WO2018101473A1

WO2018101473A1 - 化合物、葉酸受容体可視化蛍光プローブ及びそれらの使用

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Publication number: WO2018101473A1
Application number: PCT/JP2017/043357
Authority: WO
Inventors: 健二郎花岡; 泰照浦野; 宏治沼澤; 喬之池野; 雄紀星野
Original assignee: 国立大学法人東京大学
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2018-06-07

Abstract

一般式（１）で表される化合物。（式中、ＸはＳｉＲ_２、ＧｅＲ_２、ＳｎＲ_２、ＣＲ_２、ＳＯ_２又はＰＯＲ'である。前記Ｒは炭素数１以上１０以下のアルキル基である。前記Ｒ'は炭素数１以上１０以下のアルキル基、水酸基又はフェニル基である。Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成していてもよい。Ｒ^１８は下記式（２）で表される基である。ｎ^１１は１以上４以下の整数である。ｎ^１２及びｎ^１３は１以上３以下の整数である。）

Description

化合物、葉酸受容体可視化蛍光プローブ及びそれらの使用

　本発明は、化合物、葉酸受容体可視化蛍光プローブ及びそれらの使用に関する。具体的には、本発明は、化合物、葉酸受容体可視化蛍光プローブ、葉酸受容体の検出方法、葉酸受容体検出用キット、がん検出用マーカー及び神経管閉鎖検出用マーカーに関する
　本願は、２０１６年１２月２日に、米国に仮出願された米国特許第６２／４２９，０７３号明細書に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

　葉酸（ｆｏｌｉｃ　ａｃｉｄ：ＦＡ）はヌクレオチドやアミノ酸の生成原料、ＤＮＡやタンパク質のメチル化に関与する水溶性ビタミンの一つである。また、葉酸受容体（Ｆｏｌａｔｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＦＲ）は葉酸を細胞内に取り込む役割を担うタンパク質である。

一方、腫瘍組織においては葉酸受容体の発現箇所は報告例だけでも卵巣、腎臓、肺、脳、子宮内膜、結腸、膵臓、胃、前立腺、精巣、膀胱、乳房に及んでおり、特に卵巣癌や子宮内膜腫瘍での発現が注目を集めている。これら腫瘍組織ではＦＲαの高い発現が報告されているため、がん治療におけるターゲット分子の一つとして注目されている。

また、葉酸は胎児の神経管形成不全を予防するため、妊娠時にサプリメント等で補うことが推奨されている栄養素であり、葉酸の追加摂取により神経管閉塞障害の奇形児の誕生が減少したとの報告がある。動物実験においては葉酸受容体が欠損しているマウスは神経管形成期に死亡するという報告、マウス胚において神経管閉鎖部で葉酸受容体の発現をｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎにより検出したとの報告がある。

　蛍光イメージング技術においては、近年、がん摘出手術中に正常組織とがん組織とを見分けるという臨床報告や、生命科学研究用の葉酸受容体を可視化する蛍光試薬の開発が依然として報告されている等、生物学応用や臨床応用を目指した研究が盛んに行われている。

また、２０１３年には市販の近赤外蛍光色素Ｄｙｌｉｇｈｔシリーズを蛍光団に用いたプローブＦｏｌａｔｅ－Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０とＦｏｌａｔｅ－Ｄｙｌｉｇｈｔ　７５０とが報告された。これらのプローブは転移性の腫瘍を形成させた腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏイメージング実験において、プローブを静脈注射後4時間で腫瘍組織のイメージングを達成している。さらに、特許文献１では、マウス投与後２．５時間で腫瘍の可視化を達成したＯＴＬ３８が、臨床試験（ｐｈａｓｅ　ＩＩ）の段階にあることが報告されている。

米国特許出願公開第２０１６／０１１１９９号明細書

　しかしながら、何れの蛍光試薬も動物個体への投与後、標的腫瘍部位とそれ以外の部位とでコントラストをつけるためには余剰分のプローブの排泄を待つ必要があった。そのため、プローブの排泄にかかる時間が短縮され、リアルタイム且つ高感度に蛍光観察が可能なプローブが求められていた。

　また、市販のプローブであるＦｏｌａｔｅＲＳｅｎｓｅ　６８０を培養細胞に適用したところ、葉酸受容体が発現している細胞（ＫＢ細胞）から蛍光シグナルが確認できるのみならず、葉酸受容体非発現細胞（ＯＶＣＡＲ－３）の内部からも蛍光シグナルが観察されることが分かった。このことから、培養細胞において葉酸受容体非依存的に細胞内に取り込まれ蛍光を発することが、動物実験における腫瘍部以外のバックグラウンド蛍光の一因であると考えられ、葉酸受容体依存的に取り込まれるプローブが求められていた。

　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、葉酸受容体をリアルタイム且つ高感度に蛍光観察が可能であり、葉酸受容体依存的に取り込まれる新規化合物を提供する。

　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る化合物は、下記一般式（１）で表される化合物である。

（式中、ＸはＳｉＲ_２、ＧｅＲ_２、ＳｎＲ_２、ＣＲ_２、ＳＯ_２又はＰＯＲ’である。前記Ｒは炭素数１以上１０以下のアルキル基である。前記Ｒ’は炭素数１以上１０以下のアルキル基、水酸基又はフェニル基である。Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７はそれぞれ独立にハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成していてもよい。Ｒ^１８は下記式（２）で表される基である。ｎ^１１は０以上４以下の整数である。ｎ^１２及びｎ^１３は０以上３以下の整数である。）

（式中、Ｙ^１１は側鎖にアミノ基を有する親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１２は単結合又は親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１３は水酸基又は親水性アミノ酸残基である。）

　前記ＸはＳｉＲ_２である請求項１に記載の化合物。

　上記第１態様に係る化合物において、前記Ｙ^１１はアスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基又はアルギニン残基であってもよい。

　上記第１態様に係る化合物において、複数あるＲ^１１のうち少なくとも一つがメチル基又はカルボキシ基であってもよい。

上記第１態様に係る化合物において、前記Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はメチル基又はエチル基であってもよい。

上記第１態様に係る化合物において、前記Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成していてもよい。

　本発明の第２態様に係る化合物は、下記一般式（１－１）で表される化合物である。

（式中、Ｒ^１１１はメチル基又はカルボキシ基である。Ｒ^１２及びＲ^１７はそれぞれ独立にハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成していてもよい。Ｒ^１８は下記式（２）で表される基である。Ｒ^１９及びＲ^２０はそれぞれ独立に炭素数１以上１０以下のアルキル基である。ｎ^１２及びｎ^１３は０以上３以下の整数である。）

　上記第２態様に係る化合物において、前記Ｙ^１１はアスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基又はアルギニン残基であってもよい。

　上記第２態様に係る化合物において、前記Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はメチル基又はエチル基であってもよい。

　上記第２態様に係る化合物において、前記Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成していてもよい。

