JP7064583B2 - 蛍光性化合物及びこれを用いた蛍光標識生体物質 - Google Patents
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Description
この生体蛍光イメージングでは、一般的には有機蛍光色素が用いられる。しかし、有機蛍光色素は耐光性が低く、励起光照射により劣化し、目的の生体観察を十分に行えない場合がある。
例えば、特許文献1には、腫瘍の診断への使用が期待される蛍光脂質エーテル化合物が記載されており、この蛍光脂質エーテル化合物中のフルオロフォアの一例として、ジピロメテンホウ素錯体が記載されている。また、特許文献2には、化学結合を通したエネルギー移動カセットが記載されており、このカセットのドナー又はアクゼプターの一例としてジピロメテンホウ素錯体が記載されている。
本発明は、ジピロメテンホウ素錯体構造を有し、生体蛍光イメージングに求められる十分な親水性と優れた耐光性の両立を実現する蛍光性化合物を提供することを課題とする。また本発明は、この蛍光性化合物と生体物質とを結合してなる蛍光標識生体物質を提供することを課題とする。
<1>
下記式(1)又は式(4)のいずれかで表される蛍光性化合物。
R1~R6は、ハロゲン原子、シアノ基又は下記式(A)で表される基を示す。
R7は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基又はハロゲン原子を示す。ただし、R6とR7は互いに結合して環を形成することはない。
Q1及びQ2は、下記式(1-1)~式(1-3)のいずれかで表される基を示す。
L1及びL2は、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、2価の脂肪族複素環基、もしくは、下記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基、又は、これらを2~4種組み合わせた連結基を示す。
環β1及び環β2の環員数は5~8である。
ただし、R1~R7、L1、L2、Q1及びQ2のうち少なくとも1つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、オニオ基及びポリアミノ酸残基の少なくとも1種を有する。
ただし、XがCR5であって、このR5が式(A)で表される基であり、環β1及び環β2の環員数が6であり、かつ、L1及びL2がアリーレン基である場合、(a)L3が単結合であって、かつR111が炭素数18以上の直鎖アルキル基を置換基として有するアリール基であることはなく、(b)L3がアリーレン基であって、かつR111が炭素数18以上の直鎖アルキル基であることはない。また、XがCR5であって、このR5が式(A)で表される基であり、環β1及び環β2の環員数が6であり、L1及びL2がアリーレン基であり、かつ、R111がジピロメテンホウ素錯体構造を有する置換基を有する場合、このジピロメテンホウ素錯体構造はホウ素原子に対してジピロメテン骨格が3座配位又は4座配位で配位結合する構造を有する。
R111は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、又は、1価の脂肪族複素環基を示す。
*は結合部を示す。
*は結合部を示す。
<2>
上記Q1及びQ2が、いずれも、上記式(1-1)で表される基である、<1>に記載の蛍光性化合物。
<3>
上記XがCR5であって、このR5が上記式(A)で表され、この式(A)中のL3及びR111が下記を満たす、<1>又は<2>に記載の蛍光性化合物。
上記L3が単結合であって、上記R111が水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基であるか、上記L3がアルキレン基、アリーレン基及び上記式(1-1)~(1-8)のいずれかで表される基のうちの1種または2種以上を組み合わせた基であって、上記R111が水素原子である。
<4>
上記R3及びR4の少なくとも1つが、カルボキシ基もしくはその塩を含む基、スルホ基もしくはその塩を含む基、ホスホノ基もしくはその塩を含む基、オニオ基を含む基、又は、ポリアミノ酸残基を含む基である、<1>~<3>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
<5>
上記R3及びR4の少なくとも1つが、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、又は、ホスホノ基もしくはその塩である、<1>~<4>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
<6>
上記R3及びR4の少なくとも1つがスルホ基もしくはその塩である、<1>~<5>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
<7>
上記L1及びL2が、アルキレン基、エテニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基もしくは2価の脂肪族複素環基、又はこれらを2種組み合わせた連結基であって、上記環β1及び環β2の環員数が6~8である、<1>~<6>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
下記式(2)または式(5)のいずれかで表される<1>~<7>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
R1~R7及びQは上記式(1)又は(4)におけるR1~R7及びQ1と同義である。
環Aは炭化水素環又はヘテロ環を示す。
L11は、単結合、又は、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、2価の脂肪族複素環基もしくは上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基、もしくはこれらの基の2種を組み合わせた連結基を示す。
ただし、環β11及び環β21の環員数は6~8である。
<9>
下記式(3)または式(6)のいずれかで表される<1>~<8>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
R1~R7及びQは上記式(1)又は(4)におけるR1~R7及びQ1と同義であり、L11は上記式(2)又は(5)におけるL11と同義である。
R8は置換基を示し、nは0~4の整数である。
ただし、環β11及び環β21の環員数は6~8である。
下記式(7)または式(8)のいずれかで表される<1>~<6>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
R1~R7及びQは上記式(1)又は(4)におけるR1~R7及びQ1と同義である。
L12は、単結合、又は、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、2価の脂肪族複素環基もしくは上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基、もしくは、これらの基の2種を組み合わせた連結基を示す。
L13は、メチレン基、又は、上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基を示す。
ただし、環β12及び環β22の環員数は5~8である。
<11>
下記式(9)で表される<1>~<6>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
R1~R5及びQは上記式(1)又は(4)におけるR1~R5及びQ1と同義である。
L11及びL12は、単結合、又は、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、2価の脂肪族複素環基もしくは上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基、もしくは、これらの基の2種を組み合わせた連結基を示す。
L13は、メチレン基、又は、上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基を示す。
環Aは炭化水素環又はヘテロ環を示す。
ただし、環β12の環員数は5~8であって、環β21の環員数は6~8である。
<12>
上記R1~R8、L1、L2、L11~L13、Q、Q1及びQ2の少なくとも一つが、生体物質との結合性部位を有する<1>~<11>のいずれか1つに記載の蛍光性化合物。
<13>
上記<12>に記載の蛍光性化合物と生体物質とが結合してなる蛍光標識生体物質。
<14>
上記生体物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖及び脂質のいずれかである<13>に記載の蛍光標識生体物質。
<15>
上記蛍光性化合物と上記生体物質との結合が下記i)~v)のいずれかによる結合である<13>又は<14>に記載の蛍光標識生体物質。
i)ペプチド間での非共有結合又は共有結合、
ii)蛍光性化合物中の長鎖アルキル基と生体物質中の脂質二重膜又は脂質とのファンデルワールス相互作用、
iii)蛍光性化合物中のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルと生体物質中のアミノ基とを反応させてなるアミド結合、
iv)蛍光性化合物中のマレイミド基と生体物質中のスルファニル基とを反応させてなるチオエーテル結合、
v)蛍光性化合物中のアジド基と生体物質中のアセチレン基、又は、蛍光性化合物中のアセチレン基と生体物質中のアジド基とをClick反応させてなる、トリアゾール環の形成を伴う結合
本明細書において、特段の断りがない限り、二重結合については、分子内にE型及びZ型が存在する場合、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。また、特段の断りがない限り、化合物としてジアステレオマー及びエナンチオマーが存在する場合には、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。例えば、本発明の蛍光性化合物のうち3座配位のジピロメテン骨格を有する化合物には、ホウ素原子を不斉中心とするエナンチオマーが包含される。
