de Rezende and Flavio da Silva Emery,. A Review of the Synthetic Strategies for the Development of BODIPY Dyes for Conjugation with Proteins, Orbital: The Electronic Journal of Chemistry, 2013, Vol 5, No. 1, p.62-83に記載の形態により結合することができる。また、本発明の蛍光標識生体物質の作製においても、同文献に記載の方法等を適宜参照することができる。

以下に、本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物のうち、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくともいずれか１つに生体物質と結合可能な置換基を少なくとも有する化合物と、これと相互作用により結合する生体物質とから得られる本発明の蛍光標識生体物質の具体例を示すが、本発明はこれらの化合物等に限定されない。下記具体例において、スルホ基等の解離性の水素原子を有する基については、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。Ｅｔはエチル基を示す。

＜蛍光標識生体物質を含む試薬＞
本発明の蛍光標識生体物質を含む試薬において、本発明の蛍光標識生体物質は、例えば、生理食塩水及びリン酸緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液形態、並びに、微粒子状粉末及び凍結乾燥粉末等の固形形態等、特に制限されることなく、使用目的等に応じてその形態を適宜選択することができる。
例えば、蛍光標識試薬として本発明の蛍光標識生体物質を用いる場合に、上記いずれかの形態の蛍光標識生体物質を含む試薬として使用することもできる。

＜蛍光標識生体物質の用途＞
本発明の式（１）又は式（２）で表される化合物から得られる本発明の蛍光標識生体物質は、優れた蛍光強度を示すことができ、光照射により励起された蛍光標識生体物質から放出される蛍光を安定的に検出することができる。このため、本発明の蛍光標識生体物質は、蛍光標識を用いた種々の技術に適用することができ、例えば、多色ＷＢにおける蛍光標識試薬及び生体蛍光イメージング試薬として好適に用いることができる。

本発明の蛍光標識生体物質を用いて行う蛍光検出は、通常、以下（ｉ）～（ｉｉｉ）または（ｉｖ）～（ｖｉｉ）の工程を含む。（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を含む蛍光検出は、本発明の化合物で蛍光標識した一次抗体を用いる直接法に該当し、（ｉｖ）～（ｖｉｉ）の工程を含む蛍光検出は、本発明の化合物で蛍光標識した二次抗体を用いる間接法に該当する。
（ｉ）下記（ａ）及び（ｂ）をそれぞれ用意する工程
（ａ）標的とする生体物質（以下、「標的生体物質」とも称す。）を含む試料
（ｂ）上記（ａ）における標的生体物質と結合可能な生体物質（以下、「一次生体物質」とも称す。）と、本発明の化合物と、が結合した本発明の蛍光標識生体物質（以下、「本発明の蛍光標識生体物質Ａ」とも称す。）
（ｉｉ）上記（ａ）における標的生体物質と、上記（ｂ）の本発明の蛍光標識生体物質Ａにおける一次生体物質と、が結合した結合体（以下、「蛍光標識された結合体Ａ」とも称す。）を用意する工程
（ｉｉｉ）上記の蛍光標識された結合体Ａに、本発明の蛍光標識生体物質Ａが吸収する波長域の光を照射し、本発明の蛍光標識生体物質Ａが発する蛍光を検出する工程

（ｉｖ）下記（ｃ）～（ｅ）をそれぞれ用意する工程
（ｃ）標的生体物質を含む試料
（ｄ）上記（ｃ）における標的生体物質と結合可能な生体物質（以下、「一次生体物質」とも称す。）
（ｅ）上記（ｄ）の一次生体物質と結合可能な生体物質（以下、「二次生体物質」とも称す。）と、本発明の化合物と、が結合した本発明の蛍光標識生体物質（以下、「本発明の蛍光標識生体物質Ｂ」とも称す。）
（ｖ）上記（ｃ）における標的生体物質と、上記（ｄ）の一次生体物質と、が結合した結合体（以下、「結合体ｂ」とも称す。）を用意する工程
（ｖｉ）上記結合体ｂにおける一次生体物質と、本発明の蛍光標識生体物質Ｂにおける二次生体物質と、が結合した結合体（以下、「蛍光標識された結合体Ｂ２」とも称す。）を用意する工程
（ｖｉｉ）上記の蛍光標識された結合体Ｂ２に、本発明の蛍光標識生体物質Ｂが吸収する波長域の光を照射し、本発明の蛍光標識生体物質Ｂが発する蛍光を検出する工程

上記の標的生体物質と結合可能な生体物質（一次生体物質）、及び、一次生体物質と結合可能な生体物質（二次生体物質）としては、上記本発明の蛍光標識生体物質における生体物質が挙げられる。標的生体物質（被検体中の生体物質）又は一次生体物質にあわせて適宜選択することができ、被検体中の生体物質又は一次生体物質に対して特異的に結合可能な生体物質を選択することができる。