　本発明の第３態様に係る化合物は、下記式（１－１－１）又は（１－１－２）で表される化合物である。

　本発明の第４態様に係る葉酸受容体イメージングプローブは、上記第１態様に係る化合物、上記第２態様に係る化合物又は上記第３態様に係る化合物を含む。

　本発明の第５態様に係る葉酸受容体の検出方法は、上記第４態様に係る葉酸受容体イメージングプローブを用いる方法である。

　本発明の第６態様に係る葉酸受容体検出用キットは、上記第４態様に係る葉酸受容体イメージングプローブを備える。

　本発明の第７態様に係るがん検出用マーカーは、上記第４態様に係る葉酸受容体イメージングプローブを含む。

　上記第７態様に係るがん検出用マーカーにおいて、前記がんが、卵巣癌又は子宮内膜腫瘍であってもよい。

　本発明の第８態様に係る神経管閉鎖検出用マーカーは、上記第４態様に係る葉酸受容体イメージングプローブを含む。

　上記態様の化合物は、葉酸受容体依存的に取り込まれ、葉酸受容体をリアルタイム且つ高感度に蛍光観察することが可能である。

実施例１におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及び２－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０の吸収スペクトルである。実施例１におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及び２－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０の蛍光スペクトルである。実施例１におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２及び２－Ｍｅ　ＳｉＲ６５０の吸収スペクトルである。実施例１におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２及び２－Ｍｅ　ＳｉＲ６５０の蛍光スペクトルである。実施例２におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。実施例２におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。実施例２におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたＯＶＣＡＲ－３細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。実施例２におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたＯＶＣＡＲ－３細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。比較例１におけるＦｏｌａｔｅＲＳｅｎｓｅ　６８０を用いたＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。比較例１におけるＦｏｌａｔｅＲＳｅｎｓｅ　６８０を用いたＯＶＣＡＲ－３細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。実施例３における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。実施例３における１ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。実施例３における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。実施例３における１ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。実施例４におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、真ん中は明視野像であり、右側は、左側の蛍光像の破線で囲った部分の拡大図である。また、左側の図及び真ん中の図において、スケールバーは２００μｍを示す。右側の図において、スケールバーは５０μｍを示す。実施例４におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、真ん中は明視野像であり、右側は、左側の蛍光像の破線で囲った部分の拡大図である。また、左側及び真ん中の画像において、スケールバーは２００μｍを示す。右側の画像において、スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１で染色せずに４％ホルムアルデヒド溶液で固定化処理したＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは２０μｍを示す。実施例５におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１で染色後、４％ホルムアルデヒド溶液で固定化処理したＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは２０μｍを示す。実施例５における４％ホルムアルデヒド溶液で固定化処理後、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１で染色したＫＢ細胞の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは２０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。破線で囲んだ部分は、葉酸受容体が発現していると思われる領域を示す。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。図９Ａの破線で囲んだ部分を含む領域の拡大像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。破線で囲んだ部分は、葉酸受容体が発現していると思われる領域を示す。実線で囲んだ部分は、死細胞と思われる領域を示す。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。図９Ｃの破線で囲んだ部分を含む領域の拡大像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。破線で囲んだ部分は、葉酸受容体が発現していると思われる領域を示す。実線で囲んだ部分は、死細胞と思われる領域を示す。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。図９Ｅの破線で囲んだ部分を含む領域の拡大像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。図９Ｇの拡大像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは５０μｍを示す。実施例５における１ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。スケールバーは５０μｍを示す。実施例６におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたＫＢ細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。Ｔは腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）を示し、Ｍは非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）を示す。また、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例６におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。実施例６におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの各種臓器の蛍光イメージングの結果を示す画像である。上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例６におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたＫＢ細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。Ｔは腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）を示し、Ｍは非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）を示す。また、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例６におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。実施例６におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの各種臓器の蛍光イメージングの結果を示す画像である。上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例７におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。Ｔは腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）を示し、Ｍは非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）を示す。また、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例７におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。実施例７におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスの各種臓器の蛍光イメージングの結果を示す画像である。上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例７におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。Ｔは腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）を示し、Ｍは非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）を示す。また、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例７におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を投与したＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。実施例７におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を投与したＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスの各種臓器の蛍光イメージングの結果を示す画像である。上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例８における６ｍＭの葉酸存在下でＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。Ｔは腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）を示し、Ｍは非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）を示す。また、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例８における６ｍＭの葉酸存在下でＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。実施例８における６ｍＭの葉酸存在下でＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの各種臓器の蛍光イメージングの結果を示す画像である。上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。実施例９におけるＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いた市販のヒト卵巣腫瘍組織アレイの蛍光イメージングの結果を示す蛍光像である。実施例９における抗葉酸受容体抗体を用いた市販のヒト卵巣腫瘍組織アレイの免疫染色像である。

≪化合物（１）≫
本実施形態の化合物は、下記一般式（１）で表される化合物（以下、「化合物（１）」と称する場合がある）である。

　化合物（１）は、葉酸にペプチドリンカーを介して蛍光性化合物が結合した構造を有する。

＜Ｘ＞
　一般式（１）中、ＸはＳｉＲ_２、ＧｅＲ_２、ＳｎＲ_２、ＣＲ_２、ＳＯ_２又はＰＯＲ’である。中でも、ＸはＳｉＲ_２であることが好ましい。

［Ｒ］
　Ｒは炭素数１以上１０以下のアルキル基である。
Ｒにおける前記アルキル基は、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれでもよく、環状である場合、単環状及び多環状のいずれでもよい。前記アルキル基は、炭素数が１以上１０以下であり、１以上８以下であることが好ましく、１以上６以下であることがより好ましく、１以上５以下であることがさらに好ましく、１以上３以下であることが特に好ましい。

　直鎖状又は分岐鎖状の前記アルキル基は、炭素数が１以上１０以下であり、前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、２，２－ジメチルペンチル基、２，３－ジメチルペンチル基、２，４－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、３－エチルペンチル基、２，２，３－トリメチルブチル基、ｎ－オクチル基、イソオクチル基、２－エチルヘキシル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。

　直鎖状又は分岐鎖状の前記アルキル基は、炭素数が１以上８以下であることがが好ましく、１以上６以下がより好ましく、１以上５以下がさらに好ましく、１以上３以下が特に好ましい。

　環状の前記アルキル基は、炭素数が３以上１０以下であり、前記アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、ノルボルニル基、イソボルニル基、１－アダマンチル基、２－アダマンチル基等が挙げられ、さらに、これら環状のアルキル基の１個以上の水素原子が、直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基で置換されたものが挙げられる。ここで、水素原子を置換する直鎖状、分岐鎖状及び環状のアルキル基としては、Ｒにおけるアルキル基として例示した上記のものが挙げられる。

　環状の前記アルキル基は、炭素数が３以上８以下であることが好ましく、３以上６以下であることがより好ましく、５以上７以下であることがさらに好ましい。

　環状の前記アルキル基は、単環状であることが好ましい。

　Ｒにおける前記アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であることが好ましく、直鎖状がより好ましい。

　Ｒは、炭素数１以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることが好ましく、炭素数１以上６以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることがより好ましく、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることがさらに好ましく、炭素数１以上３以下の直鎖状のアルキル基、（すなわち、メチル基、エチル基又はｎ－プロピル基）であることが特に好ましい。

［Ｒ’］
　Ｒ’は炭素数１以上１０以下のアルキル基、水酸基（－ＯＨ）又はフェニル基（－Ｐｈ；Ｃ_６Ｈ_５）である。

　Ｒ’における前記アルキル基としては、上記Ｒにおける前記アルキル基として例示されたものと同様のものが挙げられる。

＜Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７＞
　一般式（１）中、Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７はそれぞれ独立にハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基（－ＯＨ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、アミノ基（－ＮＨ_２）又はアミド基（－ＣＯ－ＮＨ－）である。

　Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７における前記ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

前記ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であることが好ましい。

　Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７における前記アルキル基としては、上記Ｒにおける前記アルキル基として例示されたものと同様のものが挙げられる。

Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７における前記アルコキシ基としては、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれでもよく、環状である場合、単環状及び多環状のいずれでもよい。前記アルキル基は、炭素数が１以上１０以下であり、１以上８以下であることが好ましく、１以上６以下であることがより好ましく、１以上５以下であることがさらに好ましく、１以上３以下であることが特に好ましい。

　直鎖状又は分岐鎖状の前記アルコキシ基は、炭素数が１以上１０以下であり、前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ペンチルオキシ基、１－メチルブトキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、２－メチルペンチルオキシ基、３－メチルペンチルオキシ基、２，２－ジメチルブトキシ基、２，３－ジメチルブトキシ基、ｎ－ヘプチルオキシ基、２－メチルヘキシルオキシ基、３－メチルヘキシルオキシ基、２，２－ジメチルペンチルオキシ基、２，３－ジメチルペンチルオキシ基、２，４－ジメチルペンチルオキシ基、３，３－ジメチルペンチルオキシ基、３－エチルペンチルオキシ基、２，２，３－トリメチルブトキシ基、ｎ－オクチルオキシ基、イソオクチルオキシ基、２－エチルヘキシルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基等が挙げられる。

　直鎖状又は分岐鎖状の前記アルコキシ基は、炭素数が１以上８以下であることがが好ましく、１以上６以下がより好ましく、１以上５以下がさらに好ましく、１以上３以下が特に好ましい。

