JP7423789B2 - 化合物及びこれを用いた標識生体物質 - Google Patents

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Description

本発明は、化合物及びこれを用いた標識生体物質に関する。
様々な刺激（病気、環境変化など）に対する生体内の変化を観察するために、目的の検出対象物質に対して結合性の生体分子（抗体等）を蛍光性化合物（色素）で標識した蛍光標識生体物質が多用されている。
例えば、タンパク質混合物から特定のタンパク質を検出するウエスタンブロッティング（以下、ＷＢとも略す。）でも、上記特定のタンパク質の有無ないし存在量を、このタンパク質に対して結合性の蛍光標識抗体を用いて検出する蛍光法が利用されている。
また、生体中の生体分子、細胞及び組織等の動態及び機能等を解析するバイオイメージング技術においては、蛍光標識により可視化した生体の特定の部位を観察する生体蛍光イメージングが、生体観察の技術の一つとして利用されている。
上記蛍光標識に用いられる蛍光色素として、シアニン色素が知られている。しかし、シアニン色素を蛍光標識に用いた場合、標識後の色素間における自己会合等の相互作用が生じやすく、蛍光量子収率が低下する傾向にある。
この問題に対処した技術として、例えば、特許文献１～３には、化合物中に大員環構造を導入した大環状シアニン色素が記載されている。上記特許文献１によれば、ポリメチン鎖の両末端に位置する複素環を連結した大環状シアニン化合物により、臨床現場において使用されるイメージング剤としての用途において、エキソペプチターゼによる分解安定性が向上し、凝集が抑制され、肝臓より排出されやすいとされている。上記特許文献２によれば、ポリメチン鎖の両末端に位置する複素環のうち、一方の複素環の環構成ｓｐ３炭素原子と他方の複素環の環構成窒素原子とを連結した大環状シアニン化合物とすることにより、自己会合が抑制され、蛍光強度が高くなり、安定性も向上するとされている。また、上記特許文献３には、スルホネート（スルホン酸又はその塩）基及びホスホネート（ホスホン酸又はその塩）基の少なくとも一方を有する水溶性基架橋基により連結した大環状シアニン化合物とすることにより、量子収率が向上され、水溶性が向上されることにより自己会合が抑制され、輝度（蛍光強度）が向上するとされている。
国際公開第２００５／０００２１８号 国際公開第２００６／０４７４５２号 国際公開第２０１２／０１２５９５号
蛍光標識に用いられる色素は、溶液、メンブレン又はドットブロット等の多様な状態において優れた蛍光強度を示すことが求められる。しかし、本発明者らが蛍光強度について更なる検討を重ねたところ、上記特許文献１～３に具体的に開示されたシアニン色素を用いた蛍光標識では、溶液、メンブレン及びドットブロットのいずれの状態においても十分なレベルの蛍光強度を得ることができないことがわかってきた。
本発明は、溶液、メンブレン及びドットブロットのいずれの状態においても優れた蛍光強度を示す標識生体物質を得ることができる化合物を提供することを課題とする。また本発明は、この化合物と生体物質とを結合してなる標識生体物質を提供することを課題とする。
すなわち、本発明の上記課題は、下記の手段によって解決された。
〔１〕
下記一般式（１）で表される化合物。
Figure 0007423789000001
 式中、Ｒ１～Ｒ６は、置換基を有していてもよいアルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。ｍは１～５０であって、Ｒ２１は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２９は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して縮合環を形成していていてもよい。
ｎは１～３の整数である。
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとが、連結基ＬＬを介して結合している。連結基ＬＬは原子数１～１００の２価の連結基を示す。ただし、連結基ＬＬは、芳香族炭化水素環、スルホ基及びホスホノ基から選ばれるいずれの基も有さない。
Ｒ１～Ｒ６及びＲ２２～Ｒ２９の少なくとも１つは－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。ｍは、上記ｍと同義である。
上記式（１）で表される化合物は中性の化合物であり、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を少なくとも１つ含んでいる。
〔２〕
下記一般式（１－１）～（１－３）のいずれかで表される、〔１〕に記載の化合物。
Figure 0007423789000002
 式中、Ｌ１～Ｌ６は、アルキレン基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊を示す。＊は連結基ＬＬとの結合位置を示す。
Ｒ７及びＲ８は、置換基を有していてもよいアルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。
Ｒ１～Ｒ６、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２１～Ｒ２９、ＬＬ、ｍ及びｎは、上記のＲ１～Ｒ６、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２１～Ｒ２９、ＬＬ、ｍ及びｎと同義である。
〔３〕
上記のＬ１～Ｌ６のそれぞれが、ｍ＝１～５０であって、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む、〔２〕に記載の化合物。
〔４〕
上記連結基ＬＬが、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する、２価の連結基である、〔１〕～〔３〕のいずれか１つに記載の化合物。
〔５〕
上記一般式中における２つの複素環がいずれも、下記条件Ｉを満たす、〔１〕～〔４〕のいずれか１つに記載の化合物。
（条件Ｉ）
複素環の環構成原子であるｓｐ３炭素原子上の少なくとも１つの置換基と、複素環の環構成窒素原子上の置換基とが、ｍ＝１～５０であって、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。
〔６〕
上記連結基ＬＬにおけるＲ１～Ｒ６、Ｒ２２～Ｒ２９又はＬ１～Ｌ６との連結部が、－Ｏ－基、－Ｓ－基、－ＮＲ５０－基、－ＣＯＯ－基又は－ＣＯＮＲ５０－基である、請求項〔１〕～〔５〕のいずれか１つに記載の化合物。ただし、Ｒ５０は水素原子又はアルキル基である。
〔７〕
上記のＲ１１～Ｒ１３の少なくとも１つがアリールオキシ基である、〔１〕～〔６〕のいずれか１つに記載の化合物。
〔８〕
〔１〕～〔７〕のいずれか１つに記載の化合物と生体物質とが結合してなる標識生体物質。
〔９〕
上記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである〔８〕に記載の標識生体物質。
本発明の化合物は、溶液、メンブレン及びドットブロットのいずれの状態においても優れた蛍光強度を示す標識生体物質を得ることができる。また、本発明の標識生体物質は優れた蛍光強度を示す。
本発明において、特定の符号又は式で表示された置換基もしくは連結基等（以下、置換基等という）が複数あるとき、又は、複数の置換基等を同時に規定するときには、特段の断りがない限り、それぞれの置換基等は互いに同一でも異なっていてもよい。このことは、置換基等の数の規定についても同様である。また、複数の置換基等が近接するとき（特に、隣接するとき）には、特段の断りがない限り、それらが互いに連結して環を形成していてもよい。また、特段の断りがない限り、環、例えば脂環、芳香族環及びヘテロ環は、さらに縮環して縮合環を形成していてもよい。
本明細書において、特段の断りがない限り、二重結合については、分子内にＥ型及びＺ型が存在する場合、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。また、特段の断りがない限り、化合物としてジアステレオマー及びエナンチオマーが存在する場合には、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。
本発明において、化合物及び置換基の表示については、化合物そのもの及び置換基そのもののほか、その塩、そのイオンを含む意味に用いる。例えば、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）等は、水素原子が解離してイオン構造を取っていてもよく、塩構造を取っていてもよい。すなわち、本発明において、「カルボキシ基」はカルボン酸イオン又はその塩を、「スルホ基」はスルホン酸イオン又はその塩を、「ホスホノ基」はホスホン酸イオン又はその塩を、それぞれ含む意味で使用する。上記塩構造を構成する際の１価若しくは多価のカチオンとしては、特に制限されず、無機カチオン、有機カチオン等が挙げられ、具体的には、Ｎａ＋、Ｌｉ＋及びＫ＋等のアルカリ金属のカチオン、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋及びＢａ２＋等のアルカリ土類金属のカチオン、並びに、トリアルキルアンモニウムカチオン、テトラアルキルアンモニウムカチオン等の有機アンモニウムカチオンが挙げられる。
塩構造の場合、その塩の種類は１種類でもよく、２種類以上混在していてもよく、化合物中で塩型と遊離酸構造の基が混在していてもよく、また、塩構造の化合物と遊離酸構造化合物が混在していてもよい。
本発明の化合物は、いずれも中性の化合物である。本発明において、化合物が中性であるとは、電気的に中性であることを意味する。具体的には、化合物内の電荷を有する基又は対イオンによって、化合物全体として電荷が０となるように調整されている。例えば、一般式（１）で表される化合物において、Ｒ６が結合する窒素原子の形式電荷は＋１であり、この形式電荷と対となるようにして、化合物中のスルホ基等の解離性基がスルホン酸イオン等のイオン構造を有することによって、本発明の化合物は、化合物全体として電荷０の化合物となる。
本発明で規定する各一般式においては、化合物が有する正電荷を、特定の窒素原子が有する構造として便宜上特定して示している。ただし、本発明の化合物は共役系を有するため、実際には、上記窒素原子以外の他の原子が正電荷を採りうることもあり、化学構造の１つとして各一般式で表される構造を取りうる化合物であれば、各一般式で表される化合物に包含される。このことは負電荷についても同様である。
また、本発明の効果を損なわない範囲で、構造の一部を変化させたものを含む意味である。更に、置換又は無置換を明記していない化合物については、本発明の効果を損なわない範囲で、任意の置換基を有していてもよい意味である。このことは、置換基（例えば、「アルキル基」、「メチル基」、「メチル」などのように表現される基）及び連結基（例えば、「アルキレン基」、「メチレン基」、「メチレン」などのように表現される基）についても同様である。このような任意の置換基のうち、本発明において好ましい置換基は、後述の置換基群Ｔから選択される置換基である。
本発明において、ある基の炭素数を規定する場合、この炭素数は、本発明ないし本明細書において特段の断りのない限りは、基全体の炭素数を意味する。つまり、この基がさらに置換基を有する形態である場合、この置換基を含めた全体の炭素数を意味する。
また、本発明において「～」を用いて表される数値範囲は、「～」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本発明の化合物は、下記一般式（１）で表される。本発明の化合物が、溶液、メンブレン及びドットブロットのいずれの状態においても優れた蛍光強度を示す標識生体物質を得ることができる理由の詳細については定かではないが、次のように考えられる。
本発明の化合物は、一般式（１）で示されるように、インドリン環とインドレニン環を両末端に有するポリメチン鎖を有し、更に、Ｒ５が結合したインドリン環構成窒素原子が三級アミン構造を有し、Ｒ６が結合したインドレニン環構成窒素原子が四級アンモニウム構造を有することにより、ポリメチン骨格を介した電荷移動による吸収が生じる。
上記ポリメチン鎖とは、本発明において、共役二重結合によって結ばれたメチン鎖であって、メチン鎖を構成する炭素原子数が２ｎ＋３であるメチン鎖を意味する。メチンの水素原子はＲ１１～Ｒ１３が採り得る置換基であってもよいが、上記メチン鎖を構成する炭素原子数には計上しない。このように、本発明の化合物は、ポリメチン色素（広義にはシアニン色素）と称される化合物に分類される。
本発明の化合物は、上記構造を有する上で、更に、上記のインドリン環及びインドレニン環が有する置換基Ｒ１～Ｒ６及びＲ２２～Ｒ２９の少なくとも１つが、繰り返し数１～５０のエチレンオキシ基を含み、かつ、インドリン環が有する置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、インドレニン環が有する置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとが、芳香族炭化水素環、スルホ基及びホスホノ基から選ばれるいずれの基も含まない特定の連結基ＬＬを介して結合することにより大員環を形成している。
すなわち、排除体積効果を有する繰り返し数１～５０のエチレンオキシ基を有し、上記連結基ＬＬ中に疎水性の高い芳香族炭化水素環を含まないことにより、化合物同士の相互作用が抑制され、化合物の自己会合による蛍光強度の低下を抑制することができると考えられる。また、排除体積効果を有する繰り返し数１～５０のエチレンオキシ基を有し、上記連結基ＬＬ中に親水性の高いスルホ基及びホスホノ基のいずれの基も含まないことにより、生体物質（例えば抗体が挙げられ、以下同様である。）への結合性の低下を抑制し、スルホ基又はホスホノ基が有する電荷による生体物質の活性（例えば抗体活性が挙げられ、以下同様である。）の低下を抑制し、得られる標識生体物質は、優れた蛍光強度を示すことができると考えられる。すなわち、本発明の化合物から得られる標識生体物質において、上記連結基ＬＬは化合物の自己会合の抑制に寄与すると考えられるものの、連結基ＬＬ上にスルホ基又はホスホノ基を有する場合には生体物質表面の荷電バランスに影響を及ぼし、得られる標識生体物質（標識抗体等）の活性が低下し、標的検出における蛍光強度が低下するものと考えられる。特に上記連結基ＬＬがカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する場合には、生体物質と結合する置換基近傍に、スルホ基及びホスホノ基が存在することで、荷電反発により生体物質との結合性がより低下すると考えられる。
これに対して、上記特許文献１又は２に具体的に記載されている化合物のように、ポリメチン鎖の両末端に位置する複素環同士が連結された、大員環構造を形成していても、複素環（縮合環を含む）上に繰り返し数１～５０のエチレンオキシ基を含まない場合には、化合物の水溶性が劣り、会合により蛍光強度が低下してしまうと考えられる。更に、上記特許文献３に記載されている化合物のように、大員環構造を形成する連結基にスルホ基及びホスホノ基の少なくともいずれかの基を有することによって、生体物質への結合性が低下したり、又は生体物質の活性が低下し、得られる標識生体物質は、優れた蛍光強度を示すことができないと考えられる。
