JP2007510031A - シアニン色素標識用試薬 - Google Patents

Abstract

生物材料及び他の材料を標識且つ検出するのに有用なシアニン色素を開示する。色素は、式（Ｉ）
【化１】

［式中、Ｒ^３及びＲ^４基はＺ^１環構造に結合し、Ｒ^５及びＲ^６基はＺ^２環構造に結合し、ｎ＝１、２、又は３であり、Ｚ^１及びＺ^２は独立に、１環、又は２環縮合芳香族系を完結するのに必要な炭素原子を表し、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７基の少なくとも１つは、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは、単結合又はスペーサ基であり、Ｆは、目標結合基である）であり、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基の１以上は独立に、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗは、スルホン酸又はホスホン酸であり、ｋは、１〜１０の整数である）から選択される］を有する。色素を蛍光標識用途で使用することができ、インドリニウム環の３位に結合させた１個、好ましくは複数の水溶性基が存在すると、色素−色素相互作用が低減し、したがって色素−色素の消光が低減し、具体的には複数の色素分子が、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、及び抗体などの成分に結合する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、標識用試薬、特に１以上の水溶性基を結合させた反応性シアニン色素の分野、及びこのような色素の利用方法に関する。

蛍光標識は、マイクロアレイ解析において選抜きの検出手段として確立されている。蛍光色素で標識された核酸プローブを生成するためのいくつかの異なる方法が存在する。これらには、逆転写酵素系を使用した、色素で標識したヌクレオチドのｃＤＮＡへの直接組込みが含まれる。一代替法は、間接標識手法であり、化学的に反応するヌクレオチド類似体（例えば、アミノアリル−ｄＵＴＰ）又はビオチン化ヌクレオチド類似体を利用し、合成中にファーストストランドｃＤＮＡに組み込み、続いて修飾ヌクレオチドに共有結合又は非共有結合する反応性又は親和性色素標識で後標識する。マイクロアレイ解析での後標識戦略は、特に低発現目標用の改善された検出感度を提供する可能性を有し、より少ないｍＲＮＡの使用を可能にする。しかし、核酸分子の化学的標識を介した、又はアビジン若しくはストレプトアビジンコンジュゲートの使用を介した多重標識の使用により得ることができるなど、超高感度検出方法が依然として必要とされている。

シアニン色素は、他の蛍光色素に勝るいくつかの利点を提供する。シアニン色素の励起及び発光スペクトルは、４５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視及び近赤外スペクトルに及ぶ。さらに、シアニン色素は、非常に高い消衰係数、有利な量子収率、及び良好な光安定性を有することを特徴とする。例えば、米国特許第６０４８９８２号、第５２６８４８６号、第５５６９５８７号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ）を参照のこと。後標識は、ｃＤＮＡ又はストレプトアビジンへのシアニン色素の高レベルの組込みを生じることができるが、溶液中又は固液界面である種の色素が自己会合し、蛍光量子収率の低下を生じる傾向がある（Ｍｉｓｈｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，（２０００），１００（６），１９７３−２０１２；Ｇｒｕｂｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２０００），１１，６９６−７０４）。

国際公開第０２／２６８９１号（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）は、インドリニウム環の３位の置換基として化学的に反応する基又は抱合を受けた物質が含まれる少なくとも１つの置換インドリニウム環系が存在する修飾カルボシアニン色素、及び目標材料を有するそのコンジュゲートを記述している。国際公開第０２／２６８９１号による修飾色素は、シアニン色素の自己会合する（即ち、積層する）傾向を克服していると報告され、修飾色素で標識された色素コンジュゲートは、構造的に同様なカルボシアニン色素で標識されたコンジュゲートより蛍光性であると報告されている。

米国特許第６０８３４８５号（Ｌｉｃｈａ ｅｔ ａｌ）は、下記の構造を有する色素：

［但し、Ｘ及びＹ基には−Ｃ（ＣＨ_２Ｒ^３２）（ＣＨ_２Ｒ^３３）基が含まれ、Ｒ^２０〜Ｒ^２９、Ｒ^３２、及びＲ^３３基は、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、カルボキシアルキル、最高１０個の炭素原子を含むアルコキシカルボニル若しくはアルコキシオキソアルキル残基、又は最高４個の炭素原子を含むスルホアルキル残基を含める基で置換することができる］を使用する近赤外線（ＮＩＲ）に基づいたｉｎ−ｖｉｖｏ診断方法に関する。

特開平５−３１３３０４（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）は、複数のスルホネート基を含み、次の式で表される色素：

［式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、アルキルカルボキシレート又はアルキルスルホネート部分とすることができる］を組み込んだ銀塩写真感光材料を開示している。
米国特許第６０４８９８２号明細書 米国特許第５２６８４８６号明細書 米国特許第５５６９５８７号明細書 国際公開第０２／２６８９１号パンフレット 米国特許第６０８３４８５号明細書 特開平５−３１３３０４号公報 Ｍｉｓｈｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，（２０００），１００（６），１９７３−２０１２ Ｇｒｕｂｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２０００），１１，６９６−７０４ Ｈａｍｅｒ，Ｆ．Ｍ．，"Ｔｈｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ"，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９６４）

従来技術文献はどれも、インドリニウム環系の３位に結合させた１以上のスルホン酸又はホスホン酸水溶性基を有し、目標材料の直接共有結合又は非共有結合標識に適した少なくとも１個の基も設けられているシアニン色素を具体的には記述していない。新規クラスのシアニン色素標識用試薬は、生物材料及び他の材料を標識且つ検出するのに有用であることが今回判明した。インドリニウム環の３位に結合させた１個、好ましくは複数の水溶性基が存在すると、具体的には複数の色素分子が、核酸、タンパク質、抗体などの成分に結合する色素−色素相互作用が低減することが判明した。その結果、通常は多重標識された成分に関連し、色素−色素の積層による蛍光強度の低下が、最小限に抑えられる。

したがって、第１の態様では、式（Ｉ）の化合物が提供される。

式中、
Ｒ^３及びＲ^４基はＺ^１環構造に結合し、Ｒ^５及びＲ^６基はＺ^２環構造に結合し、ｎ＝１、２、又は３であり、
Ｚ^１及びＺ^２は独立に、１環、又は２環縮合芳香族系を完結するのに必要な炭素原子を表し、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７基の少なくとも１つは、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは、単結合、又は炭素、窒素、及び酸素原子からなる群から選択される原子を１〜２０個連結させた鎖を有するスペーサ基であり、Ｆは、目標結合基である）であり、
Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基の１以上は独立に、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗは、スルホン酸又はホスホン酸であり、ｋは、１〜１０の整数である）から選択され、
Ｒ^１及びＲ^２基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^１及びＲ^２基は独立に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、非置換ベンジル又はスルホン酸置換ベンジル、及び−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基は独立に、水素及びスルホン酸から選択され、
Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４のいずれかが前記−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基でない場合、前記残りのＲ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基が独立に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
残りのＲ^７基は、水素であり、或いはＲ^７の２つが次の基

とともに、５又は６個の原子を有する炭化水素環系を形成する。

適切には、第１の態様による化合物は、色素発色団の一形式電荷（又は、複数の電荷）と釣り合うように正又は負とすることができる１以上の対イオンを含む。対イオンの性質は、本発明に重要なものではなく、ＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋、トリフルオロアセテート（Ｆ_３Ｃ−ＣＯ_２ ⁻）、パークロレート（ＣｌＯ_４ ⁻）、Ｂｒ⁻、又はＩ⁻など知られている多数のイオンのうちの１つとすることができる。本発明の状況では、「スルホン酸」及び「ホスホン酸」という用語にはそれぞれ、「スルホネート」及び「ホスホネート」基が親酸のイオン化した形であるのでこれらも含まれることを理解されたい。

適切には、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基の少なくとも２つは、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基である。好ましい一実施形態では、Ｒ^１１及びＲ^１２基の１つ、並びにＲ^１３及びＲ^１４基の１つは、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）である。これらの実施形態では、残りのＲ^１１又はＲ^１２基、及びＲ^１３又はＲ^１４基は、好ましくはメチルである。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、Ｗがスルホン酸であるものである。好ましくは、ｋは３又は４である。特に好ましい−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗは、−（ＣＨ_２）_３−ＳＯ_３Ｈ及び−（ＣＨ_２）_４−ＳＯ_３Ｈから選択される。

適切には、Ｒ^１及びＲ^２基のいずれかが、前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^１及びＲ^２基は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、非置換ベンジル又はスルホン酸置換ベンジル、及び−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）から選択することができる。好ましくは、前記残りのＲ^１及びＲ^２基は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、スルホベンジル、及び−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基から選択することができる。好ましいアルキル基は、メチル及びエチルである。

第１の態様による色素では、Ｒ^７が−Ｅ−Ｆ基で置換されている場合、メソ位で置換されていることが好ましく、これはヘテロ環構造を連結するポリメチン鎖の中央のＲ^７基を目標結合基で置換できることを意味する。ポリメチン鎖に存在する残りのＲ^７基は水素である。

適切には、Ｚ^１及びＺ^２は独立に、フェニル及びナフチルから選択される。表１に、１つ又は２つの縮合環芳香族系を有する式（Ｉ）の化合物によるシアニン色素の具体例を、構造（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）で示す。