　環状の前記アルコキシ基は、炭素数が３以上１０以下であり、前記アルコキシ基としては、例えば、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロヘプチルオキシ基、シクロオクチルオキシ基、シクロノニルオキシ基、シクロデシルオキシ基、ノルボルニルオキシ基、イソボルニルオキシ基、１－アダマンチルオキシ基、２－アダマンチルオキシ基等が挙げられ、さらに、これら環状のアルコキシ基の１個以上の水素原子が、直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基で置換されたものが挙げられる。ここで、水素原子を置換する直鎖状、分岐鎖状及び環状のアルキル基としては、Ｒにおけるアルキル基として例示した上記のものが挙げられる。

　環状の前記アルコキシ基は、炭素数が３以上８以下であることが好ましく、３以上６以下であることがより好ましく、５以上７以下であることがさらに好ましい。

　環状の前記アルコキシ基は、単環状であることが好ましい。

　Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７における前記アルコキシ基は、直鎖状又は分岐鎖状であることが好ましく、直鎖状がより好ましい。

　Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７における前記ヒドロキシアルキル基としては、Ｒにおける前記アルキル基のうち、少なくとも１つの水素が水酸基（ヒドロキシ基）に置換されたものが挙げられる。具体的には、例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基等が挙げられ、これらに限定されない。

　中でも、Ｒ^１１は炭素数１以上８以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基又はカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）であることが好ましく、炭素数１以上６以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基又はカルボキシ基であることがより好ましく、炭素数１以上５以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基又はカルボキシ基であることがさらに好ましく、炭素数１以上３以下の直鎖状のアルキル基（すなわち、メチル基、エチル基若しくはｎ－プロピル基）又はカルボキシ基であることが特に好ましい。

　特に、ｎ^１１が２以上の整数である場合、複数個のＲ^１１のうち少なくとも一つがメチル基又はカルボキシ基であることが好ましく、カルボキシ基であることがより好ましい。

　また、Ｒ^１１がメチル基又はカルボキシ基である場合、ベンゼン環上において、Ｒ^１１はキサンテン環構造に対してオルト位にあることが好ましい。

　中でも、Ｒ^１２及びＲ^１７はそれぞれ独立に、ハロゲン原子又は炭素数１以上８以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることが好ましく、ハロゲン原子又は炭素数１以上６以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることがより好ましく、ハロゲン原子又は炭素数１以上５以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることがさらに好ましく、ハロゲン原子又は炭素数１以上３以下の直鎖状のアルキル基（すなわち、メチル基、エチル基若しくはｎ－プロピル基）であることが特に好ましい。

＜ｎ^１１＞
　一般式（１）中、ｎ^１１は０以上４以下の整数である。
　ｎ^１１は、化合物（１）（より具体的にはベンゼン環）におけるＲ^１１の結合数である。

　ｎ^１１が１以上４以下の整数である場合、化合物（１）（より具体的にはベンゼン環）において、Ｒ^１１は、ベンゼン環を構成している４個の炭素原子のいずれかに結合している。

　化合物（１）において、ｎ^１１が２以上の整数である場合、複数個のＲ^１１は互いに同一でも異なっていてもよい。すなわち、Ｒ^１１はすべて同一であってもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみ同一であってもよい。そして、これら複数個のＲ^１１の組み合わせは、特に限定されない。

　ｎ^１１は、０以上３以下の整数であることが好ましく、０以上２以下の整数であることがより好ましく、０又は１であることがさらに好ましく、１であることが特に好ましい。

＜ｎ^１２及びｎ^１３＞
一般式（１）中、ｎ^１２及びｎ^１３は０以上３以下の整数である。
　ｎ^１２は、化合物（１）（より具体的にはキサンテン環構造に含まれる右側のベンゼン環）におけるＲ^１２の結合数である。ｎ^１３は、化合物（１）（より具体的にはキサンテン環構造に含まれる左側のベンゼン環）におけるＲ^１７の結合数である。

　ｎ^１２が１以上３以下の整数である場合、化合物（１）（より具体的にはキサンテン環構造に含まれる右側のベンゼン環）において、Ｒ^１２は、キサンテン環構造に含まれる右側のベンゼン環を構成する３個の炭素原子のいずれかに結合している。
　同様に、ｎ^１３が１以上３以下の整数である場合、化合物（１）（より具体的にはキサンテン環構造に含まれる左側のベンゼン環）において、Ｒ^１７は、キサンテン環構造に含まれる左側のベンゼン環を構成する３個の炭素原子のいずれかに結合している。

　化合物（１）において、ｎ^１２が２以上の整数である場合、複数個のＲ^１２は互いに同一でも異なっていてもよい。すなわち、Ｒ^１２はすべて同一であってもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみ同一であってもよい。そして、これら複数個のＲ^１２の組み合わせは、特に限定されない。
　同様に、化合物（１）において、ｎ^１３が２以上の整数である場合、複数個のＲ^１７は互いに同一でも異なっていてもよい。すなわち、Ｒ^１７はすべて同一であってもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみ同一であってもよい。そして、これら複数個のＲ^１７の組み合わせは、特に限定されない。

　ｎ^１２及びｎ^１３は、それぞれ独立に０以上２以下の整数であることが好ましく、０又は１であることがより好ましく、０であることがさらに好ましい。

＜Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６＞
一般式（１）中、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基（－ＯＨ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、アミノ基（－ＮＨ_２）又はアミド基（－ＣＯ－ＮＨ－）である。

Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６は互いに同一でもよく、異なっていてもよい。すなわち、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はすべて同一であってもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみ同一であってもよい。そして、これらＲ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６の組み合わせは、特に限定されない。中でも、合成が容易であることから、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はすべて同一であることが好ましい。

　Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６における前記ハロゲン原子、前記炭素数１以上１０以下のアルキル基、前記炭素数１以上１０以下のアルコキシ基及び前記炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基としては、上記Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７における前記ハロゲン原子、前記炭素数１以上１０以下のアルキル基、前記炭素数１以上１０以下のアルコキシ基及び前記炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基として例示されたものと同様のものが挙げられる。

　中でも、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１以上８以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることが好ましく、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１以上６以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることがより好ましく、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１以上５以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であることがさらに好ましく、炭素数１以上３以下の直鎖状のアルキル基であることが特に好ましく、メチル基又はエチル基が最も好ましい。

　また、Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成していてもよい。

　Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７が形成する環は、単環であってもよく、２つ以上の単環がそれぞれの環の辺を互いに１つだけ供給してできる縮合環であってもよい。

　Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７が形成する環としては、例えば、ピロリジン、ピぺリジン、ヘキサメチレンイミン、モルホリン等が挙げられる。

＜Ｒ^１８＞
一般式（１）中、Ｒ^１８は、蛍光性化合物に相当し、下記式（２）で表される基（以下、「基（２）」と称する場合がある）である。

前記基（２）において、符号＊を付した結合は、蛍光性化合物であるＲ^１８中のキサンテン環構造に結合しているベンゼン環を構成する１個の炭素原子と、Ｒ^１８の結合先である葉酸に結合したペプチドリンカーのうち、Ｙ^１１に結合し、且つ、カルボニル基を構成している炭素原子と、の間で形成されている。

　また、化合物（１）中の立体障害を防止する観点から、Ｒ^１８は、ベンゼン環上において、キサンテン環構造に対してメタ位又はパラ位にあることが好ましく、メタ位にあることがより好ましい。

　また、ｎ^１１が１である、すなわち、化合物（１）がＲ^１１を１個有し、Ｒ^１１がベンゼン環上において、キサンテン環構造に対してオルト位にある場合、Ｒ^１８は、ベンゼン環上において、キサンテン環構造に対してメタ位にあり、且つ、Ｒ^１１に対してパラ位にあることが特に好ましい。

［Ｙ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３］
　一般式（２）中、Ｙ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３は、葉酸と蛍光性化合物とを結合するペプチドリンカーである。

一般式（２）中、Ｙ^１１は側鎖にアミノ基を有する親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１１として具体的には、例えば、アスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基、アルギニン残基等が挙げられる。

中でも、Ｙ^１１としては、アスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基又はアルギニン残基であることが好ましい。

　一般式（２）中、Ｙ^１２は単結合又は親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１２として具体的には、例えば、グリシン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、システイン残基等が挙げられる。

　中でも、Ｙ^１２としては、単結合、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であることが好ましい。

一般式（２）中、Ｙ^１３は水酸基又は親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１３として具体的には、例えば、グリシン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、システイン残基等が挙げられる。