上記標的生体物質のうち、タンパク質としては、いわゆる疾患マーカーが挙げられる。疾患マーカーとしては、特に制限はされるものではないが、例えば、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ＩＩ）、ＢＣＡ２２５（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、ＣＡ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＣＡ５４／６１（ＣＡ５４６）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＤＵＰＡＮ－２、エラスターゼ１、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９、γ－セミノプロテイン（γ－Ｓｍ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、Ｉｂａ１、アミロイドβ、タウ、フロチリン、扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ抗原）、シアリルＬｅＸ－ｉ抗原（ＳＬＸ）、ＳＰａｎ－１、組織ポリペプタイド抗原（ＴＰＡ）、シリアルＴｎ抗原（ＳＴＮ）、シフラ（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ：ＣＹＦＲＡ）ペプシノゲン（ＰＧ）、Ｃ－反応性タンパク（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡタンパク（ＳＡＡ）、ミオグロビン、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、トロポニンＴ、心室筋ミオシン軽鎖Ｉ等が挙げられる。

上記標的生体物質は細菌でもよく、この細菌としては、細胞微生物学的検査の対象とされる細菌が挙げられ、特に制限されるものではないが、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、レジオネラ菌、公衆衛生に問題を生じる菌等が挙げられる。

上記標的生体物質はウイルスでもよく、このウイルスとしては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルスの抗原等の肝炎ウイルス抗原、ＨＩＶウイルスのｐ２４タンパク抗原、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）のｐｐ６５タンパク抗原、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）のＥ６及びＥ７タンパク等が挙げられる。

上記（ｉ）または（ｉｖ）において、標的生体物質を含む試料は、特に制限されることなく、常法に従って調製することができる。
また、本発明の蛍光標識生体物質も、特に制限されることなく、標的生体物質と結合可能な生体物質と本発明の化合物とを常法に従って結合させて調製することができる。結合の形態及び結合を形成する反応は、上記本発明の蛍光標識生体物質で説明した通りである。

上記（ｖ）において、標的生体物質と一次生体物質とは、直接結合させても、標的生体物質及び一次生体物質とは異なるその他の生体物質を介して結合させてもよい。また、上記（ｖｉ）において、結合体ｂにおける一次生体物質と、本発明の蛍光標識生体物質Ｂにおける二次生体物質とは、直接結合させても、一次生体物質及び二次生体物質とは異なるその他の生体物質を介して結合させてもよい。
本発明の蛍光標識生体物質は、直接法及び間接法のいずれにおける蛍光標識抗体としても用いることができるが、間接法における蛍光標識抗体として用いることが好ましい。
上記（ｉｉ）または（ｖ）及び（ｖｉ）において、本発明の蛍光標識生体物質等と標的生体物質との結合は、特に制限されることなく、常法に従って行うことができる。

上記（ｉｉｉ）または（ｖｉｉ）において、本発明の蛍光標識生体物質を励起するための波長は、本発明の蛍光標識生体物質を励起可能な発光波長（波長光）であれば特に限定されない。
化合物（１）を用いた蛍光標識生体物質は、６８５ｎｍ付近（６６０～７２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は６３０～７５０ｎｍが好ましく、６５０～７３０ｎｍがより好ましい。化合物（１）を用いた蛍光標識生体物質は、多色ＷＢの近赤外領域における７００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す蛍光標識生体物質として、好適に用いることができる。
化合物（２）を用いた蛍光標識生体物質は、７８５ｎｍ付近（７６０～８２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は７３０～８５０ｎｍが好ましく、７５０～８３０ｎｍがより好ましい。化合物（２）を用いた蛍光標識生体物質は、多色ＷＢの近赤外領域における８００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す蛍光標識生体物質として、好適に用いることができる。

本発明に用いられる蛍光励起光源としては、本発明の蛍光標識生体物質を励起可能な発光波長（波長光）を発光するものであれば特に限定されず、例えば、各種レーザー光源を用いることができる。また、各種光学フィルターを用いて、好ましい励起波長を得たり、蛍光のみを検出したりする事ができる。

上記（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるその他の事項については、特に制限されることなく、蛍光標識を用いる蛍光検出において通常用いられる手法、試薬、装置等の条件を適宜選択することができる。
また、上記（ｉ）～（ｖｉｉ）以外の工程についても、蛍光標識を用いる種々の手法にあわせて、通常用いられる手法、試薬、装置等の条件を適宜選択することができる。

例えば、本発明の蛍光標識生体物質を用いた多色ＷＢは、標的生体物質として通常用いられる手法（電気泳動によるタンパク質の分離、メンブレンへのブロッティング、メンブレンのブロッキング）によりブロットメンブレンを作製し、本発明の蛍光標識生体物質を標識抗体（好ましくは、二次抗体）として用いることにより、優れた蛍光強度で標的生体物質を検出することができる。

－ 置換基群Ｔ －
本発明において、好ましい置換基としては、下記置換基群Ｔから選ばれる置換基が挙げられる。
また、本明細書において、単に置換基としてしか記載されていない場合は、この置換基群Ｔを参照するものであり、各々の基、例えば、アルキル基、が記載されているのみの場合は、この置換基群Ｔの対応する基が好ましく適用される。
さらに、本明細書において、アルキル基を環状（シクロ）アルキル基と区別して記載している場合、アルキル基は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を包含する意味で用いる。一方、アルキル基を環状アルキル基と区別して記載していない場合、及び、特段の断りがない場合、アルキル基は、直鎖アルキル基、分岐アルキル基及びシクロアルキル基を包含する意味で用いる。このことは、環状構造を採りうる基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等）を含む基（アルコキシ基、アルキルチオ基、アルケニルオキシ基等）、環状構造を採りうる基を含む化合物についても同様である。基が環状骨格を形成しうる場合、環状骨格を形成する基の原子数の下限は、この構造を採りうる基について下記に具体的に記載した原子数の下限にかかわらず、３以上であり、５以上が好ましい。
下記置換基群Ｔの説明においては、例えば、アルキル基とシクロアルキル基のように、直鎖又は分岐構造の基と環状構造の基とを明確にするため、これらを分けて記載していることもある。