本発明の化合物は、繰り返し数２ｎ＋３のメチン鎖の長さに依存して、ｎ＝１の場合に５８５ｎｍ付近に、ｎ＝２の場合に６８５ｎｍ付近に、ｎ＝３の場合に７８５ｎｍ付近に、それぞれ励起吸収波長を有する。そのため、これらの一般式（１）で表される化合物は、それぞれ、励起光源として６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ付近のものを使用する蛍光標識において、優れた蛍光強度を示す化合物として使用できる。
多色ＷＢでは、可視領域から近赤外領域までの範囲内において、複数の発光色を検出する。そのため、色素を励起発光させた際に互いに干渉してクロストークが起こらないように、複数の色素の吸収発光波形が適切な波長関係となるように選択する必要がある。ある励起光では１つの色素だけが光り、他の色素が光らないように調整されるのが理想的である。この観点で、例えば、多色ＷＢの近赤外領域の発光には、７００ｎｍ付近と８００ｎｍ付近という、ある程度波長の離れた２種類の励起光源が用いられている。
近赤外光励起による蛍光検出は、可視光励起による検出に比べてメンブレンの自家蛍光、すなわちバックグラウンド蛍光を抑制できるため、シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を高めやすく、目的のタンパク質を高感度に検出することが可能となる。そのため、近年、微量タンパク質の解析研究において、近赤外領域の発光を利用した蛍光検出ＷＢの必要性が増してきている。
しかし、近赤外領域では、一般的に蛍光色素の蛍光量子収率が低く、高いシグナル量を得ることが難しい。本発明の化合物のうちｎ＝２又は３である化合物は、上記の７００ｎｍ付近と８００ｎｍ付近の２種類のものを有する多色ＷＢにおいても、優れた蛍光強度を示す化合物として使用でき、特に、タンパク質をより高感度に観察、検出するという要望に対しても、上記特許文献１～３記載のシアニン色素を含む従来のシアニン色素を用いた蛍光標識と比較して、優れた蛍光強度を示すことができる。
以下、本発明の一般式（１）で表される化合物について詳述する。
＜一般式（１）で表される化合物＞
本発明の一般式（１）で表される化合物は、下記の通りである。
Figure 0007423789000003
式中、Ｒ１～Ｒ６は、置換基を有していてもよいアルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。ｍは１～５０であって、Ｒ２１は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２９は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して縮合環を形成していていてもよい。
ｎは１～３の整数である。
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとが、連結基ＬＬを介して結合している。このことは、上記化学構造式中において、２つの［ ］で囲われた構造を連結基ＬＬで連結する表記により示している。
上記連結基ＬＬは原子数１～１００の２価の連結基を示す。ただし、連結基ＬＬは、芳香族炭化水素環、スルホ基及びホスホノ基から選ばれるいずれの基も有さない。
Ｒ１～Ｒ６及びＲ２２～Ｒ２９の少なくとも１つは－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。ｍは、上記ｍと同義である。
上記式（１）で表される化合物は中性の化合物であり、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を少なくとも１つ含んでいる。
以下、一般式（１）における置換基等について詳述する。
（１）Ｒ１～Ｒ６
Ｒ１～Ｒ６は、置換基を有していてもよいアルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。
Ｒ１～Ｒ６として採りうるアルキル基は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基と同義である。
無置換のアルキル基の炭素数は、１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～２がさらに好ましい。
置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数としては、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、２～６がさらに好ましく、２～５が特に好ましい。また、置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数としては、３～３５が好ましく、３～２５がより好ましく、３～１５がさらに好ましく、３～１１が特に好ましい。
Ｒ１～Ｒ６として採りうるアルキル基が連結基ＬＬと結合する場合、置換基を有していてもよいアルキル基から水素原子又は置換基を１つ除いて得られるアルキレン基が、連結基ＬＬと結合する。ただし、複素環と連結基ＬＬとを連結する最短分子鎖を構成する全ての原子は、ｓｐ３炭素原子である。
連結基ＬＬと結合する場合のアルキレン基のアルキレン基部分の炭素数は、上記の置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数の記載を好ましく適用することができる。また、連結基ＬＬと結合する場合のアルキレン基のアルキレン基部分のうち、インドリン環又はインドレニン環と連結基ＬＬとを結ぶ結合を構成する原子数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、２～６がさらに好ましく、３～５が特に好ましい。
本発明において、「置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数」とは、アルキル基が有する置換基部分を除く炭素数を意味する。
本発明において、「置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数」とは、置換基部分を含む原子数（すなわち、全原子数から、最長鎖を構成しない分子鎖の原子数を引いた原子数）を意味する。なお、スルホ基、カルボキシ基等の解離性の水素原子を有する置換基が最長鎖を構成する場合、解離の有無にかかわらず、水素原子を含めて計算する。また、後述する生体物質に結合可能な置換基部分における原子数は含めない。
本発明において、「連結基ＬＬと結合する場合のアルキレン基のアルキレン基部分のうち、インドリン環又はインドレニン環と連結基ＬＬとを結ぶ結合を構成する原子数」とは、置換基部分を含む原子数（すなわち、Ｒ１～Ｒ６を構成する全原子数から、インドリン環又はインドレニン環と連結基ＬＬとを結ぶ鎖を構成しない分子鎖及び分岐鎖の原子数を引いた原子数）を意味する。
Ｒ１～Ｒ６として採りうるアルキル基が有していてもよい置換基としては、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホ基、ホスホノ基及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１、並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。また、後述する生体物質に結合可能な置換基を挙げることができる。なお、上記のアルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基におけるアルキル基部分が、後述する生体物質に結合可能な置換基を有していてもよい。
Ｒ１～Ｒ６として採りうる置換基を有するアルキル基としては、上記置換基を有するアルキル基であれば特に制限はないが、末端にカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有するアルキル基であることが好ましい。この場合、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基がアルキル基に直接置換していてもよく、アルコキシ基とカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基との組み合わせからなる基として置換していてもよい。
なお、Ｒ１～Ｒ６が連結基ＬＬと結合する場合、Ｒ１～Ｒ６は、置換基としてスルホ基及びホスホノ基のいずれも有さないアルキル基であることが好ましい。
（－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１）
Ｒ１～Ｒ６として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１において、ｍは１～５０であり、Ｒ２１は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。
ｍは平均繰り返し数（単に、繰り返し数とも称す。）を意味する。ｍは、適度な排除体積効果によって抗体との結合性の低下を抑制しつつ、より優れた蛍光強度を得る観点から、１～２４が好ましく、１～１２がより好ましく、１～１０がさらに好ましく、１～６が特に好ましく、なかでも１～４が好ましい。
上記平均繰り返し数は、化合物について１Ｈ－ＮＭＲ測定を行い、平均積分値より算出することができる。本発明において規定する平均繰り返し数は、上記方法により算出される平均繰り返し数の小数第一位を四捨五入して得られる数を意味する。
Ｒ２１における置換基を有していてもよいアルキル基は、上記Ｒ１～Ｒ６として採りうる、置換基を有していてもよいアルキル基の記載を適用することができる。
Ｒ１～Ｒ６として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１が連結基ＬＬと結合する場合、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１のうち、置換基を有していてもよいアルキル基であるＲ２１から水素原子又は置換基を１つ除いて得られる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレンが、連結基ＬＬと結合する。ただし、複素環と連結基ＬＬとを連結する最短分子鎖を構成する－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレンのうち、アルキレン部分を構成する全ての原子はｓｐ３炭素原子である。
連結基ＬＬと結合する場合の－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレンのアルキレン基部分の炭素数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、２～６がさらに好ましく、２～４が特に好ましい。また、連結基ＬＬと結合する場合の－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレンのアルキレン基部分のうち、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－と連結基ＬＬとを結ぶ結合を構成する原子数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、２～６がさらに好ましく、２～４が特に好ましい。
本発明において、「連結基ＬＬと結合する場合の－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレンのアルキレン基部分のうち、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－と連結基ＬＬとを結ぶ結合を構成する原子数」とは、置換基部分を含む原子数（すなわち、全原子数から、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－と連結基ＬＬとを結ぶ鎖を構成しない分子鎖及び分岐鎖の原子数を引いた原子数）を意味する。
Ｒ１～Ｒ６として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１及びＲ１～Ｒ６としてのアルキル基が置換基として有しうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１としては、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－無置換のアルキル基が好ましい。
Ｒ１～Ｒ６の少なくとも１つが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことが好ましく、溶液、メンブレン及びドットブロットの状態における蛍光強度をより向上させる観点から、一般式（１）における２つの複素環がいずれも、下記条件Ｉを満たすことがより好ましい。
（条件Ｉ）
複素環の環構成原子であるｓｐ３炭素原子上の少なくとも１つの置換基と、複素環の環構成窒素原子上の置換基とが、ｍ＝１～５０であって、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。
「一般式（１）における２つの複素環がいずれも、下記条件Ｉを満たす」とは、すなわち、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つと、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つと、Ｒ５及びＲ６とが、ｍ＝１～５０であって、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことを意味する。
上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造は、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１として、上記メチン鎖に直接結合する複素環に直接結合していることが好ましい。
上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－におけるｍは、上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１におけるｍと同義である。
Ｒ１～Ｒ６の置換基はシアニン色素骨格（平面）に対し垂直方向へ張り出すため、この置換基として－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことにより、縮環部分がπ－π相互作用しにくくなり（会合抑制効果が強まり）、会合による蛍光強度の低下を抑制できると推定している。
（２）Ｒ１１～Ｒ１３
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示す。隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ１１～Ｒ１３として採りうるアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基及びハロゲン原子は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基及びハロゲン原子と同義であり、好ましい範囲も同じである。
Ｒ１１～Ｒ１３として採りうるアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基及びアミノ基は、無置換であってもよく、置換基を有していてもよい。
