CN102272106A - 用于体内和体外成像的单官能羰花青染料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可用于荧光显微术的对称型羰花青染料和染料前体，及其制备方法和使用方法。

Description

用于体内和体外成像的单官能羰花青染料
优先权
本申请要求2008年11月7日提交的美国临时专利申请(序列号为61/112,535)的权益，其全部内容通过参考并入本文中。
关于联邦资助的研发的声明
本发明在国立卫生研究院授予的基金1-U01-HL080731下得到美国政府的资助。美国政府就本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明提供具有远红外/近红外(far-red/near infrared(NIR))发射的对称型羰花青染料，其可用于生化和体内成像应用。
背景技术
荧光生色团在体外和体内二者的分子成像中发挥重要的作用(Goncalves，M.S.Chem.Rev.2009，109，190)。在这些荧光指示物(reporter)中，远红外和近红外(NIR)染料在600与1000nm之间具有理想的吸收/发射波长，这使来自组织的自荧光干涉最小化，并且与生物生色团诸如血红蛋白的重叠最小(Weissleder，R.；Ntziachristos，V. Nat.Med.2003，9，123)。NIR荧光团已经成为最佳候选，用于体内成像的荧光标记和荧光探针(Ballou，B.；Ernst，L.A.；Waggoner，A.S.Curr.Med.Chem.2005，12，795；Weissleder，R.；Tung，C.H.；Mahmood，U.；Bogdanov，A.，Jr.Nat.Biotechnol.1999，17，375)。例如，与肽或者纳米颗粒结合的NIR染料已经成功应用于肿瘤的体内成像(Ballou，B.；Ernst，L.A.；Waggoner，A.S.Curr.Med.Chem.2005，12，795；Weissleder，R.；Tung，C.H.；Mahmood，U.；Bogdanov，A.，Jr.Nat.Biotechnol.1999，17，375；Weissleder.Nat.Biotechnol.2001，10，316；Leimgruber，A.B.C.；Cortez-Retamozo，V.；Etzrodt，M.；Newton，A.P.；Waterman P.；Figueiredo，J.L.；Kohler，R.H.；Elpek，N.；Mempel，T.R.；Swirski，F.K.；Nahrendorf，M.；Weissleder，R.；Pittet，M.J.Neoplasia 2009，11)、心肌梗塞(Sosnovik，D.；Nahrendorf，M.；Weissleder，R.Nat.Clin.Pract.Card.2008，5，S63)和炎症(Cortez-Retamozo，V.；Swirski，F.K.；Waterman，P.；Yuan，H.；Figueiredo，J.L.；Newton，A.P.；Upadhyay，R.；Vinegoni，C.；Kohler，R.；Blois，J.；Smith，A.；Nahredorf，M.；Josephson，L.；Weissleder，R.；Pittet，M.J. Clin.Invest.2008，118，4058)。
羰花青荧光团是具有优异光学性质(包括可调NIR发射、高的消光系数和优良的荧光量子产率)的典范NIR染料家族中的一员(Hilderbrand，S.A.；Kelly，K.A.；Weissleder，R.；Tung，C.H.Bioconjug.Chem.2005，16，1275)。自二十世纪八十年代以来，已经制备了各种羧酸衍生的羰花青来满足其在生物结合和成像应用中使用的日益增长的需求(Mujumdar，S.R.；Mujumdar，R.B.；Grant，C.M.；Waggoner，A.S.Bioconjug.Chem.1996，7，356；Mujumdar，R.B.；Ernst，L.A.；Mujumdar，S.R.；Lewis，C.J.；Waggoner，A.S.Bioconjug.Chem.1993，4，105)。然而，这些荧光标记中多数具有高成本且难以大量获得阻碍了它们的广泛使用。大多数单官能羰花青染料是不对称的，其中结合手柄与吲哚鎓或者苯并[e]吲哚鎓部分的季氮中的一个相连。在合成这些不对称染料期间，也形成不合需要的对称型染料(图1)。这些对称型染料副产物常常难以与期望的单官能染料分离，并造成合成产率降低，常常低于10％(Lin，Y.；Weissleder，R.；Tung，C.H.Bioconjug.Chem.2002，13，605)。
发明内容
本申请提供单官能羰花青标记物的简单、高产率的合成路线，所述单官能羰花青标记物可用于各种生化和体内成像环境中。
因此，在第一方面，本发明特别提供式I的羰花青染料或者其可药用盐，
其中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R3选自C(O)ORA和C(O)NRBRC；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-6烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；
n为1、2、3或者4；以及
p为1或者2。
在一种实施方式中，本发明提供羰花青染料或者其可药用盐，其选自：
Figure BDA0000074241710000031
在另一实施方式中，本发明提供羰花青染料或者其可药用盐，其选自：
Figure BDA0000074241710000051
在一方面，本发明提供式I(b)的羰花青染料或者其可药用盐，
Figure BDA0000074241710000052
其中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R3选自C(O)ORA和C(O)NRBRC；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-6烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；
n为1、2、3或者4；以及
p为1或者2。
在一种实施方式中，本发明提供权利要求4的羰花青染料或者其可药用盐，其具有下面的结构：
Figure BDA0000074241710000061
在一方面，本发明提供制备式I的羰花青染料或者其可药用盐的方法，
在式I中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R3选自C(O)ORA和C(O)NRBRC；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-6烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；
n为1、2、3或者4；以及
p为1或者2；
该方法包括：
使式I-(1)的丙二醛二苯胺(malonaldeyhyde dianil)或者其可药用盐与式I-(2)的吲哚鎓或者其可药用盐经缩合反应得到式I的羰花青染料：
Figure BDA0000074241710000071
在式I-(1)中：
R4选自H和C1-6烷基；
R5选自C1-6烷基和芳基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有选自下述基团的取代基：C(O)ORA、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)RB、ORA、SRA、NRCRD、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-4烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；以及
p为1或者2；
Figure BDA0000074241710000081
在式I-(2)中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-4烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；以及
n为1、2、3或者4。
在一种实施方式中，本发明提供生物靶标的成像方法，该方法包括：使与所述生物靶标特异性结合的靶向试剂与羰花青染料或其活性琥珀酰亚胺基酯接触足够长的时间，所述足够长的时间使得所述靶向试剂和羰花青染料反应形成化学键，由此用羰花青染料标记靶向试剂，得到标记的靶向试剂；使所述生物靶标与所述标记的靶向试剂接触，以及提供用所述标记的靶向试剂标记的所述生物靶标的荧光图像，由此对生物靶标成像。
在一些实施方式中，所述靶向试剂是抗体。在另一实施方式中，所述靶向试剂是蛋白质。在另一实施方式中，所述靶向试剂是肽。在又一实施方式中，所述靶向试剂是小分子。在另一实施方式中，所述靶向试剂是核酸。在再一实施方式中，所述靶向试剂是适体。在又一实施方式中，所述靶向试剂是表面改性的纳米颗粒。
在一些实施方式中，所述荧光图像通过荧光显微术提供。
在一些实施方式中，所述方法在活细胞中体内进行。
在一些实施方式中，所述生物靶标和所述羰花青染料经生物正交结合反应而反应。
在一些实施方式中，所述生物正交结合反应是1，3-偶极环加成反应。
在另一方面，本发明提供式I-(2)的羰花青染料前体或者其可药用盐，
Figure BDA0000074241710000091
其中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-4烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；以及
n为1、2、3或者4。
在另一方面，本发明提供式I-(1)的丙二醛二苯胺或者其可药用盐，
其中：
R4选自H和C1-6烷基；
R5选自C1-6烷基和芳基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有选自下述基团的取代基：C(O)ORA、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)RB、ORA、SRA、NRCRD、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-6烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；以及
p为1或者2。
除非另有指出，本申请所用的所有科技术语的含义都与本发明所属领域中的技术人员所理解的相同。本申请描述了用于本发明的方法和物质，然而，也可使用本领域已知的其它合适的方法和物质。文中给出的物质、方法和实例仅仅用于示例说明，并不意在限制性的。本文提及的所有的出版物、专利申请、专利、序列、数据录入和其它参考文献均通过参考以其整体并入本文中。当冲突时，以本申请说明书(包括定义)为准。
根据下面的具体描述和附图以及根据权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显然的。
附图说明
图1展示不对称染料的合成方案。
图2A-C展示显示Cy5类似物的纯度的HPLC谱线。(A)CyAm-5酸；(B)CyAm-5叠氮；(C)CyAm-5炔。
图3展示CyAm-5酸在PBS(pH 7.0)中的归一化的吸收和发射光谱。
图4展示CyAm-5酸和Cy5标准物在PBS缓冲液(pH 7.0)中的光稳定性。
图5展示用CyAm-5炔标记的CHO细胞的荧光显微照片。比例尺代表50μm。
图6A和6B展示用CyAm-5炔标记的CHO细胞和对照的荧光成像。