　中でも、Ｙ^１３としては、水酸基又はグリシン残基であることが好ましい。

　化合物（１）として好ましいものとしては、例えば、下記式（１－１）で表される化合物（以下、「化合物（１－１）」と略記する場合がある）等が挙げられる。

　なお、この化合物は、好ましい化合物（１）の一例に過ぎず、好ましい化合物（１）はこれに限定されない。

（式中、Ｒ^１１１はメチル基又はカルボキシ基である。Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、ｎ^１２及びｎ^１３は、いずれも上記と同じである。Ｒ^１９及びＲ^２０はそれぞれ独立に炭素数１以上１０以下のアルキル基である。）

（式中、Ｙ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３は、いずれも上記と同じである。。）

＜Ｒ^１１１＞
　一般式（１－１）中、Ｒ^１１１はメチル基又はカルボキシ基である。中でも、Ｒ^１１１としては、カルボキシ基であることが好ましい。

＜Ｒ^１９及びＲ^２０＞
　一般式（１－１）中、Ｒ^１９及びＲ^２０はそれぞれ独立に炭素数１以上１０以下のアルキル基である。Ｒ^１９及びＲ^２０は同一でもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、Ｒ^１９及びＲ^２０は同一であることが好ましい。

　Ｒ^１９及びＲ^２０における前記アルキル基は、上記Ｒにおける前記アルキル基として例示されたものと同様のものが挙げられる。

　中でも、Ｒ^１９及びＲ^２０はそれぞれ独立に炭素数１以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることが好ましく、炭素数１以上６以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることがより好ましく、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であることがさらに好ましく、炭素数１以上３以下の直鎖状のアルキル基、（すなわち、メチル基、エチル基又はｎ－プロピル基）であることが特に好ましい。

　化合物（１）のうち、化合物（１－１）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（１－１）－Ｉで表される化合物（以下、「化合物（１－１）－Ｉ」と略記する場合がある）等が挙げられる。

（式中、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、Ｒ^１１１、ｎ^１２、ｎ^１３、Ｙ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３は、いずれも上記と同じである。）

　化合物（１－１）－Ｉで好ましいものとしては、例えば、以下に示すもの等が挙げられる。
　Ｒ^１１１がメチル基又はカルボキシ基であり；
　Ｒ^１２及びＲ^１７がそれぞれ独立に、ハロゲン原子又は炭素数１以上８以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であり；
　Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６がそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１以上８以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であり；
Ｒ^１９及びＲ^２０がそれぞれ独立に、炭素数１以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり；
Ｙ^１１がアスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基又はアルギニン残基であり；
Ｙ^１２が単結合、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり；
Ｙ^１３が水酸基又はグリシン残基であるもの。

　化合物（１－１）－Ｉでより好ましいものとしては、例えば、以下に示すもの等が挙げられる。
　Ｒ^１１１がメチル基又はカルボキシ基であり；
Ｒ^１２及びＲ^１７がそれぞれ独立に、ハロゲン原子又は炭素数１以上６以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であり；
　Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６がそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１以上６以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であり；
　Ｒ^１９及びＲ^２０がそれぞれ独立に、炭素数１以上６以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり；
Ｙ^１１がアスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基又はアルギニン残基であり；
Ｙ^１２が単結合、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり；
Ｙ^１３が水酸基又はグリシン残基であるもの。

　化合物（１－１）－Ｉでさらに好ましいものとしては、例えば、以下に示すもの等が挙げられる。
　Ｒ^１１１がメチル基又はカルボキシ基であり；
Ｒ^１２及びＲ^１７がそれぞれ独立に、ハロゲン原子又は炭素数１以上５以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であり；
　Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６がそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１以上５以下の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基であり；
Ｒ^１９及びＲ^２０がそれぞれ独立に、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり；
Ｙ^１１がアスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基又はアルギニン残基であり；
Ｙ^１２が単結合、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり；
Ｙ^１３が水酸基又はグリシン残基であるもの。

　化合物（１）のうち、化合物（１－１）－Ｉで好ましいものとして具体的には、例えば、下記式（１－１－１）で表される化合物（以下、「化合物（１－１－１）」と略記する場合がある）、下記式（１－１－２）で表される化合物（以下、「化合物（１－１－２）」と略記する場合がある）等が挙げられる。

　化合物（１）は、上述のように、蛍光性化合物であり、キサンテン環構造の種類に対応して、適当な範囲の波長の光（好ましくは、近赤外領域の波長の光）（励起光）を照射することにより、蛍光を発生する。

　化合物（１）のうち、特に、化合物（１－１－２）は、下記式（１）－Ｉで示すように、キサンテン環構造のうち、左側又は右側に結合している第三級アミンを構成している窒素原子に、プロトン（水素イオン、Ｈ^＋）が結合してプロトン化される。このようにプロトン化された化合物（１－１－２）は蛍光を発生する。

一方、カルボアニオンがキサンテン環の９位を攻撃することでスピロ環を形成し、キサンテン環のカチオンが消失する。このようにプロトン化されていない化合物（１－１－２）は蛍光を発生しない。

このプロトン化とスピロ環化とは平衡状態にあるが、スピロ環化は脂溶性環境で形成しやすく、生体内に投与された場合において、負に帯電している細胞膜から蛍光性化合物が解離すると推察される。これらのことから、後述の実施例に示すように、このスピロ環化により、化合物（１－１－２）では、葉酸受容体非依存的な吸着が抑制されると推察される。

≪化合物（１）の製造方法≫
　化合物（１）は、例えば、キサンテン環構造の種類、すなわち、蛍光性化合物の種類に応じて、原料となるペプチドリンカーが結合した葉酸に対して、公知の反応を行って、蛍光性化合物を結合させることで製造できる。より具体的には、以下のとおりである。

＜化合物（１－１）－Ｉの製造方法＞
　化合物（１）のうち、化合物（１－１）－Ｉは、例えば、下記一般式（１ａ）で表される化合物（以下、「化合物（１ａ）」と略記することがある）と、下記一般式（１ｂ）で表される化合物（以下、「化合物（１ｂ）」と略記することがある）と、を反応させて、化合物（１－１）－Ｉを得る工程（以下、「化合物（１－１）－Ｉ製造工程」と略記する場合がある）を含む製造方法により、製造できる。
　以下、各工程について、詳細に説明する。

［化合物（１－１）－Ｉ製造工程］
　前記化合物（１－１）－Ｉ製造工程においては、化合物（１ａ）と化合物（１ｂ）とを反応させて、化合物（１－１）－Ｉを得る。
　化合物（１－１）－Ｉを得る前記反応は、公知の縮合反応である。

（化合物（１ａ））
化合物（１ａ）は公知化合物である。
化合物（１ａ）において、Ｙ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３は、前記化合物（１）におけるＹ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３と同じである。
化合物（１ａ）は、葉酸にペプチドリンカーが結合した化合物である。

化合物（１ａ）の製造方法は、例えば、まず、ペプチド合成機を用いて、通常のＦｍｏｃ固相合成法により、２－クロロトリチルクロライドレジン等の固相担体に、Ｙ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３を構成する親水性アミノ酸とグルタミン酸とをこの順に縮合させて、ペプチドリンカーを合成する。これらのアミノ酸は、側鎖に保護基が付加されていてもよい。保護基としては、例えば、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ｔｅｒｔ－ブチル基（ｔ－Ｂｕ基）等が挙げられる。

　次いで、合成したペプチドリンカーに対し、Ｎ－１０トリフルオロアセチルプテロイン酸を縮合させる。次いで、プテロイン酸のトリフルオロアセチル基を脱保護させる。脱保護反応としては、比較的温和な条件（塩基性条件）下で行うことができる。
　塩基性条件とするために用いる塩基としては、例えば、ヒドラジン、水酸化ナトリウム等が挙げられる。

　次いで、担体から切り出すことで、化合物（１ａ）が得られる。このとき、同時にペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の側鎖の脱保護を行ってもよい。　脱保護反応としては、強酸条件下で行うことができる。強酸条件とするために用いる塩基としては、例えば、トリフルオロ酢酸、４Ｍ塩酸－酢酸エチル溶液等が挙げられる。