Ｒ１１～Ｒ１３におけるアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基及びアミノ基が有していてもよい置換基としては、後述する置換基群Ｔにおける置換基が挙げられ、例えば、アルコキシ基又はスルホ基が好ましい。また、前述の－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１も好ましく挙げられる。さらに、これらの置換基の組み合わせからなる基であってもよく、例えば、－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１が挙げられる。
Ｒ１１～Ｒ１３のうち、隣接する基同士が互いに結合して形成される５又は６員環は、芳香族性又は脂肪族性のいずれであってもよく、脂肪族性であることが好ましい。また、６員環を形成することが好ましい。化合物中における上記の５又は６員環の数は特に制限されないが、１又は２個が好ましく、１個がより好ましい。
例えば、ｎ＝３の場合を例にすると、Ｒ１１～Ｒ１３のうち隣接する基同士が結合して形成される環を有する構造としては、下記構造が好ましく挙げられる。なお、下記例においては、環構造を形成していないＲ１１～Ｒ１３は水素原子であり、環構造は置換基を有しない構造を記載しているが、これらに限定されるものではない。また、下記において、波線の先の構造は省略して記載する。
Figure 0007423789000004
Ｒ１１及びインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３は、水素原子が好ましい。
Ｒ１２及び上記以外のＲ１３は、水素原子、アルキル基、アリールオキシ基又はアリールチオ基が好ましく、水素原子、アルキル基又はアリールオキシ基がより好ましい。
Ｒ１１～Ｒ１３の少なくとも１つは、アリールオキシ基であることが好ましく、Ｒ１２及び上記のインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１３のうちの少なくとも１つは、アリールオキシ基であることがより好ましい。
Ｒ１１～Ｒ１３のうち、Ｒ１１及びインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１２～Ｒ１３における隣接する基同士（すなわち、インドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１３とＲ１２のうちの隣接する基同士）が、互いに結合して５又は６員環を形成していることが好ましく、６員環を形成していることがより好ましい。また、インドリン環及びインドレニン環を結ぶ結合の中心部分に上記５又は６員環を形成していることが好ましい。インドリン環及びインドレニン環を結ぶ結合の中心部分に形成される環とは、インドリン環及びインドレニン環からの結合原子数が等しくなる炭素原子を環構成原子として含む環を意味する。
（３）Ｒ２２～Ｒ２９
Ｒ２２～Ｒ２９は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して縮合環を形成していていてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２９が連結基ＬＬと結合する場合、Ｒ２２～Ｒ２９として採り得る置換基を有していてもよい、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基又はアシルアミノ基から水素原子を１つ除いて得られる、置換基を有していてもよい、アルキレン基、アルキレンオキシ基、アリーレン基、アルキレンスルホンアミド基、シクロアルキレンスルホンアミド基、アルキレンオシカルボニル基、アルキレンカルボニルオキシ基、アルキレンカルバモイル基、シクロアルキレンカルバモイル基、又はアルキレンカルボニルアミノ基が、連結基ＬＬと結合する。ただし、Ｒ２２～Ｒ２９が結合するベンゼン環と連結基ＬＬとを連結する最短分子鎖を構成する全ての原子は、Ｒ２２～Ｒ２９として採り得る無置換の、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基又はアシルアミノ基から水素原子を１つ除いて得られる基で構成され、Ｒ２２～Ｒ２９を構成する、連結基ＬＬとの結合原子はｓｐ３炭素原子である。
Ｒ２２～Ｒ２９として採りうるアルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基及びハロゲン原子は、それぞれ、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基及びハロゲン原子と同義である。また、これらの基は置換基を有していてもよく、後述する置換基群Ｔにおける置換基、又は、前述の－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１が挙げられる。
ただし、Ｒ２２～Ｒ２９が連結基ＬＬと結合する場合、Ｒ２２～Ｒ２９は、より優れた蛍光強度が得られる観点から、芳香族炭化水素環を有さず、かつ、置換基としてスルホ基及びホスホノ基のいずれも有さないことが好ましい。上記芳香族炭化水素環を有さないとは、アリール基又はアリーレン基等の１～６価の芳香族炭化水素基を有さないことを意味する。例えば、アルキレン－カルバモイル基、アルキレン基が挙げられる。
Ｒ２２～Ｒ２９のうち隣接する基同士が互いに結合して形成される縮合環としては、特に制限はないが、例えば、ナフタレン環が挙げられる。なお、会合抑制の観点から、Ｒ２２～Ｒ２９のうち隣接する基同士が互いに結合しておらず、縮合環を形成していないことが好ましい。
水溶性の向上および会合抑制の観点から、Ｒ２２～Ｒ２５の少なくとも１つとＲ２６～Ｒ２９の少なくとも１つとが親水性基を有することが好ましく、Ｒ２２～Ｒ２５が結合する環及びＲ２６～Ｒ２９が結合する環の数１つに付き少なくとも１つの親水性基を有することがより好ましい。例えば、Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ２６～Ｒ２９うち隣接する基同士が互いに結合して縮合環としてナフタレン環をそれぞれ形成している場合、Ｒ２２～Ｒ２５が結合する環の数は２つ、Ｒ２６～Ｒ２９が結合する環の数は２つとなり、Ｒ２２～Ｒ２５の少なくとも２つ及びＲ２６～Ｒ２９の少なくとも２つが親水性基を有することがより好ましいことを意味する。上限値は、構造として可能な限り特に制限されず、後述する化合物全体としての親水性基の数にあわせて、適宜調整することができる。
親水性基としては、化合物に親水性を付与できる基である限り特に制限されないが、例えば、置換基を有するアルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基が挙げられ、スルホ基が好ましい。
Ｒ２２～Ｒ２９は、水素原子、アルキル基、スルホ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子が好ましい。
Ｒ２２～Ｒ２９が連結基ＬＬと結合する場合、Ｒ２２～Ｒ２９は、アルキル基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基又はアシルアミノ基がより好ましく、アルキル基、カルバモイル基又はアシルアミノ基がさらに好ましい。
Ｒ２２～Ｒ２９が連結基ＬＬと結合しない場合、水素原子、スルホ基、ニトロ基又はハロゲン原子がより好ましく、水素原子、スルホ基又はハロゲン原子がさらに好ましい。
（４）連結基ＬＬ
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとは、連結基ＬＬを介して結合している。
連結基ＬＬは、原子数１～１００の２価の連結基を示す。ただし、連結基ＬＬは、芳香族炭化水素環、スルホ基及びホスホノ基から選ばれるいずれの基も有さない。この連結基ＬＬを介した結合により、インドリン環及びインドレニン環の回転が抑制されることにより、蛍光強度が向上される。一方、連結基ＬＬが芳香族炭化水素環、スルホ基及びホスホノ基から選ばれるいずれの基を有する場合、芳香族炭化水素環の疎水性による会合促進が生じたり、スルホ基又はホスホノ基が示す荷電反発によって、生体物質への結合性の低下、又は、生体物質の活性の低下が生じ、蛍光強度が低下すると考えられる。上記芳香族炭化水素環を有さないとは、アリール基又はアリーレン基等の１～６価のいずれの芳香族炭化水素基も有さないことを意味する。
本発明において、「連結基ＬＬの原子数」とは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとを連結する最短分子鎖を構成する連結原子数を意味する。すなわち、連結基ＬＬを構成する全原子数から、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとを結ぶ鎖を構成しない分子鎖及び分岐鎖（－Ｈ、＝Ｏを含む）の原子数を引いた原子数を意味する。例えば、連結基ＬＬが－ＣＯＮＨ－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－ＮＨＣＯ－である場合、連結基ＬＬの原子数は６である。
なお、連結基ＬＬを構成する、Ｒ１～Ｒ６又はＲ２２～Ｒ２９との結合原子がｓｐ３炭素原子以外の原子となるようにして、連結基ＬＬを決定する。さらに、前述の、Ｒ１～Ｒ６が連結基Ｌと結合する場合の記載及びＲ２２～Ｒ２９が連結基Ｌと結合する場合の記載に基づき、連結基ＬＬと結合するＲ１～Ｒ６又はＲ２２～Ｒ２９に相当する基及び連結基ＬＬを決定する。
連結基ＬＬの原子数は、５～７０が好ましく、５～５０がより好ましく、５～３０がさらに好ましく、５～２０が特に好ましい。
連結基ＬＬは、アルキレン基、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ５０－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ５０－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－から選ばれる基の１つ又は２つ以上が結合して形成される２価の連結基であることが好ましい。Ｒ５０は、水素原子又はアルキル基を示す。
連結基ＬＬとして採り得るアルキレン基のアルキレン部分の炭素数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～７がさらに好ましく、１～６が特に好ましく、１～５が最も好ましい。
本発明において、「アルキレン基のアルキレン部分の炭素数」とは、アルキレン基が有する置換基部分を除く炭素数を意味する。
Ｒ５０として採り得るアルキル基は、上記Ｒ１～Ｒ６におけるアルキル基の記載を好ましく適用することができる。
Ｒ５０としては水素原子が好ましい。
ｐは平均繰り返し数（単に、繰り返し数とも称す。）を意味し、１～５０が好ましく、１～３０がより好ましく、１～２４がさらに好ましく、１～２０が特に好ましく、なかでも１～１２が好ましく、１～４が最も好ましい。
平均繰り返し数の測定方法及び定義は、前述の－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－における平均繰り返し数と同義である。
連結基ＬＬを構成する上記のアルキレン基、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ５０－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ５０－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－の数は、３～１１が好ましく、３～９がより好ましく、３～７がさらに好ましく、３～５が特に好ましく、３が最も好ましい。
連結基ＬＬは、アルキレン基、－ＣＯＮＲ５０－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－から選ばれる基で構成されることがより好ましく、アルキレン基及び－ＣＯＮＲ５０－から選ばれる基で構成されることがさらに好ましい。
連結基ＬＬにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つとの連結部、及び、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとの連結部は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ５０－、－ＣＯＯ－又は－ＣＯＮＲ５０－であることが好ましい。すなわち、連結基ＬＬは、連結基ＬＬを構成する、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ５０－、－ＣＯＯ－又は－ＣＯＮＲ５０－を介して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つ、及び、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つに対して結合していることが好ましい。連結基ＬＬにおける上記連結部は、－Ｏ－又は－ＣＯＮＲ５０－が好ましく、－ＣＯＮＲ５０－がより好ましい。
なお、一般式（１－１）～（１－３）のいずれかで表される化合物においては、連結基ＬＬにおけるＬ１～Ｌ６との連結部は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ５０－、－ＣＯＯ－又は－ＣＯＮＲ５０－であることが好ましい。すなわち、連結基ＬＬは、連結基ＬＬを構成する、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ５０－、－ＣＯＯ－又は－ＣＯＮＲ５０－を介して、Ｌ１～Ｌ６に対して結合していることが好ましい。連結基ＬＬにおける上記連結部は、－Ｏ－又は－ＣＯＮＲ５０－が好ましく、－ＣＯＮＲ５０－がより好ましい。
連結基ＬＬは、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する２価の連結基であることが好ましい。連結基ＬＬにおいて、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する箇所としては、アルキレン基又はＲ５０としてのアルキル基が挙げられ、アルキレン基が好ましい。
連結基ＬＬにおいて、アルキレン基又はＲ５０としてのアルキル基に対して、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基は直接結合していてもよく、連結基ＺＺＺを介して結合していてもよい。
上記連結基ＺＺＺとしては、アルキレン基、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ６０－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ６０－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－、並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。組み合わせる数は、例えば、２～７が好ましく、２～５がより好ましく、２又は３がさらに好ましい。
連結基ＺＺＺとして採り得るアルキレン基のアルキレン部分の炭素数は、上記連結基ＬＬとして採り得るアルキレン基のアルキレン部分の炭素数の記載を好ましく適用することができる。