表２に、Ｒ^７基が炭化水素環系を形成する化合物の例は、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）構造で示す。構造（ＩＩ）〜（ＶＩＩＩ）では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４基、及びｎは、本明細書の上記に定義されているようなものである。

連結部分Ｅは、目標結合基Ｆを式（Ｉ）による化合物の発色団部分に連結する。一実施形態では、目標結合基Ｆを色素のＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、又はＲ^７位に直接結合させることができ、この場合、Ｅは、単一の共有結合である。別の好ましい実施形態では、目標結合基Ｆは、スペーサ基を介して間接的に色素のＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、又はＲ^７位に共有結合することができる。この実施形態では、Ｅは、炭素、窒素、及び酸素原子を含む原子を１〜２０個連結させた直鎖又は枝分れ鎖であることが適切である。好ましくは、スペーサ基Ｅは、
−（ＣＨＲ’）_ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ’）_ｒ−
（式中、Ｑは、−ＣＨＲ’−、−ＮＲ’−、−Ｏ−、−ＣＲ’＝ＣＲ’−、−Ａｒ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ’−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−から選択され、Ｒ’は、水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、ｐは、０〜５であり、ｒは、１〜５である）から選択される。

特に好ましいリンカーは、Ｑが−ＣＨＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、及び

（式中、Ｒ’は本明細書の上記に定義されている）から選択されるものである。

本発明による色素は、少なくとも１つ、通常は２つ以下、好ましくは１つの−Ｅ−Ｆ基を含む。一実施形態では、目標結合基Ｆは、目標成分の相補的基と反応し、色素と成分との共有結合を形成する基である。この実施形態では、結合基の選択は、標識対象の成分で利用可能な基に依存し、したがって当業者によく知られている。例えば、目標結合基は、適切な条件下で成分の相補的官能基と反応することができる反応性基とすることができる。タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などの成分中に存在する官能基の例には、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、（アルデヒド及びケトンを含めて）カルボニル、及びチオホスフェートが含まれる。或いは、目標結合基Ｆは、官能基とすることができ、目標は、色素の官能基が適切な条件下で目標成分の反応性基と反応することができる反応性構成成分を含み、又はそれを含むように誘導体化することができる。どちらの場合も、成分は、式（Ｉ）による色素で標識される。適切には、反応性基Ｆは、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、及びホスホルアミダイトから選択することができる。好ましくは、反応性基は、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、又はホスホルアミダイトである。Ｆが官能基である場合、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、（アルデヒド及びケトンを含めて）カルボニル、及びチオホスフェートから選択されることが適切である。これらの反応性及び官能性の基によって、式（Ｉ）の化合物は、目標成分と反応し、それに共有結合する。

表３に、式（Ｉ）による化合物の反応性基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７、並びにＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７基が反応することができる基の例を挙げる。代替形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７は、目標成分の反応性基と反応するはずである表３の官能基とすることができる。

特に目標成分を利用可能なアミノ及びヒドロキシル官能基で標識するのに有用な特に好ましい反応性基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７には、下記が含まれる。

目標成分を利用可能なチオール官能基で標識するのに有用である特に好ましい反応性基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７には、下記が含まれる。

−Ｅ−Ｆ基の特に好ましい例は、カルボキシペンチル基Ｅを含むもの、例えば下記である。

別の実施形態では、目標結合基Ｆは、その相補的な特異的結合パートナーと特異的に非共有結合することができる親和性タグとすることができる。特異的結合パートナーの対の例には、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ニトリロ三酢酸（例えば、Ｎｉ^２＋：ＮＴＡ）とのポリヒスチジンタグ−金属イオン錯体が含まれるが、これらに限定されない。相補的な特異的結合パートナーは、目標成分検出のための標識化錯体の１成分とすることができる。したがって、好ましい一標識化形式では、ビオチン標識用の結合部位を４つ有するストレプトアビジンを、目標成分のビオチン基を本発明による色素に連結するブリッジとして使用することができ、Ｆ基は、ビオチン、イミノビオチン、又はデスチオビオチンである。本発明の状況では、互いに他方に対する特異的結合親和性を所有する２つの原子又は分子を使用できることを理解されたい。親和性タグの好ましい例は、ビオチン、イミノビオチン、及びデスチオビオチンから選択される。

別の実施形態では、本発明のシアニン蛍光色素は、１以上の追加のスルホン酸基を含むことができる。一実施形態では、１以上のスルホン酸基は、Ｚ^１及び／又はＺ^２環構造に直接結合できることが適切である。一代替実施形態では、Ｒ^１及び／又はＲ^２位をスルホベンジル又は−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）で直接置換することができる。この実施形態では、色素を、場合によってはさらにＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６位に直接結合させた１以上のスルホン酸基で置換することができる。したがって、本発明による色素は、最高５以上のスルホン酸基、好ましくは３〜５個のスルホン酸基で置換することができる。３個以上のスルホン酸基で置換された、生物目標分子を標識するためのシアニン色素を使用すると、色素−色素の凝集が低減し、励起状態の相互作用が無視でき、したがって色素−色素の消光及び蛍光の損失が最小である目標生成物が生じる。本発明の好ましい色素でそのように標識した分子の蛍光発光強度は、共有結合した色素の数に伴って増大する。さらに、色素分子の総電荷の増大に加えて、インドリニウムの３位をスルホン酸基で置換すると、立体的大きさも増やし、それによって色素−色素の凝集の低減に寄与する。

ハロゲン及びハロ基は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される。

表４に示すように、下記は本発明によるシアニン色素のより特有の例である。

構造（ＩＸ）、（Ｘ）、及び（ＸＩ）では、ｎ＝１、２、又は３であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^５基の少なくとも１つは、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅ及びＦは、本明細書の上記に定義されている）であり、
Ｒ^１及びＲ^２基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^１及びＲ^２基は独立に、メチル、エチル、及び−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ（式中、Ｗは、スルホン酸であり、ｋは、３又は４である）から選択され、
Ｒ^３及びＲ^５のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^３及びＲ^５基は独立に、水素及びスルホン酸から選択され、好ましくはスルホン酸である。

構造（ＩＸ）、（Ｘ）、及び（ＸＩ）では、−Ｅ−Ｆ基は、適切にはアルキルカルボン酸のスクシンイミジルエステル誘導体、好ましくは５−カルボキシペンチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、又は５−カルボキシペンチル、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミジルエステルである。

本発明の第１の態様による色素の具体例は、以下のとおりである。

ｉ）２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル｝−３−メチル−５−スルホ−３−｛４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル｝−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート；
ｉｉ）２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート；
ｉｉｉ）２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート；
ｉｖ）２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−［５−（カルボキシメチル）−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート；及び
ｖ）１−ベンジル−２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル）−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート。

本発明は、少なくとも本明細書の上記に定義されているようなＲ^１〜Ｒ^７位に結合させたＦ基を含めて、本発明の化合物を使用して、標識し、それによって蛍光特性を目標成分に与えることができる標識方法にも関する。特に、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体などの生物分子の多重標識及び検出のために使用することができる。したがって、第２の態様では、成分の標識方法であって、
ｉ）前記成分を、式（Ｉ）の化合物：

［式中、
Ｒ^３及びＲ^４基はＺ^１環構造に結合し、Ｒ^５及びＲ^６基はＺ^２環構造に結合し、ｎ＝１、２、又は３であり、
Ｚ^１及びＺ^２は独立に、１環、又は２環縮合芳香族系を完結するのに必要な炭素原子を表し、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７基の少なくとも１つは、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは、単結合、又は炭素、窒素、及び酸素原子からなる群から選択される原子を１〜２０個連結させた鎖を有するスペーサ基であり、Ｆは、目標結合基である）であり、
Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基の１以上は独立に、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗは、スルホン酸又はホスホン酸であり、ｋは、１〜１０の整数である）から選択され、
Ｒ^１及びＲ^２基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^１及びＲ^２基は独立に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、非置換ベンジル又はスルホン酸置換ベンジル、及び−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基は独立に、水素及びスルホン酸から選択され、
Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４のいずれかが前記−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基でない場合、前記残りのＲ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基が独立に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
残りのＲ^７基は、水素であり、或いはＲ^７の２つが次の基

とともに、５又は６個の原子を有する炭化水素環系を形成する］と接触させるステップと、
ｉｉ）前記蛍光色素を、前記成分に結合させ、それによって標識するのに適した条件下で前記成分とインキュベートするステップとを含む方法が提供される。

一実施形態では、目標結合基Ｆは、本明細書の上記に定義されている反応性又は官能性の基など、式（Ｉ）の化合物と目標成分との共有結合の形成に適した基とすることができる。代替形態では、目標結合基Ｆは、親和性タグ、例えばビオチン、デスチオビオチン、又はイミノビオチンであり、色素を非共有結合性会合によって目標に結合させる。方法は、標識対象の成分とある量の本発明による化合物を、色素が成分に結合するような条件下でインキュベートするステップを含む。目標成分との色素コンジュゲート又は錯体の形成方法は、当業者に周知である。例えば、タンパク質の共有結合標識は、通常は水性緩衝媒体、適切には重炭酸塩中、ｐＨ９．０、室温で通常は１時間行う。反応は、通常は暗所で実施する。標識タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、例えば固定相としてＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）、溶離液としてリン酸塩緩衝剤、ｐＨ７．０を使用して、未反応の色素から分離することができる。目標生体分子の多重標識では、色素と目標材料の量又は濃度の比をそれに応じて調整すべきである。適切な目標生物成分には、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物；アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、及びカルボキシル、及びチオホスフェート基のうちの１以上を含む、又はそれを含むように誘導体化されたヌクレオチド；アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、及びチオホスフェート基のうちの１以上を含む、又はそれを含むように誘導体化されたオキシ又はデオキシポリ核酸；微生物材料、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜、並びに毒素からなる群が含まれるが、これらに限定されない。