图7展示五次甲基羰花青染料在PBS缓冲液(pH 7.0)中的光稳定性。
图8总结了五次甲基羰花青染料(CyAm-5酸、CyAm-5叠氮和CyAm-5炔)的光学性质。
图9总结了五次甲基羰花青染料(CyAl-5和CyAl-5.5)的光学性质。
图10A和10B分别展示CyAl-5和CyAl-5.5的HPLC谱线。
图11A和11B分别展示CyAl-5和CyAl-5.5在PBS缓冲液(pH 7.0)中的吸收(实线)和发射(虚线)光谱。
图12A和12B展示CyAl-5和CyAl-5.5在PBS缓冲液(pH 7.0)中的光稳定性。
具体实施方式
本发明提供用于体外和体内二者成像的对称型七次甲基羰花青染料的组合物和制备方法。
本申请开发了制备对称型单官能羰花青染料的容易和高效的合成路线。给出对称型官能化染料的一步法合成最小化了形成其它不期望的染料副产物的可能性，所述其它不期望的染料副产物是难以分离的。这与不对称改性的花青染料的较常规的合成(其可能产生多种不合需要的染料副产物)形成对比。除了引入羧酸手柄之外，该方法还适用于用叠氮和炔部分进行改性，所述叠氮和炔部分是点击反应(click reaction)的主要组分。随着使用点击化学(click chemistry)在生物技术中变得越来越流行，预期这些染料用于生物标记实验的效用将增大。
本申请描述的制备丙二醛二苯胺中间体的独特途径允许在最终的花青染料上容易地引入各种官能团。通过使用不同的吲哚鎓和苯并吲哚鎓衍生物，该方法不但适用于制备Cy5染料而且还适用于制备它们的单官能Cy5.5类似物，所述单官能Cy5.5类似物具有红移的吸收和发射曲线，更适宜用于生物医学成像。因此，本发明提供合成单官能羰花青衍生物的一般策略，其适用于以高产率制备含有酸、炔或者叠氮合成手柄(synthetic handle)的远红外/NIR花青染料。如下面的实例中所示，这些染料在生物标记和生物正交标记设计中具有广泛的应用。此外，采用该合成方法，安装附加的有用官能团例如胺、硫醇和马来酰亚胺基是可行的。
本发明中所述的化合物可用于例如荧光显微术或者流式细胞计数术(flow cytomety)。此外，这些化合物也可用作小分子、聚合物和基于纳米颗粒的探针的组分，用于生物和生物医学成像应用。
本申请所用术语“烷基”意在是指直链或支链饱和烃基。示例性烷基包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、叔丁基)、戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)，等等。烷基可包含1至约20、2至约20、1至约10、1至约8、1至约6、1至约4、或者1至约3个碳原子。
本申请所用的“烯基”是指具有一个或多个碳碳双键的烷基。示例性烯基包括乙烯基、丙烯基等等。
本申请所用的“炔基”是指具有一个或多个碳碳三键的烷基。示例性炔基包括乙炔基、丙炔基等等。
本申请所用的“卤素烷基”是指具有一个或多个卤素取代基的烷基。示例性卤代烷基包括CF3、C2F5、CHF2、CCl3、CHCl2、C2Cl5、等等。
本申请所用的“芳基”是指单环或多环(例如，具有2、3或者4个稠合环)芳族烃基，例如苯基、萘基、蒽基、菲基、茚满基、茚基等等。在一些实施方式中，芳基具有约6至约20个碳原子。
本申请所用的“卤素”或者“卤代”包括氟、氯、溴和碘。
本申请中所述的化合物可以是不对称的(例如，具有一个或多个立体中心)。除非另外指出，意在包括所有的立体异构体例如对映异构体和非对映异构体。包含不对称取代的碳原子的本发明化合物可以以光学活性或者外消旋形式分离。如何由光学活性原料制备光学活性形式的方法在本领域中是已知的，例如通过解析外消旋的混合物或者通过立体选择性合成。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可存在于本申请所述化合物中，并且所有的上述稳定异构体均涵盖在本发明中。本申请描述了本发明化合物的顺式和反式几何异构体，其可以以异构体的混合物或者作为单独的异构体形式分离出。
本申请所用术语“酰肼基”是指其特征为具有4个取代基的氮氮共价键的基团，所述4个取代基中至少一个为酰基，即-(C＝O)NH-N-N2。
本申请所用术语“肼基”是指具有下式-N2H3的基团。
本申请所用术语“琥珀酰亚胺基”是指具有下式
Figure BDA0000074241710000131
的基团。
本申请所用术语“马来酰亚胺基”是指具有下式
Figure BDA0000074241710000132
的基团。
本发明化合物还包括互变异构体形式。互变异构体形式源于单键与相邻的双键的交换以及伴随的质子迁移。互变异构体形式包括质子转移互变异构体，其为具有相同经验式和总电荷的异构的质子化状态。示例性质子转移互变异构体包括酮-烯醇对、酰胺-亚氨酸对、内酰胺-内酰亚胺对、酰胺-亚氨酸对、烯胺-亚胺对，以及质子可占据杂环系统的两个或更多个位置的环状形式，例如1H-和3H-咪唑，1H-、2H-和4H-1，2，4-三唑，1H-和2H-异吲哚，及1H-和2H-吡唑。互变异构体形式可处于平衡状态，或者通过适当的取代将其立体锁定成一种形式。
本发明化合物还可包括在中间体或者最终化合物中出现的原子的所有同位素形式。同位素包括那些具有相同原子序数但不同质量数的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。
本申请所用术语“化合物”意在包括所有立体异构体、几何异构体、互变异构体、以及所述结构的同位素形式。
所有的本发明化合物及其可药用盐可以是该化合物的溶剂化或者水合固体形式的一部分。这些溶剂化物和水合物以及无水和未溶剂化形式可以以不同固体形式诸如无定形形式以及各种晶体形式出现。
在一些实施方式中，本发明化合物及其盐基本上得到分离。“基本上得到分离”是指该化合物至少部分地或者基本上从其形成或者检测的环境中分离出。部分分离出可包括例如富集有本发明化合物的组分。基本上分离出可包括含有至少约50wt％、至少约60wt％、至少约70wt％、至少约80wt％、至少约90wt％、至少约95wt％、至少约97wt％、或者至少约99wt％的本发明化合物或其盐的组分。分离化合物及其盐的方法在本领域中是常规的。
本发明还包括本申请所述化合物的可药用盐。本申请所用“可药用盐”是指本申请所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或者碱部分转化为其盐形式得到改性。可药用盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机盐或者有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱金属盐或者有机盐；等等。本发明的可药用盐包括母体化合物的常规的无毒盐，其例如由无毒的无机酸或者有机酸形成。本发明的可药用盐可通过常规的化学方法由含有碱性或者酸性部分的母体化合物合成。一般而言，这样的盐可通过这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当碱或酸在水中或者在有机溶剂中或者在水和有机溶剂的混合物中反应制备；一般而言，优选非水性的介质例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或者乙腈。合适的盐的列表参见Remington’sPharmaceutical Sciences，17thed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，p.1418和Journal ofPharmaceutical Science，66，2(1977)，这两篇文献通过参考以其整体并入本文。
本申请所用的短语“可药用”是指那些化合物、物质、组合物和/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或者其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的。
合成
聚集在对称型羰花青支架上的单官能染料可使用下面方案1中所示的合成途径制备。这些染料具有两个相同的单磺酸化-吲哚鎓部分(4)，并且可按简单的一步染料缩合反应制备，其通常具有比就不对称型花青染料合成所报道的反应显著更高的产率(Weissleder.Nat.Biotechnol.2001，10，316；Leimgruber，A.B.C.；Cortez-Retamozo，V.；Etzrodt，M.；Newton，A.P.；WatermanP.；Figueiredo，J.L.；Kohler，R.H.；Elpek，N.；Mempel，T.R.；Swirski，F.K.；Nahrendorf，M.；Weissleder，R.；Pittet，M.J.Neoplasia 2009，11)。在芳环上的两个磺酸根基团赋予最终染料优异的水溶性。经烷基链以及而后染料合成期间形成的芳基酰胺键，在多次甲基链的中心碳原子上上引入酸、叠氮和炔手柄。
所期望的官能团可引入丙二醛二苯胺中间体(3a-c)中。这些丙二醛二苯胺衍生物可经羧酸中间体2制备，羧酸中间体2可由5，5-二甲氧基戊酸甲酯(1)经Vilsmeier-Haack-Arnold氨基甲酰化而后碱性水解合成。然后，可将在对位或间位含有羧酸、炔或者叠氮的苯胺部分加入反应溶液中，产生改性的丙二醛二苯胺衍生物。化合物3a-c可在酸性后处理之后以其氯化物盐形式分离出，其纯度足够用于后续在染料缩合反应中使用。
合成单官能的羰花青荧光团可通过在含0.5％三乙胺的乙酸酐中合并1当量的中间体3和4当量1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸盐(4)来实现。在染料缩合期间，两个苯胺基团中的一个经历分子内亲核进攻，与丙二醛衍生物的羧酸反应，形成酰胺键。该独特的分子内重排可发生在所有这3种染料合成期间。分子内重排允许以一步法反应在花青染料支架的多次甲基链上容易地安装各种官能团以提供各种适于结合反应的花青染料。
方案1
Figure BDA0000074241710000151
a.C2O2Cl/DMF/CH2Cl2，70℃；b.4M NaOH；c.R-NH2Cl/10％HCl；d.乙酸/5％TEA，115℃
作为选择，可通过将羧酸部分从吲哚鎓或者苯并[e]吲哚鎓基团上移至染料分子的多次甲基主链上来制备本发明化合物。已经通过分子内交换反应产生与多次甲基主链相连的苯甲酸手柄，制备了类似的单官能染料(Shao，F.；Weissleder，R.；Hilderbrand，S.A.Bioconjug.Chem.2008，19，2487)。然而，外置的芳族基团增大了荧光团疏水性和在水性溶液中团聚的可能性。因此，含有烷基羧酸基团的改性丙二醛二苯胺衍生物可克服这些缺点(方案2)。丙二醛衍生物(1)可经7，7-二甲氧基庚酸甲酯的Vilsmeier-Haack-Arnold氨基甲酰化合成，7，7-二甲氧基庚酸甲酯通过下面方法制备：首先是环庚烯的臭氧裂解然后进行按照改编自文献(Claus，R.E.，Schreiber，S.L.Org.Synth.1990，7，168)的步骤。羧酸改性的丙二醛二苯胺可经历与两当量的适当吲哚鎓或者苯并[e]吲哚鎓缩合，产生相应的对称型单官能染料。
方案2
Figure BDA0000074241710000161
合成对称型羰花青染料常常比合成相应的不对称型羰花青进行得更顺畅，产率更高。这部分归因于在制备不对称染料中产生的染料产物混合物(图1)。可使用乙酸酐、乙酸和三乙胺的混合物作为溶剂，通过丙二醛二苯胺中间体1与吲哚鎓2或者苯并[e]吲哚鎓3的缩合制备对称的水溶性烷基-羧酸衍生染料(CyAl-5和CyAl-5.5)。
本发明化合物可使用已知的有机合成技术制备，并可根据多种可能合成路线中的任一种合成。