連結基ＺＺＺは、アルキレン基、－ＣＯＮＲ６０－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－から選ばれる基で構成されることが好ましく、－ＣＯＮＲ６０－アルキレン又は－ＣＯＮＲ６０－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－アルキレンで表される基であることがより好ましく、－ＣＯＮＲ６０－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－アルキレンで表される基であることがさらに好ましい。
Ｒ６０は水素原子又はアルキル基であり、水素原子が好ましい。Ｒ６０として採り得るアルキル基としては、上記Ｒ５０におけるアルキル基の記載を好ましく適用することができるが、Ｒ６０として採り得るアルキル基がカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有することはない。
ｐは上記ｐと同義である。
（５）ｎ
ｎは、１～３の整数であって、２又は３の整数が好ましい。
上記一般式（１）で表される化合物は、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を少なくとも１つ含んでいる。
上記一般式（１）で表される化合物は、上記のカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基により、生体物質と結合し、目的とする標識生体物質を得ることができる。なお、カルボキシ基は、生体物質に結合可能な置換基を常法により容易に誘導することができる。
本発明において、「生体物質に結合可能な置換基」は、カルボキシ基から誘導される生体物質に結合可能な置換基を含む。
一般式（１）で表される化合物中において、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する位置に特に制限はないが、Ｒ１～Ｒ６又は連結基ＬＬのいずれかの位置に少なくとも１つ有することが好ましく、連結基ＬＬに少なくとも１つ有することがより好ましい。
一般式（１）で表される化合物中におけるカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する基の数は、合計で、少なくとも１つ以上であればよく、検出対象物質の定量の観点から、１～３つが好ましく、１つ又は２つがより好ましく、１つがさらに好ましい。
上記一般式（１）で表される化合物において、Ｒ１～Ｒ６及びＲ２２～Ｒ２９の少なくとも１つは、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。ｍは上記ｍと同義である。これにより、本発明の化合物は適度な親水性と、適度な排除体積効果を有することができ、得られる標識生体物質は優れた蛍光強度を示すことができると考えられる。
また、上記一般式（１）で表される化合物は、化合物として十分な親水性を付与する観点から、化合物全体として親水性基を、２個以上有することが好ましく、２～８個有することがより好ましく、２～６個有することがさらに好ましく、３～６個有することが特に好ましい。
親水性基としては、前述のＲ２２～Ｒ２９が採りうる親水性基の記載を適用することができる。
親水性基の位置は、特段の断りがない限り特に制限されず、上記親水性基を有する基としては、例えば、Ｒ１１～Ｒ１３又はＲ２２～Ｒ２９が好ましく挙げられる。ただし、連結基ＬＬがスルホ基又はホスホノ基を含むことはない。
なお、上記一般式（１）で表される化合物が、上記のカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基として上記親水性基を有する場合、上記のカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基の他に、親水性基を１個以上有することが実際的であり、好ましい。具体例としては、カルボキシ基が挙げられる。
＜一般式（１－１）～（１－３）のいずれかで表される化合物＞
本発明の一般式（１）で表される化合物は下記一般式（１－１）～（１－３）のいずれかで表されることが好ましい。
Figure 0007423789000005
式中、Ｌ１～Ｌ６は、アルキレン基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊を示す。＊は連結基ＬＬとの結合位置を示す。
Ｒ７及びＲ８は、上記一般式（１）におけるＲ１～Ｒ４と同義であり、置換基を有していてもよいアルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。
Ｒ１～Ｒ６、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２１～Ｒ２９、ＬＬ、ｍ及びｎは、上記一般式（１）におけるＲ１～Ｒ６、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２１～Ｒ２９、ＬＬ、ｍ及びｎと同義である。ただし、Ｒ１～Ｒ６及びＲ２１～Ｒ２９は連結基ＬＬと結合することはない。
化合物中におけるＲ１～Ｒ８、Ｒ２２～Ｒ２９及びＬ１～Ｌ６の少なくとも１つは－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍで表される構造を含む。ｍは、上記ｍと同義である。
上記一般式（１）で表される化合物と同様に、一般式（１－１）～（１－３）のいずれかで表される化合物は中性の化合物であり、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を少なくとも１つ含む。
Ｌ１～Ｌ３として採りうるアルキレン基は、上記のＲ５及びＲ６として採りうる、置換基を有していてもよいアルキル基から水素原子又は置換基を１つ除いて得られるアルキレン基に相当し、この記載を好ましく適用することができる。Ｌ４～Ｌ６として採りうるアルキレン基は、Ｒ１～Ｒ４として採りうる置換基を有していてもよいアルキル基から水素原子又は置換基を１つ除いて得られるアルキレン基に相当し、この記載を好ましく適用することができる。
Ｌ１～Ｌ３として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊は、上記のＲ５及びＲ６として採りうる、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１のうち、置換基を有していてもよいアルキル基であるＲ２１から水素原子又は置換基を１つ除いて得られる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレンに相当し、この記載を好ましく適用することができる。
Ｌ４～Ｌ６として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊は、Ｒ１～Ｒ４として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１のうち、置換基を有していてもよいアルキル基であるＲ２１から水素原子又は置換基を１つ除いて得られる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレンに相当し、この記載を好ましく適用することができる。
蛍光強度をより向上させる観点から、化合物中に含まれるＬ１～Ｌ６のそれぞれが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことが好ましい。ｍは上記ｍと同義である。
溶液、メンブレン及びドットブロットの状態における蛍光強度をより向上させる観点から、一般式（１－１）～（１－３）の各式における２つの複素環がいずれも、下記条件Ｉを満たすことがより好ましい。
（条件Ｉ）
複素環の環構成原子であるｓｐ３炭素原子上の少なくとも１つの置換基と、複素環の環構成窒素原子上の置換基とが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。
「一般式（１－１）～（１－３）の各式における２つの複素環がいずれも、下記条件Ｉを満たす」とは、すなわち、一般式（１－１）においては、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つと、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つと、Ｌ１及びＬ２とが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことを意味する。一般式（１－２）においては、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つと、Ｌ４及びＲ７の少なくとも１つと、Ｒ６及びＬ３とが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことを意味する。一般式（１－３）においては、Ｒ７及びＬ６の少なくとも１つと、Ｒ８及びＬ５の少なくとも１つと、Ｒ５及びＲ６とが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことを意味する。
上記一般式（１～１）～（１－３）のいずれかで表される化合物のうち、より優れた蛍光強度が得られる観点から、上記一般式（１－１）で表される化合物が好ましい。これは、一般式（１－１）で表される化合物は化合物の平面性を保ちやすく、構造歪みによる熱失活が最小限に抑えられるためと考えられる。
より優れた蛍光強度が得られる観点から、Ｌ１及びＬ２、Ｌ３及びＬ４、又は、Ｌ５及びＬ６と、連結基ＬＬとにより形成される連結鎖（すなわち、－Ｌ１－ＬＬ－Ｌ２－、－Ｌ３－ＬＬ－Ｌ４－又は－Ｌ５－ＬＬ－Ｌ６－で表される連結鎖）を構成する最短分子鎖を構成する連結原子数の上限は、３７以下であることが好ましく、３１以下であることがより好ましく、２５以下であることがさらに好ましい。
本発明においては、蛍光強度をより優れた蛍光強度が得られる観点から、上記一般式（１－１）で表される化合物であって、Ｒ１１～Ｒ１３の少なくとも１つがアリールオキシ基であって、式（１－１）における２つの複素環が上記条件Ｉを満たし、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つと、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つと、Ｌ１及びＬ２とが、繰り返し数１～５０のエチレンオキシ基を含む化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ４が有する全てのエチレンオキシ基の繰り返し数が１～６（好ましくは１～４）であることがより好ましく、Ｌ１及びＬ２と、連結基ＬＬとにより形成される連結鎖（すなわち、－Ｌ１－ＬＬ－Ｌ２－で表される連結鎖）を構成する最短分子鎖を構成する連結原子数の上限が、上記好ましい範囲以下であることがさらに好ましい。
以下に、本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示すが、本発明はこれらの化合物に限定されない。下記具体例において、スルホ基は、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。下記具体例において、ＥＯｍは以下の構造を示し、Ｍｅはメチル基を示す。ただし、ＥＯｍはインドリン環もしくはインドレニン環の環構成原子、又は、窒素原子もしくは酸素原子に対して、炭素原子側で結合する。
Figure 0007423789000006
Figure 0007423789000007
Figure 0007423789000008
本発明の一般式（１）で表される化合物は、化合物が有する少なくとも１つの生体物質に結合可能な置換基によって、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖及び脂質などの生体物質に結合させることができ、標識生体物質として用いることができる。
生体物質に結合可能な置換基としては、生体物質に作用（付着を含む）もしくは結合するための基であれば、特に制限することなく用いることができ、国際公開第２００２／０２６８９１号等に記載の置換基を挙げることができる。なかでも、ＮＨＳエステル構造（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スクシンイミド構造、マレイミド構造、アジド基、アセチレン基、ペプチド構造（ポリアミノ酸構造）、長鎖アルキル基（好ましくは、炭素数１２～３０）、４級アンモニウム基が好ましく挙げられる。
本発明の一般式（１）で表される化合物のうち、生体物質に結合可能な置換基を少なくとも１つ有する化合物の具体例としては、例えば、後記標識生体物質における例示化合物が挙げられる。また、上記本発明の一般式（１）で表される化合物における例示化合物において、生体物質に結合可能な置換基を後記標識生体物質における例示化合物として示すようにして有する形態も、具体例として挙げられる。なお、本発明はこれらの化合物に限定されない。例えば、これらの具体例において、カルボキシ基及びスルホ基等の解離性の水素原子を有する基については、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。
本発明の一般式（１）で表される化合物は、化合物構造を一般式（１）で規定する構造とすること以外は、公知の方法で合成できる。例えば、特許文献１～３等に記載の方法が挙げられる。
生体物質に結合可能な置換基を有する化合物は、化合物構造を一般式（１）で規定する構造とすること以外は、公知の方法で合成できる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著）を参照することができる。
＜＜標識生体物質＞＞
本発明の標識生体物質は、本発明の一般式（１）で表される化合物と生体物質とが結合した物質である。本発明の一般式（１）で表される化合物は蛍光性を有し、近赤外領域の発色用として適した吸収波長ピークと優れた蛍光強度を示すため、標識生体物質に好ましく用いることができる。一般式（１）で表される化合物と生体物質との結合は、一般式（１）で表される化合物と生体物質とが直接結合した形態でもよいし、連結基を介して連結した形態でもよい。
上記生体物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖及び脂質が好ましく挙げられる。タンパク質としては抗体が好ましく挙げられ、脂質としてはリン脂質、脂肪酸及びステロールが好ましく挙げられ、リン脂質がより好ましい。
上記生体物質のうち、臨床病理的に有用な物質としては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｉｇ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の免疫グロブリン、補体、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、フェリチン、α１マイクログロブリン、β２マイクログロブリン等の血漿タンパク及びそれらの抗体、α－フェトプロテイン、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立線性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）１９－９、ＣＡ‐１２５等の腫瘍マーカー及びそれらの抗体、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）、エストロゲン、インスリン等のホルモン類及びそれらの抗体、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）関連抗原（ＨＢｓ、ＨＢｅ、ＨＢｃ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のウイルス感染関連物質及びそれらの抗体、等が挙げられる。
