JP2013032297A - バイオイメージングのための近赤外発光物質及びその合成方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】生体深部のバイオイメージングに適し、使用目的に応じた誘導体化が容易であり、簡単かつ大量合成が可能な安定性のある近赤外発光物質を実現する。
【解決手段】式1で表されるジピリンホウ素錯体をアルキル化により合成した式9で表される中間生成物を、アジ化物とのクリック反応により単糖を導入して式6で表されるジピリンホウ素錯体誘導体を合成し、このジピリンホウ素錯体誘導体は、照射する近赤外線の波長が650nmにおいて他の波長より強い蛍光を示し、この近赤外線は、生体深部の透過性が優れている。
【選択図】図1
【解決手段】式1で表されるジピリンホウ素錯体をアルキル化により合成した式9で表される中間生成物を、アジ化物とのクリック反応により単糖を導入して式6で表されるジピリンホウ素錯体誘導体を合成し、このジピリンホウ素錯体誘導体は、照射する近赤外線の波長が650nmにおいて他の波長より強い蛍光を示し、この近赤外線は、生体深部の透過性が優れている。
【選択図】図1
Description
本発明は、バイオイメージングのための近赤外発光物質及びその合成方法に関し、特に、生体に単に導入するだけでも、近赤外検出器で高感度、高効率なイメージング可能となる近赤外発光物質及びその合成方法に関する。
近年、バイオイメージング技術の進歩は著しく、有機化合物プローブ(例えば、Fura-2等)、機能性FP(Fluorescent Protein 蛍光蛋白質)、無機マテリアルプローブなどの開発が行われている。
様々な疾病が惹起されるとされている生体内で活性酸素種の解析により、病因、病態等の解明において重要である。この解明のための有機化合物プローブの例として、活性酸素種のうち、スーパーオキサイド、ヒドロキシルラジカルおよび一重項酸素には応答せず、過酸化水素だけに対して応答する高選択的な蛍光プローブとして機能するスルホン酸エステル化合物が提案されている(特許文献1参照)。
ところで、バイオイメージング技術は、病体時の病理解明、診断等へきわめて有用な手段であり、今後、ますますそのような分野への応用開発が活発に展開されていくものと予想される。病体時の病理解明、診断等へ適用されるためには、人、動物の生体深部における情報としてin vivo のバイオイメージングを得ることが要請されている。
これまで知られているバイオイメージングは、可視光領域のものがほとんどであった。従来の可視光を用いたバイオイメージングは、生体内で光の吸収が大きく透過性が悪いので、培養細胞及び組織表面等、可視光の透過する対象には使用可能であるが、生体深部におけるin vivoのバイオイメージングを得るには適していない。
そこで、近赤外光は生体分子の透過性が高く、体の深部の情報を得るのに非常に有用であることが着目され、最近、近赤外光に応答する蛍光イメージングのための手段が、化学分野、分子生物学等の分野で研究開発が活発に行われている。
しかしながら、これまで知られている既存の近赤外発光物質は安定性に問題があったり、一般に合成が難しいものが多く、しかも発光効率の高い物質の合成例は非常に限られているという問題があった。
本発明は、上記従来の問題を解決することを目的とし、次の点を課題とする。
(1)可視光では生体深部のバイオイメージングに適しないが、生体深部のバイオイメージングを可能とする近赤外発光物質を実現する。
(2)通常合成が困難な近赤外発光物質を、簡便に合成し、しかも大量に合成する合成方法を実現する。
(3)安定性を有し、しかも高効率で近赤外発光を行い、さらには、使用目的に応じた化学修飾、誘導体化が容易な近赤外発光物質を実現する。
(1)可視光では生体深部のバイオイメージングに適しないが、生体深部のバイオイメージングを可能とする近赤外発光物質を実現する。
(2)通常合成が困難な近赤外発光物質を、簡便に合成し、しかも大量に合成する合成方法を実現する。
(3)安定性を有し、しかも高効率で近赤外発光を行い、さらには、使用目的に応じた化学修飾、誘導体化が容易な近赤外発光物質を実現する。
本発明は上記課題を解決するために、図1の式1で表されるジピリンホウ素錯体又は図1の式2〜8のいずれかで表されるジピリンホウ素錯体誘導体を含むバイオイメージング用近赤外発光物質を提供する。
前記ジピリンホウ素錯体誘導体は、図1において示す式1で表されるジピリンホウ素錯体をアルキル化して合成した式9で表される中間生成物と、アジ化物とのクリック反応により単糖を導入して合成された化合物である。
前記ジピリンホウ素錯体誘導体は、照射する光の波長が630nmにおいて強い蛍光を示すバイオイメージングに適した近赤外発光物質である。
本発明は上記課題を解決するために、図1の式1で表されるジピリンホウ素錯体をアルキル化して合成した式9で表される中間生成物を、アジ化物とクリック反応することにより単糖を導入して式6で表されるジピリンホウ素錯体誘導体を含むバイオイメージング用近赤外発光物質を合成することを特徴とするバイオイメージング用近赤外発光物質の合成方法を提供する。