制备本发明化合物的反应可在合适的溶剂中进行，所述合适的溶剂在有机合成领域中的技术人员可容易地进行选择。合适的溶剂可以是在反应进行的温度下与原料(反应物)、中间体或者产物基本上不反应的，所述温度例如在大气压下的溶剂凝固点与溶剂沸点范围内的温度，或者甚至更高的温度(如果反应在密封的反应容器中进行)。给定的反应可在一种溶剂或者超过一种溶剂的混合物中进行。根据具体的反应步骤，本领域技术人员可选择适用于具体反应步骤的溶剂。
制备本发明化合物可涉及各种化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员可容易地确定对保护和脱保护的需求以及对适当保护基的选择。保护基化学可参见例如T.W. Greene和P.G. M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，3rd Ed.，Wiley & Sons，Inc.，New York(1999)，其通过参考以其整体并入本文中。
反应可根据本领域中已知的任一合适方法监控。例如，产物形成可通过光谱法诸如核磁共振谱(例如，1H或者13C)、红外光谱、分光光谱(例如，紫外可见)、质谱，或者通过色谱法诸如高效液相色谱(HPLC)或薄层色谱(TLC)监控。
用于光学成像的靶向化合物
包含本申请所述的不对称型或者对称型单官能羰花青染料的化合物和组合物可用作基于荧光的成像方法中的远红外或近红外(NIR)光学成像试剂，例如，用于疾病检测和诊断，治疗应用以及用于生化分析，参见例如，Weissleder等人，Nat.Biotechnol.17：375-8(1999)；Weissleder等人，Nat.Med.9：123-8(2003)等。本发明提供改善的明亮的远红外和近红外染料，其可代替当前的NIR染料使用，例如，用于与靶向试剂结合，所述靶向试剂例如活质分子(例如，使用Ballou等人，Curr.Med.Chem.12：795-805(2005)；Lin等人，Bioconjug.Chem.13：605-10(2002)；Mujumdar等人，Bioconjug.Chem.4：105-11(1993)；Mujumdar等人，Bioconjug.Chem.7：356-62(1996)；Narayana和Patonay，J.Org.Chem.60：2391-2395(1995)中所述的方法)、各种生物/生物医学大分子以及表面改性的纳米颗粒(参见例如，Pham等人，Bioconjug.Chem.16：735-40(2005)；McCarthy等人，Nanomed.2：153-67(2007))。本申请改进的明亮的远红外和近红外染料可用于例如与靶向试剂诸如抗体、抗体片段、肽、小分子、DNA、RNA、适体、纳米颗粒、生物高分子等联结。在一些实施方式中，所述靶向试剂是或者还包括治疗剂，例如如PCT/US2009/062958中所述。尽管这些荧光染料优选是水溶性的，但是并不排除仅溶于有机溶剂的衍生物。
靶向试剂可以是与选定靶标特异性结合的任意化合物，诸如小分子或者活质分子(例如，抗体或者其抗原结合片段)，并且可通过任选地经连接体(linker)而加入二烯或者亲双烯体进行官能化。
抗体
本申请所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原结合部分。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F(ab)和F(ab′)2片段，其保留结合抗体的能力。这样的片段可商购得，或者使用本领域已知的方法获得。例如F(ab)2片段可通过用酶诸如胃蛋白酶处理抗体而产生，该胃蛋白酶是通常产生一个F(ab)2片段和多个Fc部分的小肽的非特异性内肽酶。所得F(ab)2片段包括两个二硫键连接的Fab单元。Fc片段广泛地降解，并可通过透析、凝聚渗透或者离子交换色谱与F(ab)2分离。F(ab)片段可使用木瓜蛋白酶(一种非特异性硫醇-内肽酶)来产生，该酶在还原剂存在下将IgG分子酶切消化成3个类似大小的片段：2个Fab片段和1个Fc片段。当对Fc片段感兴趣时，木瓜蛋白酶是可选的酶，因为其产生50,00道尔顿的Fc片段；为了分离出F(ab)片段，可通过例如使用蛋白质A/G的亲和纯化来移去Fc片段。可商购多种用来产生F(ab)片段的试剂盒，其中包括免疫纯IgG1 Fab和F(ab’)2制备盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。此外，可使用产生抗原结合片段的商购服务，例如，Bio Express，West Lebanon，NH。
所述抗体可以是多克隆的、单克隆的重组体，例如，嵌合、脱免疫化(de-immunized)或者人源化、完全人类的、非人类的(例如，鼠类)、或者单链抗体。在一些实施方式中，抗体具有效应物功能并可固定补体。在一些实施方式中，抗体具有减少的或者没有与Fc受体结合的能力。例如，抗体可以是同种型或亚型、片段或者其它突变型，其不支持与Fc受体的结合，例如，其Fc受体结合区经诱变处理或者缺失。
除了使用全抗体之外，本发明还涵盖使用所述抗体的结合部分。这样的结合部分包括Fab片段、F(ab’)2片段和Fv片段。这些抗体片段可通过常规方法制得，诸如蛋白水解片段化法，参见J.Goding，Monoclonal Antibodies： Principles and Practice，pp.98-118(N.Y. Academic Press 1983)。
嵌合、人源化、脱免疫化、或者完全人类的抗体适宜人类受试者应用，包括反复给药，例如，治疗处理。
所述抗体还可以是单链抗体。单链抗体(scFV)可进行工程设计(参见例如Colcher等人，Ann.N.Y. Acad.Sci.880：263-80(1999)和Reiter，Clin.CancerRes.2：245-52(1996))。单链抗体可二聚或者多聚，以产生对同一目标蛋白的不同表位具有特异性的多价抗体。在一些实施方式中，所述抗体是单价的，例如，如Abbs等人，Ther.Immunol.1(6)：325-31(1994)中所述，其通过参考并入本文中。
制备合适抗体的方法在本领域中是已知的。参见例如，E.Harlow等人编辑的Antibodies：A Laboratory Manual (1988)。
在一些实施方式中，所述抗体与肿瘤抗原或者与存在肿瘤的组织中存在的抗原特异性结合。大量针对癌症相关抗原的抗体是已知的(Ross等人，Am JClin Pathol 119(4)：472-485，2003)。实例包括Alemtuzumab(Campath)；Daclizumab(Zenapax)；Rituximab(Rituxan)；Trastuzumab(Herceptin)；Gemtuzumab(Mylotarg)；Ibritumomab(Zevalin)；Edrecolomab(Panorex)；Tositumomab(Bexxar)；CeaVac；Epratuzumab(LymphoCide)；Mitumomab；Bevacizumab(Avastin)；Cetuximab(C-225；Erbitux)；Edrecolomab；Lintuzumab(Zamyl)；MDX-210；IGN-101；MDX-010；MAb，AME；ABX-EGF；EMD 72000；Apolizumab；Labetuzumab；ior-t1；MDX-220；MRA；H-11scFv；Oregovomab；huJ591 MAb，BZL；Visilizumab；TriGem；TriAb；R3；MT-201；非结合性G-250；ACA-125；Onyvax-105；CDP-860；BrevaRex MAb；AR54；IMC-1C11；GlioMAb-H；ING-1；Anti-LCG MAbs；MT-103；KSB-303；Therex；KW-2871；Anti-HMI.24；Anti-PTHrP；2C4抗体；SGN-30；TRAIL-RI MAb，CAT；H22xKi-4；ABX-MA1；Imuteran；以及Monopharm-C。在靶向试剂针对肿瘤抗原或者患癌组织是特异性的一些实施方式中，有效负荷可以是治疗剂诸如细胞毒素、放射性试剂或者其它可用于治疗癌症的治疗剂。
小分子和活质分子
小分子是低分子量有机化合物(小于2000道尔顿)。可用于本申请的组合物和方法中的小分子以高的亲和性与生物高分子诸如蛋白质、核酸或多糖，或者其它生物靶标结合。适宜的小分子能用亲双烯体或者二烯进行官能化。例如，小分子可以是试剂诸如紫杉醇，其与微管特异性结合，且能用亲双烯体诸如反-环辛烯或者另一烯烃进行官能化。其它实例包括与激素受体、细胞因子、趋化因子或者其它信号分子特异性结合的小分子。
活质分子是活体产生的有机分子，包括大的聚合物分子诸如蛋白质、多糖和核酸，以及小分子诸如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。具体的小分子实例包括但不限于雌二醇、睾酮、胆固醇、磷脂酰丝氨酸或者磷脂酰胆碱。
使用方法
本申请所述的化合物和组合物可用于本领域中已知的体外成像法和体内成像法中，例如，如US 2005/0249668中所述。荧光、光学图像采集和图像处理的一般原则可应用于本发明的实施中。光学成像技术的综述参见例如，Alfano等人，Ann.NY Acad.Sci.，820：248-270，1997。成像系统通常包括3个基础组件：(1)近红外光源，(2)用于分离或者区分来自用于生色团激发的光的发射的装置，和(3)检测系统。
所述光源提供单色(或者基本上单色)的近红外光。光源可以是适当地滤过的白光，例如，来自宽带源的带通光。例如，来自150瓦卤灯的光可通过可商购自Omega Optical(Brattleboro，Vt.)的合适的带通滤波器。在一些实施方式中，光源是激光。参见例如，Boas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：4887-4891，1994；Ntziachristos等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：2767-2772，2000；Alexander，J.Clin.Laser Med.Surg.9：416-418，1991。关于用于成像的近红外激光也可参见因特网(例如，imds.com)和各种其它熟知的资源。
高通过或者带通滤波器(650nm)可用于从激发光中分离光学发射。合适的高通过或者带通滤波器可商购自Omega Optical。在一些实施方式中，单一激发波长可用于激发在单一探针或者多个探针(具有不同激活位点)上的多个不同的荧光素，并且用一系列带通滤波器、衍射光栅或其它方式进行光谱分离可用于独立地读出不同的激活。
一般而言，光检测系统可包括聚光/成像和光检测/图像记录组件。尽管光检测系统可以是合并这两组件的单个整合设备，但是聚光/成像组件和光检测/图像记录组件将在下文中分开讨论。然而，记录装置可仅仅记录单个的(时间变化的)标量强度，而不记录图像。例如，基于导管的记录装置可同时记录来自多处(即，图像)的信息，或者可报道通过其它方式(诸如在导管尖端的不透射线的标记，通过荧光镜观察)与位置相关的标量信号强度。