さらに、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ、梅毒トレポネーマ等のバクテリア及びそれらの抗体、トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニア、トリバノゾーマ、マラリア原虫等の原虫類及びそれらの抗体、ＥＬＭ３、ＨＭ１、ＫＨ２、ｖ６．５、ｖ１７．２、ｖ２６．２（由来マウス１２９、１２９／ＳＶ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ）等のＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）及びそれらの抗体、フェニトイン、フェノバルビタール等の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキニシン等の心血管薬、テオフィリン等の抗喘息薬、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン等の抗生物質等の薬物類及びそれらの抗体、その他の酵素、菌体外毒素（スチレリジンＯ等）及びそれらの抗体等も挙げられる。また、Ｆａｂ’２、Ｆａｂ、Ｆｖ等の抗体断片も用いる事ができる。
本発明の一般式（１）で表される化合物（以下、化合物（１）とも略す。）と生体物質が相互作用して結合した具体的な形態としては、例えば、下記に記載する形態が挙げられる。
ｉ）化合物（１）中のペプチドと生体物質中のペプチドとの非共有結合（例えば、水素結合、キレート形成を含むイオン結合）又は共有結合、
ｉｉ）化合物（１）中の長鎖アルキル基と生体物質中の脂質二重膜及び脂質などとのファンデルワールス力、
ｉｉｉ）化合物（１）中のＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）と生体物質中のアミノ基との反応によるアミド結合、
ｉｖ）化合物（１）中のマレイミド基と生体物質中のスルファニル基（－ＳＨ）との反応によるチオエーテル結合、
ｖ）化合物（１）中のアジド基と生体物質中のアセチレン基とのＣｌｉｃｋ反応又は化合物（１）中のアセチレン基と生体物質中のアジド基とのＣｌｉｃｋ反応によるトリアゾール環の形成、
が挙げられる。
上記ｉ）～ｖ）の形態以外にも、例えば、Ｌｕｃａｓ Ｃ． Ｄ． ｄｅ Ｒｅｚｅｎｄｅ ａｎｄ Ｆｌａｖｉｏ ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｅｒｙ，． Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＢＯＤＩＰＹ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｏｒｂｉｔａｌ： Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１３， Ｖｏｌ ５， Ｎｏ． １， ｐ．６２－８３に記載の形態により結合することができる。また、本発明の標識生体物質の作製においても、同文献に記載の方法等を適宜参照することができる。
以下に、本発明の一般式（１）で表される化合物のうち、生体物質に結合可能な置換基を有する化合物と、これと相互作用により結合する生体物質とから得られる本発明の標識生体物質の具体例を示すが、本発明はこれらの標識生体物質等に限定されない。下記具体例において、スルホ基等の解離性の水素原子を有する基については、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。ＥＯ１及びＥＯ４は、前述の一般式（１）で表される化合物の具体例におけるＥＯ１及びＥＯ４と同義である。
Figure 0007423789000009
Figure 0007423789000010
＜標識生体物質を含む試薬＞
本発明の標識生体物質を含む試薬において、本発明の標識生体物質は、例えば、生理食塩水及びリン酸緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液形態、並びに、微粒子状粉末及び凍結乾燥粉末等の固形形態等、特に制限されることなく、使用目的等に応じてその形態を適宜選択することができる。
例えば、蛍光標識試薬として本発明の標識生体物質を用いる場合に、上記いずれかの形態の標識生体物質を含む試薬として使用することもできる。
＜標識生体物質の用途＞
本発明の一般式（１）で表される化合物から得られる本発明の標識生体物質は、優れた蛍光強度を示すことができ、光照射により励起された標識生体物質から放出される蛍光を安定的に検出することができる。このため、本発明の標識生体物質は、蛍光標識を用いた種々の技術に適用することができ、例えば、多色ＷＢ若しくはドットブロッティングにおける蛍光標識試薬又は生体蛍光イメージング試薬として好適に用いることができる。
本発明の標識生体物質を用いて行う蛍光検出は、通常、以下（ｉ）～（ｉｉｉ）または（ｉｖ）～（ｖｉｉ）の工程を含む。（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を含む蛍光検出は、本発明の化合物で蛍光標識した一次抗体を用いる直接法に該当し、（ｉｖ）～（ｖｉｉ）の工程を含む蛍光検出は、本発明の化合物で蛍光標識した二次抗体を用いる間接法に該当する。
（ｉ）下記（ａ）及び（ｂ）をそれぞれ用意する工程
（ａ）標的とする生体物質（以下、「標的生体物質」とも称す。）を含む試料
（ｂ）上記（ａ）における標的生体物質と結合可能な生体物質（以下、「一次生体物質」とも称す。）と、本発明の化合物と、が結合した本発明の標識生体物質（以下、「本発明の標識生体物質Ａ」とも称す。）
（ｉｉ）上記（ａ）における標的生体物質と、上記（ｂ）の本発明の標識生体物質Ａにおける一次生体物質と、が結合した結合体（以下、「蛍光標識された結合体Ａ」とも称す。）を用意する工程
（ｉｉｉ）上記の蛍光標識された結合体Ａに、本発明の標識生体物質Ａが吸収する波長域の光を照射し、本発明の標識生体物質Ａが発する蛍光を検出する工程
（ｉｖ）下記（ｃ）～（ｅ）をそれぞれ用意する工程
（ｃ）標的生体物質を含む試料
（ｄ）上記（ｃ）における標的生体物質と結合可能な生体物質（以下、「一次生体物質」とも称す。）
（ｅ）上記（ｄ）の一次生体物質と結合可能な生体物質（以下、「二次生体物質」とも称す。）と、本発明の化合物と、が結合した本発明の標識生体物質（以下、「本発明の標識生体物質Ｂ」とも称す。）
（ｖ）上記（ｃ）における標的生体物質と、上記（ｄ）の一次生体物質と、が結合した結合体（以下、「結合体ｂ」とも称す。）を用意する工程
（ｖｉ）上記結合体ｂにおける一次生体物質と、本発明の標識生体物質Ｂにおける二次生体物質と、が結合した結合体（以下、「蛍光標識された結合体Ｂ２」とも称す。）を用意する工程
（ｖｉｉ）上記の蛍光標識された結合体Ｂ２に、本発明の標識生体物質Ｂが吸収する波長域の光を照射し、本発明の標識生体物質Ｂが発する蛍光を検出する工程
上記の標的生体物質と結合可能な生体物質（一次生体物質）、及び、一次生体物質と結合可能な生体物質（二次生体物質）としては、上記本発明の標識生体物質における生体物質が挙げられる。標的生体物質（被検体中の生体物質）又は一次生体物質にあわせて適宜選択することができ、被検体中の生体物質又は一次生体物質に対して特異的に結合可能な生体物質を選択することができる。
上記標的生体物質のうち、タンパク質としては、いわゆる疾患マーカーが挙げられる。疾患マーカーとしては、特に制限はされるものではないが、例えば、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ＩＩ）、ＢＣＡ（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）２２５、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、ＣＡ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＣＡ５４／６１（ＣＡ５４６）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＤＵＰＡＮ－２、エラスターゼ１、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９、γ－セミノプロテイン（γ－Ｓｍ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、Ｉｂａ１、アミロイドβ、タウ、フロチリン、扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ抗原）、シアリルＬｅＸ－ｉ抗原（ＳＬＸ）、ＳＰａｎ－１、組織ポリペプタイド抗原（ＴＰＡ）、シリアルＴｎ抗原（ＳＴＮ）、シフラ（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ：ＣＹＦＲＡ）ペプシノゲン（ＰＧ）、Ｃ－反応性タンパク（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡタンパク（ＳＡＡ）、ミオグロビン、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、トロポニンＴ、心室筋ミオシン軽鎖Ｉ等が挙げられる。
上記標的生体物質は細菌でもよく、この細菌としては、細胞微生物学的検査の対象とされる細菌が挙げられ、特に制限されるものではないが、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、レジオネラ菌、公衆衛生上の問題を生じる菌等が挙げられる。
上記標的生体物質はウイルスでもよく、このウイルスとしては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルスの抗原等の肝炎ウイルス抗原、ＨＩＶウイルスのｐ２４タンパク抗原、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）のｐｐ６５タンパク抗原、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）のＥ６及びＥ７タンパク等が挙げられる。
上記（ｉ）または（ｉｖ）において、標的生体物質を含む試料は、特に制限されることなく、常法に従って調製することができる。
また、本発明の標識生体物質も、特に制限されることなく、標的生体物質と結合可能な生体物質と本発明の化合物とを常法に従って結合させて調製することができる。結合の形態及び結合を形成する反応は、上記本発明の標識生体物質で説明した通りである。
上記（ｖ）において、標的生体物質と一次生体物質とは、直接結合させても、標的生体物質及び一次生体物質とは異なるその他の生体物質を介して結合させてもよい。また、上記（ｖｉ）において、結合体ｂにおける一次生体物質と、本発明の標識生体物質Ｂにおける二次生体物質とは、直接結合させても、一次生体物質及び二次生体物質とは異なるその他の生体物質を介して結合させてもよい。
本発明の標識生体物質は、直接法及び間接法のいずれにおける蛍光標識抗体としても用いることができるが、間接法における蛍光標識抗体として用いることが好ましい。
上記（ｉｉ）または（ｖ）及び（ｖｉ）において、本発明の標識生体物質等と標的生体物質との結合は、特に制限されることなく、常法に従って行うことができる。
上記（ｉｉｉ）または（ｖｉｉ）において、本発明の標識生体物質を励起するための波長は、本発明の標識生体物質を励起可能な発光波長（波長光）であれば特に限定されない。
本発明の化合物（１）のうち、ｎが１である化合物を用いた標識生体物質は、５８５ｎｍ付近（５６０～６２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は５３０～６５０ｎｍが好ましく、５５０～６３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、可視領域における６００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
本発明の化合物（１）のうち、ｎが２である化合物を用いた標識生体物質は、６８５ｎｍ付近（６６０～７２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は６３０～７５０ｎｍが好ましく、６５０～７３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、多色ＷＢ等の近赤外領域における７００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
本発明の化合物（１）のうち、ｎが３である化合物を用いた標識生体物質は、７８５ｎｍ付近（７６０～８２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は７３０～８５０ｎｍが好ましく、７５０～８３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、多色ＷＢ等の近赤外領域における８００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
本発明に用いられる蛍光励起光源としては、本発明の標識生体物質を励起可能な発光波長（波長光）を発光するものであれば特に限定されず、例えば、各種レーザー光源を用いることができる。また、各種光学フィルターを用いて、好ましい励起波長を得たり、蛍光のみを検出したりする事ができる。
上記（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるその他の事項については、特に制限されることなく、蛍光標識を用いる蛍光検出において通常用いられる手法、試薬、装置等の条件を適宜選択することができる。
また、上記（ｉ）～（ｖｉｉ）以外の工程についても、蛍光標識を用いる種々の手法にあわせて、通常用いられる手法、試薬、装置等の条件を適宜選択することができる。
例えば、本発明の標識生体物質を用いた多色ＷＢは、標的生体物質として通常用いられる手法（電気泳動によるタンパク質の分離、メンブレンへのブロッティング、メンブレンのブロッキング）によりブロットメンブレンを作製し、本発明の標識生体物質を標識抗体（好ましくは、二次抗体）として用いることにより、優れた蛍光強度で標的生体物質を検出することができる。本発明の標識生体物質を用いたドットブロッティングについても、多色ＷＢと同様、標的生体物質として通常用いられる手法によりブロットニトロセルロース膜又はブロットＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜等を作製し、本発明の標識生体物質を標識抗体（好ましくは、二次抗体）として用いることにより、優れた蛍光強度で標的生体物質を検出することができる。
－ 置換基群Ｔ －