上記の一段階標識方法に加えて、本発明は、二段階標識方法にも関する。第１段階で、本発明による色素を、抗体、タンパク質、ＤＮＡプローブなど一次成分に結合させ、それによって標識する。次いで、標識方法の第２段階で、蛍光標識された一次成分を、抗体が特異的になる抗原など二次成分の検出用プローブとして使用する。

本発明の化合物を使用して、系中の特定のタンパク質又は他の成分の濃度を決定することもできる。プローブと反応することができるタンパク質の反応性基の数がわかっている場合、１分子当たりの蛍光性を知ることができ、系中のこれらの分子の濃度を系の全蛍光強度により決定することができる。この特定の方法を用いて、マイクロタイタープレートリーダー又は他の知られている免疫蛍光検出システムを使用して様々な標識分析物の濃度を測定することができる。蛍光標識された材料の濃度は、例えば蛍光偏光検出機器を使用して決定することもできる。

本発明の化合物は、抗体など様々な複数の一次成分に複数の蛍光色素を共有結合させる検出方法で使用することもでき、二次成分の混合物中の複数の二次成分をそれぞれ特定するために、一次成分はそれぞれ、抗原など異なる二次成分に特異的である。役に立つこの方法によれば、一次成分をそれぞれ、他の一次成分を標識するために使用する色素分子に比べて、異なる光吸収及び発光波長特性を有する蛍光色素で別々に標識する。次いで、標識された一次成分を、抗原などの二次成分を含有する調製物に添加し、一次成分を、それが選択的である二次成分にそれぞれ結合させる。

未反応のプローブ材料は、分析への干渉を防ぐため、例えば洗浄によって調製物から除去することができる。次いで、調製物を、特定の蛍光化合物の吸収波長を含めて、様々な励起波長にかける。次に、蛍光顕微鏡、又は励起波長の光線を選択し蛍光波長を選択するためのフィルタ若しくはモノクロメータを有するフローサイトメータや蛍光分光光度計など他の蛍光検出システムを使用して、使用する蛍光化合物に対応する発光波長の強度、特定の標識一次成分と結合した二次成分の量を指示する蛍光強度を決定する。多パラメータの蛍光研究を行うための知られている技法には、例えば多パラメータのフローサイトメトリーが含まれる。いくつかの場合には、単一励起波長を使用して、それぞれが異なる波長において蛍光を発する混合物中の２つ以上の材料からの蛍光を励起させることができ、各標識種の量は、そのそれぞれの発光波長におけるその個別の蛍光強度を検出することによって測定することができる。望むなら、光吸収方法を使用することもできる。

本発明の検出方法は、蛍光一次成分の作製が可能である任意の系に適用することができる。例えば、適切に反応する蛍光化合物をＤＮＡ又はＲＮＡ断片に抱合させ、次いで得られたコンジュゲートを、ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的目標ストランドに結合させることができる。次いで、適切な蛍光検出装置を使用して、結合した蛍光コンジュゲートの存在を検出することができる。

本発明は、
ａ）式（Ａ）を有する第１の中間体化合物：

［式中、Ｚ^１、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、本明細書の上記に定義されている］と、
ｂ）第１の中間体化合物と同じでも異なってもよく、式（Ｂ）を有する第２の中間体化合物：

［式中、Ｚ^２、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^１３、及びＲ^１４は、本明細書の上記に定義されている］と、
ｃ）第１の化合物と第２の化合物との結合の形成に適した第３の化合物（Ｃ）とを反応させるステップを含む方法によって適切に調製される式（Ｉ）の色素を調製するのに有用な中間体及び方法に関する。但し、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基のうちの少なくとも１つが、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅ及びＦは、本明細書の上記に定義されている）であり、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基のうちの１以上が独立に、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗは、スルホン酸及びホスホン酸基から選択され、ｋは、１〜１０の整数である）から選択されることを条件とする。

好ましくは、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗは、−（ＣＨ_２）_３−ＳＯ_３Ｈ及び−（ＣＨ_２）_４−ＳＯ_３Ｈから選択される。

この方法に従って、中間体化合物（Ａ）、（Ｃ）、及び（Ｂ）を単一段階又は多段階の方法で反応させて、式（Ｉ）の化合物を形成することができる。構造（Ａ）及び（Ｂ）が同じである式（Ｉ）の対称化合物は、２モル比の式（Ａ）（又は（Ｂ））の化合物を、１、３、又は５個の炭素原子を含み、本明細書の上記に定義されているＲ^７を形成するための基で置換された適切なビス官能性メチン断片と反応させることによって適切に調製することができる。例えば、トリメチンシアニン色素類似体を調製するための第３の化合物（Ｃ）として、置換Ｎ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン、又はオルトエステルを使用する。対応する方式で、ペンタメチンシアニン色素類似体を調製するには、適切に置換されたマロンジアルデヒドジアニルを使用し、ヘプタメチンシアニン色素類似体を調製するには、グルタコン酸アルデヒドを使用することができる。反応は、通常はピリジンなどの有機溶媒中で実施し、還流するまで加熱する。続いて、混合物を冷却し、エーテルなどの有機溶媒に注ぎ込む。得られる固体又は半固体を、一連のメタノール／クロロホルム溶媒を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。

構造（Ａ）及び（Ｂ）が異なる式（Ｉ）の非対称化合物は、二段階方法で好都合に調製することができる。この方法では、まず式（Ａ）のインドリニウム化合物と、結合形成に適した化合物、例えば適切に置換されたＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン又はマロンアルデヒドジアニルを無水酢酸の存在下で反応させて、２−アニリノビニル又は４−アニリン−１，３−ブタジエニル第四級塩を形成することによって中間体化合物を形成する。中間体第四級塩と、第２の２−メチルインドリニウム第四級塩を反応させて、式（Ｉ）の化合物を得ることができる。ヘテロ環系を接合させるポリメチン結合を形成するための代替中間体は知られており、例えばＨａｍｅｒ，Ｆ．Ｍ．，“Ｔｈｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９６４）に記載されている。

本発明のいくつかの色素は、当業者によく知られている方法によって他の色素に転換するための中間体として有用となり得ることが容易に理解されよう。本発明の色素は、本明細書に開示する方法によって合成することができる。特定の有用性を有する化合物の誘導体は、適切な前駆体を選択し、又は得られた化合物を官能基が様々な位置に含まれるように知られている方法によって修飾することによって調製する。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７基は、本発明の色素が様々な波長特性を有するように選択し、それによって多パラメータの解析で使用することができるいくつかの関連色素を提供することができ、単一の試料中の様々な化合物の存在及び量を、いくつかの検出蛍光発光の波長に対して識別することができる。

Ｃｙ（商標）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄの商標である。

下記の実施例及び図面によって、本発明をさらに説明する。

１． ２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（化合物１）

１．１： ５−（エトキシカルボニル）−５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸ナトリウム
水素化ナトリウム（６０重量％、１２ｇ≡０．３モル ＮａＨ）を乾燥ＤＭＦ（１００ｍｌ）中でスラリー化した。得られた懸濁液を攪拌下０℃に冷却した。これに、２−メチルアセト酢酸エチル（５０ｇ、０．３４６モル）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を、温度が＜１０℃に維持され、泡立ちが制御されるように滴下した。添加が終了し、水素発生が止むと、混合物を、透明な薄黄色溶液が生じるまで温水浴中で温めた。これを再び０℃に冷却した。１，４−ブタンスルトン（４５ｇ、０．３３モル）のＤＭＦ（２５ｍｌ）の溶液を、温度を＜１０℃に維持しながら１５分間かけて添加した。添加が終了すると、混合物を５０℃で１６時間加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発乾固し、残渣を水とジエチルエーテルに分配した。水層を保持し、有機層を新たな水で抽出し、次いで廃棄した。抽出水溶液を合わせて、新たなエーテルで洗浄し、次いで真空下で蒸発させて、ワックス質固体の生成物を得た。

^１Ｈ−ｎｍｒ（Ｄ_２Ｏ）δ４．２３（２Ｈ，ｑ）、２．９（２Ｈ，ａｐｐ ｔ）、２．２６（３Ｈ，ｓ）、２．０〜１．６（６Ｈ，ｍ）、１．３６（３Ｈ，ｓ）及び１．２６（３Ｈ，ｔ）。

１．２： ５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸
ＴＬＣが反応の終了を示唆するまで（約３時間）、上記の材料を濃塩酸（２００ｍｌ）中９０℃で加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、エタノール／ジクロロメタン混合物）によって精製して、５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸４９．６ｇを得た。