塩構造の場合、その塩の種類は1種類でもよく、2種類以上混在していてもよく、化合物中で塩型と遊離酸構造の基が混在していてもよく、また、塩構造の化合物と遊離酸構造化合物が混在していてもよい。
また、本発明の効果を損なわない範囲で、構造の一部を変化させたものを含む意味である。更に、置換又は無置換を明記していない化合物については、本発明の効果を損なわない範囲で、任意の置換基を有していてもよい意味である。このことは、置換基(例えば、「アルキル基」、「メチル基」、「メチル」などのように表現される基)及び連結基(例えば、「アルキレン基」、「メチレン基」、「メチレン」などのように表現される基)についても同様である。このような任意の置換基のうち、本発明において好ましい置換基は、後述の置換基群Tから選択される置換基である。
本発明において、ジピロメテンホウ素錯体構造とは、ホウ素原子に対してジピロメテン骨格が2座配位、3座配位及び4座配位のいずれかで配位する構造を意味する。なお、3座配位及び4座配位は、ジピロメテンの2つの窒素原子に加え、ジピロメテン骨格上の1つ又は2つの置換基がホウ素原子に配位することで、形成される。
また、本発明で記載する化学構造式において、ジピロメテンの2つの窒素原子のうちの1つの窒素原子上の正電荷、及び、ホウ素原子上の負電荷を省略して記載する。
また、本発明において、C○とは炭素数○を意味し、例えば、C18以上の直鎖アルキル基とは炭素数18以上の直鎖アルキル基を意味する。
本発明の蛍光性化合物は、いずれも、各式で示されるように、ジピロメテン骨格に置換基を1つ又は2つ以上導入した化合物を、2座配位子ではなく3座もしくは4座配位子としてホウ素原子に配位させた、特定構造を有する化合物であり、さらに特定の親水性基を有する。そのため、化合物(錯体)におけるホウ素原子の安定性が向上し、ホウ素原子部位に対する、活性酸素による光分解が阻害され、優れた耐光性を示し、十分な親水性も示すと考えられる。
以下、本発明の式(1)で表される蛍光性化合物及び本発明の式(4)で表される蛍光性化合物について、順に詳述する。
本発明の式(1)で表される蛍光性化合物は、下記の通りである。
R1~R5は、ハロゲン原子、シアノ基又は下記式(A)で表される基を示す。
Q1及びQ2は、下記式(1-1)~式(1-3)のいずれかで表される基を示す。
L1及びL2は、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、2価の脂肪族複素環基、もしくは、下記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基、又は、これらを2~4種組み合わせた連結基を示す。
環β1(すなわち、L1、Q1、ホウ素原子、並びに、ピロール環を構成する構原子のうち、L1と窒素原子とを結合する炭素原子及び窒素原子、で形成される環)及び環β2(すなわち、L2、Q2、ホウ素原子、並びに、ピロール環を構成する原子のうち、L2と窒素原子とを結合する炭素原子及び窒素原子、で形成される環)の環員数は5~8である。
ただし、R1~R5、L1、L2、Q1及びQ2のうち少なくとも1つは、親水性基として、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、オニオ基及びポリアミノ酸残基(以下、これらの親水性基を「特定の親水性基Pi」とも称す。)の少なくとも1種を有する。
また、Q1、Q2、L1及びL2において、下記式(1-1)~式(1-3)のいずれかで表される基が2個以上連続した基は含まれない。
また、XがCR5であって、このR5が式(A)で表される基である場合、(c)L3が単結合であって、かつR111が炭素数18以上の直鎖アルキル基を置換基として有するアリール基である化合物ではないことが好ましい。また、XがCR5であって、このR5が式(A)で表される基である場合、(d)L3がアリーレン基であって、かつR111が炭素数18以上の直鎖アルキル基である化合物ではないことが好ましい。なお、ホウ素原子の立体配座に生じるひずみを抑制することによりQ1及びQ2との配位結合を安定化し、より十分な耐光性を得る点からは、上記(c)及び(d)は、環β1及び環β2の環員数が6である場合に満たすことが好ましく、5、6又は8である場合に満たすことがより好ましい。
また、XがCR5であって、このR5が式(A)で表される基であり、R111がジピロメテンホウ素錯体構造を有する置換基を有する場合、(f)このジピロメテンホウ素錯体構造はホウ素原子に対してジピロメテン骨格が3座配位又は4座配位で配位結合する構造を有することが好ましい。すなわち、このジピロメテンホウ素錯体構造はホウ素原子に対して3座配位骨格又は4座配位骨格を有する構造であることが好ましく、後述の式(4)で表される3座配位骨格又は上記式(1)で表される4座配位骨格を有することがより好ましい。この(f)を満たす化合物は、R111のジピロメテンホウ素錯体構造のジピロメテン骨格が3座配位又は4座配位で配位結合することで、2座配位に起因する光分解を抑制し、十分な耐光性を得られる。なお、この効果は、ホウ素原子の立体配座に生じるひずみによって耐光性が低下する場合に、より顕在化する。この点からは、上記(f)の別の形態として、環β1及び環β2の環員数が6である場合に上記(f)を満たすことが好ましく、5、6又は8である場合に上記(f)を満たすことがより好ましい。
ただし、L3において、下記式(1-1)~式(1-3)のいずれかで表される基が2個以上連続した基は含まれない。
R111は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、又は、1価の脂肪族複素環基を示す。
なお、R111として採り得る水素原子が、後述する特定の親水性基Piにおける解離性の水素原子である場合には、水素原子が解離して、特定の親水性基Piで後述する塩構造を取っていてもよく、この塩は後述の特定の親水性基Piで記載する塩と同義である。
また、アルキレン基、アリーレン基及び式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基の組み合わせについては、種類は1種又は2種以上であり、組み合わせの数は特に限定されない。
ただし、式(A)で表される基のうち、*に最も近い基がアルキレン基又はアリーレン基(以下、「*-アルキレン基又は*-アリーレン基」と称す。)であって、以下(i)又は(ii)を満たす場合には、L3が単結合であって、R111がアルキル基又はアリール基である基として解する。
(i)*-アルキレン基又は*-アリーレン基が無置換の基である。
(ii)式(A)で表される基が特定の親水性基Piを有する基であって、この式(A)で表される基が有する特定の親水性基Piの全てが、*-アルキレン基又は*-アリーレン基に直接結合する。
上記以外の*-アルキレン基又は*-アリーレン基を有する式(A)で表される基については、L3が単結合でない基として解する。
*は結合部を示す。
L3として採りうるアリーレン基は、後述する置換基群Tから選択されるアリール基から更に水素原子を1つ除去した基と同義であり、好ましいものも同じである。
L3として採りうるアルキレン基及びアリーレン基は、無置換の基であってもよく、置換基を有する基であってもよい。L3として採りうるアルキレン基及びアリーレン基が有していてもよい置換基としては、特に限定されず、好ましくは、後述する置換基群Tから選択され、置換基の数は、1個以上であれば特に制限されず、例えば4個以下とすることができる。
L3として採りうるアルキレン基及びアリーレン基が有していてもよい置換基としては、より好ましくは、アルコキシ基及び特定の親水性基Piが挙げられる。
L3として採り得る、アルキレン基、アリーレン基及び下記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基のうちの1種又は2種以上を組み合わせた連結基において、組み合わせる基の数は、特に制限されないが、例えば、平均で、2~20000が好ましく挙げられる。
また、R111として採り得る上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基及び1価の脂肪族複素環基は、いずれも、無置換の基であってもよく、置換基を有する基であってもよい。R111として採り得る上記各基が有していてもよい置換基としては、特に限定されず、好ましくは、後述する置換基群Tから選択される基が挙げられ、より好ましくは、アルキル基、アルコキシ基、アリール基及び特定の親水性基Piが挙げられる。この場合、置換基の数は、構造として採り得る限り特に制限されないが、例えば、1~5個が好ましい。また、特定の親水性基Piの個数は、構造として採り得る限り特に制限されない。具体的には、複数個の特定の親水性基Piを採り得る、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基及び1価の脂肪族複素環基では、例えば、1~5個が好ましく、1~4個がより好ましく、1又は2個がさらに好ましい。R111として採り得る上記各基が有していてもよい置換基(ただし、特定の親水性基Piは除く。)は、さらに置換基を有していてもよく、例えば、後述する置換基群Tから選択される基が挙げられ、好ましくは、アルキル基及びアルコキシ基が挙げられる。
1価の脂肪族複素環基が特定の親水性基Piを有する形態には、置換基として特定の親水性基Piを採る形態の他に、例えば、脂肪族複素環の環構成原子である窒素原子がアンモニオ基として組み込まれた形態(例えば、ピペラジニウム基)も含む。
(1)L3が単結合であって、式(A)として特定の親水性基Piを有しない場合
R111は、水素原子、又は、特定の親水性基Piを有しない、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基もしくはヘテロアリール基が好ましい。
(2)L3が単結合であって、式(A)として特定の親水性基Piを有する場合
R111は、特定の親水性基Piを有する、アルキル基、アルキニル基、アルキニル基、アリール基又は1価の脂肪族複素環基が好ましい。
(3)L3がアルキレン基、アリーレン基及び式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基のうちの1種又は2種以上を組み合わせた基である場合
R111は、水素原子、又は、特定の親水性基Piを有する、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基もしくは1価の脂肪族複素環基が好ましい。