本発明に係る近赤外発光物質及びその合成方法よれば、生体深部におけるがん細胞であるHeLa細胞に対し効率よく近赤外発光に基づく染色を行うことができる。また、いろいろの化学修飾が容易で、目的に応じて多様な誘導体化が可能であるから、医療分野での病理解明、診断等において、その目的に応じて、いろいろな態様での適用が可能である。
本発明に係る近赤外発光物質を実施するための形態を実施例に基づき図面を参照して、以下説明する。
650nmを超える近赤外光は、生体組織に対する透過性が高い。従って、生体内組織の観測のため利用可能である。本発明は、近赤外蛍光プローブとして活用できる、安定性を有し、発光が高効率である近赤外発光物質を得ることを目的とするものであり、本発明の特徴は、ジピリンホウ素錯体を合成することで得られる近赤外発光物質及びその合成方法である。
ホウ素にアリール基とフェノキシ基が結合したジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPYは、650nm付近に強い蛍光を持つ色素である。よって、近赤外領域における細胞蛍光染色への適用が期待される。
このジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPYについては、図4に示すように、式10で表されるN2O2型ジピリンに、ArB(OH)2をクロロホルム(CHCl3)溶液中で反応させることで、式1で表されるジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPYを合成できる。
また、ジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPYは、化学修飾が容易で様々な置換基の導入が容易である。よって、ジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPYに様々な置換基を導入して、目的に応じて多様な誘導体化が可能であり、医療分野での病理解明、診断等において、その目的に応じて、いろいろな態様での適用が可能である。
以上の知見を下に、本発明者らは、様々な置換基を有するジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPYの誘導体を合成することについて、さらに、その生体細胞へのバイオイメージングへの応用について、鋭意研究開発を行った。
図1において、式1は、フェノール性水酸基を有するジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPYを表す化学式である。
この式1で表されるジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPYに、スキーム1に示すように、RX及びK2CO3をCH3CN又はアセトン(acetone)溶液中で反応させて、アルキル化する。これによって、図1の式2−4、9でそれぞれ表されるAr,O-BODIPY誘導体を合成する。
ここで、図1の式2−4、9でそれぞれ表されるAr,O-BODIPY誘導体について、アルキル基Rは、それぞれ図1中の式2−4、9に記載のとおりのものである。化合物2、3、4、9の収率は、それぞれ、>99%、75%、50%、51%である。
そして、式1で表されるAr,O-BODIPYから合成された中間生成物としての、式9で表されるアルキン部位を持つAr,O-BODIPY誘導体と、アジ化物とのクリック反応により、図1におけるスキーム2に示すように、アルキル基又は糖鎖を導入した式5−8でそれぞれ表されるAr,O-BODIPY誘導体を合成する。
ここで、図1に示す式5−8でそれぞれ表されるAr,O-BODIPY誘導体について、アルキル基R’は、それぞれ図1中の式5−8に記載しているとおりである。
なお、式9で表されるAr,O-BODIPY誘導体とアジ化物とのクリック反応は、N3−R’、Cu(0)、CuSO4・5H2O及びNa- ascorbateをTHF/H2O溶液中で反応させて行う。
本発明者らは、上記のとおり式1で表されるジピリンホウ素錯体Ar,O-BODIPY、及びこのAr,O-BODIPYから合成した式2−8でそれぞれ表されるAr,O-BODIPY誘導体について、次に説明する測定実験を行った。
この測定実験によって、式1で表されるAr,O-BODIPY及び式2−8でそれぞれ表される誘導体が近赤外光を用いた細胞染色に有用であるという結果を得た。
特に、代表的な単糖の一つであるD−グルコース(デキストロース)を導入して合成した、式6で表されるAr,O-BODIPY誘導体が、最も細胞からの蛍光強度が強く、バイオイメージングのための近赤外発光物質として効果的であることが判明した。この点について、以下、詳細に説明する。
まず、式1で表されるAr,O-BODIPY及び式2−8でそれぞれ表される誘導体をクロロホルムやメタノール中でその蛍光強度を測定したところ、いずれも650nm付近に強い蛍光を示した。この蛍光の波長域については、化合物による違いはほとんど見られなかった。
一方、含水溶媒中、具体的には、水を含むDMSO(ジメチルスルホキシド)溶媒(重量比はH2O/DMSO=9/1)中では、式1で表されるAr,O-BODIPY及び式2−6でそれぞれ表される誘導体は完全に消光し、式7、8でそれぞれ表される誘導体は650nm付近の蛍光が観測された。