^１Ｈ−ｎｍｒ（Ｄ_２Ｏ）δ２．９（２Ｈ，ａｐｐ ｔ）、２．６８（１Ｈ，ｍ）、２．２（３Ｈ，ｓ）、１．８〜１．３（６Ｈ，ｍ）及び１．１８（３Ｈ，ｄ）。

１．３： ２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸

４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（７．５ｇ）、５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（１１．０ｇ）、及び酢酸（５０ｍｌ）を、窒素中６時間加熱還流し、その間、懸濁固体は全部溶解した。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を２−プロパノールで８０℃で粉砕して、薄茶色固体の懸濁液を得た。混合物を室温に放冷し、固体をろ過で収集し、２−プロパノール及びジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。ＨＰＬＣにより、２７０ｎｍにおいて検出された主ピークを収集して、生成物を精製した。（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ １５μ、Ｃ１８ ３００Ａ、２５０×５０ｍｍ、１００ｍｌ／分、実施１回当たり０．５ｇ、定組成溶離液 水＋０．１％ＴＦＡ）。生成物画分を貯留し、蒸発させて、１１．１ｇを得た。

紫外／可視（水＋０．１％ＴＦＡ）：２６９、２２９ｎｍ
^１Ｈ−ｎｍｒ（Ｄ_２Ｏ）δ０．９（２Ｈ，ｍ）、１．６（３Ｈ，ｓ＋２Ｈ，ｍ）、２．１５（２Ｈ，ｍ）、２．７５（２Ｈ，ｍ）、２．８（ＣＨ_３の一重項は大部分交換）、７．８（１Ｈ，ｄ）、８．０（１Ｈ，ｄｄ）及び８．１（１Ｈ，ｄ）。ＬＣ−ＭＳ：実測値３６２。ＭＨ^＋＝Ｃ_１４Ｈ_２０ＮＯ_６Ｓ_２の計算値３６２。

１．４： ２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二ナトリウム

２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３．６ｇ、９．８ミリモル）を水（５０ｍｌ）に溶解した。得られる溶液を酢酸ナトリウムで、ｐＨ約７に中和し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。粘性の残渣をメタノールと共蒸発させ、次いでエーテルで粉砕して、細かい固体を得た。これを高真空下で五酸化リンを用いて乾燥して、表題の二ナトリウム塩を得、精製せずに直接使用した。

^１Ｈ−ｎｍｒ（Ｄ_２Ｏ）δ０．６〜０．８（２Ｈ，ｍ）、１．４（３Ｈ，ｓ）、１．６（２Ｈ，ｍ）、１．９〜２．１５（２Ｈ，広幅ｍ＋ｓアセテート）２．３５（ＣＨ_３の一重項は大部分交換）、２．７５（２Ｈ，ａｐｐ ｔ）、７．６（１Ｈ，ｄ）及び７．８３（２Ｈ，ｍ）。

１．５： １−エチル−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート塩

２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二ナトリウム（１ｇ）、ｐ−トルエンスルホン酸エチル（０．９５ｍｌ；５．５６ミリモル）、及びテトラメチレンスルホン（１０ｍｌ）を一緒に、１４０℃で１２時間加熱した。ＴＬＣ（シリカ；２：１ ＭｅＯＨ；ＥｔＯＡｃ）は、新規生成物スポット（ｒｆ＝０．８）が形成し、静止するとすぐに赤紫色になったことを示した。生成物を酢酸エチルに投入し、次いで濾別し、真空乾燥して、濃紫色固体の粗生成物１．５ｇを得た。生成物をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ タンパク質 ＆ ペプチド Ｃ１８（２５０ｍｍ×２５ｍｍ）；流量１０ｍｌ／分；グラジエント ０→２５％ Ｂ、３０分；溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、及び溶離液Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ；検出２２０ｎｍ）によって複数のショットで精製した。所望の生成物を含む画分を貯留し、溶媒を減圧下で除去した。薄いピンク色オイルの生成物（４００ｍｇ）が得られた。

ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：実測値３９０。ＭＨ^＋＝Ｃ_１６Ｈ_２４ＮＯ_６Ｓ_２）の計算値３９０。

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）δ０．８６（ｍ，２Ｈ）、１．５６（ｔ，３Ｈ）、１．７５（２ｘｓ，５Ｈ）、２．３６（ｍ，２Ｈ）、２．７５（ｍ，２Ｈ）、４．６０（ｑ，２Ｈ）、７．９６、８．１０（ｄｄ，２Ｈ）、８．１５（ｓ，１Ｈ）。

１．６： １−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート

２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二ナトリウム（１ｇ）、６−ブロモヘキサン酸（３．２ｇ、１６．４１ミリモル）、及びテトラメチレンスルホン（５ｍｌ）を一緒に、窒素中１１０℃で１４時間加熱した。次いで、別の分量（３．２ｇ、１６．４１ミリモル）のブロモヘキサン酸を添加し、加熱を１２時間続けた。次いで、別の分量（１．６ｇ、８．２１ミリモル）の６−ブロモヘキサン酸を添加し、加熱をさらに１２時間続けた。反応混合物を室温に冷却し、次いで酢酸エチルに注ぎ入れた。生成物を分別し、酢酸エチルで洗浄し、次いで４０℃で真空乾燥し、茶色固体（２．７１ｇ）として得られた。生成物を必要に応じて、ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ タンパク質 ＆ ペプチド Ｃ１８（２５０ｍｍ×２５ｍｍ）；流量１０ｍｌ／分；グラジエント ０→２５％ Ｂ、３０分；溶離液Ａ＝水中０．１％トリエチルアミン、及び溶離液Ｂ＝メタノール中０．１％トリエチルアミン；検出２２０ｎｍ）によって精製した。所望の生成物を含む画分を貯留し、溶媒を減圧下で除去した。粗材料（１００ｍｇ）から、黄茶色オイルの生成物が得られた。精製生成物は、トリエチルアンモニウム塩（５６ｍｇ）として得られた。

ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：実測値４７６。ＭＨ^＋＝Ｃ_２０Ｈ_３０ＮＯ_８Ｓ_２の計算値４７６。

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）δ０．８５（ｍ，２Ｈ）、１．３（ｔ，２７Ｈ）、１．５０（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，９Ｈ）、２．００（ｍ，２Ｈ）、２．２５（ｍ，４Ｈ）、２．３９（ｍ，１Ｈ）、２．７５（ｍ，２Ｈ）、３．２０（ｑ，１８Ｈ）、４．５５（ｔ，２Ｈ）、７．９５、８．１０（ｄｄ，２Ｈ）、８．１４（ｓ，１Ｈ）。

１．７： ２−［（１Ｅ，３Ｅ）−４−アニリノブタ−１，３−ジエニル］−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート

粗１−エチル−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（１．１ｇ）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）ＨＣｌ（０．５ｇ）、及び酢酸（２０ｍｌ）を、窒素中１３０℃で８時間加熱して、濃橙赤色溶液を得た。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を水／ジクロロメタン／メタノール混合物に分配した。紫外／可視分析（エタノール）により、生成物は上層の水層に存在し（λ_ｍａｘ＝５２４ｎｍ）、マロンアルデヒド出発材料は下層の有機層にしか存在していない（λ_ｍａｘ＝３８４ｎｍ）ことが確認された。水層を真空下で蒸発させ、ＨＰＬＣ（水／０．１％ＴＦＡ及びアセトニトリル／０．１％ＴＥＡ溶離液）によって精製した。生成物を含む画分を貯留し、蒸発させ、最終的に高真空下で五酸化リンを用いて乾燥して、表題の生成物を得た。

紫外／可視（水＋０．１％ＴＦＡ）：５２０ｎｍ。

ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：Ｍ＋ ５１８。

１．８： ２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート
２−［（１Ｅ，３Ｅ）−４−アニリノブタ−１，３−ジエニル］−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（７１ｍｇ）を、ピリジン（４５）：酢酸（４５）：無水酢酸（１０）（５ｍｌ）の混合物に９０℃で溶解した。この溶液に、粗１−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネートを２０分間隔で分割添加し、ついに紫外／可視分析により、半色素成分（λ_ｍａｘ＝５２４、４３０ｎｍ）がＣｙ５色素生成物（λ_ｍａｘ＝６５３ｎｍ）に完全に変換したことが示唆された。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（ＲＰＣ１８、水／メタノール／トリエチルアミン、次いで水／アセトニトリル／ＴＦＡ）によって精製した。

紫外／可視（水＋０．１％ＴＦＡ）：６５３ｎｍ。

ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：実測値９０２。ＭＨ^＋＝Ｃ_３９Ｈ_５３Ｎ_２Ｏ_１４Ｓ_４の計算値９０１。

２． ２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（化合物２）

２．１： ２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸二ナトリウム

２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二ナトリウム（１．０ｇ）、及び１，４−ブタンスルトン（１０ｍｌ）を混合し、窒素中１５０℃で５２時間加熱して、濃紫色スラリーを得た。冷却後、混合物を酢酸エチルで粉砕し、固体部分をろ過によって収集し、酢酸エチル及びジエチルエーテルで洗浄し、次いで高真空下で五酸化リンを用いて乾燥して、表題の生成物（１．４５ｇ）を得、精製せずに直接使用した。

２．２： ２−［（１Ｅ，３Ｅ）−４−アニリノブタ−１，３−ジエニル］−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート

