CN117460789A - 化合物及使用了该化合物的标记生物物质 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种下述式(1)的化合物、具有该化合物的标记生物物质。环Z1及环Z2表示由选自碳原子及氮原子中的成环原子形成的6元环。R1～R4、R11～R13、L1、L2表示特定的基团，n、α1、α2表示特定的数。R11～R13的至少1个包含羧基或能够与生物物质键合的取代基。由式(1)表示的化合物具有至少1个由‑(CH2‑CH2‑O)m‑R21表示的结构。R21表示特定的基团，m表示特定的数。由式(1)表示的化合物是中性化合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物及使用了该化合物的标记生物物质。
背景技术
为了观察活体内对各种刺激(疾病、环境变化等)的变化，大多使用利用荧光性化合物(色素)标记对目标检测对象物质具有键合性的活体分子(抗体等)的荧光标记生物物质。
例如，在从蛋白质混合物检测特定的蛋白质的免疫印迹法(以下，也简称为WB。)中，也利用使用对该蛋白质具有键合性的荧光标记抗体来检测上述特定的蛋白质的有无或存在量的荧光法。
并且，在分析活体中的活体分子、细胞及组织等的动态及功能等的生物成像技术中，利用观察通过荧光标记可视化的活体的特定的部位的活体荧光成像作为活体观察的技术之一。
作为上述荧光标记中所使用的荧光色素，例如，如专利文献1中所记载的那样，已知有花青色素。然而，在将花青色素用于荧光标记的情况下，标记后的色素之间容易发生自缔合等相互作用，存在荧光量子产率降低的倾向。
作为应对该问题的技术，例如，在专利文献2中记载有导入了水溶性的PEG(聚乙二醇)基的花青色素。根据上述专利文献2，各专利文献中记载的花青色素通过色素所具有的PEG基来抑制标记后的色素之间的自缔合，显示出比以往的花青色素高的荧光强度。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2021/0093737号说明书
专利文献2：国际公开第2009/078970号
发明内容
发明要解决的技术课题
然而，通过本发明人的研究，发现由使用了上述专利文献1中记载的花青色素的荧光标记获得的荧光强度低，并且不能获得充分的荧光强度。并且，发现在使用了上述专利文献2中记载的花青色素的荧光标记中，花青色素对抗体等活体分子的键合性本来就低，荧光强度本身也低，并且不能获得充分的荧光强度。
本发明的课题在于提供一种表示所获得的标记生物物质优异的荧光强度的化合物。并且，本发明的课题还在于，提供一种将该化合物与生物物质键合而成的标记生物物质。
用于解决技术课题的手段
即，本发明的上述课题通过下述方法得到解决。
〔1〕
一种化合物，其由下述通式(1)表示。
[化学式1]
上述式中，R1～R4表示烷基、芳基、杂芳基或-(CH2-CH2-O)m-R21。m为1～10，R21表示烷基。
R11～R13表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰胺基或卤原子，相邻的基团彼此可以相互键合而形成5元环或6元环。其中，R11～R13的至少1个包含羧基或能够与生物物质键合的取代基。
n为1～3的整数。
L1及L2表示烷基或-(CH2-CH2-O)m-R21。R21及m分别与上述R21及m含义相同。L1和L2可以彼此键合而形成环。
α1及α2为0或1。
环Z1及环Z2表示由选自碳原子及氮原子中的成环原子形成的6元环，可以具有取代基，也可以形成稠环。当环Z1及环Z2形成具有成环氮原子的6元环时，该成环氮原子可以被取代基取代。
由式(1)表示的化合物具有至少1个由-(CH2-CH2-O)m-R21表示的结构。R21及m分别与上述R21及m含义相同。
其中，由式(1)表示的化合物是中性化合物。
〔2〕
根据〔1〕所述的化合物，其由下述通式(2-1)～(2-4)中的任一个表示。
[化学式2]
在上述式中，R45表示烷基或-(CH2-CH2-O)m-R21。
R41～R44及R81～R86表示氢原子、烷基、烷氧基、芳基、磺基、磺酰胺基、硝基、羧基、酰胺基或卤原子，相邻的基团彼此可以相互键合而形成稠环。
R1～R4、R11～R13、L1、L2及m分别与上述R1～R4、R11～R13、L1、L2及m含义相同。
R1～R4、L1、L2或R45的至少1个为-(CH2-CH2-O)m-R21。R21及m分别与上述R21及m含义相同。
l表示2或3的整数。
其中，由式(2-1)～(2-4)中的任一个表示的化合物是中性化合物。
〔3〕
根据〔1〕或〔2〕所述的化合物，其中，
上述R1及R2的至少1个和上述R3及R4的至少1个包含由-(CH2-CH2-O)m-表示且m为1～10的结构。
〔4〕
根据〔3〕所述的化合物，其中，
在化合物中包含4个由-(CH2-CH2-O)m-表示且m为1～10的结构。
〔5〕
根据〔1〕～〔4〕中的任一项所述的化合物，其中，
上述L1及L2的至少1个为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1种作为取代基的烷基。
〔6〕
根据〔5〕所述的化合物，其中，
上述L1及L2为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1种作为取代基的烷基。
〔7〕
根据〔1〕～〔6〕中的任一项所述的化合物，其中，
上述R11～R13之中具有羧基的取代基或具有能够与生物物质键合的取代基的基团为由下述通式(I)～(V)中的任一个表示的取代基。
[化学式3]
在上述式中，Y表示氧原子或＝NR38，环Q1表示5元或6元的杂环或烃环。
R31～R44表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。
其中，由通式(I)～(V)中的任一个表示的基团具有至少1个羧基或能够与生物物质键合的取代基。
*表示键合键。
〔8〕
根据〔7〕所述的化合物，其中，
由上述通式(II)表示的取代基为由下述式(E-1)～(E-8)中的任一个表示的取代基。
[化学式4]
在上述式中，R51～R72表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。
其中，由通式(E-1)～(E-8)中的任一个表示的取代基具有至少1个羧基或能够与生物物质键合的取代基。
*表示键合键。
〔9〕
根据〔7〕所述的化合物，其中，
上述R11～R13之中具有羧基的取代基或具有能够与生物物质键合的取代基的基团为由上述通式(IV)表示的取代基。
〔10〕
根据〔9〕所述的化合物，其中，
上述R39～R43中的至少一者为羧基、具有羧基的烷氧基、具有羧基的烷基氨基甲酰基或具有羧基的聚(氧化亚烷基)氨基甲酰基。
〔11〕
一种标记生物物质，其由〔1〕至〔10〕中任一项所述的化合物与生物物质键合而成。
〔12〕
根据〔11〕所述的标记生物物质，其中，
上述生物物质为蛋白质、氨基酸、核酸、糖链及磷脂中的任一种。
发明效果
本发明的化合物能够获得表示优异的荧光强度的标记生物物质。并且，本发明的标记生物物质显示出优异的荧光强度。
具体实施方式
在本发明中，在存在多个由特定的符号或式表示的取代基或连接基团等(以下，称为取代基等)时或同时规定多个取代基等时，只要没有特别说明，则各取代基等可以相互相同，也可以互不相同(无论有无“分别独立地”的表达，各取代基等可以相互相同，也可以互不相同)。这对于取代基等的数量的规定也相同。并且，在多个取代基等靠近时(尤其，相邻时)，只要没有特别说明，它们可以相互连接而形成环，所形成的环可以具有不饱和键，也可以不具有不饱和键。并且，只要没有特别说明，环、例如脂环、芳香族环及杂环可以进一步稠合而形成稠环。
在本说明书中，只要没有特别说明，关于双键，在分子内存在E型及Z型的情况下，可以是其中的任一种，并且也可以是它们的混合物。并且，只要没有特别说明，在作为化合物存在非对映体及对映体的情况下，可以是其中的任一种，并且也可以是它们的混合物。
在本发明中，关于化合物及取代基的表示，除了化合物本身及取代基本身以外，还用于包含其盐、其离子的含义。例如，羧基、磺基及膦酰基(-P(＝O)(OH)2)等可以将氢原子解离而采用离子结构，也可以采用盐结构。即，在本发明中，“羧基”以包含羧酸根离子或其盐的含义使用，“磺基”以包含磺酸根离子或其盐的含义使用，“膦酰基”以包含膦酸根离子或其盐的含义使用。作为构成上述盐结构时的1价或多价阳离子，没有特别限制，可以举出无机阳离子、有机阳离子等，具体而言，可以举出Na+、Li+及K+等碱金属阳离子、Mg2+、Ca2+及Ba2+等碱土类金属阳离子、以及三烷基铵阳离子、四烷基铵阳离子等有机铵阳离子。
在盐结构的情况下，其盐的种类可以是1种，也可以混合存在2种以上，也可以在化合物中混合存在盐型和游离酸结构的基团，并且也可以混合存在盐结构的化合物和游离酸结构化合物。
本发明的化合物均为中性化合物。在本发明中，化合物为中性是指电中性。具体而言，通过化合物内的具有电荷的基团或抗衡离子，将化合物整体的电荷调整为0。例如，在由通式(1)表示的化合物中，L2所键合的氮原子的形式电荷除了α2＝0的情况以外为+1。以与该形式电荷成对的方式，化合物中的磺基等解离性基团具有磺酸根离子等离子结构，由此本发明的化合物作为化合物整体成为电荷0的化合物。当α2＝0时，L2所键合的氮原子的形式电荷为0。
另外，在由通式(1)表示的化合物中，L1所键合的氮原子的形式电荷在α1＝1时为0。当α1＝0时，以L1所键合的氮原子的形式电荷成为0的方式，代替通式(1)中的含有L1所键合的氮原子的5元环与环Z1的稠合部分的双键，而具有L1所键合的氮原子与环Z1的键合部分成为双键的共轭结构。
在本发明中规定的各通式中，为了方便，将化合物所具有的正电荷确定为特定的氮原子所具有的结构来表示。其中，由于本发明的化合物具有共轭体系，因此实际上，除上述氮原子以外的其他原子有时也能够带正电荷，只要是作为化学结构之一能够采用由各通式表示的结构的化合物，则包含在由各通式表示的化合物中。这对于负电荷也同样适用。
并且，表示在不损害本发明的效果的范围内，包含改变了结构的一部分的化合物。而且，关于未明确记载经取代或未经取代的化合物，表示在不损害本发明的效果的范围内，可以具有任意的取代基。这对于取代基(例如，表述为“烷基”、“甲基(Methyl group)”、“甲基(Methyl)”等的基团)连接基团(例如，表述为“亚烷基”、“亚甲基(Methylene group)”、“亚甲基(Methylene)”等的基团)及环(例如，表述为“杂环”、“烃环”等的环)也相同。在这样的任意的取代基中，在本发明中优选取代基是选自后述的取代基组T中的取代基。
在本发明中，在规定某个基团的碳原子数的情况下，该碳原子数只要在本发明或本说明书中没有特别说明，则表示基团整体的碳原子数。即，当为该基团进一步具有取代基的方式时，表示包含该取代基的全部碳原子数。
并且，在本发明中使用“～”表示的数值范围是指作为下限值及上限值包含记载于“～”前后的数值的范围。
本发明的化合物由下述通式(1)表示。对于本发明的化合物能够得到表示优异的荧光强度的标记生物物质的详细原因尚不清楚，但认为如下。
如通式(1)所示，本发明的化合物包含氮原子作为成环原子，并且具有在两末端具有环Z1或环Z2稠合而成的杂环的聚次甲基链(在本发明中，聚次甲基链是指在链内具有多个双键的烃链，是整体共轭的链，烃链具有取代基R11～R13。另外，构成该烃链的碳原子数为2n+3，由构成由()n括起来的烃链的碳原子、被R11取代的碳原子及构成位于它们的两侧的杂环的环构成碳原子组成。以下，相同。)，进而环Z1稠合而成的杂环的氮原子具有叔胺结构，环Z2稠合而成的杂环的氮原子具有季铵结构，由此通过经由聚次甲基骨架的电荷移动而产生吸收。如此，本发明的化合物被分类为称为聚次甲基色素(广义上为花青色素)的化合物。
本发明的化合物在具有上述结构的基础上，重复数2n+3的次甲基链上的取代基R11～R13的至少1个还包含羧基或能够与生物物质键合的取代基，并且在化合物中，具有至少1个包含PEG(聚乙二醇)基的结构，所述PEG(聚乙二醇)基由-(CH2-CH2-O)m-R21表示且m为1～10。如此，通过在化合物中的R11～R13的至少任一位置具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，能够作为具有更容易发现通过由-(CH2-CH2-O)m-R21表示的PEG基获得的排除体积效果的化学结构的化合物，并且有效地抑制化合物彼此相互作用的结果，认为能够抑制由于化合物的自缔合引起的荧光强度的降低。另外，通过将PEG基中的重复数m设为10以下，能够抑制由于m超过10的PEG基的情况下产生的大排除体积效果而产生的与生物物质的键合性下降，能够显示实用上没有问题的水平的与生物物质的键合性。
本发明的化合物依赖于重复数2n+3的次甲基链的长度，当n＝1时在520～600nm的波长区域(585nm附近)具有激励吸收波长，当n＝2时在620～700nm的波长区域(685nm附近)具有激励吸收波长，当n＝3时在740～830nm的波长区域(785nm附近)具有激励吸收波长。因此，由这些通式(1)表示的化合物分别在使用与化合物的吸收激励波长对应的大致500～800nm的波长区域的任意波长(例如，600nm、700nm、800nm附近)的光源作为激励光源的荧光标记中，能够用作可以获得显示优异的荧光强度的标记生物物质的化合物。
在多色WB中，在从可见区域到近红外区域的范围内，检测多个发光色。因此，需要以多个色素的吸收发光波形成为适当的波长关系的方式进行选择，以免在使色素激励发光时相互干涉而产生串扰。理想的是，调整成在某个激励光中仅有1个色素发光，其他色素不发光。从该观点出发，例如，在多色WB的近红外区域的发光中，使用700nm附近和800nm附近这样的波长某种程度分离的2种激励光源。
利用近红外光激励的荧光检测与利用可见光激励的检测相比，能够抑制膜的自家荧光，即背景荧光，因此容易提高信噪比(S/N比)，能够高灵敏度地检测目标蛋白质。因此，近年来，在微量蛋白质的分析研究中，利用近红外区域的发光的荧光检测WB的必要性增加。
然而，在近红外区域，通常荧光色素的荧光量子产率低，不易获得高的信号量。即使在具有上述700nm附近和800nm附近的2种化合物的多色WB中，本发明的化合物中n＝2或3的化合物也能够用作可以获得显示出优异的荧光强度的标记生物物质的化合物，尤其，对于更高灵敏度地观察、检测蛋白质的要求，与使用了含有上述专利文献1及2中记载的花青色素的以往的花青色素的荧光标记相比，也能够显示出优异的荧光强度。
以下，对本发明的由通式(1)表示的化合物进行详细说明。
＜由通式(1)表示的化合物＞
本发明的由通式(1)表示的化合物如下所述。
[化学式5]
在式中，R1～R4表示烷基、芳基、杂芳基或-(CH2-CH2-O)m-R21。m为1～10，R21表示烷基。
R11～R13表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰胺基或卤原子，相邻的基团彼此可以相互键合而形成5元环或6元环。其中，R11～R13的至少1个包含羧基或能够与生物物质键合的取代基。
n为1～3的整数。
L1及L2表示烷基或-(CH2-CH2-O)m-R21。R21及m分别与上述R21及m含义相同。L1和L2可以彼此键合而形成环。
α1及α2为0或1。
环Z1及环Z2表示由选自碳原子及氮原子中的成环原子形成的6元环，可以具有取代基，也可以形成稠环。当环Z1及环Z2形成具有成环氮原子的6元环时，该成环氮原子可以被取代基取代。
由式(1)表示的化合物具有至少1个由-(CH2-CH2-O)m-R21表示的结构。R21及m分别与上述R21及m含义相同。