内窥镜是尤其有用的聚光/成像组件。已经用于许多种组织和器官的体内光学成像的内窥镜装置和技术可用于本发明实施，所述组织和器官包括腹膜(Gahlen等人，J.Photochem.Photobiol.B 52：131-135，1999)、卵巢癌(Major等人，Gynecol.Oncol.66：122-132，1997)、结肠(Mycek等人，Gastrointest.Endosc.48：390-394，1998；Stepp等人，Endoscopy 30：379-386，1998)、胆管(Izuishi等人，Hepatogastroenterology 46：804-807，1999)、胃(Abe等人，Endoscopy 32：281-286，2000)、膀胱(Kriemair等人，Urol.Int.63：27-31，1999；Riedl等人，J.，Endourol.13：755-759，1999)和脑(Ward，J.Laser Appl.10：224-228，1998)。可用于本申请所述方法中的其它类型的聚光组件是基于导管的装置，包括光导纤维装置。所述装置尤其适用于血管内成像。参见例如，Tearney等人，Science 276：2037-2039，1997；Boppart等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4256-4261，1997。
在本发明的实施中也可采用其它成像技术，包括相控技术(Boas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：48874891，1994；Chance，Ann.NY Acad.Sci.838：29-45，1998)、弥散光断层摄影术(Cheng等人，Optics Express 3：118-123，1998；Siegel等人，Optics Express 4：287-298，1999)、活体显微镜检查(Dellian等人，Br.J.Cancer 82：1513-1518，2000；Monsky et al，Cancer Res.59：4129-4135，1999；Fukumura等人，Cell 94：715-725，1998)、荧光分子断层摄影术术(FMT)、荧光反射成像(FRI)和共焦成像(Korlach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8461-8466，1999；Rajadhyaksha等人，J.Invest.Dermatol.104：946-952，1995；Gonzalez等人，J.Med.30：337-356，1999)。
可以使用任何合适的光检测/图像记录组件例如，电荷耦合器件(CCD)系统或者摄影胶片。光检测/图像记录组件的选择将取决于包括所使用的聚光/成像组件的类型等因素。选择合适的组件、将它们组装成近红外成像系统和操作该系统都在本领域技术人员的能力范围内。
此外，本发明的组合物和方法可与其它成像组合物和方法组合使用。例如，本发明试剂可通过单独的NIR成像方法或者其与其它的传统成像方式(诸如，X射线、计算机断层摄影术(CT)、MR成像、超声、正电子发射断层摄影术(PET)和单光子计算机断层摄影术(SPECT))的组合进行成像。例如，本申请所述的方法可与CT或者MRI组合使用以同时获得解剖信息和分子信息，例如通过与另一成像方式产生的图像共记录。本发明的组合物和方法也可与X射线、CT、PET、超声、SPECT以及其它光学和MR造影剂组合使用，或者作为选择，本发明的试剂也可包括成像剂，诸如碘、钆原子和放射性同位素，其可使用CT、PET、SPECT和MR成像方式与光学成像的组合进行检测。成像剂可与所述试剂连接或者并入到所述试剂中。
体内成像
本发明的化合物和组合物可用于体内成像方法中。一般而言，这样的方法包括向受试者给予一种或多种本申请所述的化合物或者组合物；任选地允许该试剂在受试者体内分配；使受试者暴露于具有可被成像剂中至少一种荧光团吸收的波长的光下；以及检测荧光团发出的光学信号。发出的光学信号可用于构建图像。该图像可以是断层图像。此外，应理解所述方法(或者其部分)可相隔一定时间进行重复以在时间上评价受试者。
可使用本领域已知的任何装置或仪器进行照射和/或检测步骤，例如，内窥镜、导管、断层摄影系统、平面系统、手持成像系统、眼镜、或者术中成像系统或者显微镜。
在这些步骤之前或期间，检测系统可置于受试者(例如动物或人)的周围或者附近，以检测自受试者发出的信号。可处理发出的信号使其构成图像，例如断层图像。此外，经处理的信号可显示为单独的图像或者组合的图像。
此外，可这样实施体内成像方法，该方法对一个或多个分子成像探针(包括成像剂)同时进行选择性检测和成像。在这些实施方式中，将信号性质彼此不同的两种或更多种成像探针给予受试者，同时或者相继给予，其中至少一种分子成像探针是试剂。多个探针的使用允许记录多个生物过程、功能或者目标。
所述受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物如人类。受试者也可以是实验室研究中使用的无脊椎动物(例如，秀丽隐杆线虫(C.elegans)、果蝇或者其它模型研究生物体等)。
这种体内成像途径提供的信息(例如，发出信号的存在、不存在或者水平)可用于检测和/或监控受试者的疾病。示例性疾病包括但不限于自身免疫病、骨病、癌症、心血管病、环境病、皮肤病、免疫性疾病、遗传疾病、传染性疾病、代谢病、神经变性疾病、眼病和呼吸系统疾病。此外，通过使用成像剂，体内成像可用于评价化合物或治疗的效用，其中在用所述化合物或治疗法治疗受试者前后对受试者成像，并比较相应的信号/图像。
本发明还描述了体内成像方法，其中将标记的细胞给予受者。细胞可用成像剂进行离体标记。细胞可直接源于受试者或者源于另一来源(例如，源于另一受试者、细胞培养物等)。在步骤(a)中，成像剂可与细胞混合，以有效地标记细胞，并将所得标记细胞给予受试者。然后如上所述进行步骤(b)-(d)。该方法可用于监控某些细胞类型的运输和定位，所述细胞类型包括T细胞、肿瘤细胞、免疫细胞和干细胞以及其它细胞类型。具体而言，该方法可用于监控基于细胞的治疗。
本申请所述的方法可用于测定多种指标，包括跟踪在受试者中试剂随时间变化的位置，或者评价在受试者中试剂在代谢中随时间的变化或改变和/或试剂随时间的排泄。该方法也可通过对由治疗调节的分子事件和生物途径成像而用于跟踪对所述疾病的治疗，包括但不限于确定效能、最佳定时、最佳给药水平(包括用于单独的患者或者受试者)、以及组合治疗的协同效应。
本申请所述的方法和组合物可用于帮助内科医师或者外科医师鉴定和表征疾病(诸如关节炎、癌症和具体地结肠息肉、或者脆弱或不稳定斑块、动脉粥样硬化)的区域，以区分患病组织和正常组织，诸如检测使用普通的手术显微镜难以检测的肿瘤边缘(例如，在脑手术中)，从而有助于指导治疗或者手术的介入(例如，通过确定病变是癌性且应除去的还是非癌性且不用管的；或者在对疾病在手术上进行分期中，例如，手术中淋巴结分期，前哨淋巴结测图，或者评价手术中出血)。
本申请所述的方法和组合物也可用于检测、表征和/或测定疾病(尤其是早期疾病)的定位、疾病或者与疾病相关的病症的严重性、疾病的阶段、和/或对疾病的监控。发出信号的存在、不存在或者水平可以指示疾病状态。
本申请所述的方法和组合物也可用于监控和/或指导各种治疗干预(例如手术)，以及监控药物治疗(包括基于细胞的治疗)。该方法也可用于疾病或者病症的预后。
针对前述的每一种，可在治疗之前、之中、或者之后检测或者监控的所述疾病或病症的实例包括炎症(例如关节炎如类风湿关节炎引起的炎症)、癌症(例如、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、睾丸癌、皮肤癌、脑癌、胃肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、白血病、口腔癌癌、食道癌、骨癌)、心血管病(例如、动脉粥样硬化和血管的炎性病症，缺血、高血压、中风、血栓形成、弥散性血管内凝血)、皮肤病(例如卡波西肉瘤、银屑病、过敏性皮炎)、眼病(例如黄斑变性、糖尿病性视网膜病)、传染性疾病(例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染，包括获得性免疫缺乏综合征、疟疾、查加斯病、血吸虫病)、免疫疾病(例如，自身免疫障碍、淋巴瘤、多发性硬化、类风湿性关节炎、糖尿病、红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯病)、中枢神经系统疾病(例如、神经变性疾病如帕金森病或者阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、朊病毒病)、遗传病、代谢病、环境病(例如，铅、汞和反射性中毒，皮肤癌)、与骨相关的疾病(例如、骨质疏松症、原发性和转移性骨肿瘤、骨关节炎)、神经变性疾病以及手术相关的并发症(例如移植排斥、器官排斥、伤口愈合的改变、纤维化或者其它与手术移植相关的并发症)。
因此，本申请所述的方法和组合物可用于，例如确定肿瘤细胞的存在和/或位置、炎症的存在和/或位置(包括例如在动脉粥样硬化或者关节炎中活性巨噬细胞的存在)、血管疾病的存在和位置(包括在冠状和周围动脉中处于急性闭塞(即，脆弱斑块)风险的区域、扩展动脉瘤的区、颈动脉中的不稳定斑块、和缺血区域)。本申请所述的方法和组合物也可用于鉴定和评价细胞死亡、损伤、凋亡、坏死、缺氧和血管发生。本申请所述的方法和组合物也可用于药物递送和监控药物递送，尤其是在药物或者药物样分子与成像剂化学相连时。
体外成像
对于体外成像方法，本申请所述的化合物和组合物可用于各种体外测定中。示例性的体外成像方法包括：使样品例如生物样品与一种或多种本发明的成像剂接触；允许所述试剂与该样品中的生物靶标相互作用；任选地，除去未结合的试剂；用具有所述试剂的荧光团能吸收的波长的光照射样品；以及检测由荧光团发出的信号，由此确定所述试剂是否被生物靶标激活或者与生物靶标结合。
在设计、合成以及任选地配制试剂之后，本领域技术人员可体外测试该试剂，以评价其生物特性和性能特性。例如，长在培养基中的不同类型的细胞可用于评价所述试剂的生物特性和性能特性。可利用本领域已知的技术评价试剂的细胞摄取、结合或者细胞定位，包括例如，荧光显微术、FACS分析、免疫组织化学、免疫沉淀法、原位杂化和荧光共振能量转移(FRET)。作为示例，可使试剂与样品接触一定的时间，然后洗去任何游离的试剂。然后可使用适当的检测设备诸如装备有与荧光试剂的光学性质匹配的适当滤波器的荧光显微镜观测样品。在培养基中的细胞的荧光显微术或者闪烁计数也是用于确定是否发生了摄取和结合的常规方法。组织、组织切片和其它类型的样品诸如细胞离心涂片样品也可以以类似的方式用于评价试剂的生物特性和性能特性。还可使用其它检测方法，包括但不限于流式细胞计数术、免疫测定、杂化测定和微点阵分析。
组合物
可提供干的本申请所述的化合物，或者将本申请所述的化合物溶于载体或者媒介物(例如，可药用载体和媒介物)中来提供。有用的载体和媒介物包括但不限于离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如白蛋白)、缓冲物(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(″TRIS″)、脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或者电解质、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、二氧化硅胶体、三硅酸镁(magnesiumtrisilicate)、聚乙烯吡咯烷酮、基于细胞的物质、聚乙二醇、羧基甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯嵌段共聚物、糖(诸如葡萄糖)、以及合适的抗冻剂。
本申请所述的化合物和组合物可以以无菌可注射制剂形式给药。在此制剂领域中的技术人员可根据本领域已知的技术制备该制剂。可用于制备可注射制剂的可能的媒介物或者溶剂包括水、林格溶液、等张氯化钠溶液、和5％D-葡萄糖溶液(D5W)。此外，还可使用油类诸如单-甘油酯或者二-甘油酯和脂肪酸诸如油酸及其衍生物。本申请所述的化合物和组合物可经口、肠胃外、吸入、局部、直肠、经鼻、口腔、阴道、或者经植入型药盒给药。术语″肠胃外给药″包括静脉、肌内、关节内、滑膜囊腔内、胸骨内、鞘内、腹膜内、池内、肝内、损伤区、和颅内注射或者输注技术。探针也可经导管或者通过针头给药于任何组织。