粗２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸二ナトリウム（１．０ｇ）、及びマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）ＨＣｌ（１．０ｇ）、及び酢酸（１０ｍｌ）を窒素中１３０℃で１０時間加熱して、濃橙赤色溶液を得た。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を水／ジクロロメタン／メタノール混合物に分配した。紫外／可視分析（エタノール）により、生成物は上層の水層に存在し（λ_ｍａｘ＝５２４ｎｍ）、マロンアルデヒド出発材料は主に下層の有機層に存在している（λ_ｍａｘ＝３８４ｎｍ）ことが確認された。水層を真空下で蒸発させ、ＨＰＬＣ（水／０．１％ＴＦＡ及びアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶離液）によって精製した。生成物を含む画分を貯留し、蒸発させ、水溶液から凍結乾燥し、最終的に高真空下で五酸化リンを用いて乾燥して、表題の生成物を得た。赤色の形で収量２４０ｍｇ。

紫外／可視（水＋０．１％ＴＦＡ）：５２０ｎｍ。

ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：実測値６２７。ＭＨ^＋＝Ｃ_２７Ｈ_３５Ｎ_２Ｏ_９Ｓ_３の計算値６２７。

^１Ｈ−ｎｍｒ（Ｄ_２Ｏ）δ０．６５（１Ｈ，広幅ｍ）、０．９５（１Ｈ，広幅ｍ）、１．６（２Ｈ，ｍ）、１．７（３Ｈ，ｓ）、１．９（４Ｈ，ｍ）、２．３（２Ｈ，ｍ）、２．７（２Ｈ，ａｐｐ ｔ）、３．０（２Ｈ，ｔ）、４．１（２Ｈ，ａｐｐ ｔ）、６．４（２Ｈ，ｍ）、７．２〜７．６（６Ｈ，ｍ）、７．８〜８．０（２Ｈ，ｍ）、８．１５（１Ｈ，ｔ）及び８．２（１Ｈ，ｄ）。

２．３： ２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート
２−［（１Ｅ，３Ｅ）−４−アニリノブタ−１，３−ジエニル］−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（７０ｍｇ）を、ピリジン（４５）：酢酸（４５）：無水酢酸（１０）（５ｍｌ）の混合物に９０℃で溶解した。この溶液に、粗１−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネートを２０分間隔で分割添加し、ついに紫外／可視分析により、半色素成分（λ_ｍａｘ＝５２４、４３０ｎｍ）がＣｙ５色素生成物（λ_ｍａｘ＝６５６ｎｍ）に完全に変換したことが示唆された。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（ＲＰＣ１８、水／アセトニトリル／ＴＦＡ）によって精製した。

紫外／可視（水＋０．１％ＴＦＡ）：６５６ｎｍ。

ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：実測値１０１０。ＭＨ^＋＝Ｃ_４１Ｈ_５７Ｎ_２Ｏ_１７Ｓ_５の計算値１００９。

３． ２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（化合物３）

１−エチル−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート塩（１００ｍｇ）、及びＮ−［５−（フェニルアミノ）−２，４−ペンタ−ジエニリデン）アニリン一塩酸塩（６０ｍｇ）を一緒に、酢酸（５ｍｌ）、無水酢酸（５ｍｌ）、及びトリエチルアミン（０．５ｍｌ）の混合物中１２０℃で３０分間加熱した。次いで、反応混合物に、１−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（１００ｍｇ）、及びピリジン（５ｍｌ）を添加し、反応混合物を１２０℃でさらに３０分間加熱した。冷却してすぐに、濃緑色反応混合物を過剰の酢酸エチル（２５０ｍｌ）に注ぎ入れ、得られた固体を濾別し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥した。生成物をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ タンパク質 ＆ ペプチド Ｃ１８（２５０ｍｍ×２５ｍｍ）；流量１０ｍｌ／分；グラジエント ５→１５％ Ｂ、３０分；溶離液Ａ＝水中０．１％トリエチルアミン、及び溶離液Ｂ＝メタノール中０．１％トリエチルアミン；検出６５０ｎｍ、次いでグラジエントの変更 ２→２５％ Ｂ、３０分；溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、及び溶離液Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）によって精製した。所望の生成物を含む画分を貯留し、溶媒を減圧下で除去した。濃緑色固体の生成物（７ｍｇ）が得られた。

ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ^＋）：実測値９２７。ＭＨ^＋＝Ｃ_４１Ｈ_５４Ｎ_２Ｏ_１４Ｓ_４の計算値９２７。

紫外／可視；λ_ｍａｘ７５４ｎｍ（ＰＢＳ緩衝液）。

４． ２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−［５−カルボキシメチル）−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（化合物４）

４．１： ［２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドル−５−イル］酢酸

４−（カルボキシメチル）フェニルヒドラジン塩酸塩（５ｇ、０．０２５モル）、及び５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（５ｇ、０．０２４モル）を一緒に、酢酸中１４０℃で５時間加熱し、次いで室温に冷却した。反応混合物を濾過して、粒子を除去し、次いで酢酸を減圧下で除去して、濃茶色残渣を得た。残渣を水に溶解し、再濾過して、濃茶色不純物を除去した。水に溶解させた生成物を、ＨＰＬＣ（Ｐｒｅｐ ＡＫＴＡ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×５０ｍｍ）；流量１００ｍｌ／分；グラジエント ０→１００％ Ｂ、３０分；溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、及び溶離液Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ；検出２２０ｎｍ）によって精製した。所望の生成物を含む画分を貯留し、溶媒を減圧下で除去し、次いで残渣を凍結乾燥した。錆茶色固体の生成物（４．１４ｇ）が得られた。

ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）実測値３４０。ＭＨ^＋＝Ｃ_１６Ｈ_２２ＮＯ_５Ｓの計算値３４０。

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）δ０．９０（ｍ，２Ｈ）、１．６８（ｍ，５Ｈ）、２．２３（ｍ，２Ｈ）、２．７５（ｍ，４Ｈ）、３．８８（ｓ，２Ｈ）、７．４９、７．６４（ｄｄ，２Ｈ）、７．６４（ｓ，１Ｈ）。

４．２： ５−（カルボキシメチル）−２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム

２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドル−５−イル］酢酸（０．８９ｇ、２．６３ミリモル）、及び酢酸ナトリウム三水和物（０．４６ｇ）を、メタノール（３０ｍｌ）を溶解し、室温で１０分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をメタノール（３０ｍｌ）に再溶解し、再び溶媒を減圧下で除去し、薄茶色残渣を得た。これに、テトラメチレンスルホン（５ｍｌ）、及び１，４−ブタンスルトン（０．６７ｍｌ、６．５６モル）を添加した。反応混合物を、窒素中１５０℃で６時間加熱した。濃紫色残渣がフラスコの側面の周りに分離する。これを室温に冷却し、上澄みを流し出し、残渣を酢酸エチルで粉砕して、紫色固体を得た。生成物を濾別し、酢酸エチルで洗浄した（高吸湿性材料）。生成物を２％ＴＦＡを含有する水に溶解し、１２時間放置した。生成物をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ タンパク質 ＆ ペプチド Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×２５ｍｍ）；流量；１０ｍｌ／分；グラジエント ０→２５％ Ｂ、３０分；溶離液Ａ＝水中０．１％トリエチルアミン、及び溶離液Ｂ＝メタノール中０．１％トリエチルアミン；検出２２０ｎｍ）によって精製した。所望の生成物を含む画分を貯留し、溶媒を減圧下で除去した。生成物が薄紫色残渣（０．６４ｇ）として得られた。

ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：実測値４７６。Ｍ^＋＝Ｃ_２０Ｈ_３０ＮＯ_８Ｓ_２の計算値４７６。

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）δ０．８５（ｍ，２Ｈ）、１．３１（ｔ，２４Ｈ）、１．５８（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｍ，２Ｈ）、１．９５（ｑ，２Ｈ）、２．１２（ｍ，２Ｈ）、２．２６（ｍ，２Ｈ）、２．７３（ｔ，２Ｈ）、２．９６，（ｔ，２Ｈ）、３．２０（ｑ，１８Ｈ）、３．７８（ｓ，２Ｈ）、４．５５（ｔ，２Ｈ）、７．７５、７．７８（ｄｄ，２Ｈ）、７．６３（ｓ，１Ｈ）。

４．３： ２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−［５−（カルボキシメチル）−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート
５−（カルボキシメチル）−２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム（６４０ｍｇ）、及びＮ−［５−（フェニルアミノ）−２，４−ペンタ−ジエニリデン）アニリン一塩酸塩（１２５ｍｇ）を一緒に、酢酸（５ｍｌ）、無水酢酸（５ｍｌ）、及びトリエチルアミン（０．５ｍｌ）の混合物中１２０℃で４０分間加熱した。次いで、反応混合物に、１−エチル−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート塩（８２５ｍｇ（純度３０％）、及びピリジン（５ｍｌ）を添加し、反応混合物を１２０℃でさらに４０分間加熱した。冷却してすぐに、濃緑色反応混合物を過剰の酢酸エチル（５００ｍｌ）に注ぎ入れ、得られた固体を濾別し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥した。生成物（９５０ｍｇ）をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ タンパク質 ＆ ペプチド Ｃ１８（２５０ｍｍ×２５ｍｍ）；流量；１０ｍｌ／分；グラジエント １５→３０％ Ｂ、３０分；溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、及び溶離液Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）を使用して必要に応じて精製した。所望の生成物を含む画分を貯留し、溶媒を減圧下で除去した。濃緑色固体の生成物（粗材料１５０ｍｇから１１．７ｍｇ）が得られた。

ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ＋）：実測値９２７。ＭＨ^＋＝Ｃ_４１Ｈ_５４Ｎ_２Ｏ_１４Ｓ_４の計算値９２７。

紫外／可視；λ_ｍａｘ ７５６ｎｍ（ＰＢＳ緩衝液）。

５． １−ベンジル−２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（化合物５）

５．１： １−ベンジル−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート塩
２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二ナトリウム（５ｇ、１３．９ミリモル）、及び酢酸ナトリウム（３．１１ｇ）を、メタノール（１００ｍｌ）とともに１時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーションによって除去し、さらにメタノール（１００ｍ１）を添加した。これをロータリーエバポレーションによって除去して、橙色粘性固体を得た。これに、スルホラン（２５ｍｌ）、及び臭化ベンジル（９．５１ｇ、５５．６ミリモル、４ｅｑ）を添加した。混合物を窒素ガスシール中１１０℃で終夜攪拌した。冷却した赤色溶液を、攪拌しながら酢酸エチル（１ｌ）に注ぎ入れ、沈殿物を濾別した。沈殿物を多量の酢酸エチル及びジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空乾燥した。試料を水に溶解し、逆相ＴＬＣによって、０．１％ＴＦＡ変性アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ変性水（３０：７０）を使用して分析した。分離によって、生成物（Ｒ_ｆ０．６）及び出発材料（Ｒ_ｆ０．９５）が得られた。生成物のスポットは静止するとすぐに赤色になり、第四級化が行われたことが示唆された。収量：８ｇ。

５．２： １−ベンジル−２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート
１−ベンジル−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート塩（２ｇ）、１−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（２ｇ）、及びマロンアルデヒドビス−フェニルイミン（２ｇ）を、酢酸：ピリジン：無水酢酸（４．５：４．５：１）（１００ｍｌ）に溶解した。混合物を９０℃で２時間加熱した。混合物は即座に青色／緑色になった。ＵＶ測定のために、少試料を水に希釈した。紫外／可視吸収分光により、６５０ｎｍにおいてＣｙ５の形成を示すピークが観察された。反応混合物を＋２℃で終夜貯蔵した。混合物をロータリーエバポレーションにかけて、オイルを得た。これを真空ポンプに数時間かけて、確実に乾固した。粘性固体をアセトニトリル（４回×５００ｍ１）で洗浄して、乾燥粉末を得、濾過し、さらにアセトニトリルで洗浄した。固体を真空乾燥した。収量：３．０５ｇ。

色素を水（７．５ｍｌ）に溶解し、濾過し、ＨＰＬＣ（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ_１８ ４２ｍｍ×２５ｃｍ）によって、２０→３０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）、６０分のグラジエントで変性させた水（０．１％ＴＦＡ）を使用して精製した。流量は２０ｍｌ／分であった。所望の生成物を含む画分を合わせ、ロータリーエバポレーションにかけて小体積にし、小型ビンに移し、凍結乾燥した。紫外／可視検出は、６５０ｎｍにおいてであった。収量：１３２ｍｇ。次いで、部分精製した材料を水（７．５ｍｌ）に溶解し、濾過し、ＨＰＬＣ（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ_１８ ４２ｍｍ×２５ｃｍ）によって、２０−３０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）、６０分で変性させた水（０．１％ＴＦＡ）を使用して精製した。流量は２０ｍｌ／分であった。最終収量１０３ｍｇ。

プローブの分析は、消衰係数：１５６１７５Ｍ^−１ｃｍ^−１、λ_ｍａｘ６５２ｎｍ 蛍光発光ｍａｘ：６７０ｎｍ（励起６５２ｎｍ）、及び蛍光純度：９９．６％を示した。

５．３： 化合物５：ＮＨＳエステルの調製
１−ベンジル−２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（５ｍｇ）を、ＤＭＳＯ（２．２ｍｌ）、及びＨＳＰｙＵ（１０ｍｇ）を含むＤＩＰＥＡ（８０μｌ）に溶解した。混合物を２時間揺動させた。１ｍＬの乾燥酢酸エチルを入れたＳａｒｓｔｅｄｔ試験管に、４００μｌずつ分取した。試験管を１５分間遠心し、酢酸エチルをデカンテーションで除いた。分析ＨＰＬＣにより、生成物を微量の出発材料から分離した。酸の保持時間は２２．５分、エステルは３１．３８分であり、ＮＨＳエステルの純度は９６．０１％であった。

６． Ｃｙ５色素標識試験。化合物２とＣｙ５（商標）（化合物６）の比較

６．１： カルボキシ色素からＮＨＳエステルへの変換
別々のＳａｒｓｔｅｄｔ試験管中で、化合物２及び６（そろぞれ２．５ｍｇ）、及びＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、１０ｍｇ）を、無水ＤＭＦ（１００μｌ）とともに混合した。次いで、得られた溶液の両方に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０μｌ）を添加した。試験管を封鎖し、ボルテックスし、１時間放置した。この時間の終わりに、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ボルテックスし、次いで遠心して、ＮＨＳエステルを収集した。上澄み液体をデカンテーションし、ペレットを新たな酢酸エチルで洗浄し、真空乾燥した。反応は質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって確認した。

化合物２：Ｃ_４５Ｈ_５９Ｎ_３Ｏ_１９Ｓ_５の計算値Ｍ^＋＝１１０５；実測値Ｍ^＋＝１１０４。

化合物６（Ｃｙ５）：Ｃ_３７Ｈ_４３Ｎ_３Ｏ_１０Ｓ_２の計算値Ｍ^＋＝７５３；実測値Ｍ^＋＝７５２。

６．２： Ｃｙ５色素（化合物２及び６）のＮＨＳ誘導体によるヒツジγ−グロブリンの標識
ヒツジＩｇＧを、炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解し、色素ＮＨＳエステルを、無水ＤＭＳＯに約１０ｍｇ／ｍＬ（２５０μ１）で溶解した。様々な色素／タンパク質比を得るために、一連の標識実験を実施した。各反応は、５００μｌの抗体溶液を、０．１〜３２．０μｌの様々な量の色素ＮＨＳエステル溶液と組み合わせて使用した。標識反応を、暗所中、室温で４５分間揺動した。遊離色素は、固定相としてＳｅｐｈａｄｅｘ、及び溶離液としてｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによる精製によってコンジュゲートから除去した。化合物２を使用した反応の場合、精製抗体画分を、さらに透析にかけて、確実に非結合色素を完全除去した。

６．３： 紫外／可視スペクトルによるコンジュゲートのキャラクタリゼーション
まず、ニートなコンジュゲート溶液について吸収スペクトルを測定した。色素吸光度が装置のリニアレンジ（約１．５ＡＵ）を超えた場合、ＰＢＳを使用してより希釈された試料を作成し、示度を適切に縮尺した。色素吸収ピーク（約６５０ｎｍ）及び抗体吸光度（２８０ｎｍ）において、吸光度値を記録した。

色素／タンパク質比は、標準式を使用して算出した。

Ａ_ｍａｘ＝色素ピーク波長（約６５０ｎｍ）における吸光度、
ε_Ｄ＝色素ピーク波長（約２５０，０００ｄｍ^３モル^−１ｃｍ^−１）における色素の消衰係数、
Ａ_２８０＝２８０ｎｍ（抗体の吸光度ピーク）における吸光度、
ｘ＝色素ピーク消衰係数に比べた２８０ｎｍにおける色素の消衰係数（結果の数理解析、及び純色素の分光分析によって決定、＝０．０５）、
ε_ＡＢ＝２８０ｎｍにおける抗体の消衰係数（実験によって、１７０，０００ｄｍ^３モル^−１ｃｍ^−１であると決定）。

２つの色素について結果を処理して、（色素／タンパク質比）対（色素−ＮＨＳの使用量）のプロットで示した。図１（１Ａ及び１Ｂ）に、プロットを示す。２つの色素の標識効率が類似していることが理解できる。

コンジュゲート溶液をＰＢＳで（２００μｌコンジュゲートを２０ｍｌに）希釈し、蛍光示度をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５５装置で決定した。励起は、色素ピーク吸光度波長においてであった。６８０ｎｍにおける発光を記録した。初めの蛍光示度を処理して、吸光度データから決定して、各試料の抗体の実際の濃度を考慮した。したがって、２組のコンジュゲートの示度を一定濃度の抗体に縮尺し、次いで相対蛍光を色素／タンパク質比に対してプロットした。図２。

結果から、化合物２とタンパク質ＩｇＧとのコンジュゲートは、標準Ｃｙ５（化合物６−ＩｇＧコンジュゲート）より、多い色素負荷量で明るいことが示唆される。この性能の違いの理由は、相互に密接に結合している場合に色素が凝集を経由して会合する傾向が著しく減少することに由来する。凝集の低下は、２つの要因によって説明することができる。第１に、各色素標識上の負電荷の増大は、電荷−電荷の反発の増大を引き起こし、平面的芳香族系の正常な吸引をπ−πスタッキング相互作用のため阻止するように働く。第２に、新規色素の立体的大きさがより大きくなると、色素分子の緊密な接近を阻止するように働き、さらにスタッキング相互作用を防止する。