其中，由式(1)表示的化合物是中性化合物。
以下，对通式(1)中的取代基等进行详细说明。
(1)R1～R4
R1～R4表示烷基、芳基、杂芳基或-(CH2-CH2-O)m-R21。R1与R2可以相互连接而形成环，R3与R4也可以相互连接而形成环。
能够用作R1～R4的烷基、芳基及杂芳基与后述的取代基组T中的烷基、芳基及杂芳基含义相同。
未经取代的烷基的碳原子数优选为1～6，更优选为1～4，进一步优选为1～2。
作为具有取代基的烷基的烷基部分的碳原子数，优选为1～10，更优选为1～8，进一步优选为2～6，进一步优选为3～5。并且，作为构成具有取代基的烷基的最长链的原子数，优选为3～35，更优选为3～30，进一步优选为3～25。
在本发明中，“具有取代基的烷基的烷基部分的碳原子数”是指除了烷基所具有的取代基部分以外的碳原子数。
在本发明中，“构成具有取代基的烷基的最长链的原子数”是指包含取代基部分的原子数(即，从总原子数中减去不构成最长链的分子链的原子数而得的原子数)。另外，在磺基、羧基等具有解离性的氢原子的取代基构成最长链的情况下，无论有无解离，都包含氢原子进行计算。并且，不包含后述的能够与生物物质键合的取代基部分中的原子数。
作为能够用作R1～R4的烷基可以具有的取代基，可以举出烷氧基、羧基、烷氧基羰基、酰氧基、氨基甲酰基、酰氨基、磺基、膦酰基、-(CH2-CH2-O)m-R21、-(C3H6-O)m-R21以及由这些取代基的组合构成的基团。并且，能够举出后述的能够与生物物质键合的取代基。另外，上述烷氧基、羧基、烷氧基羰基、酰氧基、氨基甲酰基、酰氨基、磺基及膦酰基以及由这些取代基的组合构成的基团中的烷基部分可以具有后述的能够与生物物质键合的取代基。
作为能够用作R1～R4的具有取代基的烷基，只要是具有上述取代基的烷基则没有特别限制，从抑制分子间相互作用的观点出发，优选为具有-(CH2-CH2-O)m-R21作为取代基的烷基。在该情况下，-(CH2-CH2-O)m-R21可以直接取代烷基，也可以作为由氨基甲酰基和-(CH2-CH2-O)m-R21的组合构成的基团取代。
(-(CH2-CH2-O)m-R21)
在能够用作R1～R4的-(CH2-CH2-O)m-R21中，m为1～10，R21表示烷基。
m是指平均重复数(也简称为重复数。)，优选为4～10，更优选为4～8。
关于上述平均重复数，能够对化合物进行1H-NMR测定，由平均积分值计算。在本发明中规定的平均重复数表示将通过上述方法计算出的平均重复数的小数第一位四舍五入而获得的数。
R21中的烷基能够适用能够用作上述R1～R4的烷基的记载。
作为能够用作R1～R4的-(CH2-CH2-O)m-R21及R1～R4所包含的-(CH2-CH2-O)m-R21，优选为-(CH2-CH2-O)m-未经取代的烷基。
(-(C3H6-O)m-R21)
能够用作R1～R4的-(C3H6-O)m-R21中的m及R21与-(CH2-CH2-O)m-R21中的m及R21含义相同。
能够用作R1～R4的-(C3H6-O)m-R21中的-C3H6-可以为-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH(CH3)-及-CH(CH3)-CH2-中的任一结构。
R1～R4的至少1个优选包含由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，从进一步提高荧光强度的观点出发，R1及R2的至少1个和R3及R4的至少1个更优选包含由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，R1及R2的至少1个和R3及R4的至少1个进一步优选为，包含由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构并且在化合物中合计包含4个由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构。其中，R1及R2的至少1个、R3及R4的至少1个、L1及L2尤其优选包含由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构。上述由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构优选作为-(CH2-CH2-O)m-R21直接键合到与上述次甲基链直接键合的杂环的成环原子上。
上述-(CH2-CH2-O)m-中的m与上述-(CH2-CH2-O)m-R21中的m含义相同。
R1～R4的取代基存在于从至少具有1个羧基或能够与生物物质键合的取代基的R11～R13分开的位置，而且相对于花青色素骨架(平面)向垂直方向突出，因此推测通过包含由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构作为该取代基，更有效地表现由于由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构产生的排除体积效果，稠环部分难以发生π-π相互作用(抑制缔合的效果增强)，能够进一步抑制由缔合引起的荧光强度的降低。
(2)R11～R13
R11～R13表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰胺基或卤原子。相邻的基团彼此可以相互键合而形成5元环或6元环。其中，如后所述，R11～R13的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。
能够用作R11～R13的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及卤原子与后述的取代基组T中的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及卤原子含义相同，优选范围也相同。
并且，作为能够用作R11～R13的酰胺基，除了后述的取代基组T中的酰胺基以外，还可以举出作为源自羧酸酰胺的1价的取代基的酰氨基或氨基甲酰基、或者作为源自磺酸酰胺的1价的取代基的磺酰氨基或氨磺酰基。这些基团分别与后述的取代基组T中的酰氨基、氨基甲酰基、磺酰氨基及氨磺酰基含义相同，优选的范围也相同。作为能够用作R11～R13的酰胺基，其中，也优选为酰氨基。
能够用作R11～R13的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及酰胺基可以未经取代，也可以具有取代基。
作为R11～R13中的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及酰胺基可以具有的取代基，可以举出后述的取代基组T中的取代基，例如优选为烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、芳基、杂芳基、酰基、烷氧基羰基、烷基磺酰基、氨基、酰胺基、硝基、氰基、磺基或卤原子。并且，还可以举出氧代基(＝O)或亚氨基(＝NH、氢原子可以被取代基取代。)。并且，还可以优选举出羧基或后述的能够与生物物质键合的取代基，R11～R13中的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基或酰胺基可以具有的取代基可以为组合2种以上的上述中列举的基团而成的基团。
在R11～R13中相邻的基团彼此相互键合而形成5元环或6元环的情况下，所形成的5元环或6元环可以为芳香族性或脂肪族性中的任一种，优选为脂肪族性。化合物中的上述5元环或6元环的数量没有特别限制，优选为1或2个，更优选为1个。
例如，以n＝3的情况为例，作为具有R11～R13中相邻的基团彼此键合而形成的环的结构，可以优选举出下述结构。另外，在下述例中，没有形成环结构的R11～R13为氢原子，环结构记载为没有取代基的结构，但如上所述，R11～R13的至少1个为具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的基团，对其他R11～R13也不限定于下述结构。
[化学式6]
R11～R13之中具有羧基的取代基或具有能够与生物物质键合的取代基的基团优选为由下述通式(I)～(V)中的任一个表示的取代基，更优选为由下述通式(IV)表示的取代基。
[化学式7]
上述式中、Y表示氧原子或＝NR38，环Q1表示5元或6元的杂环或碳氢环。
R31～R44表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。
另外，R36与R37不会相互键合而形成5或6元环，并且由通式(II)表示的取代基与由(III)表示的取代基不同。
其中，由通式(I)～(V)中的任一个表示的基团具有至少1个羧基或能够与生物物质键合的取代基。
*表示键合键。
R31～R35中的相邻基团可以相互连接而形成环，R39～R43中的相邻基团也可以相互连接而形成环。
能够用作R31～R44的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及卤原子与后述的取代基组T中的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及卤原子含义相同，优选范围也相同。
能够用作R31～R44的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及卤原子可以具有取代基，例如，可以优选地举出磺基或卤原子(优选为氟原子)。
能够用作R31～R44的酰胺基能够适用上述能够用作R11～R13的酰胺基的记载。作为能够用作R31～R44的酰胺基，其中，可以优选地举出氨基甲酰基及氨磺酰基。
能够用作R31～R44的能够与生物物质键合的取代基与后述的能够与生物物质键合的取代基含义相同，优选的范围也相同。
在由上述通式(I)表示的取代基中，作为R31～R35，在上述中列举的基团中，优选为氢原子、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，更优选为氢原子、烷基、烷氧基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。
作为由上述通式(I)表示的取代基，优选为R32～R34中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，更优选为R32～R34中的至少1个(优选任意1个)具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。作为R31～R35中的任一个取代基具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的方式，R31～R35可以为羧基或能够与生物物质键合的取代基，也可以为能够用作R31～R35的取代基被羧基或能够与生物物质键合的取代基取代的方式。
在由上述通式(II)表示的取代基中，Y优选为氧原子。
环Q1表示5元或6元的杂环或烃环。
环Q1可以是芳香族环，也可以是脂肪族环，但优选为脂肪族环。
并且，作为在构成环Q1的成环原子中除了Y所键合的碳原子和具有键合键*的碳原子以外的原子，可以举出碳原子、氮原子、氧原子或硫原子，成环原子的种类可以为1种也可以为2种以上，但优选为1种或2种。
环Q1可以具有取代基，也可以形成稠环。
由上述通式(II)表示的取代基优选为由下述式(E-1)～(E-8)中的任一个表示的取代基。
[化学式8]
在上述式中，R51～R72表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。
其中，由通式(E-1)～(E-8)中的任一个表示的取代基具有至少1个羧基或能够与生物物质键合的取代基。
*表示键合键。
能够用作R51～R72的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及卤原子与后述的取代基组T中的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基及卤原子含义相同，优选范围也相同。
能够用作R51～R72的能够与生物物质键合的取代基与后述的能够与生物物质键合的取代基含义相同，优选的范围也相同。
作为R51～R72，在上述中列举的基团中，优选为氢原子、烷基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。
作为上述由通式(E-1)～(E-8)中的任一个表示的取代基，只要具有各取代基中的R51～R72中的至少1个羧基或能够与生物物质键合的取代基即可，其中，优选为：在通式(E-1)中，R52具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，在通式(E-2)中，R54具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，在通式(E-3)中，R57～R59中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，在通式(E-4)中，R61及R62中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，在通式(E-5)中，R63及R64中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，在通式(E-6)中，R65及R66中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，在通式(E-7)中，R67及R68中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，在通式(E-8)中，R69～R72中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。作为R51～R72中的任一个取代基具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的方式，R51～R72可以为羧基或能够与生物物质键合的取代基，也可以为能够用作R51～R72的取代基被羧基或能够与生物物质键合的取代基取代的方式。
在由上述通式(III)表示的取代基中，作为R36或R37，在上述中列举的基团中，优选为氢原子、烷基、氨基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。
作为由上述通式(III)表示的取代基，只要R36或R37中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基即可，更优选为R36具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。作为R36或R37中的任一个取代基具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的方式，R36或R37可以为羧基或能够与生物物质键合的取代基，也可以为能够用作R36或R37的取代基具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的方式。
在本发明中，优选为R11及除了与环Z2稠合而成的杂环键合的碳原子所具有的R13以外的R12或R13中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，更优选在连接环Z1稠合而成的杂环与环Z2稠合而成的杂环的键的中心部分具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。