对于眼的应用，本申请所述的化合物和组合物可配制成在等张的、已调节pH的、无菌盐水中的微粉化混悬剂。作为选择，本申请所述的化合物和组合物可配制成软膏剂，诸如配制在凡士林中。
对于局部施用，本申请所述的化合物和组合物可配制成合适的软膏剂，诸如配制在凡士林中。也可使用经皮贴剂。用于下消化道或者阴道的局部施用可通过栓剂或者灌肠剂实现。
本申请所述的化合物和组合物的制剂也可包括抗氧化剂或者一些其它化合物，所述其它化合物阻止或者减少荧光基线的劣化，或者保持荧光性质(包括但不限于量子产率、荧光寿命以及激发波长和发射波长)。这些抗氧化剂或者其它化合物可包括但不限于褪黑激素、二硫苏糖醇(dTT)、去铁胺(defroxamine，DFX)、甲硫氨酸和N-乙酰基半胱氨酸。
新型生色团和探针的给药将取决于大量因素，包括仪器的灵敏度，以及大量受试者相关的变量，包括动物种类、年龄、体重、给药模式、性别、饮食、给药时间和排泄速率。
在使用本发明或者本发明的任何药物组合物之前，受试者可用试剂或者治疗方案处置来提高成像过程。例如，受试者可在成像之前进行特别的饮食以减少任何自荧光或者来自消化食物的干扰，如低脱镁叶绿甲酯酸饮食以减少来自荧光脱镁叶绿甲酯酸(其源自一些食物如绿色蔬菜)的干扰。作为选择，在成像之前，可采用净制食疗，诸如那些在结肠镜检查之前采用的净制食疗，并包括使用诸如Visiciol的试剂。受试者(患者或者动物)也可用药理学改性剂处置，来改善成像质量。例如在疾病筛除中，使用低剂量酶抑制剂以相对于目标信号降低背景信号(与酶活性病理组织相比，次级地按比例地将已经低酶活性的正常组织的酶活性降低至更大程度)可改善目标与背景信号比。作为另一非限制性实例，可联合使用用甲氨蝶呤预处理以相对提高非正常组织(即，代谢活性癌症)中的摄取以及基于叶酸盐(酯)靶向给药。
实施例
本发明在下面的实施例中得到进一步说明，其不意在限制权利要求所述的本发明的范围。
实施例1.合成对称型羰花青染料及其在生物正交结合和荧光细胞成像中的用途
所有的化学物质均购自Aldrich或TCI，并且原样使用。所有的溶剂至少是试剂纯的，未进一步纯化就直接使用。所有用于表征的染料都在装备335二极管阵列检测器的Varian 210仪器上经高效液相色谱(HPLC)纯化。如果没有另外指出，HPLC缓冲液A是0.1％三氟乙酸水溶液，而缓冲液B是90％乙腈在缓冲液A中的溶液。在环境温度下于Bruker Advance-400NMR光谱仪上采集1H(400MHz)和13CNMR(100MHz)谱。将四甲基硅烷(TMS)作为内标，测量化学位移。高分辨电喷雾离子化(ESI)质谱在Bruker DaltonicsAPEXIV 4.7Tesla傅里叶变换离子回旋加速共振质谱仪(FT-ICR-MS)上获得。
5-(苯基氨基)-4-(苯基亚胺基)甲基)-4-戊烯酸衍生物(中间体3a-c)的合成
总的合成路线.在丙酮/干冰浴中，将无水二甲基甲酰胺(1.01mL，13mmol)和草酰氯(1.26g，10mmol)先后加入30mL无水二氯甲烷(DCM)中。使混合物温热至室温，历时15分钟。然后，将5，5-二甲氧基戊酸甲酯(881mg，5mmol)滴加至反应溶液中，接着在70℃加热2小时，使二氯甲烷蒸发。将所得的淡黄色油状物溶于5mL的4M NaOH中并在70℃加热1小时。在使用前，通过将苯胺类化合物(4-氨基苯甲酸、4-叠氮基苯胺、3-乙炔基苯胺)溶于丙酮中而后加入过量的浓盐酸来沉淀它们的盐，以10mmol的量将它们转化为它们相应的氯化物盐。在真空除去溶剂之后，将适当的苯胺类化合物的氯化物盐(10mmol)溶于5mL水中，加入碱性的粗制反应溶液中，使其在室温搅拌1个小时以上直至反应完全。在加入5mL的10％盐酸之后，过滤收集最后的丙二醛二苯胺盐酸盐沉淀，其为浅黄色固体。产物的纯度为95％以上，若无另外具体指出，则未进一步纯化直接用于染料合成。
羧酸中间体(3a)。产率65％，1.22g.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.65(b，2H)，8.80(s，2H)，8.08(d，4H，J＝8.8Hz)，7.63(d，4H，J＝8.8Hz)，2.90(t，2H，J＝7.6Hz)，2.48(t，2H，J＝7.9Hz).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ174.78，167.50，160.44，143.41，131.97，128.74，119.31112.49，32.75，18.35.HRMS-ESI[M+H]+m/z按[C20H18N2O6]+计算383.1238，实测383.1231。
Figure BDA0000074241710000281
叠氮化物中间体(3b)。4-叠氮基苯胺盐酸盐直接使用。产率61％，1.24g.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.85(s，2H)，7.65(d，4H，J＝8.8Hz)，7.22(d，4H，J＝8.7Hz)，6.82(d，1H，J＝8.4Hz)，6.68(d，1H，J＝8.5Hz)，2.91(t，2H，J＝7.3Hz)，2.45(t，2H，J＝7.8Hz).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ173.84，158.22，145.09，136.89，136.44，127.16，120.35，119.93，115.91，109.97，32.72，19.10.HRMS-ESI[M+H]+m/z按[C18H16N8O2]+计算377.1469，实测377.1473。
Figure BDA0000074241710000282
炔中间体(3c)。将粗制沉淀在硅胶柱上纯化，始于5％MeOH/DCM。以15％MeOH/DCM洗脱出纯产物。产率24％，440mg。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.18(s，2H)，7.39(s，2H)，7.35(d，2H，J＝7.2Hz)，7.32(d，2H，J＝1.5Hz)，7.18(d，2H，J＝7.0)，4.24(s，2H)，2.79(t，2H，J＝7.5Hz)，2.44(t，2H，J＝7.8Hz).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ175.02，155.59，145.80，130.38，127.38，123.30，121.25，119.73，113.94，83.81，81.57，32.72，19.10.HRMS-ESI[M+H]+m/z按[C22H18N3O2]+计算343.1441，实测343.1443。
染料合成(CyAm-5酸、CyAm-5叠氮和CyAm-5炔)
总的合成路线.1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸盐(4)根据文献方法(5)制备。将吲哚鎓4(4当量)和中间体3(1当量)溶于5mL含0.5％v/v三乙胺的乙酸酐中。在密封的烧瓶中，将反应溶液在115℃加热1小时。然后加入乙醚来析出粗产物，而后用大量乙醚洗涤。用制备性HPLC(Varian PursuitXRs 10C18250X21.2mm柱，0-25％缓冲液B，历时30分钟，流速21mL/min)纯化CyAm-5酸，得到蓝色染料，其为游离酸。通过制备性HPLC分离出其它染料(CyAm-5叠氮和CyAm-5炔)，其中采用相同的梯度，但是缓冲液A为50mM NH4OAc，pH 7.0；缓冲液B为乙腈。图2展示HPLC谱线，显示了CyAm-5酸、CyAm-5叠氮和CyAm-5炔的纯度。
Figure BDA0000074241710000291
CyAm-5酸(5a).产率66％，252mg，始于0.5毫摩尔3a。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.30(s，1H)，8.21(d，2H，J＝14.1Hz)，7.86(d，2H，J＝8.7Hz)，7.84(s，2H)，7.72(d，2H，J＝8.8Hz)，7.66(d，2H，J＝8.2Hz)，7.35(d，2H，J＝8.4Hz)，6.33(d，2H，J＝14.2Hz)，4.21(m，4H)，2.99(t，2H，J＝6.7Hz)，2.60(t，2H，J＝7.1Hz)，1.71(s，12H)，1.30(t，6H，J＝7.1Hz).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ173.43，172.03，167.51，154.11，145.75，143.81，142.19，141.40，133.99，130.99，126.73，125.62，120.61，118.98，110.63，100.36，49.61，39.67，36.10，27.46，20.58，12.69.HRMS-ESI[M]+m/z按[C39H44N3O9S2]+计算762.2513，实测762.2539。
CyAm-5叠氮(5b).产率：64％，116mg，始于0.24毫摩尔3b。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.08(s，1H)，8.20(d，2H，J＝14.2Hz)，7.83(s，2H)，7.66(d，2H，J＝8.9Hz)，7.64(d，2H，J＝8.7Hz)，7.34(d，2H，J＝8.4Hz)，7.03(d，2H，J＝8.9Hz)，6.32(d，2H，J＝14.2Hz)，4.20(m，4H)，2.98(t，2H，J＝6.7Hz)，2.54(t，2H，J＝6.8Hz)，1.70(s，12H)，1.29(t，6H，J＝7.1Hz).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ173.73，171.74，154.46，146.15，142.49，141.71，137.42，134.65，133.61，17.05，121.55，120.94，120.31，110.93，100.73，49.91，39.63，36.23，27.79，21.04，13.02.HRMS-ESI[M]+m/z按[C38H43N6O7S2]+计算759.2629，实测7592630。
CyAm-5炔(5c).产率65％，114mg，始于0.2毫摩尔3c。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.14(s，1H)，8.25(d，2H，J＝14.2Hz)，7.88(s，2H)，7.85(s，1H)，7.71(d，2H，J＝8.1Hz)，7.54(d，1H，J＝8.8Hz)，7.40(d，2H，J＝8.4Hz)，7.31(t，1H，J＝7.9Hz)，6.38(d，2H，J＝14.2Hz)，4.26(m，4H)，4.12(s，1H)，3.05(t，2H，J＝6.8Hz)，2.61(t，2H，J＝6.8Hz)，1.74(s，12H)，1.23(t，6H，J＝7.3Hz).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ172.81，171.24，153.59，145.20，141.57，140.79，139.28，132.49，129.14，126.39，126.13，122.19，121.91，119.99，119.77，110.03，99.83，83.33，80.47，48.98，38.70，35.49，26.84，20.30，12.11.HRMS-ESI[M]+m/z按[C40H44N3O7S2]+计算742.2615，实测742.2612.