置換基群Ｔに含まれる基としては、下記の基を含む。
アルキル基（好ましくは炭素数１～３０、より好ましくは炭素数１～２０、さらに好ましくは炭素数１～１２、さらに好ましくは炭素数１～８、さらに好ましくは炭素数１～６、特に好ましくは炭素数１～３）、アルケニル基（好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは炭素数２～２０、さらに好ましくは炭素数２～１２、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４）、アルキニル基（好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは炭素数２～２０、さらに好ましくは炭素数２～１２、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４）、シクロアルキル基（好ましくは炭素数３～２０）、シクロアルケニル基（好ましくは炭素数５～２０）、アリール基（単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２～６環の縮環の基）であってもよい。縮環の基である場合、５～７員環等からなる。アリール基は好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～３０、さらに好ましくは炭素数６～２６、特に好ましくは炭素数６～１０）、ヘテロ環基（環構成原子として少なくとも１つの窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子又はセレン原子を有し、単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２～６環の縮環の基）であってもよい。単環の基である場合、その環員数は５～７員が好ましく、５員又は６員がより好ましい。ヘテロ環基の炭素数は好ましくは２～４０、より好ましくは２～２０である。ヘテロ環基は芳香族ヘテロ環基（ヘテロアリール基）及び脂肪族ヘテロ環基（脂肪族複素環基）が包含される。）、アルコキシ基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数１～１２）、アルケニルオキシ基（好ましくは炭素数２～２０、より好ましくは炭素数２～１２）、アルキニルオキシ基（好ましくは炭素数２～２０、より好ましくは炭素数２～１２）、シクロアルキルオキシ基（好ましくは炭素数３～２０）、アリールオキシ基（好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～２６、さらに好ましくは炭素数６～１４）、ヘテロ環オキシ基（好ましくは炭素数２～２０）、

アルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数２～２０）、シクロアルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数４～２０）、アリールオキシカルボニル基（好ましくは炭素数６～２０）、アミノ基（好ましくは炭素数０～２０で、無置換アミノ基（－ＮＨ_２）、（モノ－又はジ－）アルキルアミノ基、（モノ－又はジ－）アルケニルアミノ基、（モノ－又はジ－）アルキニルアミノ基、（モノ－又はジ－）シクロアルキルアミノ基、（モノ－又はジ－）シクロアルケニルアミノ基、（モノ－又はジ－）アリールアミノ基、（モノ－又はジ－）ヘテロ環アミノ基を含む。無置換アミノ基を置換する上記各基は置換基群Ｔの対応する基と同義である。）、スルファモイル基（好ましくは炭素数０～２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのスルファモイル基が好ましい。）、アシル基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数２～１５）、アシルオキシ基（好ましくは炭素数１～２０）、カルバモイル基（好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのカルバモイル基が好ましい。）、

アシルアミノ基（好ましくは炭素数１～２０）、スルホンアミド基（好ましくは炭素数０～２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのスルホンアミド基が好ましい。）、アルキルチオ基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数１～１２）、シクロアルキルチオ基（好ましくは炭素数３～２０）、アリールチオ基（好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～２６、さらに好ましくは炭素数６～１４）、ヘテロ環チオ基（好ましくは炭素数２～２０）、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基（好ましくは炭素数１～２０）、

シリル基（好ましくは炭素数１～３０、より好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、アリール、アルコキシもしくはアリールオキシが置換したシリル基が好ましい。）、シリルオキシ基（好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、アリール、アルコキシもしくはアリールオキシが置換したシリルオキシ基が好ましい。）、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）、酸素原子（具体的には、環を構成する＞ＣＨ_２を＞Ｃ＝Ｏに置き換える）、カルボキシ基（－ＣＯ_２Ｈ）、ホスホノ基〔－ＰＯ（ＯＨ）_２〕、ホスホノオキシ基〔－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）_２〕、スルホ基（－ＳＯ_３Ｈ）、ホウ酸基〔－Ｂ（ＯＨ）_２〕、オニオ基（環状アンモニオを含むアンモニオ基、スルホニオ基（－ＳＨ_２ ^＋）、ホスホニオ基（－ＰＨ_３ ^＋）を含み、好ましくは炭素数０～３０、より好ましくは１～２０）、スルファニル基（－ＳＨ）、アミノ酸残基、又は、ポリアミノ酸残基が挙げられる。
また、カルボキシ基、ホスホノ基、スルホ基、オニオ基、アミノ酸残基、又は、ポリアミノ酸残基を置換基として有する上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アミノ基、スルファモイル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホンアミド基、アルキルチオ基、シクロアルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基が挙げられる。