R11及与环Z2稠合而成的杂环键合的碳原子所具有的R13优选为氢原子。
作为R12及除了上述以外的R13中不具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的基团，优选为氢原子、烷基、芳氧基或芳硫基，更优选为氢原子或烷基，进一步优选为氢原子。
并且，R11～R13中，R11及与环Z2稠合而成的杂环键合的碳原子所具有的除了R13以外的R12～R13中的相邻的基团彼此优选相互键合而形成5元环或6元环，更优选形成6元环。并且，优选在连接环Z1稠合而成的杂环与环Z2稠合而成的杂环的键的中心部分形成上述5元环或6元环。在连接环Z1稠合而成的杂环与环Z2稠合而成的杂环的键的中心部分形成的环表示包含来自2个杂环的键原子数相等的碳原子作为成环原子的环。
另外，当上述R11～R13中的相邻的基团彼此相互键合而形成5或6元环时，羧基或能够与生物物质键合的取代基优选在该环以外的部位上具有。
在由上述通式(IV)表示的取代基中，作为R39～R43，在上述中列举的基团中，优选为氢原子、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，更优选为氢原子、烷基、烷氧基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，进一步优选为氢原子、烷基、烷氧基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。
作为由上述通式(IV)表示的取代基，从进一步提高荧光强度的观点或从可以获得优异的耐光性的观点出发，优选为R39及R43为烷基、烷氧基或卤原子。并且，优选为R40～R42中的至少一者为羧基、具有羧基的烷氧基、具有羧基的烷基氨基甲酰基或具有羧基的聚(氧化亚烷基)氨基甲酰基，或者具有能够与生物物质键合的取代基，更优选为R40～R42中的至少一者为羧基、具有羧基的烷氧基、具有羧基的烷基氨基甲酰基或具有羧基的聚(氧化亚烷基)氨基甲酰基，进一步优选为R41为羧基、具有羧基的烷氧基、具有羧基的烷基氨基甲酰基或具有羧基的聚(氧化亚烷基)氨基甲酰基，尤其优选为R41为羧基。
作为R39～R43中的任一个取代基具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的方式，R39～R43可以为羧基或能够与生物物质键合的取代基，也可以为能够用作R39～R43的取代基被羧基或能够与生物物质键合的取代基取代的方式。
在由上述通式(V)表示的取代基中，作为R44，在上述中列举的基团中，优选为具有羧基或能够与生物物质键合的取代基作为取代基的芳基。该芳基可以具有除了羧基或能够与生物物质键合的取代基以外的取代基，例如，可以优选地举出烷基、烷氧基或卤原子。
(3)L1及L2
L1及L2表示烷基或-(CH2-CH2-O)m-R21。R21及m分别与上述R21及m含义相同。L1和L2可以彼此键合而形成环。
作为L1及L2中的烷基可以具有的取代基，可以举出烷氧基、羧基、烷氧基羰基、酰氧基、氨基甲酰基、酰氨基、磺基及膦酰基以及由这些取代基的组合构成的基团。并且，能够具有-(CH2-CH2-O)m-R21(R21及m分别与上述的R21及m含义相同。)及后述的能够与生物物质键合的取代基。另外，上述烷氧基、羧基、烷氧基羰基、酰氧基、氨基甲酰基、酰氨基、磺基及膦酰基以及由这些取代基的组合构成的基团中的烷基部分可以具有-(CH2-CH2-O)m-R21或后述的能够与生物物质键合的取代基。
能够用作L1及L2的烷基与后述的取代基组T中的烷基含义相同。
未经取代的烷基的碳原子数优选为1～6，更优选为1～4，进一步优选为1～3。
具有取代基的烷基的烷基部分的碳原子数优选为1～10，更优选为1～8，进一步优选为1～7，进一步优选为1～6，进一步优选为1～5。并且，构成具有取代基的烷基的最长链的原子数优选为3～14，更优选为3～12，进一步优选为3～10。
作为具有能够用作L1及L2的取代基的烷基，从进一步提高水溶性的观点出发，优选为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基，更优选为具有羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基，进一步优选为具有羧基及磺基中的至少1个作为取代基的烷基。另外，也可以是具有由上述优选的取代基(烷氧基、羧基、磺基及膦酰基)和除了这些取代基以外的基团的组合构成的取代基的烷基。
并且，也能够优选适用上述R1～R4能够采用的具有取代基的烷基的方式。
能够用作L1及L2的-(CH2-CH2-O)m-R21能够优选适用上述R1～R4中的-(CH2-CH2-O)m-R21的记载。
作为能够用作L1及L2的-(CH2-CH2-O)m-R21，优选为R21在末端不具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的烷基，更优选为未经取代的烷基。
从抑制因化合物中显示高脂溶性的结构引起的色素之间的缔合的观点出发，L1及L2优选为L1及L2中的至少一者具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基，更优选为L1及L2这两者具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基。
作为R1～R4与L1及L2的组合，可以优选地举出R1及R2的至少1个与R3及R4的至少1个包含由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，并且L1及L2的至少1个为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基的至少1个作为取代基的烷基的组合，更优选为R1及R2的至少1个与R3及R4的至少1个包含由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，L1及L2为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基的至少1个作为取代基的烷基的组合，进一步优选为R1及R2的至少1个与R3及R4的至少1个包含由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，L1及L2为具有磺基作为取代基的烷基。
另外，上述的具有能够用作L1及L2的烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基优选为具有羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基，更优选为具有羧基及磺基中的至少1个作为取代基的烷基，进一步优选为具有磺基作为取代基的烷基。
(4)环Z1及环Z2
环Z1及环Z2表示由选自碳原子及氮原子中的成环原子形成的6元环，可以具有取代基，也可以形成稠环。
在环Z1及环Z2形成由选自碳原子及氮原子的成环原子形成的6元环的稠环的情况下，将该稠环整体理解为环Z1及环Z2。
当环Z1及环Z2形成具有成环氮原子的6元环时，该成环氮原子可以被取代基取代。从进一步提高荧光强度的观点出发，环Z1及环Z2优选为单环。
作为能够用作环Z1及环Z2的由选自碳原子及氮原子中的成环原子形成的6元环，可以是脂肪族环，也可以是芳香族环，但优选为芳香族环。
作为上述6元环，例如，可以举出烃环或含氮杂环。作为含氮杂环，优选为相对于L1或L2所键合的氮原子位于邻位的成环原子为氮原子的含氮杂环，更优选为相对于L1或L2所键合的氮原子位于邻位的成环原子为氮原子的吡啶环。
作为上述6元环，可以举出苯环、吡啶环、嘧啶环、哒嗪环、吡嗪环及1,2,3或1,2,4-三嗪(triazine)环，优选为苯环或吡啶环。并且，还可以举出通过共轭结构的记载的方法使这些芳香族环与成环原子的种类及位置相同的脂肪族环。
作为上述6元环或上述6元环的稠环可以具有的取代基，可以举出后述的取代基组T中的取代基，优选为烷基、烷氧基、芳基、羧基、磺基、膦酰基、磺酰胺基、硝基或卤原子，更优选为烷基、磺基、磺酰胺基、硝基或卤原子。
从提高水溶性及抑制缔合的观点出发，环Z1及环Z2优选各自独立地具有1个以上的亲水性基团，更优选在构成环Z1或环Z2的环的每1个具有至少1个亲水性基团。例如，表示更优选在环Z1及环Z2均为萘环的情况下，构成环Z1及环Z2的环的数量均为2，且环Z1及环Z2均具有至少2个亲水性基团。只要是可能的结构，则上限值没有特别限制，能够根据后述的作为化合物整体的亲水性基团的数量适当调整。
作为亲水性基团，没有特别限制，例如，可以举出具有取代基的烷氧基、羧基、磺基及膦酰基，优选为磺基。这些亲水性基团可以直接键合到环Z1或环Z2上，也可以经由连接基团键合，优选为直接键合。
(5)n、α1及α2
n为1～3的整数，优选为2或3的整数。
α1及α2为0或1。α1为0表示不具有L1，α1为1表示具有L1。同样地，α2为0表示不具有L2，α2为1表示具有L2。
当环Z1为相对于L1或L2所键合的氮原子位于邻位的成环原子为氮原子的含氮杂环时，α1能够采用0。并且，当环Z2为相对于L1或L2所键合的氮原子位于邻位的成环原子为氮原子的含氮杂环时，α2能够采用0。
R11～R13的至少1个包含羧基或能够与生物物质键合的取代基。
由上述通式(1)表示的化合物通过上述羧基或能够与生物物质键合的取代基与生物物质键合，能够获得目标标记生物物质。另外，羧基能够通过常规方法容易地衍生能够与生物物质键合的取代基。
在本发明中，“能够与生物物质键合的取代基”包括能够与由羧基衍生的生物物质键合的取代基。
如此，由上述通式(1)表示的化合物通过在花青骨架结构中的特定的位置具有的取代基(具体而言，作为重复数n+1的聚次甲基链上的取代基的R11～R13中的至少1个)与生物物质键合，因此认为所获得的标记生物物质如上所述显示出优异的荧光强度。
R11～R13中的具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的基团的数量合计为至少1个以上即可，从检测对象物质的定量的观点出发，优选为1～3个，更优选为1个或2个，进一步优选为1个。
并且，从作为化合物赋予充分的亲水性的观点出发，由上述通式(1)表示的化合物优选作为化合物整体具有2个以上的亲水性基团，更优选具有2～8个，进一步优选具有2～6个，尤其优选具有3～6个。
作为亲水性基团，能够适用前述环Z1及环Z2能够采用的亲水性基团的记载。
亲水性基团的位置没有特别限制，作为具有上述亲水性基团的基团，例如，可以优选举出R11～R13、环Z1、环Z2、L1及L2。
另外，在由上述通式(1)表示的化合物作为上述羧基或能够与生物物质键合的取代基具有上述亲水性基团的情况下，除了上述羧基或能够与生物物质键合的取代基以外，实际上还具有1个以上的亲水性基团，因此优选。作为具体例，例如可以举出羧基、磺基等，可以为烷基、烷氧基等具有羧基、磺基等作为取代基的基团，例如，可以举出磺基烷基、磺基烷氧基等。
＜由通式(2-1)～(2-4)中的任一个表示的化合物＞
本发明的由通式(1)表示的化合物优选由下述通式(2-1)～(2-4)中的任一个表示。
[化学式9]
在式中，R45表示烷基或-(CH2-CH2-O)m-R21。
R41～R44及R81～R86表示氢原子、烷基、烷氧基、芳基、磺基、磺酰胺基、硝基、羧基、酰胺基或卤原子，相邻的基团彼此可以相互键合而形成稠环。
另外，对于由通式(2-1)及(2-4)中的任一个表示的化合物，优先分类为由通式(2-4)表示的化合物。即，通式(2-1)中的R43与R44键合而不形成苯环。
R1～R4、R11～R13、L1、L2及m分别与上述通式(1)中的R1～R4、R11～R13、L1、L2及m含义相同，优选的范围也相同。
R1～R4、L1、L2或R45的至少1个为-(CH2-CH2-O)m-R21。即，是指在通式(2-1)、(2-2)及(2-4)中，R1～R4、L1及L2中的至少一者为-(CH2-CH2-O)m-R21，在通式(2-3)中，R1～R4、L1及R45中的至少一者为-(CH2-CH2-O)m-R21。R21及m分别与上述通式(1)中的R21及m含义相同。
l表示2或3的整数。
与由上述通式(1)表示的化合物同样地，由上述通式(2-1)～(2-4)中的任一个表示的化合物中，R11～R13的至少1个包含羧基或能够与生物物质键合的取代基。
其中，由式(2-1)～(2-4)中的任一个表示的化合物是中性化合物。
能够用作R45的烷基及-(CH2-CH2-O)m-R21与能够用作L1或L2的烷基及-(CH2-CH2-O)m-R21含义相同。
能够用作R41～R44及R81～R86的烷基、烷氧基、芳基、磺基、磺酰胺基、硝基、羧基及卤原子分别与后述的取代基组T中的烷基、烷氧基、芳基、磺基、磺酰胺基、硝基、羧基及卤原子含义相同。
能够用作R41～R44及R81～R86的酰胺基能够适用上述通式(1)中的能够用作R11～R13的酰胺基的记载。
作为R41～R44，优选为氢原子、烷基、烷氧基、磺基或羧基。
R41～R44中的相邻基团可以相互连接而形成环。所形成的环可以是单环，也可以是稠环。作为构成的环，环元数优选为5或6，可以为脂肪族环也可以为芳香族环。当为6元环时，优选为芳香族环。
是稠环的情况下，包含R41～R44所键合的苯环，优选为包括2～5个环的稠环，更优选为包括2～4个环的稠环，进一步优选为包括2或3个环的稠环。
作为形成环的方式，优选为在R41～R44中的相邻基团相互连接而至少形成苯环，即，与R41～R44所键合的苯环对应，至少形成萘环结构。
其中，在由通式(2-1)～(2-3)中的任一个表示的化合物中的由通式(2-1)表示的化合物中，优选为R41与R42形成环，或R42与R43形成环，或R43与R44形成环，更优选为R41与R42形成环，或R42与R43形成环。
由R41～R44所键合的苯环与R41～R44中的相邻基团相互连接而形成的环构成的环可以具有取代基，作为可以具有的取代基，可以举出上述能够用作R41～R44的烷基、烷氧基、芳基、磺基、磺酰胺基、硝基、羧基及卤原子，优选为烷基、烷氧基、磺基或羧基。
在由通式(2-1)～(2-3)中的任一个表示的化合物中，从提高水溶性及抑制缔合的观点出发，优选为上述的由通式(1)表示的化合物中的与环Z1及环Z2对应的环各自独立地具有1个以上的亲水性基团，更优选在构成与环Z1或环Z2对应的环的每1个具有至少1个亲水性基团。只要是可能的结构，则上限值没有特别限制，能够根据后述的作为化合物整体的亲水性基团的数量适当调整。
作为亲水性基团，没有特别限制，例如，可以举出具有取代基的烷氧基、羧基、磺基及膦酰基，优选为磺基。这些亲水性基团可以和与环Z1或环Z2对应的环直接键合，也可以经由连接基团键合，优选为直接键合。
与环Z1或环Z2对应的环中的具有亲水性基团的位置没有特别限制，例如，优选至少具有亲水性基团作为R43，更优选具有亲水性基团作为R43。
作为R81～R86，优选为氢原子、烷基、烷氧基、芳基、磺基或羧基。
能够用作R81～R86的烷基、烷氧基及芳基可以具有取代基，作为可以具有的取代基，例如，可以举出烷基、烷氧基、磺基、磺酰胺基、硝基、羧基及卤原子，优选为烷基、烷氧基、磺基或羧基。
在由通式(2-4)表示的化合物中，从提高水溶性及抑制缔合的观点出发，优选为上述的由通式(1)表示的化合物中的与环Z1及环Z2对应的环各自独立地具有1个以上的亲水性基团，更优选在构成与环Z1或环Z2对应的环的每1个具有至少1个亲水性基团。只要是可能的结构，则上限值没有特别限制，能够根据后述的作为化合物整体的亲水性基团的数量适当调整。