光学性质.荧光团的吸收光谱和消光系数在Varian Cary 50-Bio紫外可见分光光度计上获得。消光系数在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，即10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、27mM氯化钾和137mM氯化钠中测量，并且对至少3组平行实验取平均。对于每个试验，在Mettler AT201分析天平上称出2-3mg经HPLC纯化的染料，误差±0.01mg，将其溶于去离子水中，使用10mL容量瓶来制备储备溶液。
发射光谱在Varian Cary Eclipse荧光分光光度计上采集。针对每个染料衍生物，在至少8次试验上进行量子产率测量，其中每个样品的最大吸收小于0.1，使用Cy5作为标准物(Φ＝0.27)(Mujumdar，R.B.，Ernst，L.A.，Mujumdar，S.R.，Lewis，C.J.，and Waggoner，A.S.(1993)Cyanine dye labelingreagents：sulfoindocyanine succinimidyl esters.Bioconjug.Chem.4，105-11)。消光系数和量子产率测量二者的标准偏差均小于5％。CyAm-5酸在PBS缓冲液(pH 7.0)中的归一化吸收和发射光谱示于图3中。
光稳定性数据在装备450W氙灯(Ushio inc.Japan)的Horiba Jobin YvonFluorolog-3荧光分光光度计(Edison，NY)上采集。通过监控吸光度匹配的染料样品(吸光度＜0.1)在激发波长620nm下60分钟的荧光发射，观察染料光漂白。CyAm-5酸和Cy5标准物在PBS缓冲液(pH 7.0)中的光稳定性数据示于图4中。在620nm辐照60分钟之后，42％的CyAm-5酸(18nM)被光漂白，而处于相当吸收的Cy5的54％被光漂白。因此，CyAm-5酸的光稳定性比Cy5好28％。
荧光标记和细胞成像.将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞保持在5％CO2、水饱和的气氛中，在F12HAMS培养基中生长，该培养基补充有10％FBS、1％Penstrep和1％L-谷氨酰胺。对于生物标记实验，在8孔LabTek II分室载玻片(Nunc)上将细胞温育在普通培养基或者补充有100μM Ac4ManNAc(Molecular Probes)的培养基中2～3天。轻轻抽吸培养基，通过用甲醇处理10分钟然后丙酮处理1分钟来在-20℃固定细胞。然后用500μLPBS(pH 7.0)洗涤细胞3次，并用生物正交反应溶液在室温处理1～2小时，所述生物正交反应溶液含有20μM CyAm-5炔、100μM CuSO4/100μM三[(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)(若提及时)、和1mM抗坏血酸钠在PBS(pH 7.0)中的溶液。在即将成像之前，将含有DAPI的Vectra Shield封固培养基(VectorLabs)施用于细胞。荧光图像在具有40X物镜的Nikon Eclipse TE2000-S荧光显微镜(装备Photometrics Cascade 512B CCD相机)上获取，其中使用来自Chroma Technology的激发和发射滤波器。对于核染剂(nuclear stain)和羰花青染料通道，分别采用200和1000ms的暴露时间用于图像采集。
图5显示用CyAm-5炔标记的CHO细胞的荧光显微图像。在存在Cu(I)/TBTA作为催化剂下用CyAm-5炔处理之后，展示用补充叠氮基-糖的培养基(顶部)或者未进行补充的培养基(底部)温育的细胞。图中示出，用DAPI染色的细胞核颜色为蓝色(左)，来自CyAm-5炔的荧光信号的颜色为红色(中心)和合并的图像(右)。比例尺代表50μm。
图6A-6B显示用CyAm-5炔和对照标记的CHO细胞的荧光成像。用CyAm-5炔标记具有叠氮基-糖的细胞(行1-4)和普通细胞(行5-8)，其中存在Cu(I)和配体TBTA(行1和5)，仅仅存在Cu(I)(行2和6)，仅仅存在TBTA(行3和7)，或不存在Cu(I)和配体TBTA(行4和8)。用DAPI染色的细胞核、CyAm-5炔标记的荧光、以及上述二者的合并图分别示于左、中和右列。
图7显示五次甲基羰花青染料在PBS缓冲液(pH 7.0)中的光稳定性。具有相同吸收(A620nm＜0.1)的染料样品在620nm辐照1小时。两种可与生物结合的新型染料(CyAm-5酸和CycloCyAm-5酸)分别具有30％和12％的光漂白，比Cy5(45％)更光稳定。
所有来自羰花青染料通道的图像都用相同的均化进行处理。
与通过从乙醚中沉淀的染料简单分离和组合，各染料浓集物的总产率均接近65％，即使在HPLC纯化后也是如此(图2)。与和多次甲基支架相连的官能团无关，3种染料衍生物(CyAm-5酸(5a)、CyAm-5叠氮(5b)和CyAm-5炔(5c))的光学性质都几乎相同。CyAm-5酸的吸收和发射光谱示于图3。CyAm-5酸具有典型的五次甲基花青染料的光学特性，其最大吸收和最大发射分别位于642和658nm。这3种染料的最大吸收和最大发射均相对于Cy5蓝移约5nm；而它们的斯托克位移与Cy5几何形同，为约16nm。图8总结了单官能染料(CyAm-5酸(5A)、CyAm-5叠氮(5B)、CyAm-5炔(5C))的光学性质。这3种新型染料都极其明亮，消光系数大于215,000M-1em-1，量子产率为0.17以上。
此外，新型染料比具有未取代的多次甲基链的典型花青衍生物具有更好的光稳定性。如图4中所示，在1小时照射之后，CyAm-5酸显示比Cy5少28％的光漂白。
由于它们的明亮荧光、长波长的吸收和发射以及能适应各种用于结合反应的官能团，这种新型花青染料应有用于许多生物标记和成像应用中。例如，CyAm-5酸可便利地转化为其相应的活性琥珀酰亚胺基酯(未出版数据。在无水DMF中，在4当量碳酸二琥珀酰亚胺基酯和4当量三乙胺存在下反应在1小时内室温完成)，用于与含胺的分子结合。CyAm-5叠氮和CyAm-5炔具有各种潜在的用途，其中它们可用作点击反应中的组分。此外，CyAm-5叠氮的芳基叠氮化物可用于光交联实验。
最近基于点击化学的荧光标记方法已经发展用于可视化在用含叠氮化物的糖培养的细胞中的糖蛋白(Baskin，J.M.，Prescher，J.A.，Laughlin，S.T.，Agard，N.J.，Chang，P.V.，Miller，I.A.，Lo，A.，Codelli，J.A.，and Bertozzi，C.R.(2007)Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 104，16793-7；Sawa，M.，Hsu，T.L.，Itoh，T.，Sugiyama，M.，Hanson，S.R.，Vogt，P.K.，and Wong，C.H.(2006)Glycoproteomic probes forfluorescent imaging of fucosylated glycans in vivo.Proc.Natl.Acad. Sci.USA103，12371-6；Hsu，T.L.，Hanson，S.R.，Kishikawa，K.，Wang，S.K.，Sawa，M.，and Wong，C.H.(2007)Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualizationof glycoconjugates in cells.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 104，2614-9)。我们已经修改该糖标记系统，来说明我们的单官能染料能在生物相关系统中进行有效的生物正交反应。
首先，通过用含有的叠氮基乙酰甘露糖胺的培养基培养细胞3天制备叠氮糖改性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。然后，用甲醇/丙酮固定这些细胞，在铜(I)作为催化剂下用CyAm-5炔进行标记。如图5所示，当与不含有叠氮-甘露糖胺的对照细胞相比，在其糖蛋白中具有叠氮唾液酸的的细胞显示增强的荧光信号，这表明用CyAm-5炔标记细胞通过形成三唑连接键实现。荧光信号的增强仅在存在催化剂Cu(I)和叠氮聚糖二者的情况下观察到(图6A-B)。Cu(I)螯合配体(三苄基三唑基甲基胺(TBTA))促进该反应，但不是有效标记细胞所必需的。用CyAm-5炔荧光标记CHO细胞需要Cu(I)和叠氮基-糖二者的处置，这表明所得的点击反应是用于细胞标记的选择性生物正交方法。
实施例2.基于苯并吲哚鎓和吲哚鎓衍生物的示例性羰花青染料的合成和表征
Figure BDA0000074241710000341
(1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丙磺酸盐(苯并吲哚-1)的合成：
将1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚(苯并吲哚-1，10.43g，50mmol)溶于20mL二氯苯中。然后向溶液中加入1，3-丙磺内酯(6.73g，55mmol)，将混合物在155℃于密封的烧瓶中加热1小时。冷却后，通过加入乙酸乙酯来沉淀苯并吲哚鎓盐，过滤收集该盐。产物通过LCMS得到确认，纯度大于99％。产率：96％，16.6g。
Figure BDA0000074241710000342
1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-8-磺酸(苯并吲哚-2)的合成：
向7-氨基萘-2-磺酸(19.28g，83mmol)在5mL H2O/5mL DMF中的溶液中加入碳酸钠(6.35g)，历时30分钟，以溶解初始的萘。然后加入DMF使得反应混悬液的总体积为50mL。在加入3-溴-3-甲基丁-2-酮(21.3g，0.13mol)之后，将反应混合物在80℃加热48小时，用LCMS监控反应。然后真空除去溶剂。将所得的固体溶于50mL H2O中，通过加入浓盐酸来酸化溶液。过滤收集浅粉色的固体，然后再悬浮于50mL的10％盐酸中。将该悬浮液在80℃加热2天，直至通过LCMS监控到该中间体耗尽。通过从少量的热10％盐酸中重结晶得到纯的苯并吲哚-2。产率：62％，15.4g。
Figure BDA0000074241710000343
苯并吲哚-3a
8-磺酸酯基-(1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丙磺酸盐(苯并吲哚-3a)的合成：将苯并吲哚-2(2g，7mmol)溶于18.5ml丙磺内酯中，在密封烧瓶中在190℃加热4.5小时。冷却之后，将反应溶液倒至1L丙酮中。分离出所得固体，并将其在25mL的10％盐酸中在100℃加热2小时。使粗制反应混合物冷却，用二氯甲烷萃取。弃去二氯甲烷洗涤液。在除去溶剂之后，将粗制物溶于少量甲醇中，通过加入丙酮来析出沉淀。产率：69％，1.97g。
Figure BDA0000074241710000351
3-乙基-1，1，2-三甲基-8-磺基-1H-苯并[e]吲哚鎓(苯并吲哚-3b)的合成：
将苯并吲哚-2(1g，3.5mmol)溶于10mL乙基碘和20mL无水DMF中。将反应溶液在110℃微波辐照1小时。通过过滤收集预期产物。产率：38％，426mg。
Figure BDA0000074241710000352
1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-7，9-二磺酸钠(苯并吲哚-4a)的合成.