色素凝集の低下は、コンジュゲートの吸収スペクトルを経由して観察することができる。溶液のシアニン色素の凝集は、主吸収ピークの高エネルギー側ショルダーの吸光度の増大をもたらすことが知られている。この効果は、Ｃｙ５（商標）コンジュゲートの吸収スペクトルにはっきりと見ることができ、色素／タンパク質比が増大するにつれてより顕著になる。図３Ａを参照のこと。一方、化合物２のコンジュゲートの対応する吸収スペクトルは、このような効果を示さず、コンジュゲートの色素吸収帯は、本質的に色素／タンパク質比から独立しており、スペクトルは重ねることができる。図３Ｂを参照のこと。

７． Ｃｙ７色素標識試験。化合物３及び４と、Ｃｙ７（化合物７）の比較
本発明のヘプタメチンシアニン色素例の性能を、市販のＣｙ７誘導体（化合物７）と比べた。

７．１： カルボキシ色素からＮＨＳエステルへの変換
化合物３及び４を、実施例６．１の方法を使用してそのＮＨＳエステル誘導体に変換した。

化合物３：Ｃ_４５Ｈ_５８Ｎ_３Ｏ_１６Ｓ_４の計算値Ｍ^＋＝１０２４；実測値Ｍ^＋＝１０２４。

化合物４：Ｃ_４５Ｈ_５８Ｎ_３Ｏ_１６Ｓ_４の計算値Ｍ^＋＝１０２４；実測値Ｍ^＋＝１０２４。

７．２： ヘプタメチンシアニン色素のＮＨＳ誘導体によるヒツジγ−グロブリンの標識：化合物３、４、及び７
ヒツジＩｇＧを、炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．２）に１ｍｇ／ｍＬで溶解し、色素ＮＨＳエステルを、無水ＤＭＳＯに約１０ｍｇ／ｍＬ（２５０μ１）で溶解した。様々な色素／タンパク質比を得るために、一連の標識実験を実施した。各反応は、５００μｌの抗体溶液を、０．５〜１６μｌの様々な量の色素ＮＨＳエステル溶液と組み合わせて使用した。標識反応を、暗所中、室温で４５分間揺動した。遊離色素は、固定相としてＳｅｐｈａｄｅｘ、及び溶離液としてｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによる精製によってコンジュゲートから除去した。

７．３： 紫外／可視スペクトルによるコンジュゲートのキャラクタリゼーション
まず、ニートなコンジュゲート溶液について吸収スペクトルを測定した。色素吸光度が装置のリニアレンジ（約１．５ＡＵ）を超えた場合、ＰＢＳを使用してより希釈された試料を作成し、示度を適切に縮尺した。色素吸収ピーク（約７５０ｎｍ）及び抗体吸光度（２８０ｎｍ）において、吸光度値を記録した。

色素／タンパク質比は、実施例６で示した標準式を使用して算出した。ε_Ｄは、２５０，０００ｄｍ^３モル^−１ｃｍ^−１、ｘは、０．０４として取り扱った。

図４に示すように、ＰＢＳ中のコンジュゲートの紫外／可視吸光度は、Ｃｙ７−１ｇＧコンストラクト内のＣｙ７（化合物７）は、青色シフトしたショルダーの大きさによって示唆されているように、より高い色素／タンパク質比において極めて凝集していることを示している。図４Ａ。化合物３及び４のＩｇＧコンジュゲートは、この凝集特性を発現していないことが実証されている。図４Ｂ。

７．４： 蛍光によるコンジュゲートのキャラクタリゼーション
様々なヘプタメチンシアニン色素標識コンジュゲートの相対蛍光を測定するために、紫外／可視溶液をさらにＰＢＳ緩衝液で希釈した。実施例６．３に記載したように、相対蛍光を測定し、次いで色素／タンパク質比に対してプロットした。図５。結果から、化合物３及び４によるＩｇＧコンジュゲートは、標準Ｃｙ７ ６−ＩｇＧコンジュゲートより、多い色素負荷量で明るいことが示唆される。

８． 化合物２によるアミノアリル２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェートの標識
８．１： アミノアリル−ｄＵＴＰを、炭酸塩緩衝液（１０ｍｌ、ｐＨ９．２）に溶解した。これに、アセトニトリル中Ｎ−トリフルオロアセチルアミノヘキサノイルＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２当量）を添加した。これを、室温で４．５時間攪拌した。分析ＨＰＬＣにより、この反応の終了が示された。次いで、水酸化アンモニウム（０．８８Ｓ．Ｇ．、１０ｍｌ）を添加し、混合物を終夜攪拌して、アミノヘキサノイル−アミノアリル−ｄＵＴＰを得た。この生成物を逆相ＨＰＬＣによって精製した。

８．２： オーブンで乾燥させた２５ｍｌの丸底フラスコ中で、ＤＭＳＯ（５００μｌ）中アミノヘキサノイル−アミノアリル−ｄＵＴＰ（１ｍｇ）、及びジイソプロピルエチルアミン（４０μｌ）を窒素中１５分間攪拌した。化合物２ ＮＨＳエステル（１ｍｇ）をＤＭＳＯ（３００μｌ）に溶解し、１回分として混合物に添加する。バイアルをＤＭＳＯ（２００μｌ）ですすぎ、これも添加した。ＤＭＡＰ（約１ｍｇ）を添加し、混合物を窒素中、暗所で１８時間攪拌した。試料（５００μｌ緩衝液中２５μｌ）を、分析ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ_１８ １０μ ２５×０．４６ｃｍ）を使用して、５→３０％ アセトニトリル、３０分間のグラジエントで変性させたｐＨ５．６のリン酸塩緩衝液０．０５Ｍで、一定流量１ｍｌ／分で分析した。試料検出は、２５４ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を使用して行った。クロマトグラムから、エステル及びアミンが消費されると、Ｒ_Ｔ１５．５分の新規生成物が生じることが示唆されている。生成物を、水（１ｍｌ）で希釈し、イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ、Ｑ ＨＰ ５ｍｌ）によって、２０−７５％ １Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液、６０分間で変性させた０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液で精製した。流量は１ｍｌ／分であり、検出は６５０ｎｍ及び２５４ｎｍにおいてであった。主ピークに対応する画分を合わせ、熱を加えてロータリーエバポレーションにかけ、水に溶解し、凍結乾燥した。

９． 化合物２及び５を使用したｃＤＮＡの標識
９．１： ｃＤＮＡプローブ標識
ｃＤＮＡを、後標識技法によって化合物２及び５を使用して標識した。色素の反応性ＮＨＳエステル誘導体をｃＤＮＡに結合させて、下記に記載するようにマイクロアレイプローブを生成させた。

精製したヒト骨格筋メッセンジャーＲＮＡ（１μｇ）を、アミノアリルデオキシＵＴＰ、デオキシリボヌクレオチド、逆転写酵素、及び反応緩衝液の存在下で、オリゴ−ｄＴ及びランダムプライマーを使用して、ＣｙＳｃｒｉｂｅポストラベリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で概説された標準プロトコルに従って、反応液量２０μｌにして、４２℃、１時間でｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡをガラスビーズマトリックスに結合させることによって、組み込まれていないヌクレオチド及び緩衝液を合成したｃＤＮＡから除去した。アミノアリル−ｃＤＮＡを水で溶離した。

溶離したｃＤＮＡを十分に乾燥し、一定量の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５（４０μｌ）に再懸濁し、個々の一定量を化合物２及び５の反応性ＮＨＳエステルと混合した。等量のｃＤＮＡと、１００〜５００μｇの化合物２及び５をその反応性ＮＨＳエステルとして使用した。カップリング反応は、暗所で１時間３０分間実施し、続いてガラスビーズマトリックスを使用して、標識ｃＤＮＡを未反応エステルから精製した。比較の目的で、一定量のｃＤＮＡを化合物６（Ｃｙ５ ＮＨＳエステル）でも標識した。ｃＤＮＡ標識プローブを精製し、下記に記載するように収率を決定した。

ｉ）標識ｃＤＮＡの収量の計算
収量_ｃＤＮＡ＝ＤＮＡ Ａｂｓ_{２６０ｎｍ}×３７μｇ／ｍｌ×全プローブ体積（ｍＬ）
ｉｉ）色素組込み：

Ａｂｓ_ｍａｘ＝色素ピーク波長（６５０ｎｍ）における吸光度。

ε＝色素ピーク波長における色素の消衰係数（２５０，０００モル^−１ｃｍ^−１）。

ｉｉｉ）ヌクレオチド／色素比

上記の計算により、平均プローブサイズが１０００個の塩基であり、ｃＤＮＡ中ｄＮＭＰの平均分子量が３２４．５であることが推定される。表５に、標識反応からの結果を示す。

化合物６の標識効率は、化合物２及び５のどちらよりも高かったが、これは、より多い量の後者の反応性色素を標識混合物に添加することによって克服することができる。化合物５は、おそらく化合物５の改善された水に対する安定性のため、化合物２より高いカップリング効率をもたらした。さらに、６５０ｎｍにおける色素蛍光最大に隣接する６０５ｎｍにおけるショルダーピークの吸光度の低下によって示唆されるように、本発明による色素の構造中の複数のスルホネート基の存在は、プローブ凝集を低減させるようである（図６及び７を参照のこと）。これは、６５０ｎｍにおける最大に隣接する６０５ｎｍにおいて大きなショルダーピークを示す化合物６−標識ｃＤＮＡプローブと対照的である（図８）。