置換基群Ｔから選ばれる置換基は、より好ましくは、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、シクロアルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アミノ基、アシルアミノ基、シアノ基又はハロゲン原子であり、特に好ましくは、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、アシルアミノ基又はシアノ基である。

置換基群Ｔから選ばれる置換基は、特段の断りがない限り、上記の基を複数組み合わせてなる基をも含む。例えば、化合物又は置換基等がアルキル基、アルケニル基等を含むとき、これらは置換されていても置換されていなくてもよい。また、アリール基、ヘテロ環基等を含むとき、それらは単環でも縮環でもよく、置換されていても置換されていなくてもよい。

以下に実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。

実施例で用いた化合物（１）～（６）、比較化合物（１）～（３）を、以下に示す。
なお、実施例化合物において、特に記載しない場合にも、スルホ基およびカルボキシ基は塩構造（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、あるいはＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）塩）を含んでいてもよい。Ｅｔはエチル基を示す。

比較化合物（１）は特開２０１０－１９５７６４号に記載の式（８）の化合物である。
比較化合物（２）は国際公開第２００５／０４４９２３号に記載の化合物（３）である。比較化合物（３）は国際公開第２００２／０２６８９１号に記載の化合物（２１）である。
比較化合物（１）～（３）は、それぞれ、各文献記載の方法により、合成した。
また、比較標識抗体（１）～（３）は、後述する標識抗体（１）の合成方法と同様の方法により、合成した。

以下に、各実施例で用いる化合物（１）～（６）及びこれらの化合物に対応する各標識抗体の合成方法を詳しく説明するが、出発物質、色素中間体及び合成ルートはこれらに限定されるものではない。
以下の合成ルートにおいて、室温とは２５℃を意味する。

特に記載のない場合、逆相カラムクロマトグラフィーにおける担体は、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）またはＳｆａｒ Ｃ１８（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を使用した。溶離液における混合比は、容量比である。例えば、「アセトニトリル：水＝０：１００→２０：８０」は、「アセトニトリル：水＝０：１００」の溶離液を「アセトニトリル：水＝２０：８０」の溶離液へ変化させたことを意味する。
分取ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、２７６７（商品名、ｗａｔｅｒｓ社製）〕を使用した。

ＭＳスペクトルは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＳＱＤ ＬＣ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ〔Ｗａｔｅｒｓ社製、イオン化法：ＥＳＩ（ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、エレクトロスプレーイオン化）〕又はＬＣＭＳ－２０１０ＥＶ〔島津製作所社製、イオン化法：ＥＳＩ及びＡＰＣＩ（Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＣｈｅｍｉｃａｌＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ、大気圧化学イオン化）を同時に行うイオン化法〕を用いて測定した。
特に記載のない場合、ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ^＋］^＋は、化合物から対カチオンであるＥｔ_３ＮＨ^＋が全て除かれ、化合物としての電荷が＋１となるようにＨ^＋が付加された値を意味し、ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｈ^＋］^－は、化合物から対カチオンであるＥｔ_３ＮＨ^＋が全て除かれ、化合物としての電荷が－１となるようにＨ^＋が除かれた値を意味する。

［合成例１］
下記のスキームに基づき、化合物（１）を合成した。

１）化合物（１－Ｂ）の合成
化合物（１－Ａ）１０ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌ、蒸留水３．３ｍｌ、炭酸ナトリウム３．１ｇ及び３－ブロモ－３－メチル－２－ブタノン７．４２ｇを２００ｍｌ３つ口フラスコに入れ、窒素雰囲気下９０℃にて１２時間加熱攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、そこへ１０％塩酸水溶液を１５ｍｌ添加し、９０℃にて１２時間加熱攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、メタノールに分散させろ過を施した。ろ液を減圧濃縮し、アセトンを加えて沈殿を生じさせ、上澄みをデカンテーションにて除去した。この粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（アセトニトリル／水＝０／１００→１０／９０）にて精製することで化合物（１－Ｂ）３．８ｇを得た。

２）化合物（１－Ｃ）の合成
化合物（１－Ｂ）５００ｍｇ、スルホラン２ｍｌ、６－ブロモヘキサン酸３６５ｍｇ及びトリエチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ）０．１６９ｍｌを５０ｍｌナスフラスコに入れ、１２０℃でに６時間反応させた。そこへ、酢酸エチルを加え、沈殿を生じさせた。沈殿物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２０／１００）にて精製し、化合物（１－Ｃ）１００ｍｇを得た。

３）化合物（１－Ｆ）の合成
窒素置換した５０ｍｌ三ツ口フラスコに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１５ｍｌ、水素化ナトリウム１．６７ｇを入れ、攪拌しているところに化合物（１－Ｄ）５．１ｍｌを滴下し、しばらく攪拌した。次に、２，４－ブタンスルトン４．１ｍｌを滴下し加熱攪拌した。８０℃にて３０分攪拌した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍｌを追加し、４時間反応させた。溶媒を減圧留去し、酢酸エチル及び蒸留水で分液操作を施し、蒸留水により粗生成物を抽出した。得られた粗生成物に３０％塩酸水溶液１８ｍｌを加え、１００℃にて３時間反応させた。その後、溶媒を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／メタノール＝０／１００→２５／７５）で精製することで、化合物（１－Ｆ）３ｇを得た。