将6-氨基-1，3-萘二磺酸钠(27.83g，80mmol)溶于10mL H2O和90mLDMF中。然后将碳酸钠(8.48g，80mmol)加入反应溶液中。在加入3-溴-3-甲基丁-2-酮(19.8g，0.12mol)之后，将反应混合物在90℃加热2天。然后真空除去溶剂。将所得的粘性凝胶溶于10％HCl中，将其温育在90℃直至LCMS监控到中间体完全耗尽。通过真空除去溶剂得到粗产物，将其再溶于少量甲醇中。然后通过加入丙酮沉淀产物，接着通过加入碳酸钠直至pH 7.0，转化为钠盐。将苯并吲哚的甲醇溶液倒入大量异丙醇中然后过滤得到粉末形式的最终产物。产率：52％，15.4g。
7，9-二磺酸酯基-(1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丙磺酸盐(苯并吲哚-4b)的合成。将苯并吲哚-3(2.03g，5mmol)和乙酸钠(1.22g，15mmol)溶于25mL丙磺内酯中，在180℃加热3小时。然后将反应淤浆溶于少量乙醇中，通过加入丙酮来析出沉淀。过滤收集粗制品，在25mL乙醇中搅拌以除去过量的乙酸钠。过滤收集纯的产物。产率：(1.30g，47％)。
Figure BDA0000074241710000362
3-乙基-1，1，2-三甲基-7，9-二磺基-1H-苯并[e]吲哚鎓(苯并吲哚-5)的合成.将苯并吲哚-3(2.01g，5mmol)溶于10mL乙基碘和20mL无水DMF中。反应溶液在100℃微波辐照1小时。通过加入丙酮来沉淀出粗产物，用100％H2O从C18反相柱中洗脱出。产率：29％，632.4mg。
Figure BDA0000074241710000363
CyAm-A的合成：将苯并吲哚鎓1(408mg，1.22mmol)和丙二醛二苯胺中间体(94mg，0.22mmol)溶于3mL含5％v/v三乙胺的乙酸酐中。在密封烧瓶中将反应溶液在115℃加热1小时。然后加入乙醚沉淀粗制染料，接着用乙醚洗涤沉淀。粗制固体在0.1％TFA/水中温育1小时，然后在C18反相柱(Isolute)上纯化。通过将乙腈在0.1％TFA/H2O中的浓度逐步从2％增至25％，从柱中洗脱出纯产物。用阳离子交换柱将染料转化为其钠盐。产率：42％，98.7mg。
CyAm-B的合成：将苯并吲哚鎓2(515mg，1.20mmol)和丙二醛二苯胺中间体(100mg，0.24mmol)溶于3mL含5％v/v TEA的乙酸酐中。根据针对CyAm-A详述的步骤进行反应。粗产物在C18反相柱上纯化。纯的染料以15％MeCN在0.1％TFA/H2O中的溶液洗脱。通过阳离子交换将染料转化为钠盐。产率：44％，129.2mg。
Figure BDA0000074241710000372
CyAm-C的合成：将苯并吲哚鎓3(390.4mg，1.23mmol)和丙二醛二苯胺中间体(95mg，0.22mmol)溶于3mL含5％v/v TEA的乙酸酐中，在115℃加热1小时。对粗产物按照针对CyAm-A的步骤进行后处理和纯化。纯的染料用10％MeCN在0.1％TFA/H2O中的溶液洗脱。通过阳离子交换将染料转化为钠盐。产率：55％，124.2mg。
Figure BDA0000074241710000381
CyAm-D的合成：将苯并吲哚鎓4(610.6mg，1.23mmol)和丙二醛二苯胺中间体(95mg，0.22mmol)溶于2mL乙酸酐、1mL乙酸和5％v/v TEA中，在115℃加热1小时。对粗产物按照用于CyAm-A的步骤进行后处理。C18使用反相柱(Varian)纯化粗产物。纯的染料用5％MeCN在0.1％TFA/H2O中的溶液洗脱。通过阳离子交换将染料转化为其钠盐。产率：43％，146.9mg。
Figure BDA0000074241710000382
CyAm-E的合成：将苯并吲哚鎓3(393.6mg，0.9mmol)和丙二醛二苯胺中间体(49mg，0.11mmol)溶于3mL含5％v/v TEA的乙酸酐中，在115℃加热1小时。对粗产物按照针对CyAm-A所用的步骤进行后处理和纯化。纯的染料用10％MeCN在0.1％TFA/H2O中的溶液洗脱。通过阳离子交换将染料转化为钠盐。产率：54％，77.1mg。
Figure BDA0000074241710000383
CycloCyAm-5酸的合成：遵循针对CyAm-5染料报道的方法合成染料。将吲哚鎓6(0.2mmol)和丙二醛二苯胺酸衍生物(0.05mmol)溶于2mL包含1％TEA的2∶1乙酸酐/乙酸混合物中。反应溶液在115℃加热1小时。冷却后，加入大量乙醚沉淀出粗产品，通过制备性HPLC进行纯化。
图7示例说明了示例性五次甲基羰花青染料在PBS缓冲液(pH 7.0)中的光稳定性。将具有相同吸收(A620nm＜0.1)的染料样品在620nm辐照1小时。两种可生物结合的新型染料(CyAm-5酸和CycloCyAm-5酸)分别显示30％和12％的光漂白，它们比Cy5(45％)更光稳定。
实施例3.CyAl-5和CyAl-5.5的合成
合成7-(苯基氨基)-6-((E)-(苯基亚胺基)甲基)庚-6-烯酸盐酸盐(1)
Figure BDA0000074241710000391
在搅拌下，历时5分钟将光气(50mmol的20％w/w在甲苯中的溶液)加入冰浴中的N，N-二甲基甲酰胺(3.9mL，50mmol)中，得到白色糊状物。使该混合物静置，直至不再观察到气体生成(～30分钟)。然后将遵循公开的方法将由环庚烯制备的7，7-二甲氧基庚酸甲酯(5.1g，25mmol)(Claus，R.E.，andSchreiber，S.L.(1986)Ozonolytic cleavage of cyclohexene to terminallydifferentiated products：methyl 6-oxohexanoate，6，6-dimethoxyhexanal，methyl6，6-dimethoxyhexanoate.Organic Syntheses 64，150-156.)滴加到反应溶液中，接着在70℃加热1小时。冷却后，旋转蒸发除去溶剂得到黄棕色油状物。将该油状物混悬在水(20mL)中，然后加入5mL的10％盐酸和苯胺盐酸盐(6.5g，50mmol)。将所得的混合物密封在厚壁玻璃耐压管中，在油浴中120℃加热1.5小时。在加热之后，历时2小时使反应溶液缓慢冷却至室温，期间产品结晶析出(如果反应混合物冷却太快，则取而代之的是，形成粘稠的沉淀)。在过滤和水洗之后，得到1，其为黄色固体(2.05g，23％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.72(d，2H，J＝12Hz)，7.58(d，4H，J＝8.4Hz)，7.51(t，4H，J＝8.0Hz)，7.30(t，4H，J＝7.2Hz)，2.77(t，2H，J＝6.4Hz)，2，27(t，2H，J＝7.6Hz)，1.71-1.64(m，2H)，1.50-1.42(m，2H).HRMS-ESI[M]+m/z按[C20H23N2O2]+计算323.1754，实测323.1743。
Figure BDA0000074241710000401
CyAl-5的合成方法(类似方法用于制备CyAl-5.5)：
将4当量吲哚鎓2(107mg，0.4mmol)或者苯并吲哚鎓与1当量1(32mg，0.1mmol)溶于1mL乙酸/乙酸酐/三乙胺(5∶5∶1)中。然后通过在密封的厚壁玻璃耐压管中在110℃加热反应溶液45分钟，形成染料。粗制的荧光物通过C18柱色谱纯化，其中用30％乙腈和0.1％三氟乙酸在水中的溶液洗脱。CyAl-5.产率39％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.18(d，2H，J＝14Hz)，7.82(s，2H)，7.65(d，2H，J＝8.2Hz)，7.35(d，2H，J＝8.4Hz)，6.18(d，2H，J＝14Hz)，4.24-4.19(m，4H)，2.63(t，2H，J＝7.4Hz)，2.31(t，2H，J＝8.0Hz)，1.71(s，12H)，1.68(t，2H，J＝7.8Hz)，1.50-1.47(m，2H)，1.28(t，6H，J＝7.2Hz).HRMS-ESI[M-2H]-m/z按[C34H41N2O9S2]-计算669.2310，实测669.2252。CyAl-5.5.产率40％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.27-8.24(m，4H)，8.20(d，2H，J＝8.8Hz)，8.16(d，2H，J＝8.8Hz)，7.87(d，2H，J＝8.6Hz)，7.76(d，2H，J＝8.8Hz)，6.21(d，J＝14.3Hz)，4.31(m，4H)，2.68-2.64(m，2H)，2.09(t，2H，J＝7.0Hz)，1.99(s，12H)，1.71(t，2H，J＝6.6Hz)，1.53(t，2H，J＝7.2Hz)，1.36(t，6H，J＝7.0Hz).HRMS-ESI[M-2H]-m/z按[C42H45N2O9S2]-计算769.2623，实测769.2493。
图9总结了CyAl-5和CyAl-5.5的光学性质。光谱在磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中获得。消光系数和染料最大吸收进行3次重复测量。CyAl-5的发射光谱在620nm激发，CyAl-5.5的发射光谱在640nm激发。CyAl-5和CyAl-5.5、Cy5和Cy5.5分别用作荧光标准物。数据为至少8次重复测量的平均，误差＜5％。
CyAl-5(A)和CyAl-5.5(B)的纯化
CyAl-5和CyAl-5.5均容易地使用便宜的预填充C18柱通过反相柱色谱高纯度地纯化(分别参见图10A和10B)。CyAl-5和CyAl-5.5经乙腈/水/0.1％三氟乙酸溶液(0-100％乙腈，历时30分钟)洗脱，并且适于化学和光学表征。通过用4当量碳酸二琥珀酰亚胺基酯和8当量三乙胺在无水DMF中进行处理，两种荧光物易于转化为其相应的反应性琥珀酰亚胺基酯。
制备CyAl-5(A)和CyAl-5.5(B)的活性酯
通过用4当量碳酸二琥珀酰亚胺基酯和8当量三乙胺在无水DMF中处理过夜，CyAl-5和CyAl-5.5二者均可转化为其相应的N-羟基琥珀酰亚胺基酯。活性染料产物通过用乙醚从反应混合物中沉淀出得到分离。
CyAl-5(A)和CyAl-5.5(B)的吸收和发射
改性的荧光物保持了与羰花青染料一致的光学性质。图11A和11B分别显示CyAl-5(A)和CyAl-5.5(B)在PBS缓冲液(pH 7.0)中的吸收(实线)和发射(虚线)光谱。CyAl-5和CyAl-5.5具有在远红外至近红外区的吸收和发射光谱，其与用于成像的可商购的Cy 5和Cy 5.5的常见的滤波器设置非常匹配(如www.gelifesciences.com上说明，Cy5和Cy5.5的λabs/λem分别是646/664nm和673/693nm)。所述新型染料是明亮的，CyAl-5和CyAl-5.5的消光系数分别为233,000和157,000M-1cm-1，量子产率分别为13％和12％。
CyAl-5(A)和CyAl-5.5(B)的光稳定性