作为亲水性基团，没有特别限制，例如，可以举出具有取代基的烷氧基、羧基、磺基及膦酰基，优选为磺基。这些亲水性基团可以和与环Z1或环Z2对应的环直接键合，也可以经由连接基团键合，优选为直接键合。
与环Z1或环Z2对应的环中的具有亲水性基团的位置没有特别限制，例如，优选至少在R83～R85中的任1个中具有亲水性基团，更优选至少作为R83及R85具有亲水性基团或至少作为R84具有亲水性基团，进一步优选作为R83及R85具有亲水性基团或作为R84具有亲水性基团，尤其优选作为R83及R85具有亲水性基团。
以下，示出本发明的由通式(1)表示的化合物的具体例，但本发明并不限定于这些化合物。在下述具体例中，-SO3X中的X+表示氢离子(H+)、钠离子、钾离子、铵(NH4 +)或三乙胺(NH(CH2CH3)3 +)。
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
[化学式18]
[化学式19]
作为本发明的第一优选的方式，可以举出由上述通式(1)表示的化合物中在740～830nm具有激励吸收波长的方式。在上述的R11～R13中，具有羧基的取代基或具有能够与生物物质键合的取代基的基团为由上述通式(I)～(V)中的任一个表示的取代基，优选为由上述通式(I)、(II)及(IV)中的任一个表示的取代基，更优选可以举出由上述通式(I)或(IV)表示的取代基。
作为本发明的第一优选的方式中的化合物，例如，可以举出在由上述通式(2-1)～(2-4)中的任一个表示的化合物(其中，l＝3的整数。)中由上述通式(2-1)表示的化合物，可以更优选地举出通式(2-1)中的各取代基满足以下方式I或II的任一方式的化合物。
(方式I)
上述R11～R13中，具有羧基的取代基或聚能够与生物物质键合的取代基的基团为由上述通式(I)或(II)表示的取代基，L1及L2为上述-(CH2-CH2-O)m-R21，或者为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基，R1及R2的至少1个与R3及R4的至少1个包含上述由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，R41～R44中的至少1个(优选为R43)为磺基的方式。
在该方式中，作为上述通式(I)中的取代基R31～R35，在上述基团中，优选为氢原子、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，更优选为氢原子、烷基、烷氧基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。在由上述通式(I)表示的取代基中，从进一步提高荧光强度的观点或从可以获得优异的耐光性的观点出发，优选为R31及R35为烷基、烷氧基或卤原子。并且，尤其优选为R32～R34中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。
在该方式中，作为由上述通式(II)表示的取代基，优选为上述由式(E-4)～(E-8)中的任一个表示的取代基，更优选为上述由式(E-6)表示的取代基。关于式(E-4)～(E-8)中的取代基，能够适用上述记载。
(方式II)
上述R11～R13中，具有羧基的取代基或聚能够与生物物质键合的取代基的基团为由上述通式(IV)表示的取代基，L1及L2为上述-(CH2-CH2-O)m-R21或为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基，R1及R2的至少1个与R3及R4的至少1个包含上述由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，R41～R44中的至少1个(优选为R43)为磺基的方式。
在该方式中，作为上述通式(IV)中的取代基R39～R43，在上述基团中，优选为氢原子、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，更优选为氢原子、烷基、烷氧基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。在由上述通式(IV)表示的取代基中，从进一步提高荧光强度的观点或从可以获得优异的耐光性的观点出发，优选为R39及R43为烷基、烷氧基或卤原子。并且，尤其优选为R40～R42中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。
作为本发明的第二优选的方式，可以举出在620～700nm具有激励吸收波长，且在由上述通式(2-1)～(2-4)中的任一个表示的化合物(其中，l＝2的整数。)中，优选为由上述通式(2-1)表示的化合物。在上述的R11～R13中，具有羧基的取代基或具有能够与生物物质键合的取代基的基团为由上述通式(I)～(V)中的任一个表示的取代基，优选为由上述通式(I)、(IV)及(V)中的任一个表示的取代基，更优选可以举出由上述通式(IV)表示的取代基。
作为上述通式(IV)中的取代基R39～R43，在上述基团中，优选为氢原子、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，更优选为氢原子、烷基、烷氧基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。在由上述通式(IV)表示的取代基中，从进一步提高荧光强度的观点或从可以获得优异的耐光性的观点出发，优选为R39及R43为烷基、烷氧基或卤原子。并且，尤其优选为R40～R42中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。
在本发明的第二优选的方式中的由上述通式(2-1)表示的化合物(其中，l＝2的整数。)中，作为上述除了取代基以外的取代基，可以优选地举出L1及L2为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基的至少1个作为取代基的烷基，R1及R2的至少1个和R3及R4的至少1个包含上述的由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，R41～R44中的至少1个(优选为R43)为磺基的方式。
作为本发明的第三优选的方式，可以举出在620～720nm具有激励吸收波长，在由上述通式(2-1)～(2-4)中的任一个表示的化合物(其中，l＝2的整数。)中，优选为由上述通式(2-4)表示的化合物。在上述的R11～R13中，具有羧基的取代基或具有能够与生物物质键合的取代基的基团为由上述通式(I)～(V)中的任一个表示的取代基，优选为由上述通式(I)、(IV)及(V)中的任一个表示的取代基，更优选可以举出由上述通式(IV)表示的取代基。
作为上述通式(IV)中的取代基R39～R43，在上述基团中，优选为氢原子、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，更优选为氢原子、烷基、烷氧基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、羧基或能够与生物物质键合的取代基。在由上述通式(IV)表示的取代基中，从进一步提高荧光强度的观点，并且可以获得优异的耐光性的观点出发，优选为R39或R43的至少一者为烷基、烷氧基或卤原子，更优选为R39及R43为烷基、烷氧基或卤原子。并且，优选为R40～R42中的至少1个具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，尤其优选为R41具有羧基或能够与生物物质键合的取代基。
在本发明的第三优选的方式中的上述通式(2-4)表示的化合物(其中，l＝2的整数。)中，作为上述除了取代基以外的取代基，可以优选地举出L1及L2为上述的-(CH2-CH2-O)m-R21，或者为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1个作为取代基的烷基，R1及R2的至少1个与R3及R4的至少1个包含上述的由-(CH2-CH2-O)m-表示的结构，R83～R85中的至少1个(优选为R83及R85或R84，更优选为R83及R85)为磺基的方式。
本发明的由通式(1)表示的化合物能够通过R11～R13的至少1个所具有的能够与生物物质键合的取代基与蛋白质、肽、氨基酸、核酸、糖链及脂质等生物物质键合，能够用作标记生物物质。
作为能够与生物物质键合的取代基，只要是用于与生物物质作用(包括附着)或键合的基团，则能够没有特别限制地使用，能够举出国际公开第2002/026891号等中记载的取代基。其中，可以优选举出NHS酯结构(N-羟基琥珀酰亚胺酯)、琥珀酰亚胺结构、马来酰亚胺结构、叠氮基、乙炔基、肽结构(聚氨基酸结构)、长链烷基(优选为碳原子数12～30)、季铵基。
本发明的由通式(1)表示的化合物中，作为在R11～R13中至少任意1个上至少具有能够与生物物质键合的取代基的化合物的具体例，例如，除了上述的由本发明的通式(1)表示的化合物以外，可以举出后述标记生物物质中的例示化合物。并且，在上述本发明的由通式(1)表示的化合物中的例示化合物中，如作为后述标记生物物质中的例示化合物所示那样具有能够与生物物质键合的取代基的方式也可以作为具体例而举出。另外，本发明并不限定于这些化合物。例如，在这些具体例中，关于羧基及磺基等具有解离性的氢原子的基团，可以将氢原子解离而采用盐结构。
关于本发明的由通式(1)表示的化合物，将化合物结构设为通式(1)中规定的结构，除此以外，能够利用公知的方法合成。例如，可以举出专利文献1、专利文献2等中记载的方法。
关于具有能够与生物物质键合的取代基的化合物，将化合物结构设为通式(1)中规定的结构，除此以外，能够利用公知的方法合成。例如，能够参考BioconjugateTechniques(Third Edition、Greg T.Hermanson著)。
＜＜标记生物物质＞＞
本发明的标记生物物质是本发明的由通式(1)表示的化合物与生物物质键合而成的物质。本发明的由通式(1)表示的化合物具有荧光性，显示出适合用于近红外区域的显色的吸收波长峰和优异的荧光强度，因此能够优选用于标记生物物质。由通式(1)表示的化合物与生物物质之间的键合可以是由通式(1)表示的化合物与生物物质直接键合的方式，也可以是经由连接基团连接的方式。
作为上述生物物质，可以优选举出蛋白质(包括肽)、氨基酸、核酸、糖链及脂质。作为蛋白质，可以优选举出抗体，作为脂质，可以优选举出磷脂、脂肪酸及固醇，更优选磷脂。
上述生物物质中，作为临床病理上有用的物质没有特别限制，例如可以举出Ig(Immunoglobulin：免疫球蛋白)G、IgM、IgE、IgA、IgD等免疫球蛋白、补体、C反应蛋白(CRP)、铁蛋白、α1微球蛋白、β2微球蛋白等血浆蛋白及它们的抗体、α-甲胎蛋白、癌胚抗原(CEA)、前列腺性酸性磷酸酶(PAP)、CA(carbohydrate antigen：碳水化合物抗原(糖链抗原))19-9、CA-125等肿瘤标记及它们的抗体、黄体化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、雌激素、胰岛素等激素类及它们的抗体、乙型肝炎病毒(HBV)相关抗原(HBs、HBe、HBc)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、成人T细胞白血病(ATL)等病毒感染相关物质及它们的抗体等。
而且，也可以举出白喉病菌、肉毒杆菌、支原体、苍白密螺旋体等细菌及它们的抗体、弓形浆虫、滴虫、利什曼虫、锥虫、疟原虫等原虫类及它们的抗体、ELM3、HM1、KH2、v6.5、v17.2、v26.2(源自小鼠129、129/SV、C57BL/6、BALB/c)等ES细胞(Embryonic Stem Cell：胚胎干细胞)及它们的抗体、苯妥英、苯巴比妥等抗癫痫药、奎尼丁、地高辛等心血管药、茶碱等抗哮喘药、氯霉素、庆大霉素等抗生素等药物类及它们的抗体、其他酶、外毒素(苯乙烯吡啶(styrelidine O)等)及它们的抗体等。并且，还能够使用Fab’2、Fab、Fv等抗体片段。
作为本发明的由通式(1)表示的化合物(以下，也简称为化合物(1)。)与生物物质相互作用而键合的具体的方式，例如可以举出下述记载的方式。
可以举出：
i)化合物(1)中的肽与生物物质中的肽的非共价键(例如，氢键、包含螫合形成的离子键)或共价键；
ii)化合物(1)中的长链烷基与生物物质中的脂质二重膜及脂质等的范德瓦尔斯力；
iii)基于化合物(1)中的NHS酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)与生物物质中的氨基的反应的酰胺键；
iv)基于化合物(1)中的马来酰亚胺基团与生物物质中的硫烷基(-SH)的反应的硫醚键；及
v)基于化合物(1)中的叠氮基与生物物质中的乙炔基的点击反应或基于化合物(1)中的乙炔基与生物物质中的叠氮基的点击反应的三唑环的形成。
除了上述i)～v)的方式以外，例如也能够通过Lucas C.D.de Rezende andFlavio da Silva Emery,.A Review of the Synthetic Strategies for theDevelopment of BODIPY Dyes for Conjugation with Proteins,Orbital:TheElectronic Journal of Chemistry,2013,Vol 5,No.1,p.62-83中记载的方式键合。并且，在本发明的标记生物物质的制作中，也能够适当参考该文献中记载的方法等。
以下示出本发明的由通式(1)表示的化合物中由至少在R11～R13中的至少任一个上具有能够与生物物质键合的取代基的化合物和通过与其相互作用而键合的生物物质获得的本发明的标记生物物质的具体例，但本发明并不限定于这些化合物等。在下述具体例中，关于磺基等具有解离性的氢原子的基团，可以将氢原子解离而采用盐结构。
[化学式20]
[化学式21]
＜含有标记生物物质的试剂＞
在含有本发明的标记生物物质的试剂中，本发明的标记生物物质没有特别限制，能够根据使用目的等适当选择其形态，例如溶解于生理盐水及磷酸缓冲液等水系介质中的溶液形态以及微粒子状粉末及冻结干燥粉末等固体形态等。
例如，在使用本发明的标记生物物质作为荧光标记试剂的情况下，也能够用作含有上述任一种形态的标记生物物质的试剂。
＜标记生物物质的用途＞
由本发明的由通式(1)表示的化合物获得的本发明的标记生物物质能够显示出优异的荧光强度，能够稳定地检测从通过光照射激励的标记生物物质释放的荧光。因此，本发明的标记生物物质能够适用于使用荧光标记的各种技术，例如，能够适合用作多色WB中的荧光标记试剂或活体荧光成像试剂。
使用本发明的标记生物物质进行的荧光检测通常包括以下(i)～(iii)或(iv)～(vii)的工序。包括(i)～(iii)的工序的荧光检测与使用利用本发明的化合物进行荧光标记的一抗的直接法对应，包括(iv)～(vii)的工序的荧光检测与使用利用本发明的化合物进行荧光标记的二抗的间接法对应。
(i)分别准备下述(a)及(b)的工序
(a)含有作为目标的生物物质(以下，也称为“目标生物物质”。)的试样
(b)能够与上述(a)中的目标生物物质键合的生物物质(以下，也称为“一次生物物质”。)与本发明的化合物键合而成的本发明的标记生物物质(以下，也称为“本发明的标记生物物质A”。)