（化合物（１ｂ））
化合物（１ｂ）は公知化合物である。
化合物（１ｂ）において、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、Ｒ^１１１、ｎ^１２及びｎ^１３は、前記化合物（１－１）におけるＲ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、Ｒ^１１１、ｎ^１２及びｎ^１３と同じである。
化合物（１ｂ）は、蛍光性化合物であるシリコンローダミンにＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル基が付加した化合物である。

　化合物（１ａ）の製造方法では、例えば、シリコンローダミンと、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）とを縮合反応させて、化合物（１ａ）を得る。このとき、縮合剤を用いて、反応を行うことが好ましい。前記縮合剤としては、特に限定されてないが、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等の水溶性カルボジイミド等が挙げられる。

　シリコンローダミンは、後述の実施例に示すように、合成してもよく、市販のものを用いてもよい。

（化合物（１－１）－Ｉ）
　化合物（１－１）－Ｉは新規化合物である。
　化合物（１－１）－Ｉにおいて、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、Ｒ^１１１、ｎ^１２、ｎ^１３、Ｙ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３は、前記化合物（１－１）におけるＲ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、Ｒ^１１１、ｎ^１２、ｎ^１３、Ｙ^１１、Ｙ^１２及びＹ^１３と同じである。

　化合物（１－１）－Ｉ製造工程においては、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。
　前記非プロトン性溶媒は特に限定されないが、例えば、ペルフルオロヘキサン、α，α，α－トリフルオロトルエン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、デカヒドロナフタレン、四塩化炭素、ジオキサン、フルオロトリクロロメタン、ベンゼン、トルエン、トリエチルアミン、二硫化炭素、ジイソプロピルエーテル、ジエチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、１，２－ジメトキシエタン、２－メトキシエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ：ＴＨＦ）、塩化メチレン、ピリジン、２－ブタノン、アセトン、ヘキサメチルホスホルアミド、Ｎ－メチルピロリジノン、ニトロメタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、スルホラン、ジメチルスルホキシド、ジイソプロピルエチルアミン、酢酸イソプロピル、ジクロロメタン、ジメチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ：ＤＭＦ）、炭酸プロピレン等が挙げられる。
　前記溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる

　化合物（１－１）－Ｉ製造工程においては、例えば、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；ＤＩＥＡ）等の塩基を用いて反応を行うことが好ましい。
　前記塩基は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
　前記塩基の使用量は、化合物（１ａ）の使用量の１倍モル量以上５０倍モル量以下であることが好ましい。

　化合物（１－１）－Ｉ製造工程において、化合物（１ｂ）の使用量は、化合物（１ａ）の使用量０．５倍モル量以上２倍モル量以下であることが好ましい。

　化合物（１－１）－Ｉ製造工程において、反応温度は、４℃以上４０℃以下であることが好ましく、１０℃以上３０℃以下であることがより好ましい。
　化合物（１－１）－Ｉ製造工程において、反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましく、１時間以上１５時間以下であることがより好ましい。

　化合物（１－１）－Ｉ製造工程において、反応終了後は、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、化合物（１－１）－Ｉを取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、化合物（１－１）－Ｉを取り出せばよい。また、取り出した化合物（１－１）－Ｉは、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて１回以上行うことで、精製してもよい。

　化合物（１－１）－Ｉ、化合物（１ａ）、化合物（１ｂ）等の各化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。

≪葉酸受容体イメージングプローブ≫
　本実施形態の葉酸受容体イメージングプローブは、上述の化合物（１）を含む。

　本実施形態の葉酸受容体イメージングプローブは、葉酸受容体依存的に取り込まれ、葉酸受容体をリアルタイム且つ高感度に蛍光観察することが可能である。

　なお、一般的に、「葉酸受容体（ＦＲ）」とは、細胞表面に存在し、システインを多く含む糖タンパク質であり、葉酸を高親和性で結合し、葉酸の細胞取り込みに関わっている。また、ＦＲα、ＦＲβ及びＦＲγの３種類存在する。葉酸受容体の発現レベルは、ほとんどの組織で非常に低い。一方、がんの多くでは低濃度葉酸条件下で急速に分裂する細胞の葉酸の需要に応じるために葉酸受容体、特にＦＲαが高いレベルで発現している。そのため、本実施形態の葉酸受容体イメージングプローブは、がん検出用マーカーとして有用である。

　葉酸受容体イメージングプローブは、葉酸受容体を高発現しているがんであれば、検出することができる。検出対象となるがんとして具体的には、例えば、例えば、乳癌（例えば、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌等）、前立腺癌（例えば、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌等）、膵癌（例えば、膵管癌等）、胃癌（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌等）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫等）、結腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸癌（例えば、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍等）、小腸癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌（例えば、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌等）、頭頚部癌、唾液腺癌、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓癌（例えば、原発性肝癌、肝外胆管癌等）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、腎盂と尿管の移行上皮癌等）、胆嚢癌、膵臓癌、子宮内膜腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌（例、上皮性卵巣癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱癌、尿道癌、皮膚癌（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺癌（例えば、甲状腺髄様癌等）、副甲状腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。

　また、本明細書において、「癌」とは、診断名を表す際に用いられ、「がん」とは、悪性新生物の総称を表す際に用いられる。

　中でも、本実施形態の葉酸受容体イメージングプローブは、卵巣癌又は子宮内膜腫瘍の検出に用いられることが好ましい。

　また、妊娠期に葉酸が欠乏すると、胎児に新券環閉鎖障害が起こり、柔道の場合は死に至る。また、葉酸受容体は、胎児期において神経管閉鎖部で発現することが知られている。よって、本実施形態の葉酸受容体イメージングプローブは、胎児期における神経管閉鎖検出マーカーとしても有用である。

　インビトロ試験系では、葉酸受容体を発現している細胞及び該細胞を含む組織に対して、本実施形態の葉酸受容体イメージングプローブを１ｎＭ以上１ｍＭ以下程度、特に１μＭ以上５０μＭ以下程度添加することが好ましい。

　被検動物の体内への投与等、インビボ試験系では、本実施形態の葉酸受容体イメージングプローブを１ｎＭ以上１ｍＭ以下程度、特に、１０μＭ以上３００μＭ以下程度投与することが好ましい。投与方法としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、筋内的又は経皮的に当業者に公知の方法が挙げられる。これにより、被検動物の体内での葉酸受容体をリアルタイム且つ高感度に蛍光観察することができる。

　前記被検動物としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。

≪葉酸受容体の検出方法≫
　本実施形態の葉酸受容体の検出方法は、上述の葉酸受容体イメージングプローブを用いる方法である。

　本実施形態の葉酸受容体の検出方法によれば、葉酸受容体をリアルタイム且つ高感度に蛍光観察することが可能である。

　本実施形態の葉酸受容体の検出方法は、インビトロ又はインビボ試験系において、葉酸受容体を発現している若しくは発現している可能性がある細胞又は該細胞を含む組織と、上述の葉酸受容体イメージングプローブとを、接触させる接触工程と、前記葉酸受容体イメージングプローブの蛍光を測定する測定工程とを含む方法である。

＜接触工程＞
　インビトロ系における接触工程では、被検動物等から採取された葉酸受容体を発現している若しくは発現している可能性がある細胞又は該細胞を含む組織に、上述の葉酸受容体イメージングプローブを添加することで、接触させる。このとき、上述の葉酸受容体イメージングプローブは培地等に溶解させて添加してもよい。使用する培地は、使用する細胞の種類等に応じて、適宜選択することができる。培地として具体的には、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ：ＥＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　１６４０　ｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ１６４０培地）、Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ等が挙げられ、これらに限定されない。

　また、インビトロ系における上述の葉酸受容体イメージングプローブの添加量としては、上述の「葉酸受容体イメージングプローブ」において例示された量と同じである。

　また、インビトロ系における接触時間としては、上述の葉酸受容体イメージングプローブの添加量に応じて適宜選択することができる。接触時間として具体的には、例えば１０分以上１時間以下とすることができ、例えば２０分以上４０分以下とすることができ、例えば３０分程度とすることができる。

　また、インビボ系における接触工程では、上述の葉酸受容体イメージングプローブを被検動物の体内に投与することで、被検動物体内に存在する葉酸受容体を発現している若しくは発現している可能性がある細胞又は該細胞を含む組織と、上述の葉酸受容体イメージングプローブとを、接触させる。投与方法及び投与量は、上述の「葉酸受容体イメージングプローブ」において例示された方法及び量と同じである。