本発明において、好ましい置換基としては、下記置換基群Ｔから選ばれる置換基が挙げられる。
また、本発明において、単に置換基としてしか記載されていない場合は、この置換基群Ｔを参照するものであり、各々の基、例えば、アルキル基、が記載されているのみの場合は、この置換基群Ｔの対応する基が好ましく適用される。
さらに、本明細書において、アルキル基を環状（シクロ）アルキル基と区別して記載している場合、アルキル基は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を包含する意味で用いる。一方、アルキル基を環状アルキル基と区別して記載していない場合、及び、特段の断りがない場合、アルキル基は、直鎖アルキル基、分岐アルキル基及びシクロアルキル基を包含する意味で用いる。このことは、環状構造を採りうる基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等）を含む基（アルコキシ基、アルキルチオ基、アルケニルオキシ基等）、環状構造を採りうる基を含む化合物についても同様である。基が環状骨格を形成しうる場合、環状骨格を形成する基の原子数の下限は、この構造を採りうる基について下記に具体的に記載した原子数の下限にかかわらず、３以上であり、５以上が好ましい。
下記置換基群Ｔの説明においては、例えば、アルキル基とシクロアルキル基のように、直鎖又は分岐構造の基と環状構造の基とを明確にするため、これらを分けて記載していることもある。
置換基群Ｔに含まれる基としては、下記の基を含む。
アルキル基（好ましくは炭素数１～３０、より好ましくは炭素数１～２０、さらに好ましくは炭素数１～１２、さらに好ましくは炭素数１～８、さらに好ましくは炭素数１～６、特に好ましくは炭素数１～３）、アルケニル基（好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは炭素数２～２０、さらに好ましくは炭素数２～１２、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４）、アルキニル基（好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは炭素数２～２０、さらに好ましくは炭素数２～１２、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４）、シクロアルキル基（好ましくは炭素数３～２０）、シクロアルケニル基（好ましくは炭素数５～２０）、アリール基（単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２～６環の縮環の基）であってもよい。縮環の基である場合、５～７員環等からなる。アリール基は好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～３０、さらに好ましくは炭素数６～２６、特に好ましくは炭素数６～１０）、ヘテロ環基（環構成原子として少なくとも１つの窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子又はセレン原子を有し、単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２～６環の縮環の基）であってもよい。単環の基である場合、その環員数は５～７員が好ましく、５員又は６員がより好ましい。ヘテロ環基の炭素数は好ましくは２～４０、より好ましくは２～２０である。ヘテロ環基は芳香族ヘテロ環基（ヘテロアリール基）及び脂肪族ヘテロ環基（脂肪族複素環基）が包含される。）、アルコキシ基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数１～１２）、アルケニルオキシ基（好ましくは炭素数２～２０、より好ましくは炭素数２～１２）、アルキニルオキシ基（好ましくは炭素数２～２０、より好ましくは炭素数２～１２）、シクロアルキルオキシ基（好ましくは炭素数３～２０）、アリールオキシ基（好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～２６、さらに好ましくは炭素数６～１４）、ヘテロ環オキシ基（好ましくは炭素数２～２０）、ポリアルキレンオキシ基（好ましくは炭素数２～４０、より好ましくは炭素数２～２０）、
アルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数２～２０）、シクロアルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数４～２０）、アリールオキシカルボニル基（好ましくは炭素数６～２０）、アミノ基（好ましくは炭素数０～２０で、無置換アミノ基（－ＮＨ２）、（モノ－又はジ－）アルキルアミノ基、（モノ－又はジ－）アルケニルアミノ基、（モノ－又はジ－）アルキニルアミノ基、（モノ－又はジ－）シクロアルキルアミノ基、（モノ－又はジ－）シクロアルケニルアミノ基、（モノ－又はジ－）アリールアミノ基、（モノ－又はジ－）ヘテロ環アミノ基を含む。無置換アミノ基を置換する上記各基は置換基群Ｔの対応する基と同義である。）、スルファモイル基（好ましくは炭素数０～２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのスルファモイル基が好ましい。）、アシル基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数２～１５）、アシルオキシ基（好ましくは炭素数１～２０）、カルバモイル基（好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのカルバモイル基が好ましい。）、
アシルアミノ基（好ましくは炭素数１～２０）、スルホンアミド基（好ましくは炭素数０～２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのスルホンアミド基が好ましい。）、アルキルチオ基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数１～１２）、シクロアルキルチオ基（好ましくは炭素数３～２０）、アリールチオ基（好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～２６、さらに好ましくは炭素数６～１４）、ヘテロ環チオ基（好ましくは炭素数２～２０）、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基（好ましくは炭素数１～２０）、
シリル基（好ましくは炭素数１～３０、より好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、アリール、アルコキシもしくはアリールオキシが置換したシリル基が好ましい。）、シリルオキシ基（好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、アリール、アルコキシもしくはアリールオキシが置換したシリルオキシ基が好ましい。）、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）、酸素原子（具体的には、環を構成する＞ＣＨ２を＞Ｃ＝Ｏに置き換える）、カルボキシ基（－ＣＯ２Ｈ）、ホスホノ基〔－ＰＯ（ＯＨ）２〕、ホスホリル基〔－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）２〕、スルホ基（－ＳＯ３Ｈ）、ホウ酸基〔－Ｂ（ＯＨ）２〕、オニオ基（環状アンモニオを含むアンモニオ基、スルホニオ基、ホスホニオ基を含み、好ましくは炭素数０～３０、より好ましくは１～２０）、スルファニル基（－ＳＨ）、アミノ酸残基、又は、ポリアミノ酸残基が挙げられる。
また、カルボキシ基、ホスホノ基、スルホ基、オニオ基、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキル基（ｍはＲ１～Ｒ６におけるｍと同義である。）を置換基として有する上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アミノ基、スルファモイル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホンアミド基、アルキルチオ基、シクロアルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基が挙げられる。
置換基群Ｔから選ばれる置換基は、より好ましくは、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、シクロアルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アミノ基、アシルアミノ基、シアノ基又はハロゲン原子であり、特に好ましくは、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、アシルアミノ基又はシアノ基である。
置換基群Ｔから選ばれる置換基は、特段の断りがない限り、上記の基を複数組み合わせてなる基をも含む。例えば、化合物又は置換基等がアルキル基、アルケニル基等を含むとき、これらは置換されていても置換されていなくてもよい。また、アリール基、ヘテロ環基等を含むとき、それらは単環でも縮環でもよく、置換されていても置換されていなくてもよい。
以下に実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。なお、室温とは２５℃を意味する。
実施例で用いた化合物（１）～（７）、比較化合物（１）～（６）を、以下に示す。
なお、実施例化合物において、特に記載しない場合にも、スルホ基は塩構造（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、ＴＥＡ（トリエチルアミン）塩あるいはＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）塩）を含んでいてもよい。ＥＯ１及びＥＯ４は、前述の一般式（１）で表される化合物の具体例におけるＥＯ１及びＥＯ４と同義である。ｍは、平均繰り返し数を意味する。いずれの化合物も、平均繰り返し数の小数第一位が０である化合物を原料として用いて合成した。
Figure 0007423789000011
Figure 0007423789000012
Figure 0007423789000013
以下に、各化合物の合成方法を詳しく説明するが、出発物質、色素中間体及び合成ルートはこれらに限定されるものではない。
以下の合成ルートにおいて、室温とは２５℃を意味する。
特に記載のない場合、逆相カラムクロマトグラフィーにおける担体は、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８（商品名、Ｂｉｏｔａｇｅ社製）またはＳｆａｒ Ｃ１８（商品名、Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を使用し、順相カラムクロマトグラフィーにおける担体は、Ｈｉ－Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ（商品名、山善社製）を使用した。
逆相カラムクロマトグラフィー又は順相カラムクロマトグラフィーにおいて使用する溶離液における混合比は、容量比である。例えば、「アセトニトリル：水＝０：１００→２０：８０」は、「アセトニトリル：水＝０：１００」の溶離液を「アセトニトリル：水＝２０：８０」の溶離液へ変化させたことを意味する。
分取ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、２７６７（商品名、ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。
ＭＳスペクトルは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＳＱＤ ＬＣ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ〔商品名、Ｗａｔｅｒｓ社製、イオン化法：ＥＳＩ（ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、エレクトロスプレーイオン化）〕又はＬＣＭＳ－２０１０ＥＶ〔商品名、島津製作所社製、イオン化法：ＥＳＩ及びＡＰＣＩ（Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＣｈｅｍｉｃａｌＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ、大気圧化学イオン化）を同時に行うイオン化法〕を用いて測定した。
＜化合物（１－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）を合成した。
Figure 0007423789000014
Figure 0007423789000015
１）化合物（１－Ｃ）の合成
窒素置換した５０ｍｌ容の三ツ口フラスコに、ｔｅｒｔ－ブタノール（ｔＢｕＯＨ）２００ｍｌ及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ｔＢｕＯＫ）１２ｇを入れ、攪拌しているところに化合物（１－Ａ）１４．４ｇを滴下し、しばらく攪拌した。次に、ポリエチレングリコールメチルエーテルトシラート（エチレングリコール単位の平均繰り返し数＝４．０、ＴｓＯ－ＥＯ４－Ｍｅ）３６．３ｇを滴下し、８０℃にて１時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、酢酸エチル及び蒸留水で分液操作を施し、蒸留水により粗生成物を抽出した。得られた粗生成物に３０％塩酸水溶液３０ｍｌを加え、１００℃にて３時間撹拌した。その後、溶媒を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝５０／５０→３０／７０）で精製することで、化合物（１－Ｃ）１０．７ｇを得た。
２）化合物（１－Ｅ）の合成
１Ｌ容の三ツ口フラスコに化合物（１－Ｄ）２０ｇ及び蒸留水１２０ｍｌを入れ、攪拌しているところへ、３０％塩酸水溶液４０ｍｌを滴下した。塩氷浴で冷却し、３℃以下を維持しながら、亜硝酸ナトリウム４．２２ｇを蒸留水８０ｍｌに溶かした溶液をゆっくり滴下し、その後０～３℃で４５分間攪拌した。続いて、塩化スズ（ＩＩ）２１ｇを蒸留水６０ｍｌと３０％ＨＣｌ ２０ｍｌに溶解した溶液をゆっくり滴下し、その後４０分間７℃以下で攪拌した。溶媒を濃縮して、残渣をイソプロパノールで洗浄し、化合物（１－Ｅ）１５ｇを得た。
３）化合物（１－Ｆ）の合成
２００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｅ）２．０ｇ、酢酸（ＡｃＯＨ）３０ｍｌ、化合物（１－Ｃ）２．５ｇ及び酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）１．２４ｇを入れ、窒素雰囲気下１４０℃にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→３５／６５）で精製し、化合物（１－Ｆ）１．０ｇを得た。
４）化合物（１－Ｇ）の合成