４）化合物（１－Ｇ）の合成
１Ｌ三ツ口フラスコに化合物（１－Ａ）２０ｇ、蒸留水１２０ｍｌを入れ、攪拌しているところへ、３０％塩酸水溶液と蒸留水４０ｍｌとを混合した溶液を滴下した。塩氷浴で冷却し、３℃以下を維持しながら、亜硝酸ナトリウム４．２２ｇを蒸留水８０ｍｌに溶かした溶液をゆっくり滴下し、その後０～３℃で４５分間攪拌した。続いて、塩化スズ（II）２１ｇを蒸留水６０ｍｌと３０％ＨＣｌ ２０ｍｌに溶解した溶液をゆっくり滴下し、その後４０分間７℃以下で攪拌した。その後、反応液にイソプロパノールを加え、沈殿物を生成させた後、吸引ろ過により、化合物（１－Ｇ）１５ｇを得た。

５）化合物（１－Ｈ）の合成
２００ｍｌナスフラスコに化合物（１－Ｇ）２．０ｇ、酢酸（ＡｃＯＨ）３０ｍｌ、化合物（１－Ｆ）２．１ｍｌ、酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）１．２４ｇを入れ、窒素雰囲気下１４０℃にて１時間反応させた。室温に戻し、酢酸エチル９０ｍｌを加え、生成した沈殿物をろ過した。ろ物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２５／７５）で精製し、化合物（１－Ｈ）１ｇを得た。

６）化合物（１－Ｉ）の合成
５０ｍｌナスフラスコに化合物（１－Ｈ）２００ｍｇ、スルホラン２ｍｌ、１，３－プロパンスルトン０．７２ｍｌ、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン０．１４２ｍｌを入れ、１２０℃で１．５時間反応させた。室温に戻し、酢酸エチルを加えて沈殿を生成させ、上澄みをデカンテーションで除去した。得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００）にて精製し、化合物（１－Ｉ）１５２ｍｇを得た。

７）化合物（１－Ｊ）の合成
試験管に化合物（１－Ｉ）５ｍｇ、ジメチルスルホキシド０．１ｍｌ、メタノール（ＭｅＯＨ）０．１ｍｌを入れ、超音波処理を施した。攪拌しながら、グルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩１．８ｍｇ、無水酢酸（Ａｃ_２Ｏ）３μｌ、トリエチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ）２．４μｌを加え、窒素雰囲気下にてしばらく攪拌させた。反応収束後、酢酸エチル１８ｍｌを加えて沈殿を生じさせ、沈殿物をろ過で採取し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２５／７５）にて精製し、化合物（１－Ｊ）８ｍｇを得た。この反応と精製を３回繰り返し、化合物（１－Ｊ）２２ｍｇを得た。

８）化合物（１）の合成
５０ｍｌナスフラスコに、化合物（１－Ｃ）８ｍｇ、化合物（１－Ｊ）１６ｍｇ、メタノール０．６ｍｌ、無水酢酸８μｌ、トリエチルアミン６μｌを加え、窒素雰囲気下で室温にて１６時間攪拌した。メタノール２ｍｌを加えた後に、酢酸エチル３０ｍｌを加えて沈殿物を生じさせ、生成した沈殿物をろ別した。これを分取ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥を施した。精製物を解凍した後、メタノールと微量のトリエチルアミンを添加して３０分間攪拌した後、遠心エバポレーターにて溶媒留去、乾燥させることで化合物（１）２ｍｇを得た。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ^＋）^＋＝１１５９、（Ｍ－Ｈ^＋）^－＝１１５７

９）標識抗体（１）の合成

化合物（１）に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド０．２８ｍｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ＴＥＴＲＡＭＥＴＨＹＬ－Ｏ－（Ｎ－ＳＵＣＣＩＮＩＭＩＤＹＬ）ＵＲＯＮＩＵＭ ＨＥＸＡＦＬＵＯＲＯＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ０．７ｍｇを溶解させたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液、及びトリエチルアミンを加えて３時間攪拌させた。その後、酢酸エチルを加えて上澄みを除去し、真空乾燥を施すことで化合物（１－ＮＨＳ）を得た。
マイクロチューブに、抗ウサギＩｇＧ抗体（２．３ｍｇ／ｍｌ）２１７μｌ、炭酸塩バッファー２１．７μｌを入れ、振とう撹拌を施し、そこへ化合物（１－ＮＨＳ）のジメチルスルホキシド溶液を抗体に対して３等量のモル比になるように加え、振とう撹拌を行った。室温にて１時間静置させ、反応液をゲルろ過カラムクロマトグラフィーＰＤ１０（ＧＥヘルスケア ライフサイエンス社製）とＰＢＳ溶液を用いて精製を施し、標識抗体（１）を得た。

［合成例２］
下記のスキームに基づき、化合物（２）を合成した。

５０ｍｌナスフラスコに化合物（１－Ｈ）５０ｍｇ、６－ブロモヘキサン酸３４１ｍｇ、スルホラン１ｍｌ、蒸留水０．１ｍｌを入れ、１３０℃にて３０分攪拌した。室温に戻し、酢酸エチルを加えて沈殿を生じさせ、上澄みを除去した。沈殿物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→１５／８５）にて精製し、化合物（２－Ａ）１００ｍｇを得た。
化合物（１）の合成における化合物（１－Ｃ）を上記化合物（２－Ａ）に置き換え、その他は同様にして化合物（２）を合成した。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ^＋）^＋＝１２８１、（Ｍ－Ｈ^＋）^－＝１２７９