なかでも、XがCR5であって、このR5が式(A)で表され、上記(1)~(3)の好ましい形態を満たすことが、光化学的分解の抑制による高耐光性付与の点からより好ましい。このことは、The Journal of Physical Chemistry A, 2016, 120, p.2537-2546に記載されているように、2座のジピロメテン配位子を有するホウ素錯体において、メソ位がNである場合、メソ位がCHである場合と比べて光化学的分解が起きやすいことと、同様のメカニズムによると考えられる。
*は結合部を示す。
なお、R11として採り得る上記アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アシル基及びスルホニル基は、いずれも、無置換の基であってもよく、置換基を有する基であってもよい。上記、置換基を有する基としては、特定の親水性基Piを置換基として有する、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アシル基及びスルホニル基が好ましく挙げられる。
R12として採りうる置換基としては、特に限定されず、好ましくは、後述する置換基群Tから選択される。R12としては、水素原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基が好ましく、ヒドロキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基がより好ましく、ヒドロキシ基がさらに好ましい。
なお、R12が後述する特定の親水性基Piにおける解離性の水素原子である場合には、水素原子が解離して、特定の親水性基Piで後述する塩型を取っていてもよく、この塩は後述の特定の親水性基Piで記載する塩と同義である。
*及び**は結合部を示す。なお、**は、L3として採り得る基である場合におけるR111との結合部を示す。式(1A-2)は、L3中いずれの*側でR111と結合してもよい。
上記L3として採り得る、上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基を組み合わせた連結基としては、上記式(1A-1)、(1A-2)、(1A-4)又は式(1A-8)で表される基が好ましい。
上記式(1A-1)、(1A-4)又は(1A-8)で表される基とR111としての水素原子とで表される基は、特定の親水性基Piとしての、カルボキシ基、スルホ基又はホスホノ基にそれぞれ相当する。また、これらの基から水素原子が解離性の水素原子として解離した基は、それぞれ、カルボキシ基の塩、スルホ基の塩又はホスホノ基の塩に相当する。
L3として採り得る2種以上を組み合わせた連結基としては、例えば、アルキレン基-[式(1A-2)で表される基-アルキレン基]-式(1A-1)、(1A-4)又は(1A-8)で表される基、アリーレン基-[式(1A-2)で表される基-アルキレン基]-式(1A-1)、(1A-4)又は(1A-8)で表される基、アリーレン基-式(1A-2)で表される基-[アルキレン基-式(1-1)で表される基]-アルキレン基-式(1A-1)、(1A-4)又は(1A-8)で表される基、及び、アルキレン基-式(1A-2)で表される基-[アルキレン基-式(1-1)で表される基]-アルキレン基-式(1A-1)、(1A-4)又は(1A-8)で表される基が好ましく挙げられる。なお、[ ]は繰り返し構造であることを示す。
L1及びL2として採り得る連結基については、後述する通りである。
上記Xは、CR5又はNを示し、CR5が好ましい。
・R1~R5
上記R1~R5は、各々独立に、ハロゲン原子、シアノ基又は上記式(A)で表される基を示す。
R1~R5が採りうるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子である。
上記R1~R4としては、上記式(A)で表される基が好ましく、上記R111の好ましい態様(1)~(3)のいずれかの基がより好ましい。上記R1~R4が特定の親水性基Piを有する場合は、上記R111の好ましい態様(2)又は(3)で記載する、特定の親水性基Piを有する基がより好ましい。
上記R5としては、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基が好ましい。ここで、R5として好ましい各置換基は、式(A)のR111におけるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基と同義である。R5としてより好ましくは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基である。これらのR5として好ましく採り得るアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びヘテロアリール基は、特定の親水性基Piを有する基であることが好ましい。
上記Q1及びQ2は、各々独立に、上記式(1-1)~式(1-3)のいずれかで表される基を示す。
Q1及びQ2は、それぞれ異なっていても同一でもよく、同一であることが好ましい。
より具体的には、Q1及びQ2は、最もホウ素原子との結合エネルギーが高く安定である点から、いずれかが上記式(1-1)で表される基であることが好ましく、いずれも上記式(1-1)で表される基であることがより好ましい。式(1-1)で表される基、すなわち酸素原子が、他の原子に比べ最もホウ素原子との結合エネルギーが高く安定であることは、例えば、Dean, John, A. Lange's Handbook of Chemistry. McGraw-Hill., PROPERTIES OF ATOMS, RADICALS, AND, BONDS, SECTION 4.41を参照することができる。
上記L1及びL2は、各々独立に、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、2価の脂肪族複素環基、もしくは、上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基、又は、これらを2~4種組み合わせた連結基を示す。
L1及びL2として採りうるアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基及び2価の脂肪族複素環基は、それぞれ、後述する置換基群Tから選択されるアルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基及び脂肪族複素環基から更に水素原子を1つ除去した基と同義であり、好ましいものも同じである。
また、L1及びL2として採りうる上記各基は、無置換の基であってもよく、置換基を有する基であってもよい。L1及びL2として採りうる上記各基が有していてもよい置換基としては、特に限定されず、好ましくは、後述する置換基群Tから選択され、置換基の数は、1個以上であれば特に制限されず、例えば4個以下とすることができる。
L1及びL2として採りうる上記各基が有していてもよい置換基としては、より好ましくは、ハロゲン原子、シアノ基、アルコキシ基、酸素原子、1つ以上のカルボキシ基を含む基、1つ以上のスルホ基を含む基、1つ以上のホスホノ基を含む基、1つ以上のオニオ基を含む基、又は、ポリアミノ酸残基を含む基であり、さらに好ましくはカルボキシ基、ホスホノ基、スルホ基、オニオ基、ポリアミノ酸残基、又は、ポリアミノ酸残基を置換基として有するアミノ基である。なお、上記のカルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基には、それぞれ、その塩が含まれる。
L1として採りうるアリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基及び2価の脂肪族複素環基において、式(1)中のピロール環中の炭素原子と結合する結合部と上記Q1と結合する結合部との関係は、特に制限されないが、各基中の隣接する2つの原子(ビシナル原子)であることが好ましい。また、L2として採りうるアリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基及び2価の脂肪族複素環基においても、式(1)中のピロール環中の炭素原子と結合する結合部と及び上記Q2と結合する結合部との関係は、特に制限されないが、各基中の隣接する2つの原子(ビシナル原子)であることが好ましい。
例えば、L1及びL2としてフェニレン基を採る場合、1,2-フェニレン基が好ましい。
L1として採りうるアルケニレン基及びシクロアルケニレン基における炭素-炭素二重結合(C=C結合)の位置は特に制限されない。また、L2として採りうるアルケニレン基及びシクロアルケニレン基における炭素-炭素二重結合(C=C結合)の位置についても、特に制限されない。
L1及びL2を構成し得るアルケニレン基の炭素原子数及び総炭素数は、上記L1及びL2を構成し得るアルキレン基の炭素原子数及び総炭素数と同様に数える。L1及びL2を構成し得るアルケニレン基は、上記炭素原子数については、2~3が好ましく、2がより好ましい。一方、L1及びL2の総炭素数については、2~46が好ましく、2~13がより好ましく、2~7が更に好ましく、2~3が特に好ましい。
前述するL3を構成し得るアルキレン基及び後述するL11及びL12を構成し得るアルキレン基の炭素原子数及び総炭素数は、L1及びL2を構成し得るアルキレン基の炭素原子数及び総炭素数と同様に数える。なお、L1~L3、L11及びL12を構成し得るこれらの基以外の基(すなわち、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基及び2価の脂肪族複素環基)の炭素数は、全炭素数を意味する。
L1及びL2は、それぞれ異なっていても同一でもよく、同一であることが好ましい。
式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基を含むL1及びL2としては、[アルキレン基、アルケニレン基(好ましくはエテニレン基)、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基及び2価の脂肪族複素環基]のいずれかと[前述する式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基]とを2~4種組み合わせた連結基が好ましく、[アルキレン基、アルケニレン基(好ましくはエテニレン基)、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基及び2価の脂肪族複素環基]のいずれかと[前述する式(1-1)、(1-2)、(1-3)、(1-4)及び(1A-2)のいずれかで表される基]とを組み合わせた連結基がより好ましい。