化合物（１－Ｆ）５００ｍｇ、スルホラン２ｍｌ、６－ブロモヘキサン酸３６５ｍｇ及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）０．１６９ｍｌを５０ｍｌ容のナスフラスコに入れ、１２０℃にて６時間加熱撹拌した。反応液へ、酢酸エチルを加え、沈殿を生じさせた。沈殿物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２０／１００）にて精製し、化合物（１－Ｇ）１０５ｍｇを得た。
５）化合物（１－Ｈ）の合成
２５ｍＬ容のナスフラスコに化合物（１－Ｇ）５０ｍｇ、メタノール（ＭｅＯＨ）１ｍｌを入れた。攪拌しながら、グルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩９ｍｇ、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）８μｌ、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）４μｌを加え、窒素雰囲気下にてしばらく攪拌させた。反応収束後、蒸留水を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→３０／７０）にて精製し、化合物（１－Ｈ）２８ｍｇを得た。
６）化合物（１－Ｋ）の合成
５０ｍＬ容のナスフラスコに化合物（１－Ｉ）７００ｍｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬ、Ｎ，Ｎ’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１．２ｇ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）１ｍＬを入れ、窒素雰囲気下、室温にて１時間撹拌した。そこへ、化合物（１－Ｊ）１．２ｇを加え、室温にてさらに１時間撹拌した。その後、溶媒を濃縮して、酢酸エチル１００ｍＬで抽出し、セライトろ過により不溶物を取り除いた。溶媒濃縮後、ギ酸２０ｍＬを加え、８０℃にて３時間加熱撹拌した。溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２０／８０）で精製し、化合物（１－Ｋ）５２７ｍｇを得た。
７）化合物（１－Ｌ）の合成
１０ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｈ）２０ｍｇ、ＤＭＦ２ｍＬ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＳＴＵ） ８０ｍｇ、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）７７μＬを加え、３時間撹拌した。その後、化合物（１－Ｋ）の１０ｍｇと炭酸ナトリウム３ｍｇを水４０ｍＬで溶かした溶液へ上記反応液を滴下し、その後３時間撹拌した。反応液を濃縮後、分取ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥を施して、化合物（１－Ｌ）１５．１ｍｇを得た。
８）化合物（１）の合成
１０ｍＬ容のナスフラスコに化合物（１－Ｌ）１０．０ｍｇ、ＤＭＦ２ｍＬ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＳＴＵ） ２ｍｇ、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ） ５μＬを加え、３時間反応させた。その後、アミノヘキサン酸 １ｍｇを反応液に加え、その後３時間撹拌した。反応液を濃縮後、分取ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥を施して、化合物（１）６．１ｍｇを得た。化合物（１）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１６６２、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１６６０
９）化合物（１－ＮＨＳ）の合成
化合物（１）２．６ｍｇに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．２８ｍｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート １ｍｇを溶解させたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液、及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）１．３μＬを加えて１時間攪拌させた。その後、溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを加えて上澄みを除去、真空乾燥を施すことで化合物（１－ＮＨＳ）を得た。
＜化合物（２－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）の合成と同様にして化合物（２－ＮＨＳ）を合成した。化合物（２）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１６１４、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１６１２
なお、化合物（２－Ｆ）及び（２－Ｇ）は以下のようにして合成した。
２５ｍＬ容のナスフラスコに化合物（２－Ｄ）２８２ｍｇ、化合物（２－Ｅ）４５．７ｍｇ、酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）５４．７ｍｇ及び無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）２．０ｍＬを加え、窒素雰囲気下、６０℃で２時間攪拌した。反応収束後、蒸留水を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２５／７５）にて精製し、化合物（２－Ｆ）１７４．２ｍｇを得た。
試験管に化合物（２－Ｆ）１０ｍｇ及び蒸留水５００μＬを加え、９５℃で攪拌した。この溶液へ、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム２０ｍｇと水酸化ナトリウム６ｍｇを蒸留水５００μＬに混合した溶液を滴下して、９５℃で３０分撹拌した。反応液を室温に冷却し、分取ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥を施して、化合物（２－Ｇ）５．５ｍｇを得た。
Figure 0007423789000016
Figure 0007423789000017
＜化合物（３－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（２－ＮＨＳ）の合成と同様にして化合物（３－ＮＨＳ）を合成した。化合物（３）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１８５５、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１８５３
Figure 0007423789000018
Figure 0007423789000019
＜化合物（４－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（２－ＮＨＳ）の合成と同様にして化合物（４－ＮＨＳ）を合成した。化合物（４）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１６９５、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１６９３
Figure 0007423789000020
Figure 0007423789000021
＜化合物（５－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（２－ＮＨＳ）の合成と同様にして化合物（５－ＮＨＳ）を合成した。化合物（５）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１７２３、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１７２１
Figure 0007423789000022
＜化合物（６－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（２－ＮＨＳ）の合成と同様にして化合物（６－ＮＨＳ）を合成した。化合物（６）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１５４７、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１５４５
Figure 0007423789000023
＜化合物（７－ＮＨＳ）の合成＞
化合物（４－ＮＨＳ）の合成において、化合物（３－Ｃ）に代えて、下記スキームに基づき合成した化合物（７－Ｂ）を用いた以外は、化合物（４－ＮＨＳ）の合成と同様にして化合物（７－ＮＨＳ）を合成した。化合物（７）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝２２５３、（Ｍ－Ｈ＋）－＝２２５１
Figure 0007423789000024
Figure 0007423789000025
＜比較化合物（１－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（２－ＮＨＳ）と同様に比較化合物（１－ＮＨＳ）を合成した。比較化合物（１）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１２７９、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１２７７
Figure 0007423789000026
＜比較化合物（２－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（２－ＮＨＳ）と同様に比較化合物（２－ＮＨＳ）を合成した。比較化合物（２）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１２０４、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１２０２
Figure 0007423789000027
Figure 0007423789000028
＜比較化合物（３－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（２－ＮＨＳ）と同様に比較化合物（３－ＮＨＳ）を合成した。比較化合物（３）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１７０８、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１７０６
なお、以下において、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルの略称である。
Figure 0007423789000029
Figure 0007423789000030
比較化合物（４）は特許文献１に記載の化合物１１であり、文献記載の方法に従い合成した。比較化合物（４）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝８６４、（Ｍ－Ｈ＋）－＝８６２
比較化合物（５）は特許文献２に記載の化合物２２であり、文献記載の方法に従い合成した。比較化合物（５）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝１１００、（Ｍ－Ｈ＋）－＝１０９８
比較化合物（６）は国際公開第２００１／００２３７４号に記載の化合物１７であり、文献記載の方法に従い合成した。比較化合物（６）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝８８５、（Ｍ－Ｈ＋）－＝８８３
比較化合物（４）、（５）及び（６）の各ＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）化合物は、化合物（１）から化合物（１－ＮＨＳ）を合成する方法と同様にして、合成した。
＜実施例１＞
上記の各化合物について、蛍光標識率、溶液蛍光強度及びメンブレン上蛍光強度を評価した。
［０］蛍光標識抗体の作製
マイクロチューブに、抗ウサギＩｇＧ抗体（２．３ｍｇ／ｍｌ）２１７μＬ及び炭酸塩バッファー２１．７μＬを入れ、振とう撹拌を施した後、化合物（１－ＮＨＳ）のジメチルスルホキシド溶液を、抗体１当量に対して１０当量になるように加え、さらに振とう撹拌を行った。室温にて１時間静置させ、反応液をゲルろ過カラムクロマトグラフィーＰＤ１０（ＧＥヘルスケア ライフサイエンス社製）とＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）を用いて精製を施し、標識抗体（１）を得た。
同様にして、各化合物及び比較化合物の標識抗体を得た。
［１］溶液蛍光強度の評価
上記で調製した標識抗体の溶液を、タンパク質濃度０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、分光蛍光強度計（商品名：ＲＦ－５３００、島津製作所社製）を用いて、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値を算出した。比較化合物（１）－ＩｇＧの蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値を基準値とし、この基準値に対する比（標識抗体の蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値／基準値）を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表１に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
－ 蛍光強度の評価基準 －
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が１．５倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が１．４倍以上１．５倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が１．３倍以上１．４倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．３倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．１倍以上１．２倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．９倍以上１．１倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．９倍未満
Figure 0007423789000031
（表の注）
標識抗体の欄において、化合物（Ｚ）－ＩｇＧ又は比較化合物（Ｚ）－ＩｇＧとの表記は、それぞれ、化合物（Ｚ－ＮＨＳ）のＩｇＧ標識抗体又は比較化合物（Ｚ－ＮＨＳ）のＩｇＧ標識抗体を意味する。Ｚは、各化合物の番号を意味する。以降の表においても同義である。