標識抗体（２）の合成

標識抗体（１）の合成において、化合物（１）を化合物（２）に置き換え、その他は同様にして標識抗体（２）を合成した。

［合成例３］
下記のスキームに基づき、化合物（３）を合成した。

化合物（１－Ｈ）の合成において、化合物（１－Ａ）を化合物（３－Ａ）に置き換え、その他は同様にして化合物（３－Ｃ）を得た。また、化合物（２－Ａ）の合成において、化合物（１－Ｈ）を化合物（３－Ｃ）に置き換え、その他は同様にして化合物（３－Ｄ）を得た。
化合物（１）の合成において、化合物（１－Ｈ）を化合物（３－Ｃ）に置き換え、１，３－プロパンスルトンを２，４－ブタンスルトンに置き換え、化合物（１－Ｃ）を化合物（３－Ｄ）に置き換え、その他は同様にして化合物（３）を合成した。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ^＋）^＋＝１２９５、（Ｍ－Ｈ^＋）^－＝１２９３

標識抗体（３）の合成

標識抗体（１）の合成において、化合物（１）を化合物（３）に置き換え、その他は同様にして標識抗体（３）を合成した。

［合成例４］
下記のスキームに基づき、化合物（４）を合成した。

１）化合物（４－Ｂ）の合成
１Ｌナスフラスコに化合物（１－Ｄ）２５ｍｌ、６－ブロモヘキサン酸エチル３４ｍｌ、エタノール２００ｍｌ、２．６８Ｍのナトリウムエトキシド／エタノール溶液６７．４ｍｌを入れ、９０℃で１２時間反応させた。吸引ろ過を施し、ろ液を減圧濃縮し、そこへ１Ｍ塩酸水溶液を１００ｍｌ、クロロホルム１００ｍｌを加え、分液操作を施した。有機層を除去し、再度クロロホルム１００ｍｌで洗浄し、有機層を除去した。硫酸マグネシウムで乾燥を施した後、上澄みを採り減圧濃縮を行った。得られた粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（１００／０→８５／１５）を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物（４－Ａ）を得た。
次に、５００ｍｌ三ツ口フラスコに得られた化合物（４－Ａ）全量をそのまま用い、メタノール３００ｍｌ、水酸化ナトリウム１０ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶かした溶液を入れ、９０℃にて１２時間反応させた。反応液を減圧濃縮し、３０％塩酸水溶液２５ｍｌを滴下し、ｐＨ１以下にした。酢酸エチル１５０ｍｌを加えて分液操作を施し、有機層を除去した後に再度酢酸エチル１００ｍｌを添加して有機層を除去した。硫酸マグネシウムで乾燥を施し、上澄みを減圧濃縮することで、化合物（４－Ｂ）１０ｇを得た。

２）化合物（４－Ｄ）の合成
化合物（１－Ｈ）の合成における化合物（１－Ｆ）を化合物（４－Ｂ）に置き換え、その他は化合物（１－Ｈ）の合成方法と同様にして、化合物（４－Ｄ）を合成した。

３）化合物（４－Ｅ）の合成
５０ｍｌナスフラスコに化合物（４－Ｄ）１５０ｍｇ、メタノール１０ｍｌ、酢酸カリウム４５ｍｇを加え、５分間攪拌した後、減圧濃縮を施した。次に２，４－ブタンスルトン１．５ｍｌ、蒸留水１５０μｌを加え、１４０℃で２時間反応させた。室温に戻し、酢酸エチルを加えて沈殿を生じさせ、上澄みを除去した。真空乾燥を施した後、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２５／７５）にて精製し、化合物（４－Ｅ）４０ｍｇを得た。

４）化合物（４－Ｆ）の合成
化合物（１－Ｊ）の合成における化合物（１－Ｉ）を化合物（４－Ｅ）に置き換え、その他は化合物（１－Ｊ）と同様の合成方法にて、化合物（４－Ｆ）を合成した。

５）化合物（４）の合成
化合物（３）の合成における化合物（３－Ｆ）を化合物（４－Ｆ）に置き換え、その他は化合物（３）の合成方法と同様にして、化合物（４）を合成した。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ^＋）^＋＝１４０９、（Ｍ－Ｈ^＋）^－＝１４０７

６）標識抗体（４）の合成

標識抗体（１）の合成において、化合物（１）を化合物（４）に置き換え、その他は同様にして標識抗体（４）を合成した。

［合成例５］
下記のスキームに基づき、化合物（５）を合成した。

１）化合物（５－Ａ）の合成
１０ｍｌナスフラスコに化合物（１－Ｂ）３００ｍｇ、２，４－ブタンスルトン１．５１ｍｌ、酢酸ナトリウム０．２０ｍｌを入れ、１４０℃にて４時間反応させた。室温に戻し、アセトンを加えて沈殿を生じさせ、ろ過により沈殿物を採取した後、ろ物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→５／９５）により精製することで、化合物（５－Ａ）１００ｍｇを得た。