R1~R5、L1、L2、Q1及びQ2のうち少なくとも1つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基(-SO3H)もしくはその塩、ホスホノ基〔-PO(OH)2〕もしくはその塩、オニオ基及びポリアミノ酸残基の少なくとも1種を有する。上記「塩」は、式(1)で表される蛍光性化合物の分子内で塩を形成する形態を含む意味である。
カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基の塩としては、例えば、Na、Li及びK等のアルカリ金属の塩、Mg、Ca及びBa等のアルカリ土類金属の塩、テトラアルキルアンモニウム等の有機アミンの塩が挙げられる。
式(1)で表される化合物中における特定の親水性基Piの数は、R1~R5、L1、L2、Q1及びQ2のうちのいずれかが少なくとも1つ有する限り特に制限されない。式(1)で表される化合物として有し得る特定の親水性基Piの数は、親水性と耐光性の両立の点から、1~6個が好ましく、1~4個がより好ましく、1~3個がさらに好ましく、2又は3個が特に好ましい。
式(1)で表される蛍光性化合物中に複数の上記カルボキシ基等が含まれる場合は、その複数の基は塩構造及び遊離酸構造のいずれであってもよく、互いに同一でもよく異なっていてもよい。
ここで、「ポリアミノ酸」とは、2以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物を意味し、ペプチド及びタンパク質を含む概念である。「ポリアミノ酸」を構成するアミノ酸の数は、2~30が好ましく、4~20がより好ましく、6~10がさらに好ましい。「ポリアミノ酸残基」は、ポリアミノ酸から得られる基である。「ポリアミノ酸残基」は、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸が有する-NH2、-CO2H、-OH又は-SHの水素原子の1つを結合手(-)に置き替えた基(例えば-CO2Hの水素原子を結合手に置き換えると-C(=O)-O-**となる。**はポリアミノ酸が式(1)の蛍光性化合物中に組み込まれるための結合部となる。)が好ましい。また、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸が有する-NH2、-CO2H、-OH又は-SHの水素原子の1つを結合手(-)に置き替えた基は、更に、>C=O及び>NH等の結合を介することにより、ポリアミノ酸残基として組み込まれていてもよい。
上記オニオ基は、アンモニオ基(ピリジニウム塩、ピペリジニウム塩、ピペラジニウム塩及びピロリジニウム塩などの環状アンモニオを含む。)、スルホニオ基及びホスホニオ基が挙げられ、アンモニオ基が好ましい。
オニオ基を構成する対イオンとしては、例えば、スルホネートイオン及びヨージドイオン等の無機イオンが挙げられる。
上記観点から、R3及びR4の少なくとも1つが、1つ以上のカルボキシ基もしくはその塩を含む基、1つ以上のスルホ基もしくはその塩を含む基、1つ以上のホスホノ基もしくはその塩を含む基、1つ以上のオニオ基を含む基、又は、ポリアミノ酸残基を含む基であることが好ましく、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、又は、ホスホノ基もしくはその塩であることがより好ましく、スルホ基もしくはその塩であることがさらに好ましい。
環β1及び環β2の環員数は、各々独立に、5~8であり、6~8が好ましく、6又は7がより好ましく、7が更に好ましい。
ここで、環β1及び環β2は、互いに同一であっても異なっていてもよく、同一であることが好ましい。
環β1及び環β2環構造において、L1とQ1の組み合わせ及びL2とQ2の組み合わせ等は、特に制限されず、L1、L2、Q1及びQ2として、それぞれ、採りうる好ましい基又は連結基の組み合わせが好ましく挙げられる。例えば、L1及びL2が、アルキレン基、エテニレン基、アリーレン基若しくはヘテロアリーレン基又はこれらを2種組み合わせた連結基であって、環β1及び環β2の環員数が6~8であることが好ましい。
本発明の蛍光性化合物は、式(1)で表されるジピロメテンホウ素錯体構造以外に、置換基としてジピロメテンホウ素錯体構造を有する置換基を有してもよい。同一分子内に2個以上のジピロメテンホウ素錯体構造を有する場合には、いずれのジピロメテンホウ素錯体構造もホウ素原子に対する3座配位骨格又は4座配位骨格を有する。これにより、高い耐光性を示すことができる。
また、R5は、ジピロメテン骨格との結合位置に対するオルト位の両方に置換基を有することがより好ましく、これらの置換基がアルキル基又はアルコキシ基であることがさらに好ましい。
また、XがCR5であって、このR5が式(A)であって、L3が単結合かつR111がアリール基である場合、このR111は、ホウ素原子を含む置換基で置換されたアリール基ではないことが好ましい。
別の態様として、XがCR5であって、このR5が式(A)であって、L3が単結合かつR111がアリール基である場合、このR111は、アリール基又はヘテロアリール基を含む置換基で置換されていないアリール基であることが好ましい。
本発明の式(1)で表される蛍光性化合物は、下記式(2)で表されることが好ましい。
R1~R5及びQは上記式(1)におけるR1~R5及びQ1とそれぞれ同義である。
環Aは炭化水素環又はヘテロ環を示す。
L11は、単結合、又は、アルキレン基、エテニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、2価の脂肪族複素環基もしくは上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基、もしくは、これらの基の2種を組み合わせた連結基を示す。
ただし、環β11及び環β21(すなわち、L11、Q、環Aを構成する原子のうちピロール環と結合する原子及びL11と結合する原子、ホウ素原子、並びに、ピロール環を構成する原子のうち、環Aと窒素原子とを結合する炭素原子及び窒素原子、で形成される2つの環)の環員数は、各々独立に、6~8であり、6又は7が好ましく、7がより好ましい。環β11及び環β21は、互いに同一であっても異なっていてもよく、同一であることが好ましい。
また、L11として採りうる上記各基は、無置換の基であってもよく、置換基を有する基であってもよい。L11として採りうる上記各基が有していてもよい置換基としては、特に限定されず、上記L1及びL2と同義である。好ましくは、1つ以上のカルボキシ基を含む基、1つ以上のスルホ基を含む基、1つ以上のホスホノ基を含む基、1つ以上のオニオ基を含む基、又は、ポリアミノ酸残基であり、より好ましくはカルボキシ基、ホスホノ基、スルホ基、オニオ基、又は、ポリアミノ酸残基である。なお、上記のカルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基には、それぞれ、その塩が含まれる。
L11として採りうるエテニレン基は、上記L1で記載するエテニレン基と同義である。
L11としては、アルキレン基が好ましく、メチレン基がより好ましい。このメチレン基は、置換基を有していてもよい。
式中における2つのL11は、それぞれ、互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。
上記環Aが採りうる炭化水素環及びヘテロ環としては、芳香族炭化水素環、脂肪族炭化水素環、芳香族ヘテロ環及び脂肪族ヘテロ環が挙げられる。この脂肪族炭化水素環及び脂肪族ヘテロ環における環は、不飽和結合を有していても構わない。これらの環は、後述する置換基群Tから選択されるアリール基、シクロアルキル基及びシクロアルケニル基、ヘテロアリール基並びにヘテロ環基における結合手部分を水素原子に置換した環と同義であり、好ましいものも同じである。
上記環Aがヘテロ環である場合、環β11又は環β21を構成する原子は特に制限されないが、例えば、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子が挙げられ、少なくとも1つの上記環を構成する原子が炭素原子であることが好ましい。
具体的には、芳香族炭化水素環としては、ベンゼン及びナフタレン等が挙げられ、脂肪族炭化水素環としては、シクロプロパン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロプロペン、シクロペンテン及びシクロヘキセン等が挙げられ、芳香族ヘテロ環としては、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、1,2,3-トリアジン及びこれらの縮合環等が挙げられ、脂肪族ヘテロ環としては、ピロリジン、ピペレジン、ピペラジン及びモルホリン等が挙げられる。
式中における2つの環Aは、それぞれ、互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。
すなわち、L11が単結合であって、環β11及び環β21の環員数が6である化合物は、ホウ素原子に配位するQ(酸素原子)がフェノール性水酸基であるため酸性度が高く、水中での加水分解が起こり得る。これに対して、L11が例えばメチレン基であって、環β11及び環β21の環員数が7である化合物は、ホウ素原子に配位するQ(酸素原子)がベンジルアルコール型であるため水酸基の酸性度が低く、加水分解が抑制され、結果として水中でのより高い耐光性を維持していると考えられる。
本発明の式(1)で表される蛍光性化合物は、下記式(3)で表されることがより好ましい。
R1~R5及びQは上記式(1)におけるR1~R5及びQ1とそれぞれ同義であり、L11は上記式(2)におけるL11と同義である。
R8は置換基を示す。
nは0~4の整数であり、0~3の整数が好ましく、0~2の整数がより好ましく、0又は1が特に好ましい。
ただし、環β11及び環β21(すなわち、L11、Q、ベンゼン環を構成する原子のうちピロール環と結合する原子及びL11と結合する原子、ホウ素原子、並びに、ピロール環を構成する構成原子のうち、ベンゼン環と窒素原子とを結合する炭素原子及び窒素原子、で形成される環)の環員数は6~8であり、6又は7が好ましく、7がより好ましい。環β11及び環β21は、互いに同一であっても異なっていてもよく、同一であることが好ましい。