＜測定工程＞
　次いで、インビトロ系における測定工程では、接触工程後に蛍光顕微鏡等、公知の装置を用いて、蛍光を測定することができる。

　一方、インビボ系における測定工程では、上述の葉酸受容体イメージングプローブの被検動物への投与前、投与直後、及び、投与から３０分後から６時間後程度まで、公知の生体内イメージャーを用いて、経時的に蛍光を測定することができる。また、後述の実施例に示すように、本実施形態の葉酸受容体の検出方法は、早いタイムコースで、高感度のイメージングを達成できる。

また、例えば、外科手術前のがん患者に、上述の葉酸受容体イメージングプローブを投与することで、生体内の腫瘍部を容易に蛍光染色することができ、外科手術におけるがん細胞の取り残しを防止することができる。

≪葉酸受容体検出用キット≫
　本実施形態の葉酸受容体検出用キットは、上述の葉酸受容体イメージングプローブを備える。

　本実施形態の葉酸受容体検出用キットによれば、葉酸受容体をリアルタイム且つ高感度に蛍光観察することが可能である。本実施形態の葉酸受容体検出用キットは、がん検出用キット、神経管閉鎖検出用キットとしても有用である。

　本実施形態の葉酸受容体検出用キットは、上述の葉酸受容体イメージングプローブを１種単独で備えていてもよく、２種以上組み合わせて備えていてもよい。２種以上組み合わせて備える場合、化合物（１）中のキサンテン構造の種類、すなわち、蛍光性化合物の種類が異なることが好ましい。

　本実施形態の葉酸受容体検出用キットは、上述の葉酸受容体イメージングプローブに加えて、更に、前記プローブを溶解及び希釈するための緩衝液等を備えていてもよい。

　前記緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられ、ｐＨは特に限定されない。

　以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。

［合成例１］葉酸ペプチドの合成
　以下に示す合成経路に従い、葉酸ペプチドを合成した。

　上記合成経路に示すとおり、まず、ペプチド部位（γ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ）は、ペプチド合成機によって、２－クロロトリチルレジン（１．２２ｍｍｏｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ；ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を固相担体として、通常のＦｍｏｃ合成法にて合成した。さらに、固相上にてペプチドのＮ末端にＮ－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ　ｐｔｅｒｏｉｃ　ａｃｉｄをジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）中にて１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ：ＨＯＢｔ）、Ｗａｔｅｒ－Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）及びトリエチルアミン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：Ｅｔ３Ｎ）を混ぜて反応させた。プテリン環上のＮ－１０位のトリフルオロアセチル基は２％ヒドラジン及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ：ＤＭＦ）含有溶液によって脱保護した。その後、トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ：ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ：ＴＩＰＳ）及びＨ_２Ｏの混合溶液（ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ_２Ｏ＝９５：２．５：２．５（容量比）；合計２ｍＬ）を固相に加え、９０分インキュベーションすることでｆｏｌａｔｅ－ｐｅｐｔｉｄｅをレジンから切り出した。溶媒を減圧除去し、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）にて部分的に精製し（６５．８ｍｇ、３４％　ｉｎ　２ｓｔｅｐｓ）、そのまま次の反応へと用いた。

　なお、得られた精製物の精密質量測定（ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＭＳ：ＨＲＭＳ）の結果は以下のとおりであった。
　HRMS (ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺ 742.2909 Found, 742.2862 (-4.7 mmu).

［合成例２］２，５－ｄｉＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０の合成
１．ｂｉｓ（２－ｂｒｏｍｏ－４－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅの合成
　公知文献（参考文献１：「Koide Y et al., “Evolution of Group 14 Rhodamines as Platforms for Near-Infrared Fluorescence Probes Utilizing Photoinduced Electron Transfer.”, ACS Chem Biol., Vol. 6, Issue 6, p600-608, 2011.」）に従い、以下の式（Ａ）で表される化合物（ｂｉｓ（２－ｂｒｏｍｏ－４－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）（以下、「化合物（Ａ）」と称する場合がある）を合成した。

２．Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｄｉａｍｉｎｏ－Ｓｉ－ｘａｎｔｈｏｎｅ（ＳｉＸ－１）の合成
　次いで、化合物（Ａ）を用いて、公知文献（参考文献２：「Egawa T et al., “Development of a far-red to near-infrared fluorescence probe for calcium ion and its application to multicolor neuronal imaging.”, J Am Chem Soc., Vol. 133, No. 36, p14157-14159, 2011.」）に従い、以下の式（Ｂ）で表される化合物（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｄｉａｍｉｎｏ－Ｓｉ－ｘａｎｔｈｏｎｅ（ＳｉＸ－１））（以下、「化合物（Ｂ）」又は「ＳｉＸ－１」と称する場合がある）を合成した。

３．２－ｂｒｏｍｏ－１，４－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｂｉｓ（３－ｍｅｔｈｙｌ－３－ｏｘｅｔａｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）　ｅｓｔｅｒの合成
　次いで、４－Ｂｒｏｍｏｔｅｌｅｐｈｔｈａｌｉｃ　ａｃｉｄ（５．０２ｇ、２０．４５ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（８．４３ｇ、４４．１４ｍｍｏｌ）、,N-ジメチル－４－アミノピリジン（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－４－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ：ＤＭＡＰ）（７１５ｍｇ、５．８６ｍｍｏｌ）及び３－ｍｅｔｈｙｌ－３－ｏｘｅｔａｎｅｍｅｔｈａｎｏｌ（５．０ｍＬ、５０．９８ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、室温にて一晩攪拌した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）：ｎ－ヘキサン＝１：１）により精製し、以下の式（Ｃ）で表される化合物（２－ｂｒｏｍｏ－１，４－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　１，４－ｂｉｓ［（３－ｍｅｔｈｙｌ－３－ｏｘｅｔａｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］　ｅｓｔｅｒ）（以下、「化合物（Ｃ）」と称する場合がある）（６．０２ｇ、１４．６ｍｍｏｌ、収率７１％）を得た。

　得られた化合物（Ｃ）の^１Ｈ　ＮＭＲ及び^１３Ｃ　ＮＭＲによる測定結果を以下に示す。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 1.43 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 4.44 (s, 2H), 4.47 (s, 4H), 4.49 (s, 2H), 4.61 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 4.63 (d, J = 1.2 Hz, 2H) 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.1 Hz, 1.5 Hz, 2H), 8.31 (d, J = 1.5 Hz, 1H).
¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ= 21.0, 21.2, 39.1, 39.2, 69.9, 70.1, 79.3, 79.4, 121.3, 128.1, 131.1, 133.5, 135.1, 136.2, 164.3, 165.6.

４．１，１’－（４－ｂｒｏｍｏ－１，３－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）－ｂｉｓ（４－ｍｅｔｈｙｌ－２，６，７－ｔｒｉｏｘａｂｉｃｙｃｌｏ［２．２．２］ｏｃｔａｎｅ）の合成
　次いで、化合物（Ｃ）を用いて、公知文献（参考文献３：「Butkevich AN et al., “Fluorescent Rhodamines and Fluorogenic Carbopyronines for Super-Resolution STED Microscopy in Living Cells.”, Angew Chem Int Ed Engl., Vol. 55, No. 10, p3290-3294, 2016.」）に従い、下記式（Ｄ）で表される化合物（１，１’－（４－ｂｒｏｍｏ－１，３－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）－ｂｉｓ（４－ｍｅｔｈｙｌ－２，６，７－ｔｒｉｏｘａｂｉｃｙｃｌｏ［２．２．２］ｏｃｔａｎｅ））（以下、「化合物（Ｄ）」と称する場合がある）を合成した。

５．２，５－ｄｉＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０の合成
　次いで、無水テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ：ＴＨＦ）（１０ｍＬ）に溶解させた化合物（Ｄ）（４０６ｍｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）をアルゴンが充填された火炎乾燥したフラスコへと加えた。この反応液を－７８℃ まで冷却し、そこに１Ｍ　ｓｅｃ－ブチルリチウム（ｓｅｃ－ＢｕＬｉ）（０．９８ｍｍｏｌ）を加えた。その後、反応液を一時間攪拌した。さらに同じ温度のまま、ＳｉＸ－１（１０６ｍｇ、０．３２７ｍｍｏｌ）を溶解させた無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）をゆっくり反応液へ加えた。その後、反応液を室温へとし、さらに３．５時間攪拌した。その後、ＡｃＯＨ（５ｍＬ）を反応液へと加え、溶媒を減圧除去した。残渣を６Ｎ　ＨＣｌ水溶液に溶解し、一晩加熱還流下攪拌した。室温へと冷やした後、溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣにて精製し、以下の式（Ｅ）で表される化合物（２，５－ｄｉＣＯＯＨ－ＳｉＲ６５０　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ｓａｌｔ）（以下、「化合物（Ｅ）」と称する場合がある）（５４．３ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ、収率２８％）を得た。

　得られた化合物（Ｅ）の^１Ｈ　ＮＭＲ及びＨＲ－ＭＳによる測定結果を以下に示す。
　¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ = 0.58 (s, 3H), 0.66 (s, 3H), 3.30 (s, 12H), 6.77 (dd, J = 9.5 Hz, 2.9 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.83 (s, 1H), 8.30 (s, 2H).
HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺ 473.1897, Found, 473.1937 (+4.0 mmu).