２）化合物（５－Ｃ）の合成
化合物（１－Ｊ）の合成において、化合物（１－Ｉ）を化合物（５－Ａ）に、グルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩を化合物（５－Ｂ）に置き換え、それ以外は化合物（１－Ｊ）の合成方法と同様にして、化合物（５－Ｃ）を合成した。

３）化合物（５－Ｄ）の合成
５０ｍｌナスフラスコに化合物（４－Ｄ）１５０ｍｇ、メタノール１０ｍｌ、酢酸カリウム４５ｍｇを加え、５分間攪拌した後、減圧濃縮を施した。次に２，４－ブタンスルトン１．３５ｍｌ、蒸留水１５０μｌを加え、１１０℃で１時間反応させた。室温に戻し、酢酸エチルを加えて沈殿を生じさせ、上澄みを除去した。真空乾燥を施した後、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→１５／８５）にて精製し、化合物（５－Ｄ）５５ｍｇを得た。

４）化合物（５）の合成
化合物（２）の合成における化合物（１－Ｊ）を化合物（５－Ｃ）に、化合物（２－Ａ）を化合物（５－Ｄ）に置き換え、その他は化合物（２）の合成方法と同様にして、化合物（５）を合成した。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ^＋）^＋＝１１８７、（Ｍ－Ｈ^＋）^－＝１１８５

５）標識抗体（５）の合成

標識抗体（１）の合成において、化合物（１）を化合物（５）に置き換え、その他は同様にして標識抗体（５）を合成した。

［合成例６］
下記のスキームに基づき、化合物（６）を合成した。

１）化合物（６－Ａ）の合成
化合物（４－Ｄ）の合成における化合物（１－Ｇ）を化合物（３－Ｂ）に置き換え、それ以外は化合物（４－Ｄ）の合成方法と同様にして、化合物（６－Ａ）を合成した。

２）化合物（６－Ｂ）の合成
化合物（３－Ｅ）の合成における化合物（３－Ｃ）を化合物（６－Ａ）に置き換え、それ以外は化合物（３－Ｅ）の合成方法と同様にして、化合物（６－Ｂ）を合成した。

３）化合物（６－Ｃ）の合成
化合物（５－Ｃ）の合成における化合物（５－Ａ）を化合物（３－Ｅ）に置き換え、それ以外は化合物（５－Ｃ）の合成方法と同様にして、化合物（６－Ｃ）を合成した。

４）化合物（６）の合成
化合物（５）の合成において、化合物（５－Ｃ）を化合物（６－Ｃ）に、化合物（５－Ｄ）を化合物（６－Ｂ）に置き換え、それ以外は化合物（５）の合成方法と同様にして化合物（６）を合成した。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ^＋）^＋＝１３０９、（Ｍ－Ｈ^＋）^－＝１３０７

５）標識抗体（６）の合成

標識抗体（１）の合成において、化合物（１）を化合物（６）に置き換え、その他は同様にして標識抗体（６）を合成した。

＜実施例１＞
上記で合成した各標識抗体について、下記特性を評価し、その結果を表１に示した。

［蛍光強度の評価］
上記で調製した各標識抗体の溶液について、分光蛍光強度計（商品名：ＲＦ－５３００、島津製作所社製）を用いて、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０ｎｍ～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値を算出した。比較標識抗体（１）の蛍光波長８１０ｎｍ～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値を基準値とし、この基準値に対する比（蛍光波長８１０ｎｍ～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値／基準値）を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｂ」以上が合格である。

－ 蛍光強度の評価基準 －
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が２倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上２倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が０．９倍以上１．２倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が０．９倍未満

（表の注）
標識抗体の欄において、各標識抗体（Ｚ）を、化合物（Ｚ）－ＩｇＧとして表記した。また、各比較標識抗体（Ｚ）を、比較化合物（Ｚ）－ＩｇＧとして表記した。Ｚは、各化合物の番号を意味する。

上記表１の結果から、以下のことがわかる。
比較化合物（１）は、Ｒ^１～Ｒ^４がすべてメチル基であり、本発明で規定する構造ではない。この比較化合物（１）を用いた比較標識抗体（１）の蛍光強度は低かった（Ｎｏ．ｃ０１）
比較化合物（２）は、式（２）で表される化合物におけるｎ１～ｎ４の合計が２でありＳＯ_３ ^－Ｘ^＋基の数が少なく、また、ナフタレン環を有しない点で、本発明で規定する化合物でない。この比較化合物（２）を用いた標識抗体の蛍光強度は比較標識抗体（１）よりも低かった（Ｎｏ．ｃ０２）。
また、比較化合物（３）は、式（２）で表される化合物におけるｎ１～ｎ４の合計が２でありＳＯ_３ ^－Ｘ^＋基の数が少ない点、ナフタレン環を有しない点、さらに、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つがカルボキシアルキル基である構造だが、本発明で規定する但書きの条件（Ｉ）及び（ＩＩ）のいずれも満たさない点で、本発明で規定する化合物ではない。この比較化合物（３）を用いた標識抗体の蛍光強度もまた、比較標識抗体（１）よりも低いものであった（Ｎｏ．ｃ０３）。
これに対して、本発明で規定する化合物（１）～（６）の標識抗体は、いずれも、上記比較標識抗体（１）の蛍光強度に対して１．２倍以上の蛍光強度を有し、優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．ｃ０１に対するＮｏ．１０１～１０６）。
このように、本発明の式（２）で表される化合物を用いた蛍光標識生体物質は、７８５ｎｍの励起光源に対して優れた蛍光強度を有するため、多色ＷＢ等の蛍光標識に好適に用いることができ、その汎用性ないし利便性を大きく向上させることができる。
また、本発明の式（１）で表される化合物を用いた蛍光標識生体物質は、本発明の式（２）で表される化合物を用いた蛍光標識生体物質と同様に、６８５ｎｍの励起光源に対して優れた蛍光強度を有する。多色ＷＢ等の蛍光標識に好適に用いることができ、その汎用性ないし利便性を大きく向上させることができる。