なかでも、式(3)で表されるベンゼン環は、L11との結合位置に対してピロール環とは逆側のメタ位にR8を有することが、本発明の蛍光性化合物の水溶液中での耐光性が向上される点で、好ましい。
なかでも、式(3)で表されるベンゼン環は、L11との結合位置に対してピロール環とは逆側のメタ位にR8を有することが、本発明の蛍光性化合物を含有する蛍光標識生体物質を蛍光色素として使用した染色細胞の耐光性が向上される点で、好ましい。
本発明の式(1)で表される蛍光性化合物は、下記式(7)で表されることも好ましい。
R1~R5及びQは上記式(1)におけるR1~R5及びQ1と同義である。
L12は、単結合、又は、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、2価の脂肪族複素環基もしくは上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基、もしくは、これらの基の2種を組み合わせた連結基を示す。
L13は、メチレン基、又は、上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基を示す。
ただし、環β12及び環β22(すなわち、L12、L13、Q、ホウ素原子、並びに、ピロール環を構成する構成原子のうち、L13と窒素原子とを結合する炭素原子及び窒素原子、で形成される環)の環員数は5~8であり、6~7が好ましく、7がより好ましい。環β12及び環β22は、互いに同一であっても異なっていてもよく、同一であることが好ましい。
L12として採りうるアルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基及び2価の脂肪族複素環基は、上記L11におけるアルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基及び2価の脂肪族複素環基の記載を好ましく適用することができる。
L12は、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、2価の脂肪族複素環基、又は、アルキレン基と上記式(1-1)~式(1-8)のいずれかで表される基とを組み合わせた連結基が好ましく、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、2価の脂肪族複素環基、又は、アルキレン基と上記式(1-3)若しくは式(1-4)で表される基とを組み合わせた連結基がより好ましく、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基又は2価の脂肪族複素環基がさらに好ましく、アルキレン基又はシクロアルキレン基が特に好ましく、アルキレン基が最も好ましい。
上記アルキレン基の炭素原子数は、1又は2が好ましい。
L13として採りうるメチレン基は、置換基を有していてもよい。
L13は、メチレン基、又は、上記式(1-1)~式(1-4)及び式(1-7)のいずれかで表される基が好ましく、メチレン基又は式(1-1)もしくは式(1-3)で表される基がより好ましく、メチレン基又は式(1-1)で表される基がさらに好ましく、メチレン基が特に好ましい。
本発明の式(1)で表される蛍光性化合物は、下記式(9)で表されることも好ましい。
したがって、式(9)において、X、R1~R5及び環β21並びに環β21を構成するL11、Q及び環Aは、それぞれ、上記式(2)における、X、R1~R5及び環β21並びに環β21を構成するL11、Q及び環Aと同義であり、好ましいものも同じである。
本発明の式(4)で表される蛍光性化合物は、下記の通りである。
したがって、式(4)において、X、R1~R5、L1、Q1及び環β1は、それぞれ、上記式(1)における、X、R1~R5、L1、Q1及び環β1と同義であり、好ましいものも同じである。
ただし、上記式(4)においては、R1~R7、L1及びQ1のうち少なくとも1つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、ホスホノ基もしくはその塩、オニオ基及びポリアミノ酸残基の少なくとも1種、すなわち前述の特定の親水性基Piを有する。
R6とR7は、直接又は連結基を介して、互いに結合して環を形成することはない。この環とは、式(1)で表される蛍光性化合物中の、ピロール環中の隣接する炭素原子及び窒素原子とホウ素原子とL2とQ2とで形成される環、すなわち環β11を意味し、この環以外の環であれば形成してもよい。
本発明の式(4)で表される蛍光性化合物は、下記式(5)で表されることが好ましい。
したがって、式(5)において、X、R1~R5、L11、Q、環β11及び環Aは、それぞれ、上記式(2)における、X、R1~R5、L11、Q及び環β11と同義であり、好ましいものも同じである。
本発明の式(4)で表される蛍光性化合物は、下記式(6)で表されることがより好ましい。
したがって、式(5)において、X、R1~R5、R8、L11、Q、n及び環β11は、それぞれ、上記式(3)における、X、R1~R5、R8、L11、Q、n及び環β11と同義であり、好ましいものも同じである。
本発明の式(4)で表される蛍光性化合物は、下記式(8)で表されることも好ましい。
したがって、式(8)において、X、R1~R5、L12、L13、Q及び環β12は、それぞれ、上記式(7)における、X、R1~R5、L12、L13、Q及び環β12と同義であり、好ましいものも同じである。
さらに、本発明の式(1)又は式(4)で表される蛍光性化合物は、水を含む水溶性溶媒(水溶性溶媒は酸素を比較的多く含む溶媒である)中においても、耐光性に優れる。そのため、従来の蛍光性化合物を用いた場合に比べ、長期間、高解像度で生体観察等することが可能となる。
すなわち、本発明の式(1)又は式(4)で表される蛍光性化合物は、生体物質との間で相互作用(物理吸着及び化学結合等)する基を有した化合物も包含され、このような形態は、本発明の蛍光性化合物を生体蛍光イメージングに適用する点から特に好ましい。
具体的には、本発明の蛍光性化合物は、R1~R8、L1、L2、L11~L13、Q、Q1及びQ2の少なくとも一つが(式(1)又は式(4)で表される蛍光性化合物においてはR1~R7、L1、L2、Q1及びQ2の少なくとも一つが)、生体物質との結合性部位を有することが好ましく、結合性部位としては、例えば、下記蛍光標識生体物質で記載する部位が挙げられる。
以下に、生体物質との間で相互作用する基を有した化合物の具体例を示すが、本発明はこれらの化合物に限定されない。下記具体例において、特定の親水性基Pi等の解離性の水素原子を有する基については、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。また、構造式中におけるmは平均繰り返し数であり、0~10000を示す。
本発明の蛍光標識生体物質は、本発明の式(1)又は式(4)で表される蛍光性化合物と生体物質とが結合した物質である。式(1)又は式(4)で表される蛍光性化合物と生体物質との結合は、式(1)又は式(4)で表される蛍光性化合物と生体物質とが直接結合した形態でもよいし、連結基を介して連結した形態でもよい。
上記生体物質のうち、臨床病理的に有用な物質としては、特に制限されるものではないが、例えば、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD等の免疫グロブリン、補体、CRP.フェリチン、α1マイクログロブリン、β2マイクログロブリン等の血漿タンパク及びそれらの抗体、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原(CEA)、前立線性酸性ホスファターゼ(PAP)、CA19‐9、CA‐125等の腫瘍マーカー及びそれらの抗体、黄体化ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト繊毛性ゴナドトロビン(hCG)、エストロゲン、インスリン等のホルモン類及びそれらの抗体、HBV関連抗原(HBs.HBe.HBc).HIV.ATL等のウイルス感染関連物質及びそれらの抗体、等が挙げられる。
さらに、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ、梅毒トレポネーマ等のバクテリア及びそれらの抗体、トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニア、トリバノゾーマ、マラリア原虫等の原虫類及びそれらの抗体、ELM3、HM1、KH2、v6.5、v17.2、v26.2(由来マウス129、129/SV、C57BL/6、BALB/c)等のES細胞及びそれらの抗体、フェニトイン、フェノバルビタール等の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキニシン等の心血管薬、テオフィリン等の抗喘息薬、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン等の抗生物質等の薬物類及びそれらの抗体、その他の酵素、菌体外毒素(スチレリジンO等)及びそれらの抗体等も挙げられる。また、Fab’2、Fab、Fv等の抗体断片も用いる事ができる。
i)蛍光性化合物(1)又は(4)中のペプチドと生体物質中のペプチドとの非共有結合(例えば、水素結合、キレート形成を含むイオン結合)又は共有結合、
ii)蛍光性化合物(1)又は(4)中の長鎖アルキル基と生体物質中の脂質二重膜及び脂質などとのファンデルワールス力、
iii)蛍光性化合物(1)又は(4)中のNHSエステル(N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)と生体物質中のアミノ基との反応によるアミド結合、
iv)蛍光性化合物(1)又は(4)中のマレイミド基と生体物質中のスルファニル基(-SH)との反応によるチオエーテル結合、
v)蛍光性化合物(1)又は(4)中のアジド基と生体物質中のアセチレン基とのClick反応又は蛍光性化合物(1)又は(4)中のアセチレン基と生体物質中のアジド基とのClick反応によるトリアゾール環の形成、
が挙げられる。