相对差的光稳定性是采用羰花青染料用于生物成像的一个缺点。这对于要求连续辐照或者使用高功率激光激发的成像应用是尤其重要的。CyAl-5和CyAl-5.5二者都显示改善的光稳定性，在辐照30分钟之后，相对于Cy5和Cy5.5标准物，光分解分别减少21％和56％(分别参见图12A和12B)。在多次甲基链上烷基化显著改善了花青染料的光稳定性，尤其是具有大的芳族端基的那些。
实施例4.合成CyAm-7
4-((1E，3E)-6-羧基-4-((E)-(4-羧基苯基亚胺基)甲基)己-1，3-二烯基氨基)苯甲酸氢溴酸盐的合成：
Figure BDA0000074241710000411
在冰水浴上，将3-吡啶丙酸(10mmol，1.52g)和4-氨基苯甲酸(20mmol，2.74g)溶于75mL甲醇中。然后将溴化氰(10mmol，1.07g)在5mL甲醇中的溶液加入反应溶液中，历时5分钟。在搅拌2小时后过滤收集产物(1.02g，21％)，并用二氯甲烷洗涤。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ12.40(s，3H)，7.95-7.83(m，5H)，7.67-7.65(m，1H)，7.17(d，2H，J＝8.0Hz)，7.09(d，2H，J＝8.5Hz)，6.95(d，1H，J＝10.5Hz)，6.17(t，1H，J＝12.3Hz)，2.71(t，2H，J＝7.5Hz)，2.40(t，2H，J＝7.8Hz)。ESI[M+H]+m/z按[C22H21N2O6]+计算409.4，实测409.3。
CyAm-7的合成：
Figure BDA0000074241710000421
向4-((1E，3E)-6-羧基-4-((E)-(4-羧基苯基亚胺基)甲基)-己-1，3-二烯基氨基)苯甲酸氢溴酸盐(165.6mg，0.33mmol)在乙酸(2mL)和三乙胺(0.2mL)中的溶液中加入2，3，3-三甲基-1-(4-磺基丁基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(423.7mg，1.02mmol)。将反应混合物在110℃搅拌30分钟。冷却后，通过加入乙醚沉淀反应物，通过反相色谱(C18硅胶)纯化。用含有15％乙腈和0.1％TFA的水洗脱纯的CyAm-7(186mg，55％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.99(t，1H，J＝)，7.85(d，2H，J＝6Hz)，7.77(s，4H)，7.70(d，2H，J＝8.7Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.37-7.32(m，2H)，4.14(m，4H)，2.9(m，2H)，2.60-2.52(m，6H)，1.90-1.76(m，8H)，1.65(s，12H).HRMS-ESI[M+Na]2-m/z(z＝2)按[C45H50N3O15S4Na]2-计算511.6017，实测511.6017。
其它实施方式
应理解，尽管已经结合本发明的具体描述来描述本发明，但是前述的描述意在示例说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求定义。其它方面、优点和改变也在所附权利要求的范围内。

Claims (14)

1.式I的羰花青染料或者其可药用盐，
Figure FDA0000074241700000011
其中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
R3选自C(O)ORA和C(O)NRBRC；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-6烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或者4选自下面基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；
n为1、2、3或者4；以及
p为1或者2。
2.权利要求1的羰花青染料或者其可药用盐，其选自：
Figure FDA0000074241700000021
3.权利要求1的羰花青染料或者其可药用盐，其选自：
Figure FDA0000074241700000031
4.式I(b)的羰花青染料或者其可药用盐，
Figure FDA0000074241700000032
其中：X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R3选自C(O)ORA和C(O)NRBRC；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-6烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；
n为1、2、3或者4；以及
p为1或者2。
5.权利要求4的羰花青染料或者其可药用盐，其具有下面结构：
6.制备式I的羰花青染料或者其可药用盐的方法，
Figure FDA0000074241700000042
1
其中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD或者C(O)ORA；
R3选自C(O)ORA和C(O)NRBRC；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-6烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基、或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；
n为1、2、3或者4；以及
p为1或者2；
该方法包括：
使式I-(1)的丙二醛二苯胺或者其可药用盐与式I-(2)的吲哚鎓化合物或者其可药用盐经缩合反应得到式I的羰花青染料：
Figure FDA0000074241700000051
I-(1)
在式I-(1)中：
R4选自H和C1-6烷基；
R5选自C1-6烷基和芳基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有选自下述基团的取代基：C(O)ORA、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)RB、ORA、SRA、NRCRD、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基、或者马来酰亚胺基；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-4烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基、或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10；以及
p为1或者2；
Figure FDA0000074241700000061
在式I-(2)中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-4烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基、或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；以及
n为1、2、3或者4。
7.生物靶标的成像方法，该方法包括：
使与所述生物靶标特异性结合的靶向试剂与权利要求1的任一羰花青染料或其活性琥珀酰亚胺基酯接触足够长的时间，所述足够长的时间使得所述靶向试剂和权利要求1的羰花青染料反应形成化学键，由此用所述羰花青染料标记靶向试剂，得到标记的靶向试剂；
使所述生物靶标与所述标记的靶向试剂接触，以及
提供用所述标记的靶向试剂标记的所述生物靶标的荧光图像，由此对所述生物靶标成像。
8.权利要求7的方法，其中所述靶向试剂选自下组：抗体、蛋白质、肽、小分子、核酸、适体和表面改性的纳米颗粒。
9.权利要求7的方法，其中所述荧光图像通过荧光显微术提供。
10.权利要求7的方法，其中所述方法在活细胞中体内进行。
11.权利要求7的方法，其中所述生物靶标和所述羰花青染料经生物正交结合反应而反应。
12.权利要求11的方法，其中所述生物正交结合反应是1，3-偶极环加成反应。
13.式I-(2)的羰花青染料前体或者其可药用盐，
其中：
X选自O、NH、N(CH3)、S、Se、Te、C(CH3)2；
R1选自H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
或者2个彼此相邻的R1与其相连的C原子一起形成芳环，所述芳环任选地取代有1、2、3或4个独立地选自下述基团的取代基：H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、NO2、ORA、C(O)RB、C(O)NRCRD、C(O)ORA、OC(O)RB、OC(O)NRCRD、NRCRD、NRCC(O)RB、NRCC(O)NRCRD、NRCC(O)ORA、S(O)RB、S(O)NRCRD、S(O)2RB、NRCS(O)2RB、S(O)2NRCRD和P(ORB)2，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
R2为C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基任选地取代有S(O)2RB、NRCRD、或者C(O)ORA；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-4烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基、或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；以及
n为1、2、3或者4。
14.式I-(1)的丙二醛二苯胺或者其可药用盐，
Figure FDA0000074241700000081
其中：
R4选自H和C1-6烷基；
R5选自C1-6烷基和芳基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有选自下述基团的取代基：C(O)ORA、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)RB、ORA、SRA、NRCRD、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基、或者马来酰亚胺基；
RA、RB、RC和RD独立地选自H、C1-6烷基、芳基或者琥珀酰亚胺基，其中所述C1-6烷基和芳基任选地取代有1、2、3或4个选自下述基团的取代基：C(O)ORa1、C2-6烯基、C2-6炔基、N3、C(O)Rb1、ORa1、SRa1、NRc1Rd1、-S(O)2Cl、酰肼基、肼基、或者马来酰亚胺基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1独立地选自H和C1-6烷基；
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p为1或者2。
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