比較化合物（４－ＮＨＳ）のＩｇＧ標識抗体については、上記方法では標識することができなかったため、上記表中において「－」と示す。これは、水溶性が低く、抗体との反応系中で析出したためと推定される。以降、表２及び３における比較化合物（４）－ＩｇＧに係る蛍光強度の評価「－」についても、同様である。
［２］メンブレン上蛍光強度評価
上記で調製した標識抗体の溶液（抗ウサギＩｇＧ溶液）をタンパク質濃度５．０ｎｇ／ｍＬに調製し、２μＬをニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットした。メンブレンを乾燥後、次いでＴＢＳ－Ｔ中、Ｆｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎブロッキング緩衝液でブロックした。膜を室温で１時間攪拌しながらインキュベートした。ブロッキング溶液を取り除き、標識抗体のＰＢＳ溶液をＴＢＳ（Tris Buffered Saline）で２００００倍希釈した。メンブレンを希釈した溶液に浸し、１時間攪拌しながらインキュベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔ（Tris Buffered Saline with Tween 20）で１０分間、３回洗浄し、最後にＴＢＳで１０分洗浄した。得られたメンブレンを４０℃のホットプレートで１時間乾燥させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥＨＣ社製）を用いて画像化し、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度を算出した。比較化合物（１）－ＩｇＧの蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値を基準値とし、この基準値に対する比（標識抗体の蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値／基準値）を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表２に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
－ 蛍光強度の評価基準 －
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が２．０倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が１．８倍以上２．０倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が１．６倍以上１．８倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．４倍以上１．６倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．４倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．９倍以上１．２倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．９倍未満
Figure 0007423789000032
［３］ドットブロット評価
トランスフェリン（２０ｍｇ／ｍＬ）をＴＢＳ－Ｔで５０ｎｇ／ｍＬに調製し、２μＬをニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットした。メンブレンを乾燥後、次いでＴＢＳ－Ｔ中、Ｆｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎブロッキング緩衝液でブロックした。続いて、ＰＢＳ－Ｔ（Phosphate Buffered Saline with Tween 20）３０ｍＬにウサギ抗ヒトトランスフェリンのポリクローナル抗体６μＬを加え、メンブレンを浸して１時間振とうした。その後、メンブレンを取り出し、ＴＢＳ－Ｔで４回洗浄した。その後、ＴＢＳ－Ｔを３０ｍＬに上記で作製した０．１ｍｇ／ｍＬの標識抗体（抗ウサギＩｇＧ）１５μＬを加え、そこにメンブレンを浸し、室温で１時間攪拌しながらインキュベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔで１０分間／回、３回洗浄し、最後にＴＢＳで１０分洗浄した。得られたメンブレンを４０℃のホットプレートで１時間乾燥させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥＨＣ社製）を用いて画像化し、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度を算出した。比較化合物（１）－ＩｇＧの蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値を基準値とし、この基準値に対する比（標識抗体の蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値／基準値）を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表３に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
－ 蛍光強度の評価基準 －
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が２．０倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が１．８倍以上２．０倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が１．６倍以上１．８倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．４倍以上１．６倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．４倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．９倍以上１．２倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．９倍未満
Figure 0007423789000033
上記表１～３の結果から、以下のことがわかる。
比較化合物（１）は、一般式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとが結合して大員環を形成していない点で、本発明で規定する化合物ではない。比較化合物（２）は、一般式（１）におけるＲ１～Ｒ６及びＲ２２～Ｒ２９の少なくとも１つが繰り返し数１～５０のエチレンオキシ基を有しない点で、本発明で規定する化合物ではない。比較化合物（３）は、一般式（１）における大員環を形成する連結基ＬＬがスルホ基を有する点で、本発明で規定する化合物ではない。これらの比較化合物（１）～（３）を用いた標識抗体は、溶液での蛍光強度、メンブレン上における蛍光強度、ドットブロットでの蛍光強度がいずれも低かった（Ｎｏ．ｃ１１～ｃ１３、ｃ２１～ｃ２３、ｃ３１～ｃ３３）。比較化合物（４）は国際公開第２００５／０００２１８号記載の化合物であり、この比較化合物（４）を用いた場合には、そもそも抗体を標識することができなかった。比較化合物（５）は国際公開第２００６／０４７４５２号記載の化合物であって、比較化合物（６）は国際公開第２００１／００２３７４号記載の化合物であり、これらの比較化合物（５）又は（６）を用いた標識抗体は、溶液での蛍光強度、メンブレン上における蛍光強度、ドットブロットでの蛍光強度がいずれも低かった（Ｎｏ．ｃ１４～ｃ１６、ｃ２４～ｃ２６、ｃ３４～ｃ３６）。
これらに対して、本発明で規定する化合物（１）～（７）の標識抗体は、いずれも、上記比較標識抗体（１）の蛍光強度に対して、溶液状態で１．３倍以上、メンブレン又はドットブロットのいずれの状態でも１．４倍以上の蛍光強度を有し、優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．ｃ１１に対するＮｏ．１０１～１０７、Ｎｏ．ｃ２１に対するＮｏ．２０１～２０７、Ｎｏ．ｃ３１に対するＮｏ．３０１～３０７）。
なかでも、一般式（１）におけるＲ１１～Ｒ１３の少なくとも１つがアリールオキシ基である化合物（２）～（７）を用いた標識抗体は、メンブレン、ドットブロットの状態においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．２０１に対するＮｏ．２０２～２０７、Ｎｏ．３０１に対するＮｏ．３０２～３０７）。また、一般式（１）における２つの複素環がいずれも条件Ｉを満たし、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つと、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つと、Ｒ５及びＲ６とが、繰り返し数１～５０のエチレンオキシ基を含む化合物（３）～（７）を用いた標識抗体は、溶液及びメンブレンの状態において、さらに優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．１０３～１０７、２０３～２０７）。さらにＲ１～Ｒ４が有するエチレンオキシ基の繰り返し数が１～４である化合物（３）～（６）を用いた標識抗体は、Ｒ１～Ｒ４が有するエチレンオキシ基の繰り返し数が１０である化合物（７）を用いた標識抗体に対して、ドットブロットの状態においてもさらに優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．３０３～３０６）。
このように、一般式（１）で表される本発明の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとが連結基ＬＬを介して結合した大員環化合物であって、連結基ＬＬが芳香族炭化水素環、スルホ基及びホスホノ基から選ばれるいずれの基も有さず、Ｒ１～Ｒ６及びＲ２２～Ｒ２９の少なくとも１つが繰り返し数１～５０のエチレンオキシ基を含むことにより、得られる標識生体物質に、溶液、メンブレン、ドットブロットのいずれの状態においても、優れた蛍光強度を付与することができる。
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
本願は、２０２０年７月３０日に日本国で特許出願された特願２０２０－１２９７５４に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (8)

  1. 下記一般式（１）で表される化合物。
    Figure 0007423789000034
     式中、Ｒ１～Ｒ６は、置換基を有していてもよいアルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。ｍは１～５０であって、Ｒ２１は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。
    Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。ただし、Ｒ １１ ～Ｒ １３ の少なくとも１つはアリールオキシ基である。
    Ｒ２２～Ｒ２９は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して縮合環を形成していていてもよい。
    ｎは１～３の整数である。
    ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ２２～Ｒ２５から選ばれる１つと、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６及びＲ２６～Ｒ２９から選ばれる１つとが、連結基ＬＬを介して結合している。連結基ＬＬは原子数１～１００の２価の連結基を示す。ただし、連結基ＬＬは、芳香族炭化水素環、スルホ基及びホスホノ基から選ばれるいずれの基も有さない。
    Ｒ１～Ｒ６及びＲ２２～Ｒ２９の少なくとも１つは－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。ｍは、前記ｍと同義である。
    前記式（１）で表される化合物は中性の化合物であり、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を少なくとも１つ含んでいる。
  2. 下記一般式（１－１）～（１－３）のいずれかで表される、請求項１に記載の化合物。
    Figure 0007423789000035
     式中、Ｌ１～Ｌ６は、アルキレン基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊を示す。＊は連結基ＬＬとの結合位置を示す。
    Ｒ７及びＲ８は、置換基を有していてもよいアルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。
    Ｒ１～Ｒ６、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２１～Ｒ２９、ＬＬ、ｍ及びｎは、前記のＲ１～Ｒ６、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２１～Ｒ２９、ＬＬ、ｍ及びｎと同義である。
  3. 前記のＬ１～Ｌ６のそれぞれが、ｍ＝１～５０であって、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む、請求項２に記載の化合物。
  4. 前記連結基ＬＬが、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する、２価の連結基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  5. 前記一般式中における２つの複素環がいずれも、下記条件Ｉを満たす、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
    （条件Ｉ）
    複素環の環構成原子であるｓｐ３炭素原子上の少なくとも１つの置換基と、複素環の環構成窒素原子上の置換基とが、ｍ＝１～５０であって、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。
  6. 前記連結基ＬＬにおけるＲ１～Ｒ６、Ｒ２２～Ｒ２９又はＬ１～Ｌ６との連結部が、－Ｏ－基、－Ｓ－基、－ＮＲ５０－基、－ＣＯＯ－基又は－ＣＯＮＲ５０－基である、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。ただし、Ｒ５０は水素原子又はアルキル基である。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物と生体物質とが結合してなる標識生体物質。
  8. 前記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである請求項７に記載の標識生体物質。
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