また、含水溶媒中において、動的光散乱光度計を用いて粒度分布測定を行ったところ、式7、8でそれぞれ表される誘導体はほとんど散乱を示さなかったので、含水溶媒でも凝集していないことが分かった。
式1で表されるAr,O-BODIPY及び式2−6でそれぞれ表される誘導体は、上記のとおり含水溶媒中において消光した。また、粒度分布測定から、粒径30−80nmの凝集体を形成していることが分かった。
これらの結果から、含水溶媒中において、式1で表されるAr,O-BODIPY及び式2−6でそれぞれ表される誘導体は凝集体を形成して蛍光が消光していると考えられる。他方、糖のような親水性置換基を導入した式7、8でそれぞれ表される誘導体は含水溶媒にも可溶で、有機溶媒と同様の蛍光が観測されたものと考えられる。
次に、HeLa細胞に対し、式1で表されるAr,O-BODIPY、式2−8でそれぞれ表される誘導体を加え、2時間培養し、蛍光顕微鏡観察を行った。その観察結果、細胞内から650nm以上の蛍光が観測された。
これを、フローサイトメトリーを用いて、細胞中の蛍光強度を見積もった。この結果を、図2(a)、(b)に示す。図2(a)は、HeLa細胞中における誘導体1−4の蛍光強度を示し、図2(b)は、HeLa細胞中における誘導体5−8の蛍光強度を示す。
なお、図2(a)、(b)中、横軸は誘導体の式1−8の式の番号を表し、縦軸は蛍光強度(Fluorescence Intensity)を示し、その単位はa.u.である。
図2(a)、(b)に示すように、「式1で表されるAr,O-BODIPY」>「式2で表される誘導体」>「式3で表される誘導体」>「式4で表される誘導体」の順となり、アルキル基が長くなるほど蛍光が弱くなることが分かった。これはアルキル基が長いほど、水中で凝集しやすくなり、消光が起きているものと考えられる。
また、式6−8でそれぞれ表される誘導体については、蛍光強度は、「式6で表される誘導体」>「式7−8それぞれ表される誘導体」となり、糖鎖が長くなるほど蛍光が弱くなった。これは、親水性置換基である糖の糖鎖が長くなり水溶性が高くなるほど、蛍光の細胞膜透過性が低くなったためだと考えられる。
単糖を置換基として有する式6で表される誘導体は蛍光顕微鏡においても強い蛍光が観測され、図3に示すように、細胞内組織(図3中の白部分の黒い部分)を可視化できるという知見が得られた。
以上の結果、図1において、式1で表されるAr,O-BODIPY及び式2−8でそれぞれ表される誘導体が近赤外光を用いた細胞染色に有用であり、特に、式6で表される誘導体が、最も細胞からの蛍光強度が強く、バイオイメージングのための蛍光物質として効果的であるということが実証された。
本発明によれば、HeLa細胞に対し、式6で表される誘導体を加え培養する、という極めて簡便な作業、操作で細胞の近赤外イメージングが行える。
以上、本発明に係るバイオイメージングのための近赤外発光物質を実施するための形態、及び該近赤外発光物質の合成方法を実施するための形態を、実施例に基づいて説明したが、本発明はこのような実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された技術的事項の範囲内でいろいろな実施例があることは言うまでもない。
本発明に係るバイオイメージングのための近赤外発光物質は上記のような構成であるから、標的化が可能なバイオイメージング技術として適用できバイオイメージング技術の飛躍的発展(発光効率、発光波長、誘導体化)をもたらすことが期待できる。
例えば、本発明に係るバイオイメージングのための近赤外発光物質は、生体の細胞イメージング、患部イメージングに利用でき、生理活性物質の発光性タグとして、生理活性物質(薬剤)の体内挙動の追跡に利用でき、さらに、遺伝子発現メカニズム解明による遺伝子治療薬の開発、タンパク質の機能解明に基づく人工ホルモンなどの開発等に利用できる。
Claims (4)
- 下記式1で表されるジピリンホウ素錯体又は下記式2〜8のいずれかで表されるジピリンホウ素錯体誘導体を含むことを特徴とするバイオイメージング用近赤外発光物質。
- 前記ジピリンホウ素錯体誘導体は、下記式1で表されるジピリンホウ素錯体をアルキル化して合成した下記の式9で表される中間生成物と、アジ化物とのクリック反応により単糖を導入して合成された化合物であることを特徴とする請求項1記載のバイオイメージング用近赤外発光物質。
- 前記ジピリンホウ素錯体誘導体は、照射する光の波長が630nmにおいて他の波長より強い蛍光を示すことを特徴とする請求項1又は2に記載のバイオイメージング用近赤外発光物質。
- 下記式1で表されるジピリンホウ素錯体をアルキル化して合成した下記式9で表される中間生成物を、アジ化物とクリック反応することにより単糖を導入して下記式6で表されるジピリンホウ素錯体誘導体を含むバイオイメージング用近赤外発光物質を合成することを特徴とするバイオイメージング用近赤外発光物質の合成方法。
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