［合成例３］２－Ｍｅ－５－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０の合成
１．ＳｉＸ－１の合成
　合成例２の「２．」と同様の方法を用いて、ＳｉＸ－１を合成した。

２．ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　３－ｂｒｏｍｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏａｔｅの合成
　次いで、４．０７ｇの３－ｂｒｏｍｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄからｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　２－ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｏａｔｅと同様の合成方法を用いて、下記式（Ｆ）で表される化合物（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　３－ｂｒｏｍｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏａｔｅ）（以下、「化合物（Ｆ）」と称する場合がある）（３．４７ｇ、収率７６％）を合成した。

　得られた化合物（Ｆ）の^１Ｈ　ＮＭＲ及び^１３Ｃ　ＮＭＲによる測定結果を以下に示す。
　¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 1.58 (s, 9H), 2.44 (s, 3H), 7.27 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.81 (dd, J = 8.1 Hz, 1.5 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 1.5 Hz, 1H).
¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ= 23.1, 28.1, 81.4, 124.6, 128.2, 130.5, 131.3, 133.2, 142.6, 164.5.

３．２－Ｍｅ－５－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０の合成
　次いで、６２７ｇの化合物（Ｆ）と７２．３ｍｇのＳｉＸ－１とから、２，５－ｄｉＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０と同様の合成方法を用いて、下記式（Ｇ）で表される化合物（２－Ｍｅ－５－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０）（以下、「化合物（Ｇ）」と称する場合がある）（５３．５ｍｇ、収率４３％）を合成した。

　得られた化合物（Ｇ）の^１Ｈ　ＮＭＲ及びＨＲ－ＭＳによる測定結果を以下に示す。
　¹H NMR (300 MHz, CD₃OD):δ = 0.61 (s, 3H), 0.63 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 3.35 (s, 12H), 6.78 (dd, J = 9.9 Hz, 2.6 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 8.11 (d, J = 8.1 Hz, 1H).
HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺ 455.2155, Found, 455.2131 (-2.4 mmu).

［合成例４］葉酸受容体イメージングプローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）の合成１
　次いで、葉酸受容体イメージングプローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）を以下に示す合成経路に従い、合成した。具体的には、以下に示すとおりである。

１．２，５－ｄｉＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０　５－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒの合成
　まず、化合物（Ｅ）（２７．９ｍｇ、４７．０μｍｏｌ）を溶解させたＴＨＦ（３ｍＬ）に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）（１７．９ｍｇ、１５０μｍｏｌ）及びＷＳＣＤ・ＨＣｌ（３１．０ｍｇ、１６２μｍｏｌ）を加えた。反応溶液を３５℃で３時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣにて一部精製し、粗精製の下記式（Ｈ）で表される化合物（２，５－ｄｉＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０　５－　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ｓａｌｔ）（１５．４ｍｇ）（以下、「化合物（Ｈ）」と称する場合がある）を得た。この化合物（Ｈ）をそのまま次の反応に用いた。

２．葉酸受容体イメージングプローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）の合成
　次いで、化合物（Ｈ）（７．２ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）と、合成例１で得られた葉酸ペプチド（１０．１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）とをＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶解させ、そこにＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：ＤＩＥＡ）（５７μＬ、０．３２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温にて一晩攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣにて精製し、下記式（１－１－２）で表される化合物（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）（以下、「化合物（１－１－２）」と称する場合がある）（２．７ｍｇ、２．０μｍｏｌ、収率９％ｉｎ２ｓｔｅｐ）を得た。

　得られた化合物（１－１－２）のＨＲ－ＭＳによる測定結果、並びに、ＨＰＬＣの分析条件を以下に示す。ＨＰＬＣ分析により、化合物（１－１－２）は分析開始から約１２分後に検出された。
　HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺, 1196.4621, Found, 1196.4621 (0.0 mmu).
HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H₂O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H₂O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.

［合成例５］葉酸受容体イメージングプローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）の合成２
１．２－Ｍｅ－５－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０　５－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒの合成
　まず、化合物（Ｇ）（９．７ｍｇ、１７．５μｍｏｌ）を溶解させたＴＨＦ（３ｍＬ）に、ＮＨＳ（４５．７ｍｇ、３９８μｍｏｌ）とＷＳＣＤ・ＨＣｌ（３８．０ｍｇ、１９９μｍｏｌ）とを加え、反応液を室温にて一晩攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣにて一部精製し、粗精製の下記式（Ｉ）で表される化合物（２－Ｍｅ５－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０　５－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ　ｓａｌｔ）（以下、「化合物（Ｉ）」と称する場合がある）（５．４ｍｇ）を得た。この化合物（Ｉ）は、そのまま次の反応に用いた。

２．葉酸受容体イメージングプローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）の合成
　次いで、化合物（Ｉ）（６．５ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）と、合成例１で得られた葉酸ペプチド（５．７ｍｇ、０．００６７ｍｍｏｌ）とをＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（１７μＬ、０．０９８ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温にて一晩攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣにて精製し、下記式（１－１－１）で表される化合物（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）（以下、「化合物（１－１－１）」と称する場合がある）（１．０ｍｇ、０．７８μｍｏｌ、収率１２％ｉｎ２ｓｔｅｐ）を得た。

　得られた化合物（１－１－１）のＨＲ－ＭＳによる測定結果、並びに、ＨＰＬＣの分析条件を以下に示す。ＨＰＬＣ分析により、化合物（１－１－１）は分析開始から約１４分後に検出された。
　HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺, 1166.4880, Found, 1166.4881 (0.1 mmu); HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H₂O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H₂O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.

［実施例１］葉酸受容体イメージングプローブの光学特性の確認
　合成例４で得られた葉酸受容体イメージングプローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）は、合成例１で得られた葉酸ペプチドに、下記式（Ｊ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｊ）」又は「２－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０」と称する場合がある）を結合させた化合物である。また、合成例５で得られた葉酸受容体イメージングプローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）は、合成例１で得られた葉酸ペプチドに、下記式（Ｊ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｋ）」又は「２－Ｍｅ　ＳｉＲ６５０」と称する場合がある）を結合させた化合物である。化合物（Ｊ）は、励起波長が６４２ｎｍであり、蛍光波長が６６６ｎｍである。また、化合物（Ｋ）は、励起波長が６４６ｎｍであり、蛍光波長が６６８ｎｍである。

１．吸収及び蛍光スペクトルの測定
　ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１（化合物（１－１－２））及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２（化合物（１－１－１））を０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に１μＭとなるようにそれぞれ溶解し、吸光光度計（型番：ＵＶ－２５５０、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）及び蛍光光度計（型番：Ｆ－７０００、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いて、吸収及び蛍光スペクトルを測定した。また、コントロールとして、２－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０（化合物（Ｊ））及び２－Ｍｅ　ＳｉＲ６５０（化合物（Ｋ））を０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に１μＭとなるようにそれぞれ溶解し、同様に、吸収及び蛍光スペクトルを測定した。結果を図１Ａ～図１Ｄに示す。なお、図１Ａは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及び２－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０の吸収スペクトルである。図１Ｂは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及び２－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０の蛍光スペクトルである。図１ＣはＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２及び２－Ｍｅ　ＳｉＲ６５０の吸収スペクトルである。図１Ｄは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２及び２－Ｍｅ　ＳｉＲ６５０の蛍光スペクトルである。