(ii)准备上述(a)中的目标生物物质与上述(b)的本发明的标记生物物质A中的一次生物物质键合而成的键合体(以下，也称为“荧光标记的键合体A”。)的工序
(iii)向上述荧光标记的键合体A照射本发明的标记生物物质A吸收的波长区域的光，检测本发明的标记生物物质A发出的荧光的工序
(iv)分别准备下述(c)～(e)的工序
(c)含有目标生物物质的试样
(d)能够与上述(c)中的目标生物物质键合的生物物质(以下，也称为“一次生物物质”。)
(e)能够与上述(d)的一次生物物质键合的生物物质(以下，也称为“二次生物物质”。)与本发明的化合物键合而成的本发明的标记生物物质(以下，也称为“本发明的标记生物物质B”。)
(v)准备上述(c)中的目标生物物质与上述(d)的一次生物物质键合而成的键合体(以下，也称为“键合体b”。)的工序
(vi)准备上述键合体b中的一次生物物质与本发明的标记生物物质B中的二次生物物质键合而成的键合体(以下，也称为“荧光标记的键合体B2”。)的工序
(vii)向上述荧光标记的键合体B2照射本发明的标记生物物质B吸收的波长区域的光，检测本发明的标记生物物质B发出的荧光的工序
作为能够与上述目标生物物质键合的生物物质(一次生物物质)及能够与一次生物物质键合的生物物质(二次生物物质)，可以举出上述本发明的标记生物物质中的生物物质。能够根据目标生物物质(受检体中的生物物质)或一次生物物质适当选择，能够选择能够与受检体中的生物物质或一次生物物质特异键合的生物物质。
作为上述目标生物物质中的蛋白质，可以举出所谓的疾病标记。作为疾病标记，没有特别限制，例如可以举出α-甲胎蛋白(AFP)、PIVKA-II(protein induced by vitaminKabsence or antagonist II：抗原蛋白K缺失或抗原II反转的蛋白)、BCA225(breastcarcinoma-associated antigen：乳腺癌胚胎相关)、碱性甲胎蛋白(BFP)、CA(carbohydrate antigen：糖链抗原)15-3、CA19-9、CA72-4、CA125、CA130、CA602、CA54/61(CA546)、癌胚抗原(CEA)、DUPAN-2、弹性蛋白酶1、免疫抑制酸性蛋白(IAP)、NCC-ST-439、γ-精蛋白(γ-Sm)、前列腺特异抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、神经特异烯醇酶(NSE)、Iba1、淀粉样蛋白β、Tau、flotillin、鳞状细胞癌相关抗原(SCC抗原)、唾液酸LeX-i抗原(SLX)、SPan-1、组织多肽抗原(TPA)、唾液酸Tn抗原(STN)、CYFRA(cytokeratin：细胞角蛋白)胃蛋白酶原(PG)、C-反应性蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A蛋白(SAA)、肌红蛋白、肌酸激酶(CK)、肌钙蛋白T、心室肌肌球蛋白轻链I等。
上述目标生物物质可以是细菌，作为该细菌，可以举出作为细胞微生物学性检查对象的细菌，虽没有特别限制，但例如可以举出大肠杆菌、沙门氏菌、呼吸道病菌、对公众卫生产生问题的菌等。
上述目标生物物质可以是病毒，作为该病毒的抗原，没有特别限制，例如可以举出丙型、乙型肝炎病毒的抗原等肝炎病毒抗原、HIV病毒的p24蛋白抗原、CMV(巨细胞病毒)的pp65蛋白抗原、HPV(人乳头瘤病毒)的E6及E7蛋白等。
上述目标生物物质可以为细胞，作为该细胞，并不限于生细胞，也可以为死细胞。
在上述(i)或(iv)中，含有目标生物物质的试样没有特别限制，能够按照常规方法制备。
并且，本发明的标记生物物质也没有特别限制，能够使能够与目标生物物质键合的生物物质与本发明的化合物按照常规方法键合而制备。键的形态及形成键的反应如上述本发明的标记生物物质中所说明。
在上述(v)中，目标生物物质与一次生物物质可以直接键合，也可以经由与目标生物物质及一次生物物质不同的其他生物物质键合。并且，在上述(vi)中，键合体b中的一次生物物质与本发明的标记生物物质B中的二次生物物质可以直接键合，也可以经由与一次生物物质及二次生物物质不同的其他生物物质键合。
本发明的标记生物物质也能够用作直接法及间接法的任一者中的荧光标记抗体，优选用作间接法中的荧光标记抗体。
在上述(ii)或(v)及(vi)中，本发明的标记生物物质等与目标生物物质的键合没有特别限制，能够按照常规方法进行。
在上述(iii)或(vii)中，关于用于激励本发明的标记生物物质的波长，只要是能够激励本发明的标记生物物质的发光波长(激励波长)，则没有特别限定。
本发明的化合物(1)中，使用n为1的化合物的标记生物物质在585nm附近(具体而言，560～600nm的波长区域)具有吸收极大波长，因此照射的光的波长区域优选为530～650nm，更优选为550～630nm。使用该化合物的标记生物物质能够适合用作对可见区域中的600nm附近的激励光源显示出优异的荧光强度的标记生物物质。
本发明的化合物(1)中，使用n为2的化合物的标记生物物质在685nm附近(具体而言，620～700nm的波长区域)具有吸收极大波长，因此照射的光的波长区域优选为630～750nm，更优选为650～730nm。使用该化合物的标记生物物质能够适合用作对多色WB等近红外区域中的700nm附近的激励光源显示出优异的荧光强度的标记生物物质。
本发明的化合物(1)中，使用n为3的化合物的标记生物物质在785nm附近(具体而言，740～830nm的波长区域)具有吸收极大波长，因此照射的光的波长区域优选为700～850nm，更优选为730～830nm。使用该化合物的标记生物物质能够适合用作对多色WB等近红外区域中的800nm附近的激励光源显示出优异的荧光强度的标记生物物质。
作为在本发明中使用的荧光激励光源，只要是发射能够激励本发明的标记生物物质的发光波长(激励波长)的光源，则没有特别限定，例如，能够使用各种激光光源。并且，能够使用各种滤光器，获得优选的激励波长或仅检测荧光。
关于上述(i)～(vii)中的其他事项，没有特别限制，能够适当选择在使用荧光标记的荧光检测中通常使用的方法、试剂、装置等条件。
并且，关于上述(i)～(vii)以外的工序，也能够根据使用荧光标记的各种方法适当选择通常使用的方法、试剂、装置等条件。
例如，使用本发明的标记生物物质的多色WB通过作为目标生物物质通常使用的方法(利用电泳的蛋白质的分离、向膜的印迹、膜的结块)制作印迹膜，通过将本发明的标记生物物质用作标记抗体(优选为二抗)，能够以优异的荧光强度检测目标生物物质。
-取代基组T-
在本发明中，作为优选取代基，可以举出选自下述取代基组T中的取代基。
并且，在本发明中，在仅记载为取代基的情况下，参考该取代基组T，在仅记载有各个基团例如烷基的情况下，优选适用该取代基组T的对应的基团。
而且，在本说明书中，在将烷基与环状(环)烷基区分记载的情况下，烷基以包含直链烷基及支链烷基的含义使用。另一方面，在未将烷基与环状烷基区分记载的情况及没有特别说明的情况下，烷基以包含直链烷基、支链烷基及环烷基的含义使用。这对于含有能够采用环状结构的基团(烷基、烯基、炔基等)的基团(烷氧基、烷硫基、烯氧基等)、含有能够采用环状结构的基团的化合物也相同。在基团能够形成环状骨架的情况下，形成环状骨架的基团的原子数的下限与关于能够采用该结构的基团在下述中具体地记载的原子数的下限无关，为3以上，优选为5以上。
在下述取代基组T的说明中，例如，如烷基和环烷基那样，为了明确直链或支链结构的基团和环状结构的基团，有时将它们分开记载。
作为取代基组T中包含的基团，包括下述基团。
可以举出烷基(优选为碳原子数1～30，更优选为碳原子数1～20，进一步优选为碳原子数1～12，进一步优选为碳原子数1～8，进一步优选为碳原子数1～6，尤其优选为碳原子数1～3)、烯基(优选为碳原子数2～30，更优选为碳原子数2～20，进一步优选为碳原子数2～12，进一步优选为碳原子数2～6，进一步优选为碳原子数2～4)、炔基(优选为碳原子数2～30，更优选为碳原子数2～20，进一步优选为碳原子数2～12，进一步优选为碳原子数2～6，进一步优选为碳原子数2～4)、环烷基(优选为碳原子数3～20)、环烯基(优选为碳原子数5～20)及芳基(可以是单环的基团，也可以是稠环的基团(优选为2～6环的稠环的基团)。在其为稠环的基团的情况下，由5～7元环等构成。芳基优选为碳原子数6～40，更优选为碳原子数6～30，进一步优选为碳原子数6～26，尤其优选为碳原子数6～10)、杂环基(作为成环原子具有至少1个氮原子、氧原子、硫原子、磷原子、硅原子或硒原子，可以是单环的基团，也可以是稠环的基团(优选为2～6环的稠环的基团)。在其为单环的基团的情况下，该环元数优选为5～7元，更优选为5元或6元。杂环基的碳原子数优选为2～40，更优选为2～20。杂环基包含芳香族杂环基(杂芳基)及脂肪族杂环基(脂肪族杂环基)。)、烷氧基(优选为碳原子数1～20，更优选为碳原子数1～12)、烯氧基(优选为碳原子数2～20，更优选为碳原子数2～12)、炔氧基(优选为碳原子数2～20，更优选为碳原子数2～12)、环烷氧基(优选为碳原子数3～20)、芳氧基(优选为碳原子数6～40，更优选为碳原子数6～26，进一步优选为碳原子数6～14)、杂环氧基(优选为碳原子数2～20)、聚亚烷基氧基(优选为碳原子数2～40，更优选为碳原子数2～20)、
烷氧基羰基(优选为碳原子数2～20)、环烷氧基羰基(优选为碳原子数4～20)、芳氧基羰基(优选为碳原子数6～20)、氨基(优选为碳原子数0～20，包含未经取代氨基(-NH2)、(单-或二-)烷基氨基、(单-或二-)烯基氨基、(单-或二-)炔基氨基、(单-或二-)环烷基氨基、(单-或二-)环烯基氨基、(单-或二-)芳基氨基、(单-或二-)杂环氨基。取代未经取代氨基的上述各基团与取代基组T的对应的基团含义相同。)、氨磺酰基(优选为碳原子数0～20，优选为烷基、环烷基或芳基的氨磺酰基。)、酰基(优选为碳原子数1～20，更优选为碳原子数2～15)、酰氧基(优选为碳原子数1～20)、氨基甲酰基(优选为碳原子数1～20，优选为烷基、环烷基或芳基的氨基甲酰基。)、
酰氨基(优选为碳原子数1～20、例如，乙酰氨基、环己基羰基氨基、苯甲酰氨基等)、酰胺基(氨基羰基)、磺酰胺基(可以为磺酰氨基或氨磺酰基的任一种。优选为碳原子数0～20，优选为烷基、环烷基或芳基的磺酰胺基。)、烷硫基(优选为碳原子数1～20，更优选为碳原子数1～12)、环烷硫基(优选为碳原子数3～20)、芳硫基(优选为碳原子数6～40，更优选为碳原子数6～26，进一步优选为碳原子数6～14)、杂环硫基(优选为碳原子数2～20)、烷基、环烷基或芳基磺酰基(优选为碳原子数1～20)、
甲硅烷基(优选为碳原子数1～30，更优选为碳原子数1～20，优选为烷基、芳基、烷氧基或芳氧基取代的甲硅烷基。)、甲硅烷氧基(优选为碳原子数1～20，优选为由烷基、芳基、烷氧基或芳氧基取代的甲硅烷氧基。)、羟基、氰基、硝基、卤原子(例如氟原子、氯原子、溴原子或碘原子)、氧原子(具体而言，将构成环的＞CH2取代为＞C＝O)、羧基(-CO2H)、膦酰基〔-PO(OH)2〕、磷酰基〔-O-PO(OH)2〕、磺基(-SO3H)、硼酸基〔-B(OH)2〕、鎓基(包含含有环状铵基的铵基、锍基、膦基，优选为碳原子数0～30，更优选为1～20)、硫烷基(-SH)、氨基酸残基或聚氨基酸残基。
并且，可以举出具有羧基、膦酰基、磺基、鎓基、氨基酸残基、聚氨基酸残基或-(CH2-CH2-O)m-烷基(m与R1～R6中的m含义相同。)作为取代基的上述烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、环烷氧基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基羰基、环烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基、氨磺酰基、酰基、酰氧基、氨基甲酰基、酰氨基、磺酰胺基、烷硫基、环烷硫基、芳硫基、杂环硫基、烷基、环烷基或芳基磺酰基。
选自取代基组T中的取代基更优选为烷基、烯基、环烷基、芳基、杂环基、烷氧基、环烷氧基、芳氧基、烷氧基羰基、环烷氧基羰基、氨基、酰氨基、氰基或卤原子，尤其优选为烷基、烯基、芳基、杂环基、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、酰氨基或氰基。
关于选自取代基组T中的取代基，只要没有特别说明，也包括组合多个上述基团而成的基团。例如，在化合物或取代基等包含烷基、烯基等时，它们可以被取代或未被取代。并且，在包含芳基、杂环基等时，它们可以是单环或稠环，可以被取代或未被取代。
实施例
以下，根据实施例，对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不限定于此。另外，室温是指25℃。
将由上述通式(1)表示的化合物(1)～(20)、比较化合物(1)～(5)及AlexaFluor647示于以下。
化合物(1)～(4)及(17)～(20)为在740～830nm具有激励吸收波长的本发明的第一优选的方式的化合物，化合物(5)～(7)为在620～700nm具有激励吸收波长的本发明的第二优选的方式的化合物，化合物(8)～(16)为在620～700nm具有激励吸收波长的本发明的第三优选的方式的化合物。
另外，在实施例化合物及比较化合物中，由-SO3H表示的磺基在提纯工序等中可以采用包含一部分盐结构(例如，钾盐、钠盐、TEA(三乙基胺)盐或DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)盐)的结构。并且，在实施例及比较化合物中，添加在将乙烯氧基结构括起来的括号中的数字是指平均重复数。任一化合物均使用平均重复数的小数第一位为0的化合物作为原料来合成。
[化学式22]
[化学式23]
[化学式24]
[化学式25]
比较化合物(1)为美国专利申请公开第2021/0093737号说明书记载的化合物。
比较化合物(2)为国际公开第2009/078970号记载的化合物的NHS酯衍生物。
比较化合物(5)为推测具有上述化学结构的AlexaFluor647(产品名称、产品编号A33084、Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)的NHS酯衍生物。
以下，对在各实施例中使用的化合物(1)～(16)及比较化合物(1)～(4)的合成方法进行详细说明，但起始物质、色素中间体及合成途径并不限定于这些。
在以下合成途径中，室温是指25℃。
在没有特别记载的情况下，反相柱色谱法中的载体使用了SNAP Ultra C18(产品名称，Biotage公司制造)或Sfar C18(产品名称，Biotage公司制造)，正相柱色谱法中的载体使用了Hi-Flash Column(产品名称，YAMAZEN CORPORATION制造)。
在反相柱色谱法或正相柱色谱法中使用的洗脱液中的混合比是容量比。例如，“乙腈:水＝0:100→20:80”表示将“乙腈:水＝0:100”的洗脱液改变为“乙腈:水＝20:80”的洗脱液。
分离纯化HPLC(High Performance Liquid Chromatography：高效液相色谱)使用了2767(产品名称，Waters Corporation制造)。
MS谱图使用ACQUITY SQD LC/MS System〔产品名称，Waters Corporation制造，离子化法：ESI(ElectroSpray Ionization制造，电喷雾离子化)〕或LCMS-2010EV〔产品名称，Shimadzu Corporation制造，同时进行离子化法：ESI及APCI(Atmospheric PressureChemicalIonization，大气压化学离子化)的离子化法〕进行了测定。