１０． 色素光安定性
化合物２、５、及び６を、シンチレーションバイアル中で、約０．５ＡＵ、全体積１０ｍｌに希釈した。バイアルを、２０℃に温度制御された部屋のライトボックスに配置した。ＵＶ吸光度は、間隔をおいて１２０時間測定した。図９に、結果を示す。これから、発色団構造に結合させた複数のスルホネート基を含むシアニン色素の光安定性は、このような基をより少なく含む色素に比べて向上していることが示唆されている。

重複試料も、暗所の点以外は同じ条件下で貯蔵した。これらの試料では、ＵＶ吸光度の変化は観察されなかった。

化合物２及び化合物５について、色素／タンパク質比対ＮＨＳエステルの使用量を示すプロット図である。 ペンタメチンシアニン色素について、一定抗体濃度における相対蛍光強度対色素／タンパク質比のプロット図である。 低及び高色素／タンパク質比での化合物５及び化合物２のＩｇＧコンジュゲートの吸収スペクトルを示す図である。 高色素／タンパク質比で化合物３及び４と比べた化合物６のＩｇＧコンジュゲートの吸収スペクトルを示す図である。 ヘプタメチンシアニン色素の相対蛍光強度対色素／タンパク質比を示すプロット図である。 化合物２で標識されたｃＤＮＡのスペクトルスキャン（２００〜７００ｎｍ）の図である。 化合物５で標識されたｃＤＮＡのスペクトルスキャン（２００〜７００ｎｍ）の図である。 化合物６で標識されたｃＤＮＡのスペクトルスキャン（２００〜７００ｎｍ）の図である。 化合物２、５、及び６について、間隔をおいて１２０時間測定されたＵＶ吸光度を示すプロット図である。

Claims (19)

1. 式（Ｉ）の化合物
   

   

   ［式中、
   Ｒ^３及びＲ^４基はＺ^１環構造に結合し、Ｒ^５及びＲ^６基はＺ^２環構造に結合し、ｎ＝１、２、又は３であり、
   Ｚ^１及びＺ^２は独立に、１環、又は２環縮合芳香族系を完結するのに必要な炭素原子を表し、
   Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７基の少なくとも１つは、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは、単結合、又は炭素、窒素、及び酸素原子からなる群から選択される原子を１〜２０個連結させた鎖を有するスペーサ基であり、Ｆは、目標結合基である）であり、
   Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基の１以上は独立に、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗは、スルホン酸又はホスホン酸であり、ｋは、１〜１０の整数である）から選択され、
   Ｒ^１及びＲ^２基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^１及びＲ^２基は独立に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、非置換ベンジル又はスルホン酸置換ベンジル、及び−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）から選択され、
   Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基は独立に、水素及びスルホン酸から選択され、
   Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４のいずれかが前記−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基でない場合、前記残りのＲ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基が独立に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
   残りのＲ^７基は、水素であり、或いはＲ^７の２つが次の基
   

   

   とともに、５又は６個の原子を有する炭化水素環系を形成する］。
2. Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４の少なくとも２つが独立に、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）である請求項１記載の化合物。
3. Ｒ^１１及びＲ^１２基の１つ、並びにＲ^１３及びＲ^１４基の１つが、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）であり、残りのＲ^１１又はＲ^１２基、及びＲ^１３又はＲ^１４基が、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである請求項１記載の化合物。
4. Ｗがスルホン酸である請求項１乃至３のいずれか記載の化合物。
5. −（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗが、−（ＣＨ_２）_３−ＳＯ_３Ｈ及び−（ＣＨ_２）_４−ＳＯ_３Ｈから選択される請求項１乃至３のいずれか記載の化合物。
6. Ｚ^１及びＺ^２が、フェニル及びナフチル部分から選択される請求項１乃至５のいずれか記載の化合物。
7. 前記目標結合基Ｆが、目標材料の官能基との反応用の反応性基、又は目標材料の反応性基との反応用の官能基を含む請求項１乃至６のいずれか記載の化合物。
8. 前記反応性基が、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、及びホスホルアミダイトから選択される請求項７記載の化合物。
9. 前記官能基が、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含めてカルボニル、並びにチオホスフェートから選択される請求項７記載の化合物。
10. 前記目標結合基Ｆが、親和性タグを含む請求項１乃至６のいずれか記載の化合物。
11. 前記スペーサ基Ｅが、
    −（ＣＨＲ’）_ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ’）_ｒ−
    ［但し、Ｑは、−ＣＨＲ’−、−ＮＲ’−、−Ｏ−、−ＣＲ’＝ＣＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ’−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−から選択され、Ｒ’は、水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、ｐは、０〜５であり、ｒは、１〜５である］から選択される請求項１乃至１０のいずれか記載の化合物。
12. Ｑが、−ＣＨＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、及び
    

    

    ［但し、Ｒ’は本明細書の上記に定義されている］から選択される請求項１１記載の化合物。
13. 前記−Ｅ−Ｆ基が、カルボキシペンチル基を含む請求項１乃至６のいずれか記載の化合物。
14. 下記から選択される請求項１乃至１３のいずれか記載の化合物。
    ｉ）２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル｝−３−メチル−５−スルホ−３−｛４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル｝−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート；
    ｉｉ）２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート；
    ｉｉｉ）２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート；
    ｉｖ）２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−［５−（カルボキシメチル）−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル｝−１−エチル−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート；及び
    ｖ）１−ベンジル−２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−５−スルホ−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドル−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル）−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート
15. 請求項１乃至１４のいずれか１項記載の化合物の調製方法であって、
    ａ）式（Ａ）を有する第１の中間体化合物
    

    

    ［式中、Ｚ^１、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、本明細書の上記に定義されている］と、
    ｂ）第１の中間体化合物と同じでも異なってもよく、式（Ｂ）を有する第２の中間体化合物
    

    

    ［式中、Ｚ^２、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^１３、及びＲ^１４は、本明細書の上記に定義されている］と、
    ｃ）第１の化合物と第２の化合物との結合の形成に適した第３の化合物（Ｃ）とを反応させるステップを含み、
    但し、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基のうちの少なくとも１つが、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅ及びＦは、本明細書の上記に定義されている）であり、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基のうちの１以上が独立に、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗは、スルホン酸及びホスホン酸基から選択され、ｋは、１〜１０の整数である）から選択されることを条件とする方法。
16. 次式の化合物
    

    

    ［式中、
    Ｒ^３及びＲ^４基はＺ^１環構造（式中、Ｚ^１は本明細書の上記に定義されている）に結合し、
    Ｒ^１、Ｒ^３、及びＲ^４基の少なくとも１つは、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは及びＦは本明細書の上記に定義されている）であり、
    Ｒ^１１及びＲ^１２基の少なくとも１つは、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗはスルホン酸及びホスホン酸基から選択され、ｋは１〜１０の整数である）である］。
17. −（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗが、−（ＣＨ_２）_３−ＳＯ_３Ｈ及び−（ＣＨ_２）_４−ＳＯ_３Ｈから選択される請求項１６記載の化合物。
18. 目標成分の標識方法であって、
    ｉ）前記成分を、式（Ｉ）の化合物：
    

    

    ［式中、
    Ｒ^３及びＲ^４基はＺ^１環構造に結合し、Ｒ^５及びＲ^６基はＺ^２環構造に結合し、ｎ＝１、２、又は３であり、
    Ｚ^１及びＺ^２は独立に、１環、又は２環縮合芳香族系を完結するのに必要な炭素原子を表し、
    Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７基の少なくとも１つは、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは、単結合、又は炭素、窒素、及び酸素原子からなる群から選択される原子を１〜２０個連結させた鎖を有するスペーサ基であり、Ｆは、目標結合基である）であり、
    Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基の１以上は独立に、−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗは、スルホン酸又はホスホン酸であり、ｋは、１〜１０の整数である）から選択され、
    Ｒ^１及びＲ^２基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^１及びＲ^２基は独立に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、非置換ベンジル又はスルホン酸置換ベンジル、及び−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基（式中、Ｗ及びｋは本明細書の上記に定義されている）から選択され、
    Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基のいずれかが前記−Ｅ−Ｆ基でない場合、前記残りのＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６基は独立に、水素及びスルホン酸から選択され、
    Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４のいずれかが前記−（ＣＨ_２）_ｋ−Ｗ基でない場合、前記残りのＲ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４基が独立に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
    残りのＲ^７基は、水素であり、或いはＲ^７の２つが次の基
    

    

    とともに、５又は６個の原子を有する炭化水素環系を形成する］と接触させるステップと、
    ｉｉ）前記蛍光色素を、前記成分に結合させ、それによって前記成分を標識するのに適した条件下で前記成分とインキュベートするステップとを含む方法。
19. 前記成分が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物；アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、及びカルボキシル、及びチオホスフェート基のうちの１以上を含む、又はそれを含むように誘導体化されたヌクレオチド；アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、及びチオホスフェート基のうちの１以上を含む、又はそれを含むように誘導体化されたオキシ又はデオキシポリ核酸；微生物材料、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜、並びに毒素からなる群から選択される請求項１８記載の方法。

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