ただし、上記ii)で記載する蛍光性化合物(1)又は(4)中の長鎖アルキル基には、式(1)又は式(4)で規定する通り、XがCR5であって、R5が式(A)で表される基であり、L3が単結合かつR111がアリール基である場合、アリール基上の炭素数が18以上の直鎖アルキル基は含まれない。
上記i)~v)の形態以外にも、例えば、Lucas C. D. de Rezende and Flavio da Silva Emery,. A Review of the Synthetic Strategies for the Development of BODIPY Dyes for Conjugation with Proteins, Orbital: The Electronic Journal of Chemistry, 2013, Vol 5, No. 1, p.62-83に記載の形態により結合することができる。また、本発明の蛍光標識生体物質の作製においても、同文献に記載の方法等を適宜参照することができる。
本発明の蛍光標識生体物質を含む試薬において、本発明の蛍光標識生体物質は、例えば、生理食塩水及びリン酸緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液形態、並びに、微粒子状粉末及び凍結乾燥粉末等の固形形態等、特に制限されることなく、使用目的等に応じてその形態を適宜選択することができる。
例えば、下記生体蛍光イメージング試薬として本発明の蛍光標識生体物質を用いる場合に、上記いずれかの形態の蛍光標識生体物質を含む試薬として使用することもできる。
本発明の式(1)又は式(4)で表される蛍光性化合物から得られる本発明の蛍光標識生体物質は、光照射により励起された蛍光性化合物から放出される蛍光を安定的に検出することができる。しかも、生体蛍光イメージング試薬としての十分な親水性を備える。このため、本発明の蛍光標識生体物質は、例えば、生体蛍光イメージング試薬として好適である。
本発明の蛍光標識生体物質を蛍光色素として使用して染色した細胞は、褪色が高度に抑制されることにより、長時間に亘り蛍光強度を維持することができる。このため、本発明の蛍光標識生体物質は、タイムラプス測定による顕微鏡観察等の長期に亘る生体物質の観察、共焦点レーザー顕微鏡等の高解像度顕微鏡又はSTED顕微鏡(誘導放出抑制顕微鏡)等の超解像顕微鏡を用いた生体物質の観察などの、優れた耐光性が求められる生体蛍光イメージングにより好適に用いることができる。
(i)標的とする生体物質(以下、「標的生体物質」と称す。)と、標的生体物質と結合可能な生体物質と本発明の蛍光性化合物とが結合した本発明の蛍光標識生体物質と、を用意する工程
(ii)標的生体物質と本発明の蛍光標識生体物質とを結合させる工程
(iii)本発明の蛍光標識生体と標的生体物質とが結合した物質に、本発明の蛍光標識生体が吸収する波長域の光を照射し、本発明の蛍光標識生体が発する蛍光を検出する工程
また、本発明の蛍光標識生体物質も、特に制限されることなく、標的生体物質と結合可能な生体物質と本発明の蛍光性化合物とを常法に従って結合させて調製することができる。結合の形態及び結合を形成する反応としては、上記本発明の蛍光標識生体物質で記載する相互作用して結合する形態及び反応を挙げることができる。
本発明の蛍光標識生体物質と標的生体物質との結合は、特に制限されることなく、常法に従って行うことができる。
本発明において、好ましい置換基としては、下記置換基群Tから選ばれる置換基が挙げられる。
また、本明細書において、単に置換基としてしか記載されていない場合は、この置換基群Tを参照するものであり、各々の基、例えば、アルキル基、が記載されているのみの場合は、この置換基群Tの対応する基が好ましく適用される。
さらに、本明細書において、アルキル基を環状(シクロ)アルキル基と区別して記載している場合、アルキル基は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を包含する意味で用いる。一方、アルキル基を環状アルキル基と区別して記載していない場合、及び、特段の断りがない場合、アルキル基は、直鎖アルキル基、分岐アルキル基及びシクロアルキル基を包含する意味で用いる。このことは、環状構造を採りうる基(アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等)を含む基(アルコキシ基、アルキルチオ基、アルケニルオキシ基等)、環状構造を採りうる基を含む化合物についても同様である。基が環状骨格を形成しうる場合、環状骨格を形成する基の原子数の下限は、この構造を採りうる基について下記に具体的に記載した原子数の下限にかかわらず、3以上であり、5以上が好ましい。
下記置換基群Tの説明においては、例えば、アルキル基とシクロアルキル基のように、直鎖又は分岐構造の基と環状構造の基とを明確にするため、これらを分けて記載していることもある。
アルキル基(好ましくは炭素数1~30、より好ましくは炭素数1~20、さらに好ましくは炭素数1~12、さらに好ましくは炭素数1~8、さらに好ましくは炭素数1~6、特に好ましくは炭素数1~3)、アルケニル基(好ましくは炭素数2~30、より好ましくは炭素数2~20、さらに好ましくは炭素数2~12、さらに好ましくは炭素数2~6、さらに好ましくは炭素数2~4)、アルキニル基(好ましくは炭素数2~30、より好ましくは炭素数2~20、さらに好ましくは炭素数2~12、さらに好ましくは炭素数2~6、さらに好ましくは炭素数2~4)、シクロアルキル基(好ましくは炭素数3~20)、シクロアルケニル基(好ましくは炭素数5~20)、アリール基(単環の基であってもよく、縮環の基(好ましくは2~6環の縮環の基)であってもよい。縮環の基である場合、5~7員環等からなる。アリール基は好ましくは炭素数6~40、より好ましくは炭素数6~30、さらに好ましくは炭素数6~26、特に好ましくは炭素数6~10)、ヘテロ環基(環構成原子として少なくとも1つの窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子又はセレン原子を有し、単環の基であってもよく、縮環の基(好ましくは2~6環の縮環の基)であってもよい。単環の基である場合、その環員数は5~7員が好ましく、5員又は6員がより好ましい。ヘテロ環基の炭素数は好ましくは2~40、より好ましくは2~20である。ヘテロ環基は芳香族ヘテロ環基(ヘテロアリール基)及び脂肪族ヘテロ環基(脂肪族複素環基)が包含される。)、アルコキシ基(好ましくは炭素数1~20、より好ましくは炭素数1~12)、アルケニルオキシ基(好ましくは炭素数2~20、より好ましくは炭素数2~12)、アルキニルオキシ基(好ましくは炭素数2~20、より好ましくは炭素数2~12)、シクロアルキルオキシ基(好ましくは炭素数3~20)、アリールオキシ基(好ましくは炭素数6~40、より好ましくは炭素数6~26、さらに好ましくは炭素数6~14)、ヘテロ環オキシ基(好ましくは炭素数2~20)、
また、カルボキシ基、ホスホノ基、スルホ基、オニオ基、アミノ酸残基、又は、ポリアミノ酸残基を置換基として有する上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アミノ基、スルファモイル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホンアミド基、アルキルチオ基、シクロアルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基が挙げられる。
比較化合物(2)はBODIPY(登録商標) 496/512(インビトロジェン社製、商品名)である。
KP-Sil Cartridge(Biotage社)、ハイフラッシュカラムW001、W002、W003、W004又はW005〔山善(株)〕を使用した。NHシリカは、SNAP KP-NH Cartridge(Biotage社)を使用した。溶離液における混合比は、容量比である。例えば、「クロロホルム:メタノール=90:10→50:50」は、「クロロホルム:メタノール=90:10」の溶離液を「クロロホルム:メタノール=50:50」の溶離液へ変化させたことを意味する。
分取薄層シリカゲルクロマトグラフィーは、PLCガラスプレートシリカゲルF60(メルク社)を使用した。NHシリカは、PLC05 Plates NH〔富士シリシア化学(株)〕を使用した。
溶媒:A液:0.1%ギ酸-水
B液:0.1%ギ酸-アセトニトリル
グラジエントサイクル:0.00min(A液/B液=95/5)、2.00min(A液/B液=5/95)、3.00min(A液/B液=5/95)、3.01min(A液/B液=100/0)、3.80min(A液/B液=100/0)
流速:0.5 mL/min
カラム温度:室温
検出波長:254nm
また、保持時間(RT)は、SQD(Waters社)を用いて測定し、分(min)で示した。
各合成例における記載は、具体的には、以下の通りである。
RT(min):保持時間(分)
特に記載のない場合、MSは、MS(ESI m/z):[M+H]+を意味する。
以下に示す各化合物の合成に用いた略語は下記の化合物である。
DDQ:2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン
DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド
HATU:1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート
NBS:N-ブロモスクシンイミド
NHS:N-ヒドロキシこはく酸イミド
GABA:γ-アミノ酪酸
PdCl2(dtbpf):[1,1’-ビス(ジ-tert-ブチルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド
RuPhos:2-ジシクロへキシルホスフィノ-2’,6’-ジイソプロポキシビフェニル
TFA:トリフルオロ酢酸
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
DCM:ジクロロメタン
DMAP:4-ジメチルアミノピリジン
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
THF:テトラヒドロフラン
Anti-IgG:抗マウスIgG抗体
Ac:アセチル基
Boc又はBOC:tert-ブトキシカルボニル基
Bu:ブチル基
Me:メチル基
Et:エチル基
PEG:ポリエチレングリコール