＜化合物(1)的合成＞
根据下述方案，合成了化合物(1)。
[化学式26]
1)化合物(1-C)的合成
向200ml容量的茄形烧瓶中加入化合物(1-A)1.9g、乙酸(AcOH)20ml、化合物(1-B)1.3g及乙酸钾(AcOK)0.98g，在氮气气氛下，在140℃下搅拌1小时。减压蒸馏去除溶剂，通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→35/65)提纯，获得了化合物(1-C)0.99g。
2)化合物(1-D)的合成
将化合物(1-C)478mg、mPEG4-Br1.08g、环丁砜2mL及三乙基胺(Et3N)0.132ml加入到50ml容量的茄形烧瓶中，在120℃下加热搅拌了6小时。向反应液中添加乙酸乙酯/己烷(1/1)20mL，使其产生沉淀。将沉淀物通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→20/100)提纯，获得了化合物(1-D)369mg。
3)化合物(1-F)的合成
向试验管中添加化合物(1-D)214mg、化合物(1-E)43mg、乙酸钾(AcOK)25mg及乙酸酐(Ac2O)1mL，在氮气气氛下，在60℃下搅拌2小时。反应收敛后，添加蒸馏水，通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→25/75)提纯，获得了化合物(1-F)170mg。
4)化合物(1-H)的合成
向试验管中添加化合物(1-F)10mg及蒸馏水300μL，在95℃下进行搅拌。向该溶液中滴加将化合物(1-G)3mg和氢氧化钠5mg混合到蒸馏水200μL中的溶液，在95℃下搅拌了30分钟。将反应液冷却至室温，通过分离纯化HPLC提纯，实施冻结干燥，获得了化合物(1-H)6.0mg。化合物(1-H)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1097、(M-H+)-＝1095
5)化合物(1)的合成
将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)0.30ml、化合物(1-I)1mg溶解在化合物(1-H)3.0mg中后，使其搅拌了1小时。然后，减压蒸馏去除溶剂，添加乙酸乙酯1.5mL去除上清液，实施真空干燥，由此获得了化合物(1)。
＜化合物(2)的合成＞
根据下述方案，与化合物(1)同样地合成了化合物(2)。化合物(2-G)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1313
[化学式27]
另外，以如下方式合成了化合物(2-C)。
向氮气置换的500ml容量的三口烧瓶中加入叔丁醇(tBuOH)200ml及叔丁醇钾(tBuOK)12g，在搅拌时滴加化合物(2-A)14.4g，搅拌片刻。接着，滴加三乙二醇2-溴乙基甲基醚(Br-mPEG4)32.5g，进行加热搅拌。在80℃下搅拌1小时后，减压蒸馏去除溶剂，利用乙酸乙酯及蒸馏水实施分液操作，通过蒸馏水提取了粗产物。向所获得的粗产物中添加30％盐酸水溶液30ml，在100℃下搅拌3小时。然后，减压蒸馏去除溶剂，通过正相柱色谱法(洗脱液：己烷/乙酸乙酯＝50/50→30/70)提纯，由此获得了化合物(2-C)11.0g。
＜化合物(3)的合成＞
根据下述方案，与化合物(1)同样地合成了化合物(3)。化合物(3-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1450、(M-H+)-＝1448
[化学式28]
＜化合物(4)的合成＞
根据下述方案，与化合物(1)同样地合成了化合物(4)。化合物(4-F)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1484、(M-H+)-＝1482
[化学式29]
另外，以如下方式合成了化合物(4-C)。
向已氮气置换的50ml容量的烧瓶中，加入化合物(4-A)500mg、化合物(4-B)1.28mL、甲醇钠0.8g及甲醇10mL，并加热回流了3小时。在冷却至室温之后，通过过滤获得了化合物(4-C)0.52g。
＜化合物(5)的合成＞
根据下述方案，合成了化合物(5)。
[化学式30]
1)化合物(5-B)的合成
向5ml容量的茄形烧瓶中添加化合物(2-E)94mg、化合物(5-A)34mg、乙酸钾(AcOK)80mg及乙酸酐(Ac2O)4.5mL，在氮气气氛下，在60℃下搅拌2.5小时。将反应液添加到乙酸乙酯，使其产生沉淀。将沉淀物通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→10/90)提纯，获得了化合物(5-B)46mg。化合物(5-B)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1190、1192
2)化合物(5-D)的合成
向试验管中加入化合物(5-B)30mg、化合物(5-C)28mg、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷加合物21mg、碳酸钾35mg、乙醇1.26ml及蒸馏水0.126ml，在氮气气氛下，在55℃下加热搅拌了30分钟。减压蒸馏去除溶剂，通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→20/100)及分离纯化HPLC提纯，并实施冻结干燥获得了化合物(5-D)2.6mg。化合物(5-D)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1291
3)化合物(5)的合成
将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)0.10ml、三乙基胺0.001ml及化合物(1-I)1mg溶解在化合物(5-D)0.9mg中后，使其搅拌了1小时。然后，减压蒸馏去除溶剂，添加乙酸乙酯/己烷(1/1)1mL去除上清液，实施真空干燥，由此获得了化合物(5)。
另外，以如下方式合成了化合物(5-A)。
向100ml容量的三口茄形烧瓶中加入了化合物(5-E)2.89g、乙醇15ml。在冰冷下，滴加将苯胺2.05ml和乙醇15ml的混合物之后，在60℃下加热搅拌了4小时。在反应结束之后，减压蒸馏去除溶剂直至达到减半之后，转移至冰盐水浴进行了搅拌。通过对产生的固体进行过滤并干燥，获得了化合物(5-A)2.55g。化合物(5-A)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝301、303
另外，以如下方式合成了化合物(5-C)。
向50ml容量的三口茄形烧瓶中，加入了化合物(5-F)316mg、四羟基二硼烷141mg、二氯双[二叔丁基-(对二甲基氨基苯基)膦]钯(II)1.5mg、四氢呋喃3.2ml、甲醇1.6ml、N,N-二异丙基乙胺0.348ml。在55℃下加热搅拌2小时之后，减压蒸馏除去了溶剂。向残渣中加入三氟乙酸3.2ml，并在室温下搅拌了15分钟。在反应结束后，减压蒸馏去除溶剂之后，通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→10/90)提纯，并实施冻结干燥而获得了化合物(5-C)93mg。化合物(5-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝227、(M-H+)-＝225
＜化合物(6)的合成＞
根据下述方案，与化合物(5)同样地合成了化合物(6)。化合物(6-B)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1259
[化学式31]
＜化合物(7)的合成＞
根据下述方案，与化合物(5)同样地合成了化合物(7)。
[化学式32]
另外，以如下方式合成了化合物(7-D)。
向200ml容量的茄形烧瓶中加入了化合物(7-C)500mg、碳酸钾(K2CO3)1.20g、1,3-丙烷磺内酯0.95ml、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)20ml及蒸馏水10ml。在80℃下加热搅拌1小时之后，加入了1,3-丙烷磺内酯0.57ml。在80℃下加热搅拌1小时之后，减压蒸馏除去了溶剂。向残渣中加入乙酸乙酯30ml，在60℃下加热搅拌15分钟之后，将其空气冷却至0℃。通过对固体进行过滤，并实施减压干燥，获得了白色固体。使所获得的固体溶解在蒸馏水5ml中，并加入了氢氧化钠(NaOH)400mg。在80℃下加热搅拌1小时之后，冷却至室温，并加入了30％氯化氢水溶液1.2ml。将反应液通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→10/90)提纯，并实施冷冻干燥而获得了化合物(7-D)333mg。化合物(7-D)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M-H+)-＝475、477
另外，以如下方式合成了化合物(7-A)。
在化合物(5-C)的合成法中，使用化合物(7-D)来代替化合物(5-F)，除此以外，以相同的方式获得了无色固体化合物(7-A)(118mg、产率30％)。
[M+H+]+：443
＜化合物(8)的合成＞
根据下述方案，与化合物(5)同样地合成了化合物(8)。化合物(8-B)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1231
[化学式33]
＜化合物(9)的合成＞
根据下述方案，合成了化合物(9)。
[化学式34]
化合物(9-B)的合成
向100ml容量的茄形烧瓶中加入化合物(9-A)2.9g、乙醇15ml，在0℃下滴加溶解有苯胺2.1mL的乙醇15mL之后，在氮气气氛下在60℃下搅拌了4小时。减压蒸馏去除溶剂将溶剂量设为15mL，并将其空气冷却至0℃。对所析出的黄色晶体进行过滤而获得了化合物(9-B)2.6g。
化合物(9-E)的合成
向氮气置换的500ml容量的三口烧瓶中加入叔丁醇(tBuOH)200ml及叔丁醇钾(tBuOK)12g，在搅拌时滴加化合物(9-C)14.4g，搅拌片刻。接着，滴加三乙二醇2-溴乙基甲基醚(Br-mPEG4)32.5g，进行加热搅拌。在80℃下搅拌1小时后，减压蒸馏去除溶剂，利用乙酸乙酯及蒸馏水实施分液操作，通过蒸馏水提取了粗产物。向所获得的粗产物中添加30％盐酸水溶液30ml，在100℃下搅拌3小时。然后，减压蒸馏去除溶剂，通过正相柱色谱法(洗脱液：己烷/乙酸乙酯＝50/50→30/70)提纯，由此获得了化合物(9-E)11.0g。
化合物(9-G)的合成
向100ml容量的三口茄形烧瓶中加入化合物(9-F)100mg、乙酸(AcOH)0.3ml、化合物(9-E)124mg及乙酸钾(AcOK)31mg，在氮气气氛下，在130℃下搅拌了1小时。减压蒸馏去除溶剂，通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→20/80)提纯，获得了化合物(9-G)58mg。
化合物(9-H)的合成
在50ml容量的茄形烧瓶中加入化合物(9-G)470mg、1,3-丙烷磺内酯0.15mL、环丁砜2mL、乙酸钾(AcOK)254mg，并在110℃下加热搅拌了1小时。向反应液中添加乙酸乙酯20mL，使其产生沉淀。将沉淀物通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→30/70)提纯，获得了化合物(9-H)475mg。
化合物(9-I)的合成
向试验管中加入化合物(9-H)171mg、化合物(9-B)48mg、三乙基胺(Et3N)71μL、甲醇(MeOH)5μL及乙酸酐(Ac2O)0.48mL，在氮气气氛下在50℃下搅拌了2小时。反应收敛后，添加蒸馏水，通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→25/75)提纯，获得了化合物(9-I)150mg。
化合物(9-K)的合成
向试验管中加入化合物(9-I)10mg、碳酸钾(K2CO3)10mg、乙醇(EtOH)300μL及蒸馏水100μL，在50℃下进行了搅拌。向该溶液中滴加将化合物(9-J)6mg和[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)(Pd(dppf)Cl2)混合于蒸馏水200μL而成的溶液，在50℃下搅拌了30分钟。将反应液冷却至室温，通过分离纯化HPLC提纯，实施冻结干燥，获得了化合物(9-K)3.6mg。化合物(9-K)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1491、(M-H+)-＝1489
化合物(9)的合成
将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)0.30ml、化合物(9-L)1mg溶解在化合物(9-K)3.6mg中后，使其搅拌了1小时。然后，减压蒸馏去除溶剂，添加乙酸乙酯1.5mL去除上清液，实施真空干燥，由此获得了化合物(9)。
＜化合物(10)的合成＞
根据下述方案，与化合物(9)同样地合成了化合物(10)。化合物(10-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1505、(M-H+)-＝1503
另外，如下合成了化合物(10-B)。向100ml容量的三口茄形烧瓶中加入化合物(10-A)500mg、四羟基二硼烷309mg、二氯双[二叔丁基-(4-二甲基氨基苯基)膦]钯(II)3mg、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)760μL、四氢呋喃(THF)5mL及甲醇(MeOH)2.5mL，并在氮气气氛下在55℃下搅拌了3小时。减压蒸馏去除溶剂，通过反相柱色谱法(洗脱液：乙腈/水＝0/100→30/70)提纯，获得了化合物(10-B)220mg。
[化学式35]
＜化合物(11)的合成＞
根据下述方案，与化合物(10)同样地合成了化合物(11)。化合物(11-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1551、(M-H+)-＝1549
[化学式36]
＜化合物(12)的合成＞
根据下述方案，与化合物(10)同样地合成了化合物(12)。化合物(12-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1519、(M-H+)-＝1517
[化学式37]
＜化合物(13)的合成＞
根据下述方案，与化合物(10)同样地合成了化合物(13)。化合物(13-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1767、(M-H+)-＝1765
[化学式38]
＜化合物(14)的合成＞
根据下述方案，与化合物(10)同样地合成了化合物(14)。化合物(14-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1521、(M-H+)-＝1519
[化学式39]
＜化合物(15)的合成＞