本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。

本願は、２０１９年１２月１９日に日本国で特許出願された特願２０１９－２２９５９８に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (10)

1. 下記式（１）又は式（２）で表される化合物。
   

   

   式中、Ｒ^１～Ｒ^４は、置換基を有していてもよいアルキル基を示す。但し、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つはスルホアルキル基であり、該スルホアルキル基がスルホ基の他に置換基を有しない場合、該スルホ基のみを有するアルキル基のうち、少なくとも１つは分岐のスルホアルキル基である。Ｒ^１とＲ^２は互いに連結して環を形成していてもよく、Ｒ^３とＲ^４は互いに連結して環を形成していてもよい。
   Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７は、水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。
   但し、Ｒ^１～Ｒ^４の少なくとも１つがカルボキシアルキル基または下記の生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基である場合、下記（Ｉ）又は（ＩＩ）を満たす。
   （Ｉ）Ｒ^１１～Ｒ^１５及びＲ^２１～Ｒ^２７の少なくとも１つがアルキル基もしくはアリール基である。
   （ＩＩ）前記のカルボキシアルキル基または下記の生体物質と結合可能な置換基を有するアルキル基に該当しないＲ^１～Ｒ^４の少なくとも１つが、スルホアルキル基を単結合又は連結基を介して有するアルキル基である。
   Ｌ^１１及びＬ^１２は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。
   ｎ１～ｎ４は、０～２の整数であって、ｎ１＋ｎ２≧１、ｎ３＋ｎ４≧１及びｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧３を満たす。
   ｍ＝ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４－１である。
   Ｘ^＋は１価のカチオンを示す。
   Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくとも１つは、カルボキシ基または下記の生体物質と結合可能な置換基を有する。
   ＜生体物質と結合可能な置換基＞
   Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル構造、マレイミド構造、アジド基、アセチレン基、ペプチド構造、長鎖アルキル基、又は４級アンモニウム基。
2. 下記式（１－１）～式（１－６）又は式（２－１）～式（２－６）のいずれかで表される請求項１に記載の化合物。
   

   

   式中、Ｒ^１～Ｒ^４、Ｒ^１１～Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２７、Ｌ^１１、Ｌ^１２及びＸ^＋は、前記の式（１）及び式（２）におけるＲ^１～Ｒ^４、Ｒ^１１～Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２７、Ｌ^１１、Ｌ^１２及びＸ^＋と同義である。
3. 前記の式（１－１）、式（１－２）、式（２－１）又は式（２－２）のいずれかで表される請求項２に記載の化合物。
4. 前記のＲ^１～Ｒ^４が、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アミノカルボニル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基から選択される基を置換基として有していてもよいアルキル基であって、前記のＬ^１１及びＬ^１２が、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アミノカルボニル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基から選択される基を置換基として有するアルキル基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
   但し、前記のＲ^１～Ｒ^４の少なくとも１つはスルホアルキル基であり、該スルホアルキル基がスルホ基の他に置換基を有しない場合、該スルホ基のみを有するアルキル基のうち、少なくとも１つは分岐のスルホアルキル基である。
5. 前記のＲ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^２１～Ｒ^２３及びＲ^２５～Ｒ^２７が水素原子であって、前記のＲ^１３及びＲ^２４が水素原子又はアルキル基である、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
6. 前記のＲ^１及びＲ^２の少なくとも１つが置換基を有するアルキル基であり、かつ、前記のＲ^３及びＲ^４の少なくとも１つが置換基を有するアルキル基である、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。
   但し、前記のＲ^１～Ｒ^４の少なくとも１つはスルホアルキル基であり、該スルホアルキル基がスルホ基の他に置換基を有しない場合、該スルホ基のみを有するアルキル基のうち、少なくとも１つは分岐のスルホアルキル基である。
7. 前記のＬ^１１及びＬ^１２がカルボキシ基及びスルホ基の少なくとも１つを置換基として有するアルキル基である、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物。
8. 前記のＲ^１～Ｒ^４、Ｒ^１３、Ｒ^２４、Ｌ^１１及びＬ^１２の少なくとも１つが、下記の抗体と結合可能な置換基を有する請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。
   ＜抗体と結合可能な置換基＞
   Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル構造、マレイミド構造、アジド基、アセチレン基、ペプチド構造、長鎖アルキル基、又は４級アンモニウム基。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物と生体物質とが結合してなる蛍光標識生体物質。
10. 前記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである請求項９に記載の蛍光標識生体物質。