iPr:イソプロピル基
TMS:トリメチルシリル基
下記のスキームに基づき、化合物(1)を合成した。
下記化合物(1-A)、化合物(1-B)及び化合物(1-C)を、それぞれ、chem.Eur.J.2016,22,93-96に記載の方法、Org.Process Res.Dev.2015,19,1774-1783に記載の方法に準じて、合成した。
化合物(1-C)112mgのCPME溶液11mLに、水0.02mL、2-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸 76mg〔和光純薬工業(株)〕、PdCl2(dtbpf) 16mg〔東京化成工業(株)〕及びフッ化セシウム152mg〔和光純薬工業(株)〕を添加し、加熱還流下90分間撹拌した。続いて、反応液を室温まで冷却した後、反応液に飽和重層水を添加後、酢酸エチルで3回抽出し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=100:0
→ 50:50)で精製し、減圧下溶媒を留去した。得られた生成物をアセトン溶液20mLの溶液とし、塩化カルシウム90mgを加えてマイクロウェーブ反応装置にて160℃で30分間撹拌した。その後、反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチルのみ)で精製し、減圧下溶媒を留去し、化合物(1-D)31mg(赤褐色固体)を得た。
MS(ESI m/z):441(M+H)
RT(min):1.83
化合物(1-D)4.5mgのアセトニトリル溶液2mLに、クロロスルホン酸3μL〔和光純薬工業(株)〕を添加し、室温下5分撹拌した。その後、反応液を直接分取薄層シリカゲルクロマトグラフィー(メタノール:クロロホルム=20:80)にて精製し、化合物(1)1mg(赤褐色固体)を得た。
MS(ESI m/z):521(M+H)
RT(min):1.19
下記のスキームに基づき、化合物(2)を合成した。
MS(ESI m/z):557(M+H)
RT(min):1.28
下記のスキームに基づき、化合物(3)を合成した。
MS(ESI m/z):557(M+H)
RT(min):1.28
下記のスキームに基づき、化合物(4)と標識抗体(1)を合成した。
MS(ESI m/z):565(M-K+2H)
RT(min):1.07
MS(ESI m/z):662(M+H)
下記のスキームに基づき、化合物(5)と標識抗体(2)を合成した。
MS(ESI m/z):650(M-2X+3H)
MS(ESI m/z):747(M-X+2H)
下記のスキームに基づき、化合物(6)と標識抗体(3)を合成した。
MS(ESI m/z):645(M-2K+3H)
MS(ESI m/z):780(M-2K+3H)
下記のスキームに基づき、化合物(7)と標識抗体(4)を合成した。
MS(ESI m/z):623(M-K)
MS(ESI m/z):722(M-K+2H)
下記のスキームに基づき、化合物(8)と標識抗体(5)を合成した。
MS(ESI m/z):659(M-K)
MS(ESI m/z):758(M-K+2H)
下記のスキームに基づき、化合物(9)と標識抗体(6)を合成した。
MS(ESI m/z):683(M-K)
MS(ESI m/z):782(M-K+2H)
下記のスキームに基づき、化合物(10)と標識抗体(7)を合成した。
化合物(7-C)から化合物(7)を合成する方法において、化合物(7-C)を化合物(10-B)に変更した以外は同様にして化合物(10)を合成した。
MS(ESI m/z):591(M-K)
MS(ESI m/z):690(M-K+2H)
下記のスキームに基づき、化合物(11)と標識抗体(8)を合成した。
MS(ESI m/z):651(M-K)
MS(ESI m/z):750(M-K+2H)
下記のスキームに基づき、化合物(12)と標識抗体(9)を合成した。
MS(ESI m/z):776(M-X+2H)
MS(ESI m/z):873(M-2X+3H)
下記のスキームに基づき、化合物(13)と標識抗体(10)を合成した。
MS(ESI m/z):776(M-X+2H)
MS(ESI m/z):733(M-X+2H)
下記のスキームに基づき、化合物(14)を合成した。
MS(ESI m/z):1959(M-X+2H)、1915(M-X+2H)、1871(M-X+2H)、1827(M-X+2H)、1783(M-X+2H)、1739(M-X+2H)
(左からn=28、27、26、25、24、23)
下記のスキームに基づき、化合物(15)を合成した。
MS(ESI m/z):485(M+H)
下記のスキームに基づき、化合物(16)を合成した。
MS(ESI m/z):592(M-X+2H)
下記のスキームに基づき、化合物(17)及び化合物(18)を合成した。
化合物(7-E)~化合物(7)を合成する方法において、化合物(7-E)を化合物(17-A)に変更し、化合物(7)の合成までに用いる試薬の当量を半量に変更した以外は、化合物(7)の合成と同様にして、化合物(17)及び化合物(18)を合成した。
MS(ESI m/z):565(M-K)
下記のスキームに基づき、化合物(19)と標識抗体(11)を合成した。
化合物(7-G)から化合物(7)を合成する方法において、化合物(7-G)に代えて化合物(19-B)を用いた以外は同様にして、化合物(19)を合成した。
MS(ESI m/z):671(M-K)
MS(ESI m/z):768(M-1)
下記のスキームに基づき、化合物(20)を合成した。
化合物(7-F)から化合物(7-H)を合成する方法において、化合物(7-F)を化合物(20-A)に置き換えた以外は同様にして化合物(20-D)を合成した。化合物(15-A)から化合物(16)を合成する方法において、化合物(15-A)を化合物(20-D)に置き換えることで化合物(20)を合成した。
MS(ESI m/z):664(M-X)
下記のスキームに基づき、化合物(21)を合成した。
MS(ESI m/z):613(M-X)
下記のスキームに基づき、化合物(22)を合成した。
MS(ESI m/z):639(M-K)
下記のスキームに基づき、化合物(23)を合成した。
MS(ESI m/z):707(M+K)
MS(ESI m/z):451(M+K)
下記のスキームに基づき、化合物(24)と標識抗体(12)を合成した。
MS(ESI m/z):168(M+K)
MS(ESI m/z):595(M-K)
MS(ESI m/z):575(M-K)
MS(ESI m/z):672(M-K)
上記で合成した化合物及び比較化合物について、下記特性を評価し、その結果を表1に示した。
1.5mLのエッペンチューブ中に、上記で合成した化合物を含むDMSO溶液(20mM in DMSO(ジメチルスルホキシド)、評価サンプル溶液)5μLと、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(以下、「PBS溶液」とも称す。)495μLとを入れて混合し、マルチシェーカーMS 300(商品名、アズワン社製)により、2000rpmで30分間撹拌した。混合液を遮光下で60分間静置した後、さらに遠心沈降(12000rpm、5分間)させた。0.20μmのフィルタでろ過したろ液について、UHPLC Nexera〔(株)島津製作所、Shim-pack XR-ODSII〕を用いて化合物濃度(化合物がすべて溶解した場合、化合物濃度は200μMとなる。)を測定し、以下の評価基準に基づき評価した。
本試験において、水溶性は、評価ランク「B」以上が合格である。
- 水溶性の評価基準 -
A: 100μM以上
B: 1μM以上100μM未満
C: 0.1μM以上1μM未満
D: 水溶性が低く濃度測定不可
PBS溶液(pH7.4)に上記で合成した化合物を、吸収波長ピークの吸光度が0.095~0.105となるように溶解した。この溶液を、メリーゴーランド光照射機〔ウシオ電機(株)のキセノンランプUXL-500D-O、HA-50フィルタ、Y44フィルタ、露光強度22mW/cm2(500nm換算)〕を用いて露光した状態で、各化合物の吸収波長ピークの吸光度を分光器(HP社、Agilent8453)により経時的に測定した。露光前の吸収波長ピークの吸光度を100%として、この吸収波長ピークの吸光度が20%低下(吸収波長ピークの吸光度が80%に到達)するまでの露光時間を求め、以下の評価基準に基づき評価した。
本試験において、耐光性は、評価ランク「C」以上が合格である。
- 耐光性の評価基準 -
A:100時間以上
B:50時間以上100時間未満
C:25時間以上50時間未満
D:2時間以上25時間未満
E:2時間未満
F:低水溶性により評価不可
また、比較化合物(1)との比較から、本発明の蛍光性化合物が有する親水性基は、化合物の親水性を高めるだけでなく、耐光性の向上にも寄与することがわかる。
このように、本発明の蛍光性化合物は十分な親水性と優れた耐光性の両立を実現した、生体蛍光イメージングの蛍光色素として好適な化合物である。
上記で合成した標識抗体について、水溶性及び耐光性の両特性を評価し、その結果を表2に示した。
水溶性及び耐光性は、上記実施例1における水溶性及び耐光性の評価において、化合物に代えて標識抗体を用いた以外は同様にして評価を行った。ただし、本実施例2における耐光性は、評価ランク「D」以上が合格である。
参考標識抗体(1)は、Alexa Fluor(登録商標) 568標識抗マウスIgG抗体(アブカム社製、商品名)である。なお、この標識抗体におけるAlexa Fluor 568は、下記化学構造を有する蛍光色素と推定される。下記構造式中において、*は抗マウスIgG抗体との結合部位を示す。
このように、本発明の蛍光標識生体物質は十分な親水性と優れた耐光性の両立を実現し、長期間、高解像度での生体観察等、生体蛍光イメージングの標識生体物質として好適である。
上記で合成した標識抗体及び比較標識抗体を用いて、下記の通り細胞染色を行った。調製した染色細胞について、下記特性を評価し、その結果を表3に示した。
NCI-H460細胞〔カタログ番号:HTB-177TM、ATCC社〕をスライドチャンバーに播種し、10%のウシ胎児血清と1%のPenicilline/Streptomycinとを含むRPMI-1640培地〔いずれもThermo Fisher社〕にて3日間、インキュベータにて培養した。