根据下述方案，与化合物(9)同样地合成了化合物(15)。化合物(15-K)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1331、(M-H+)-＝1329
[化学式40]
＜化合物(16)的合成＞
根据下述方案，与化合物(13)同样地合成了化合物(16)。化合物(16-A)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1608、(M-H+)-＝1606
[化学式41]
＜化合物(17)的合成＞
化合物(17)的合成
向试验管中加入化合物(2-F)5mg、三乙基胺(TEA)8μL、蒸馏水100μL，在80℃下进行了搅拌。向该溶液中滴加将化合物(9-J)2mg和四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)混合于蒸馏水100μL而成的溶液，在80℃下搅拌了1小时。将反应液冷却至室温，通过分离纯化HPLC提纯，实施冻结干燥，获得了化合物(17)2.8mg。化合物(17)的MS测定及吸收荧光测定的结果如下所述。另外，λex是指激励波长，λem是指荧光波长，以下含义也相同。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1297、(M-H+)-＝1295
λex＝768nm、λem＝787nm
[化学式42]
＜化合物(18)的合成＞
根据下述方案，与化合物(17)同样地合成了化合物(18)。化合物(18)的MS测定及吸收荧光测定的结果如下所述。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1327、(M-H+)-＝1325
λex＝765nm、λem＝784nm
[化学式43]
＜化合物(19)的合成＞
根据下述方案，与化合物(17)同样地合成了化合物(19)。化合物(19)的MS测定及吸收荧光测定的结果如下所述。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1325、(M-H+)-＝1323
λex＝770nm、λem＝789nm
[化学式44]
＜化合物(20)的合成＞
根据下述方案，与化合物(17)同样地合成了化合物(20)。化合物(20)的MS测定及吸收荧光测定的结果如下所述。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1573、(M-H+)-＝1571
λex＝777nm、λem＝794nm
[化学式45]
＜比较化合物(1)的合成＞
根据下述方案，与化合物(1)同样地合成了比较化合物(1)。化合物(c1-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝989、(M-H+)-＝987
[化学式46]
＜比较化合物(2)的合成＞
根据下述方案，与化合物(1)同样地合成了比较化合物(2)。化合物(c2-C)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝2858、(M-H+)-＝2856
[化学式47]
＜比较化合物(3)的合成＞
根据下述方案，与化合物(1)同样地合成了比较化合物(3)。化合物(c3-D)的MS测定的结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1111、(M-H+)-＝1109
[化学式48]
＜比较化合物(4)的合成＞
根据下述方案，与化合物(8)同样地合成了比较化合物(4)。比较化合物(4-G)的MS测定结果如下。
MS(ESI m/z)：(M+H+)+＝1565、(M-H+)-＝1563
[化学式49]
＜实施例1：激励光波长785nm下的评价＞
对上述的各化合物(1)～(4)及比较化合物(1)～(3)评价了荧光标记率、溶液荧光强度及膜上荧光强度。
[1]荧光标记率的评价
向微型管中加入抗兔IgG抗体(2.3mg/ml)217μL及碳酸盐缓冲液21.7μL，实施振荡搅拌后，以相对于抗体成为表1所示的摩尔当量比的方式添加上述化合物(1)的二甲基亚砜溶液，进一步进行了振荡搅拌。在室温下静置1小时，使用凝胶过滤柱色谱PD10(GEHealthcare Life Sciences制造)和PBS溶液(磷酸缓冲食盐水)对反应液实施提纯，获得了利用上述化合物(1)标记的标记抗兔IgG抗体。以相同的方式，获得了利用各化合物或比较化合物标记的标记抗兔IgG抗体。对于所获得的标记抗体，通过下述所示的方法计算出荧光标记率(DOL)。将结果汇总表示在表1中。
荧光标记率的计算方法使用了如下所示的通常的方法。[]中的记载表示单位，[-]是指没有单位。在本试验中，蛋白质是指抗兔IgG抗体。
荧光标记率＝荧光色素的浓度/蛋白质的浓度
荧光色素的浓度是指标记的荧光色素的总摩尔浓度[M]，蛋白质的浓度是指荧光标记的蛋白质的摩尔浓度[M]，分别通过下述式计算。
荧光色素的浓度＝Dyemax/εdye
蛋白质的浓度＝(IgG280-(Dyemax×CF))/εprotein
上述式中的各符号如下所述。
Dyemax；荧光色素在最大吸收波长下的吸收[-]
εdye；荧光色素的摩尔吸光系数[M-1cm-1]
IgG280；荧光标记蛋白质在280nm下的吸收[-]
Dye280；荧光色素在280nm下的吸收[-]
εprotein；蛋白质的摩尔吸光系数[M-1cm-1]
CF(Correction Factor)；Dye280/Dyemax[-]
[表1]
| No. | 标记抗体 | 3当量 | 5当量 | 7当量 | 10当量 |
| 101 | 化合物(1)-IgG | 2.3 | 3.6 | 4.5 | 6.2 |
| 102 | 化合物(2)-IgG | 2.2 | 3.5 | 4.5 | 6.1 |
| 103 | 化合物(3)-IgG | 2.3 | 3.7 | 4.4 | 6.5 |
| 104 | 化合物(4)-IgG | 2.2 | 3.4 | 4.3 | 6.0 |
| c11 | 比较化合物(1)-IgG | 2.2 | 3.2 | 4.2 | 5.9 |
| c12 | 比较化合物(2)-IgG | 1.2 | 1.8 | 2.4 | 3.3 |
| c13 | 比较化合物(3)-IgG | 2.3 | 3.3 | 4.2 | 6.1 |
(表注)
在标记抗体栏中，化合物(Z)-IgG或比较化合物(Z)-IgG的表述分别是指，利用化合物(Z)标记的标记抗兔IgG抗体或利用比较化合物(Z)标记的标记抗兔IgG抗体。Z是指各化合物的编号。在以后的表中也含义相同。
由上述表1的结果可知以下内容。
作为本发明的化合物的化合物(1)～(4)在相对于抗体1当量以3当量、5当量、7当量及10当量中的任一摩尔当量添加的情况下，也显示出与作为使用以往专利文献1中记载的标记化合物的比较化合物(1)时相同程度，且超过使用作为以往专利文献2中记载的标记化合物的比较化合物(2)时的荧光标记率，作为与抗体的键合性，显示出实用上没有问题的充分的水准。这能够从No.c11或c12与No.101～104的对比中读取。
另一方面，从本发明的通式(1)中的L1具有能够与生物物质键合的取代基的方面考虑，比较化合物(3)不是本发明中规定的化合物。本发明的化合物即化合物(1)～(4)和比较化合物(3)显示出相同程度的荧光标记率，发现荧光标记率没有差异。
[2]溶液荧光强度的评价
将在上述[1]的荧光标记率的评价中制备的各标记抗体的溶液调整为蛋白质浓度0.005mg/mL，使用分光荧光强度计(产品名称：RF-5300或RF-6000，Shimadzu Corporation制造)，以785nm的激励光统一曝光条件，计算出荧光波长810～840nm的范围的荧光强度的积分值。以比较化合物(1)-IgG的DOL2.2(添加3当量色素)的荧光波长810～840nm的范围的荧光强度的积分值为基准值，计算出与该基准值的比(标记抗体的荧光波长810～840nm的范围的荧光强度的积分值/基准值)，根据以下评价基准进行了评价。将结果汇总表示在表2中。
-荧光强度(积分值)的评价基准-
A：荧光强度与基准值之比为2.0倍以上
B：荧光强度与基准值之比为1.7倍以上且小于2.0倍
C：荧光强度与基准值之比为1.4倍以上且小于1.7倍
D：荧光强度与基准值之比为1.2倍以上且小于1.4倍
E：荧光强度与基准值之比为1.1倍以上且小于1.2倍
F：荧光强度与基准值之比为0.9倍以上且小于1.1倍
G：荧光强度与基准值之比小于0.9倍
[表2]
由上述表2的结果可知以下内容。
从不具有包含PEG基的结构的方面考虑，比较化合物(1)不是本发明中规定的结构。利用该比较化合物(1)标记的标记抗体在溶液中的荧光强度在任一DOL中均低(No.c11)。
从PEG的重复数(本发明中规定的m)为24的方面考虑，比较化合物(2)的PEG的重复数比本发明中规定的PEG的重复数长。利用该比较化合物(2)标记的标记抗体在溶液中的荧光强度低于DOL相同的由化合物(1)～(4)标记的标记抗体(No.c12)。
从通式(1)中不是R11～R13的L1具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的方面考虑，比较化合物(3)不是本发明中规定的结构。利用该比较化合物(3)标记的标记抗体在溶液中的荧光强度在任一DOL中均低(No.c13)。
与此相对，利用作为本发明的化合物的化合物(1)～(4)标记的标记抗体均显示出相对于利用上述比较化合物(1)标记的标记抗体的荧光强度明显高的荧光强度(相对于No.c11的No.101～104)。
并且，在利用作为本发明的化合物的化合物(1)～(4)标记的标记抗体的中，也发现将具有包含PEG基的结构的位置设为R1及R2的至少1个和R3及R4的至少1个的利用本发明的化合物(2)～(4)标记的标记抗体显示更加优异的荧光强度，具有在化合物中还包含2个PEG基的结构的利用本发明的化合物(3)及(4)标记的标记抗体显示进一步优异的荧光强度。
并且，从表1和表2所示的使用了PEG的重复数为4的化合物(1)的No.101与使用了仅在PEG的重复数为24的方面结构不同的比较化合物(2)的No.c12的对比，发现通过将PEG的重复数设定在本发明的规定范围内，能够以更少的荧光性化合物的使用量充分标记抗体(表1)。并且，通过显示相同程度的DOL的标记抗体的溶液彼此的比较，还发现只要将PEG的重复数设定在本发明的规定范围内，则能够实现更加优异的荧光强度(表2)。
[3]膜上荧光强度
将兔IgG溶液调整成蛋白质浓度5.0ng/mL，在硝基纤维素膜上慎重地点样2μL。将膜干燥后，接着在TBS-T(Tris Buffered Saline with Tween 20：含吐温20的Tris缓冲盐水)中利用Fish Gelatin结块缓冲液阻断。一边将膜在室温下进行搅拌一边孵化1小时。去除结块溶液，利用TBS缓冲液将标记抗体(在上述[1]中制备的标记抗体的溶液、稀释前的浓度1mg·mL)的PBS溶液稀释20000倍。将膜浸入稀释的溶液中，搅拌的同时孵化1小时。将膜利用TBS-T缓冲液清洗3次，每次10分钟，最后利用TBS缓冲液清洗10分钟。将所获得的膜在40℃的热板上干燥1小时，使用Amersham Typhoon scanner(GEHC公司制造)进行图像化，以785nm的激励光统一曝光条件，测定6.48mm2组分的荧光波长810～840nm的范围的荧光强度作为信号荧光强度。以比较化合物(1)-IgG DOL2.2的荧光波长810～840nm的范围的信号荧光强度的积分值为基准值，计算出与该基准值的比(标记抗体的荧光波长810～840nm的范围的信号荧光强度的积分值/基准值)，根据以下评价基准进行了评价。将结果汇总表示在表3中。
-荧光强度(积分值)的评价基准-
A：信号荧光强度与基准值之比为2.0倍以上
B：信号荧光强度与基准值之比为1.7倍以上且小于2.0倍
C：信号荧光强度与基准值之比为1.4倍以上且小于1.7倍
D：信号荧光强度与基准值之比为1.2倍以上且小于1.4倍
E：信号荧光强度与基准值之比为1.1倍以上且小于1.2倍
F：信号荧光强度与基准值之比为0.9倍以上且小于1.1倍
G：信号荧光强度与基准值之比小于0.9倍
[表3]
对于上述表3中所示的标记抗体的膜上的信号荧光强度，也获得了与上述表2中所示的标记抗体的溶液中的荧光强度相同的结果。
＜实施例2：激励光波长633nm下的评价＞
对于上述的各化合物(5)～(8)及比较化合物(5)，评价了染色细胞中的荧光强度。并且，对化合物及标记抗体中的荧光量子产率及耐光性进行了评价。
[4]标记抗体在染色细胞中的荧光强度评价
在上述[1]的荧光标记率评价中的各标记抗体溶液的制备中，如下述表4所示的那样对抗体的标记中使用的化合物及相对于抗体1当量的化合物的摩尔当量比进行变更，除此以外，以相同的方式，制备了各标记抗体溶液。
使用在上述中合成的标记抗体及比较标记抗体，如下进行了细胞染色。对于所制备的染色细胞，对下述特性进行了评价。将结果总括示于表4中。
[染色细胞样品的制作]
将HeLa细胞〔European Collection of Authenticated Cell Cultures公司〕播种到96孔板〔Thermo Fisher Scientific,Inc.〕，并在包含10％胎牛血清、1％的Penicilline/Streptomycin和1％MEM非必需氨基酸的D-MEM培养基〔均为FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation〕中，在培养箱中培养了20小时。
接着，除去培养基，使用甲醇在-20℃下进行5分钟处理，固定化之后，利用PBS〔Thermo Fisher Scientific,Inc.〕进行清洗，加入包含浓度0.2％的TritonX-100(聚乙二醇单辛基苯基醚)〔Aldrich公司〕、浓度2％的BSA(牛血清白蛋白)〔Biological Industries公司〕作为结块及膜穿透性的PBS溶液并静置了1小时。除去结块及膜穿透性，加入抗α-微管蛋白抗体〔兔多克隆、GeneTex公司〕稀释液作为一抗，以抗体终浓度1μg/mL在4℃下静置了15小时。利用PBST进行清洗之后，加入2μg/mL的在上述制备的各标记抗体水溶液作为二抗，一边遮光一边在室温下静置1小时，再次利用PBST进行了清洗。进一步利用PBS进行清洗后，利用注射器在各阱添加Prolong Gold〔Thermo Fisher Scientific,Inc.〕1滴作为防褪色剂，获得了各染色细胞样品。另外，下述荧光强度的评价中，使用了刚制作的染色细胞样品。
[染色细胞中的荧光强度评价]
使用PerkinElmer制造酶标仪EnSight，在以下条件下对所获得的染色细胞的荧光强度进行测定。
(测定条件)孔扫描模式、激励波长633nm、荧光波长670-720nm(数据间隔5nm)、带宽8nm、100次累计、3×3点、测定高度3mm、点距1mm)
将荧光波长670～720nm范围的荧光强度的和(积分值)设为试样的荧光强度。以比较化合物(5)-IgG DOL3.7的荧光波长670～720nm的范围的荧光强度的积分值为基准值，计算出与该基准值的比(标记抗体的荧光波长670～720nm的范围的荧光强度的积分值/基准值)，根据以下评价基准进行了评价。将结果汇总表示在表4中。
-荧光强度(积分值)的评价基准-
A：荧光强度与基准值之比为2.5倍以上
B：荧光强度与基准值之比为2.0倍以上且小于2.5倍
C：荧光强度与基准值之比为1.2倍以上且小于2.0倍
D：荧光强度与基准值之比为1.0倍以上且小于1.2倍
E：荧光强度与基准值之比小于1.0倍
[表4]