続いて培地を除き、4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて20分間処理を行い固定化したのちPBS〔Thermo Fisher社〕で洗浄し、濃度0.5%のTritonX-100(ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル)のPBS溶液で10分間処理をした後、PBSで洗浄した。続いて濃度1%のBSA(ウシ血清アルブミン)水溶液を加え30分処理した後、一次抗体として抗α-Tubulin抗体〔マウスモノクローナル、カタログ番号:017-25031、富士フイルム和光純薬社〕希釈液を加え、抗体終濃度0.5μg/mLにて室温にて1時間静置した。PBSで洗浄したのち、二次抗体として10μg/mLの各標識抗体水溶液を加え、遮光しながら室温にて1時間静置し、再度PBSで洗浄することで各染色細胞サンプルを得た。
なお、下記耐光性の評価は、作製直後の染色細胞サンプルを用いた。
各染色細胞サンプルを共焦点レーザー顕微鏡〔TCS SP5、ライカ社製〕に設置し、光源のHe-Neレーザー(出力100%)を波長543nm、検出を波長554~773nmとして各4時間のタイムラプス測定を実施した。染色部4か所、非染色部4か所の蛍光強度の時間プロファイルを取得し、染色部の平均信号強度から非染色部の平均信号強度を差し引いた値を正味の蛍光強度とした。露光前の蛍光強度を100%として、20%低下(蛍光強度が80%に到達)するまでの露光時間を求め、以下の評価基準に基づき評価した。
- 耐光性の評価基準 -
A:4時間以上
B:3時間以上4時間未満
C:2時間以上3時間未満
D:1時間以上2時間未満
E:1時間未満
このように、本発明の蛍光性化合物を用いた蛍光標識生体物質は、従来のジピロメテンホウ素錯体構造を有する化合物の欠点であった耐光性を改善することができ、生体物質のイメージング又は生体物質の検出に使用する蛍光色素としての汎用性を大きく向上させることができる。
Claims (15)
- 下記式(1)又は式(4)のいずれかで表される蛍光性化合物。
R1~R6は、ハロゲン原子、シアノ基又は下記式(A)で表される基を示す。
R7は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基又はハロゲン原子を示す。ただし、R6とR7は互いに結合して環を形成することはない。
Q1及びQ2は、下記式(1-1)~式(1-3)のいずれかで表される基を示す。
L1及びL2はアルキレン基であるか、又は、アルキレン基およびアリーレン基を組合せてなる基であり、L 1 及びL 2 がアルキレン基である場合、環β 1 及び環β 2 の環員数は5~7であり、L 1 及びL 2 がアルキレン基およびアリーレン基を組合せてなる基である場合は、環β 1 及び環β 2 の環員数は7である。
ただし、R1~R7、L1、L2、Q1及びQ2のうち少なくとも1つは、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、及びホスホノ基もしくはその塩の少なくとも1種を有する。
R111は、水素原子を示す。
*は結合部を示す。
式中、R 11 は水素原子又は炭素数1~3のアルキル基を示す。R12は水素原子、ヒドロキシ基又は炭素数1~3のアルキル基を示す。
*は結合部を示す。 - 前記Q1及びQ2が、いずれも、前記式(1-1)で表される基である、請求項1に記載の蛍光性化合物。
- 前記XがCR5であって、該R5が前記式(A)で表される、請求項1又は2に記載の蛍光性化合物。
- 前記R3及びR4の少なくとも1つが、カルボキシ基もしくはその塩を含む基、スルホ基もしくはその塩を含む基、又は、ホスホノ基もしくはその塩を含む基である、請求項1~3のいずれか1項に記載の蛍光性化合物。
- 前記R3及びR4の少なくとも1つが、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、又は、ホスホノ基もしくはその塩である、請求項1~4のいずれか1項に記載の蛍光性化合物。
- 前記R3及びR4の少なくとも1つがスルホ基もしくはその塩である、請求項1~5のいずれか1項に記載の蛍光性化合物。
- 前記Q1及びQ2が前記式(1-1)で表される基であり、
前記R1~R4が前記式(A)で表され、かつ、前記式(A)中、L3が単結合又は-SO3-であり、R111が水素原子であり、
前記R6が、前記式(A)で表され、かつ、前記式(A)中、L3が単結合、アルキレン基、アリーレン基もしくは前記式(1-1)で表される基であるか、又は、アルキレン基、アリーレン基および前記式(1-1)で表される基を組合せてなる基であり、
前記R7が水酸基であり、
前記環β1及び環β2の環員数が7であり、
前記XがCR5であり、該R5が前記式(A)で表され、かつ、前記式(A)中、L 3 が下記(b)を満たす、請求項1に記載の蛍光性化合物。
(b)前記L3がアルキレン基、アリーレン基、上記式(1-1)で表される基、式(1-3)で表される基、式(1-4)で表される基もしくは式(1-7)で表される基であるか、又は、アルキレン基、アリーレン基、上記式(1-1)で表される基、式(1-3)で表される基、式(1-4)で表される基および式(1-7)で表される基から選ばれる2種以上を組合せてなる基である。
ただし、前記式(1)で表される蛍光性化合物合物においては、前記R3及びR4の少なくとも1つがスルホ基もしくはその塩であるか、又は、前記R1~R5の少なくとも1つがカルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、及びホスホノ基もしくはその塩の2種以上を有し、前記式(4)で表される蛍光性化合物においては、前記R3及びR4の少なくとも1つがスルホ基もしくはその塩であるか、又は、R1~R7の少なくとも1つがカルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、及びホスホノ基もしくはその塩の2種以上を有する。 - 前記蛍光性化合物が前記式(3)で表され、
前記XがCR5であり、該R5が前記式(A)で表され、かつ、前記式(A)中、L3が単結合、アルキレン基、アリーレン基、前記式(1-1)で表される基、式(1-3)で表される基、式(1-4)で表される基もしくは式(1-7)で表される基であるか、又は、アルキレン基、アリーレン基、前記式(1-1)で表される基、式(1-3)で表される基、式(1-4)で表される基および式(1-7)で表される基から選ばれる2種以上を組合せてなる基であり、
前記R1及びR2は水素原子であり、
前記R3及びR4は、前記式(A)で表され、かつ、前記式(A)中、L3が単結合又は-SO3-であり、
前記Qは、前記式(1-1)で表される基であり、
前記L11がメチレン基であり、
前記R8が、L11の結合位置に対してピロール環とは逆側のメタ位のみに位置し、かつ、アルコキシ基又はハロゲン原子であり、nは0または1であり、
nが0の場合において、前記R1~R5、L11、Qの少なくとも1つは、カルボキシ基もしくはその塩、及びスルホ基もしくはその塩の少なくとも1種を有し、nが1の場合において、前記R1~R5、R8、L11、Qの少なくとも1つは、カルボキシ基もしくはその塩、及びスルホ基もしくはその塩の少なくとも1種を有する、請求項9に記載の蛍光性化合物。
ただし、前記R3及びR4の少なくとも1つがスルホ基もしくはその塩であるか、又は、nが0の場合には前記R1~R5のうち少なくとも1つが、nが1の場合には前記R1~R5およびR8のうち少なくとも1つが、カルボキシ基もしくはその塩、スルホ基もしくはその塩、及びホスホノ基もしくはその塩の2種以上を有する。 - 下記式(7)で表される請求項1~6のいずれか1項に記載の蛍光性化合物。
前記Qが前記式(1-1)で表される基であり、
前記R1及びR2が水素原子であり、
前記R3及びR4が前記式(A)で表され、かつ、前記式(A)中、L3が単結合又は-SO3-であり、
前記L12がアルキレン基であり、
前記L13がメチレン基又は前記式(1-3)で表される基であり、
前記環β12及び環β22の環員数は7であり、
前記XがCR5であり、該R5が前記式(A)で表され、かつ、前記式(A)中、L 3 が下記(b)を満たす。
(b)前記L3がアルキレン基、アリーレン基、上記式(1-1)で表される基、式(1-3)で表される基、式(1-4)で表される基もしくは式(1-7)で表される基であるか、又は、アルキレン基、アリーレン基、上記式(1-1)で表される基、式(1-3)で表される基、式(1-4)で表される基および式(1-7)で表される基から選ばれる2種以上を組合せてなる基である。 - 前記蛍光性化合物が抗体との結合性部位を有し、該抗体との結合性部位を、R 1 ~R 8 、L 1 、L 2 、L 11 ~L 13 、Q、Q 1 及びQ 2 のいずれかが有する請求項1~11のいずれか1項に記載の蛍光性化合物。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の蛍光性化合物が生体物質との結合性部位を有し、該生体物質との結合性部位を、R 1 ~R 8 、L 1 、L 2 、L 11 ~L 13 、Q、Q 1 及びQ 2 のいずれかが有し、該蛍光性化合物と該生体物質とが結合してなる蛍光標識生体物質からなる、バイオイメージング試薬。
- 前記生体物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖及び脂質のいずれかである請求項13に記載のバイオイメージング試薬。
- 前記蛍光性化合物と前記生体物質との結合が下記i)~v)のいずれかによる結合である請求項13又は14に記載のバイオイメージング試薬。
i)ペプチド間での非共有結合又は共有結合、
ii)蛍光性化合物中の長鎖アルキル基と生体物質中の脂質二重膜又は脂質とのファンデルワールス相互作用、
iii)蛍光性化合物中のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルと生体物質中のアミノ基とを反応させてなるアミド結合、
iv)蛍光性化合物中のマレイミド基と生体物質中のスルファニル基とを反応させてなるチオエーテル結合、
v)蛍光性化合物中のアジド基と生体物質中のアセチレン基、又は、蛍光性化合物中のアセチレン基と生体物質中のアジド基とをClick反応させてなる、トリアゾール環の形成を伴う結合
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