由上述表4的结果可知以下内容。
作为本发明的化合物的化合物(5)～(8)显示出荧光标记率(DOL)4.7～8.2，作为与抗体的键合性，显示出实用上没有问题的充分的水准。
从通式(1)中不是R11～R13的R3具有羧基或能够与生物物质键合的取代基，不具有由-(CH2-CH2-O)m-R21表示的结构的方面考虑，比较化合物(5)不是本发明中规定的结构。
作为本发明的化合物的由化合物(5)～(8)标记的标记抗体均显示出相对于使用了上述比较化合物(5)的标记抗体的荧光强度明显高的荧光强度(相对于No.c15的No.105～108)。
[5]荧光量子产率的评价
通过以下参考资料中记载的方法对上述的化合物或标记抗体的PBS溶液(pH7.4)进行了评价。
“A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields”(HORIBA Scientific公司的资料，通过https://www.horiba.com/fileadmin/uploads/Scientific/Documents/Fluorescence/quantumyieldstrad.pdf能够获得)
对于荧光量子产率，评价等级越高则荧光量子产率越优异，因此非常优选。
-荧光量子产率的评价基准-
A：0.5以上
B：0.4以上且小于0.5
C：0.3以上且小于0.4
D：0.2以上且小于0.3
E：小于0.2
[6]耐光性的评价
将在上述中合成的化合物或标记抗体以吸收波长峰的吸光度成为0.095～0.105的方式溶解在PBS溶液(pH7.4)中。使用旋转木马光照射机〔Ushio Inc.制造的氙气灯UXL-500D-O、HA-50滤光片、Y44滤光片、曝光强度22mW/cm2(500nm换算)〕对该溶液进行曝光的状态下，通过分光器(Agilent Technologies,Inc.制造、Agilent8453)随时间测定了各化合物或标记抗体的吸收波长峰的吸光度。将曝光前的吸收波长峰的吸光度设为100％，求出该吸收波长峰的吸光度第一次降低50％(吸收波长峰的吸光度达到50％)为止的曝光时间，基于以下评价基准进行了评价。
由于评价等级越高则稳定的时间越长，因此优选。
-耐光性的评价基准-
A：40小时以上
B：30小时以上且小于40小时
C：20小时以上且小于30小时
D：10小时以上且小于20小时
E：小于10小时
[表5]
(表注)
AlexaFluor647如上所述，比较化合物(5)-IgG是指，使用AlexaFluor647的NHS酯体而制作的标记抗体。
从上述表4及5的结果，发现在620～700nm具有激励吸收波长的本发明的第二优选的方式的化合物及其标记抗体除了显示所获得的标记生物物质优异的荧光强度以外，还显示优异的荧光量子产率，而且与市售的作为荧光性化合物的AlexaFluor647及其标记抗体相比，耐光性也更优异。
＜实施例3：激励光波长685nm下的评价＞
对上述的各化合物(9)～(13)及比较化合物(4)评价了溶液荧光强度及膜上荧光强度。
[7]溶液荧光强度的评价
在上述[1]的荧光标记率评价中的各标记抗体溶液的制备中，如下述表6所示的那样对抗体的标记中使用的化合物及相对于抗体1当量的化合物的摩尔当量比进行变更，除此以外，以相同的方式，制备了各标记抗体溶液。将所获得的标记抗体的溶液调整成蛋白质浓度0.005mg/mL，使用分光荧光强度计(产品名称：RF-6000，Shimadzu Corporation制造)，以685nm的激励光统一曝光条件，计算出荧光波长710～730nm的范围的荧光强度的积分值。以比较化合物(4)-IgG的DOL3.4(添加10当量色素)的荧光波长710～730nm的范围的荧光强度的积分值为基准值，计算出与该基准值的比(标记抗体的荧光波长710～730nm的范围的荧光强度的积分值/基准值)，根据以下评价基准进行了评价。将结果汇总表示在表6中。
-荧光强度(积分值)的评价基准-
A：荧光强度与基准值之比为2.0倍以上
B：荧光强度与基准值之比为1.7倍以上且小于2.0倍
C：荧光强度与基准值之比为1.4倍以上且小于1.7倍
D：荧光强度与基准值之比为1.2倍以上且小于1.4倍
E：荧光强度与基准值之比为1.1倍以上且小于1.2倍
F：荧光强度与基准值之比为0.9倍以上且小于1.1倍
G：荧光强度与基准值之比小于0.9倍
[表6]
由上述表6的结果可知以下内容。
作为本发明的化合物的化合物(9)～(13)显示出荧光标记率(DOL)2.1～7.8，作为与抗体的键合性，显示出实用上没有问题的充分的水准。
从通式(1)中不是R11～R13的L1具有羧基或能够与生物物质键合的取代基的方面考虑，比较化合物(4)不是本发明中规定的结构。使用了该比较化合物(4)的标记抗体在溶液中的荧光强度在任一DOL中均低(No.c14)。
与此相对，作为本发明的化合物的由化合物(9)～(13)标记的标记抗体均显示出相对于使用了上述比较化合物(4)的标记抗体的荧光强度明显高的荧光强度(相对于No.c14的No.109～113)。
并且，在具有能够与生物物质键合的取代基的R13为由通式(IV)表示的基团的本发明的化合物(9)～(13)的标记抗体中，也发现在通式(IV)中的R39或R43至少具有1个取代基的本发明的化合物(10)～(13)显示更优异的荧光强度，在R39及R43这两者上具有取代基的本发明的化合物(11)～(13)显示进一步优异的荧光强度。
[8]免疫印迹荧光强度评价
将转铁蛋白(Merck KGaA制造)利用Fluorescent Compatible Sample Buffer(4X，non-reducing)(Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)稀释来设为1ng/uL、0.3ng/uL、0.1ng/μL，在95℃下加热处理了5分钟。对Novex 4-20％ Tris-Glycine Mini Gels(Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)加载前述转铁蛋白样品与PageRulerPrestainedNIR Protein Ladder(Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)之后，在恒定电压225V下实施了45分钟电泳。将电泳后的凝胶和硝基纤维素膜(Cytiva公司制造)进行叠加，以恒定电压20V实施1小时的蛋白转印之后，将膜浸渍于Western Blot Blocking Buffer(FishGelatin)(Takara Bio Inc.制造)在4℃下静置了12小时。将膜利用TBS-T buffer进行清洗之后，浸渍于放了Transferrin用一抗(Dako公司制造)(5000倍稀释)的液体，振动1小时，将膜利用TBS-T buffer进行清洗。制备比较化合物(4)-IgG(25000倍稀释)的液体，将膜浸入，在遮光状态下振动1小时振后，利用TBS-T进行了清洗。将膜在40℃恒温槽避光1小时使其干燥。使用Amersham Typhoon scanner(Cytiva公司制造)进行图像化，以685nm的激励光统一测定条件，测定3.24mm2组分的荧光波长710～730nm的范围的荧光强度作为信号荧光强度。以与上述相同的方式对其他化合物的标记抗体测定了荧光强度。
以比较化合物(4)-IgG DOL3.4的荧光波长710～730nm的范围的信号荧光强度的积分值为基准值，计算出与该基准值的比(标记抗体的荧光波长710～730nm的范围的信号荧光强度的积分值/基准值)，根据以下评价基准进行了评价。将结果汇总表示在表7中。
-荧光强度(积分值)的评价基准-
A：信号荧光强度与基准值之比为3.0倍以上
B：信号荧光强度与基准值之比为2.5倍以上且小于3.0倍
C：信号荧光强度与基准值之比为2.0倍以上且小于2.5倍
D：信号荧光强度与基准值之比为1.5倍以上且小于2.0倍
E：信号荧光强度与基准值之比为1.1倍以上且小于1.5倍
F：信号荧光强度与基准值之比为0.9倍以上且小于1.1倍
G：信号荧光强度与基准值之比小于0.9倍
[表7]
对于上述表7中所示的标记抗体的免疫印迹中的荧光强度，也获得了与上述表7中所示的标记抗体的溶液中的荧光强度相同的结果。
＜实施例4＞
对上述的各化合物(19)及(20)以及市售品(AlexaFluor750)评价了耐光性。
[9]耐光性的评价
将在上述中合成的化合物或市售品以吸收波长峰的吸光度成为0.095～0.105的方式溶解在PBS溶液(pH7.4)中。使用旋转木马光照射机〔Ushio Inc.制造的氙气灯UXL-500D-O、HA-50滤光片、Y44滤光片、曝光强度22mW/cm2(500nm换算)〕对该溶液进行曝光的状态下，通过分光器(Agilent Technologies,Inc.制造、Agilent8453)随时间测定了各化合物或市售品的吸收波长峰的吸光度。将曝光前的吸收波长峰的吸光度设为100％，求出该吸收波长峰的吸光度第一次降低50％(吸收波长峰的吸光度达到50％)为止的曝光时间，基于以下评价基准进行了评价。
由于评价等级越高则稳定的时间越长，因此优选。
-耐光性的评价基准-
A：9小时以上
B：7小时以上且小于9小时
C：5小时以上且小于7小时
D：3小时以上且小于5小时
E：小于3小时
[表8]
| No. | 荧光性化合物 | 耐光性 |
| 119 | 化合物(19) | A |
| 120 | 化合物(20) | A |
| c15 | AlexaFluor750 | E |
(表注)
AlexaFluor750：AlexaFluor750(产品名称、Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)。是一种λex＝749nm、λem＝775nm的荧光色素，被称为耐光性优异的色素。
从上述表8的结果，发现在740～830nm具有激励吸收波长的本发明的第一优选的方式的化合物与市售的作为荧光性化合物的AlexaFluor750相比耐光性优异。
如此，使用了本发明的化合物的标记生物物质在溶液、膜上、染色细胞及免疫印迹中的至少任一种方式中具有优异的荧光强度。
对于本发明与其实施方式一同进行了说明，但本发明人认为，只要没有特别指定，在说明的任何细节中也不会对本发明进行限定，在不违反所附的技术方案所示的发明的精神和范围的情况下，应该作广泛的解释。
本申请主张基于2021年6月18日在日本申请的日本特愿2021-101305及2022年3月18日在日本申请的日本特愿2022-044427的优先权，在此作为参考将其内容作为本说明书中记载的一部分而引用。
Claims (12)
1.一种化合物，其由下述通式(1)表示，
[化学式1]
上述式中，R1～R4表示烷基、芳基、杂芳基或-(CH2-CH2-O)m-R21，m为1～10，R21表示烷基，R11～R13表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰胺基或卤原子，相邻的基团彼此可以相互键合而形成5元环或6元环，其中，R11～R13的至少1个包含羧基或能够与生物物质键合的取代基，
n为1～3的整数，
L1及L2表示烷基或-(CH2-CH2-O)m-R21，R21及m分别与所述R21及m含义相同，L1和L2可以彼此键合而形成环，
α1及α2为0或1，
环Z1及环Z2表示由选自碳原子及氮原子中的成环原子形成的6元环，可以具有取代基，也可以形成稠环，当环Z1及环Z2形成具有成环氮原子的6元环时，该成环氮原子可以被取代基取代，
由式(1)表示的化合物具有至少1个由-(CH2-CH2-O)m-R21表示的结构，R21及m分别与所述R21及m含义相同，
其中，由式(1)表示的化合物是中性化合物。
2.根据权利要求1所述的化合物，其由下述通式(2-1)～(2-4)中的任一个表示，
[化学式2]
在上述式中，R45表示烷基或-(CH2-CH2-O)m-R21，
R41～R44及R81～R86表示氢原子、烷基、烷氧基、芳基、磺基、磺酰胺基、硝基、羧基、酰胺基或卤原子，相邻的基团彼此可以相互键合而形成稠环，
R1～R4、R11～R13、L1、L2及m分别与所述R1～R4、R11～R13、L1、L2及m含义相同，
R1～R4、L1、L2或R45的至少1个为-(CH2-CH2-O)m-R21，R21及m分别与所述R21及m含义相同，
l表示2或3的整数，
其中，由式(2-1)～(2-4)中的任一个表示的化合物是中性化合物。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，
所述R1及R2的至少1个和所述R3及R4的至少1个包含由-(CH2-CH2-O)m-表示且m为1～10的结构。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中，
在化合物中包含4个由-(CH2-CH2-O)m-表示且m＝1～10的结构。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中，
所述L1及L2的至少1个为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1种作为取代基的烷基。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中，
所述L1及L2为具有烷氧基、羧基、磺基及膦酰基中的至少1种作为取代基的烷基。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中，
所述R11～R13之中具有羧基的取代基或具有能够与生物物质键合的取代基的基团为由下述通式(I)～(V)中的任一个表示的取代基，
[化学式3]
在上述式中，Y表示氧原子或＝NR38，环Q1表示5元或6元的杂环或烃环，
R31～R44表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰胺基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，
其中，由通式(I)～(V)中的任一个表示的基团具有至少1个羧基或能够与生物物质键合的取代基，
*表示键合键。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中，
由所述通式(II)表示的取代基为由下述式(E-1)～(E-8)中的任一个表示的取代基，
[化学式4]
在上述式中，R51～R72表示氢原子、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、卤原子、磺基、硝基、氰基、羧基或能够与生物物质键合的取代基，
其中，由通式(E-1)～(E-8)中的任一个表示的取代基具有至少1个羧基或能够与生物物质键合的取代基，
*表示键合键。
9.根据权利要求7所述的化合物，其中，
所述R11～R13之中具有羧基的取代基或具有能够与生物物质键合的取代基的基团为由所述通式(IV)表示的取代基。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中，
所述R39～R43中的至少一者为羧基、具有羧基的烷氧基、具有羧基的烷基氨基甲酰基或具有羧基的聚(氧化亚烷基)氨基甲酰基。
11.一种标记生物物质，其由权利要求1至10中任一项所述的化合物与生物物质键合而成。
12.根据权利要求11所述的标记生物物质，其中，
所述生物物质为蛋白质、氨基酸、核酸、糖链及磷脂中的任一种。
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