また、各蛍光物質の最大吸収波長（Ａｂｓ_ｍａｘ）、最大蛍光波長（Ｅｍ_ｍａｘ）及び蛍光量子収率（Φ_ｆｌ）を以下の表１にまとめた。なお、２－ＣＯＯＨ　ＳｉＲ６５０及び２－Ｍｅ　ＳｉＲ６５０の蛍光量子収率（Φ_ｆｌ）は、クレシルバイレット（Φ_ｆｌ＝０．５４）のメタノール溶液を蛍光標準として用いた。

　図１Ａ～図１Ｄから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２のいずれのプローブも、色素単体と比較して、葉酸ペプチドと結合させることで、蛍光が減少していたが、蛍光イメージングを行うには十分は大きさの蛍光であった。

［実施例２］培養細胞の蛍光イメージング１
１．ＫＢ細胞（ＦＲ＋）の蛍光イメージング
　葉酸受容体を発現している（以下、「ＦＲ＋」と略記する場合がある）細胞であるＫＢ細胞（ヒト口腔類表皮癌由来細胞株）について、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いた蛍光イメージングを行った。

　まず、ＫＢ細胞をハンクス平衡塩液（Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）を用いて、３回洗浄した。次いで、ＫＢ細胞に、５μＭの各プローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）を含むイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ：ＥＭＥＭ）（０．０３％プルロニックＦ－１２７含有）を添加して、１時間インキュベートした。次いで、ＫＢ細胞を、ＨＢＳＳを用いて、３回洗浄した。

次いで、ＨＢＳＳ中のＫＢ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡（型番：ＴＣＳ　ＳＰ５、ライカマイクロシステムズ社製）（Ｅｍ．６５０ｎｍ、Ｅｘ．６７０－７５０ｎｍ）を用いて、観察した。結果を図２Ａ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）及び図２Ｂ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）に示す。なお、図２Ａ及び図２Ｂにおいて、左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。

　図２Ａから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１は細胞膜上の葉酸受容体を選択的に染色できた。また、図２Ｂから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２は、細胞膜上の葉酸受容体に加えて、細胞内から点状の蛍光が観察された。

２．ＯＶＣＡＲ－３細胞（ＦＲ－）の蛍光イメージング
　次いで、図２Ａ及び図２Ｂにおける染色が、葉酸受容体選択的であることを確かめるために、葉酸受容体を発現していない（以下、「ＦＲ－」と略記する場合がある）細胞であるＯＶＣＡＲ－３細胞（ヒト卵巣癌由来細胞株）について、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いた蛍光イメージングを行った。

　まず、ＯＶＣＡＲ－３細胞を、ＨＢＳＳを用いて、３回洗浄した。次いで、ＯＶＣＡＲ－３細胞に、５μＭの各プローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）を含むロズウェルパーク記念研究所１６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　１６４０　ｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ１６４０培地）（０．０３％プルロニックＦ－１２７含有）を添加して、１時間インキュベートした。次いで、ＯＶＣＡＲ－３細胞を、ＨＢＳＳを用いて、３回洗浄した。

次いで、ＨＢＳＳ中のＫＢ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡（型番：ＴＣＳ　ＳＰ５、ライカマイクロシステムズ社製）（Ｅｍ．６５０ｎｍ、Ｅｘ．６７０－７５０ｎｍ）を用いて、観察した。結果を図３Ａ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）及び図３Ｂ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）に示す。なお、図３Ａ及び図３Ｂにおいて、左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。

　図３Ａから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１はＯＶＣＡＲ－３細胞を染色しなかった。一方、図３Ｂから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２では、ＯＶＣＡＲ－３の細胞内において点状の蛍光が観察された。このことから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２では、葉酸受容体非依存的な取り込みがあることが示唆された。

［比較例１］培養細胞の蛍光イメージング２
　市販の蛍光プローブであるＦｏｌａｔｅＲＳｅｎｓｅ　６８０を用いて、培養細胞の蛍光イメージングを行った。

１．ＫＢ細胞（ＦＲ＋）の蛍光イメージング
　５μＭのＦｏｌａｔｅＲＳｅｎｓｅ　６８０を含むＥＭＥＭ（０．０３％プルロニックＦ－１２７及び０．６５％ＤＭＳＯ含有）を用いた以外は、実施例２の「１．」と同様の方法を用いて、ＫＢ細胞（ＦＲ＋）の蛍光イメージングを行った。結果を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。

２．ＯＶＣＡＲ－３細胞（ＦＲ－）の蛍光イメージング
　５μＭのＦｏｌａｔｅＲＳｅｎｓｅ　６８０を含むＲＰＭＩ１６４０培地（０．０３％プルロニックＦ－１２７及び０．６５％ＤＭＳＯ含有）を用いた以外は、実施例２の「２．」と同様の方法を用いて、ＯＶＣＡＲ－３細胞（ＦＲ－）の蛍光イメージングを行った。結果を図４Ｂに示す。図４Ｂにおいて、左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。

　図４Ａ及び図４Ｂから、葉酸受容体が発現している細胞（ＫＢ細胞）から蛍光シグナルが確認できるのみならず、葉酸受容体非発現細胞（ＯＶＣＡＲ－３細胞）の内部からも蛍光シグナルが観察された。このことから、市販の蛍光プローブであるＦｏｌａｔｅＲＳｅｎｓｅ　６８０を用いて染色した培養細胞において、葉酸受容体非依存的に細胞内に取り込まれ、蛍光を発することが明らかとなった。

［実施例３］培養細胞の蛍光イメージング３
　次いで、ＫＢ細胞を用いたイメージングの際に、１ｍＭの葉酸を添加した競合阻害実験を行った。

　まず、ＫＢ細胞を、ＨＢＳＳを用いて、３回洗浄した。次いで、ＫＢ細胞に、５μＭの各プローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）を含むＥＭＥＭ（１ｍＭ葉酸及び０．５％ＤＭＳＯ含有）を添加して、３０分間インキュベートした。また、コントロールとして、５μＭの各プローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）を含み、且つ、１ｍＭ葉酸を不含のＥＭＥＭを添加した細胞も準備して、同様に３０分間インキュベートした。次いで、ＫＢ細胞を、ＨＢＳＳを用いて、３回洗浄した。

次いで、ＨＢＳＳ中のＫＢ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡（型番：ＴＣＳ　ＳＰ５、ライカマイクロシステムズ社製）（Ｅｍ．６５０ｎｍ、Ｅｘ．６７０－７５０ｎｍ）を用いて、観察した。結果を図５Ａ～図５Ｄに示す。なお、図５Ａは、１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いて染色したＫＢ細胞である。図５Ｂは、１ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いて染色したＫＢ細胞である。図５Ｃは、１ｍＭの葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いて染色したＫＢ細胞である。図５Ｄは、１ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いて染色したＫＢ細胞である。また、図５Ａ～図５Ｄにおいて、左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。

　図５Ａ～図５Ｄから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１は葉酸の過剰添加によって蛍光が大きく低下した。一方で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２においては細胞膜上からの蛍光は消失したものの、細胞内からの蛍光が観察された。

以上の結果から、細胞膜上から観察される蛍光は、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２が細胞膜上の葉酸受容体に結合しているものであることが明らかとなった。また、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２の葉酸競合阻害実験の結果から、細胞内から観察される蛍光は、葉酸受容体非依存的に細胞内に取り込まれたプローブによるものであることが分かった。

［実施例４］マウス胚の蛍光イメージング１
　マウスは神経管が形成される時期において、神経管閉鎖部において葉酸受容体ＦＯＬＲ－１（ヒトのＦＲα）が発現することがｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより示唆されている。そこで、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いて、マウス胚の神経管閉鎖部における葉酸受容体の発現を可視化できるか実験を行った。

　まず、２０μＭの各プローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）を含み、葉酸不含のダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）（１０％ラットＩＣ血清含有）を５００μＬずつ調製した。次いで、妊娠したマウスから受精から８．５日経過したマウス胚を摘出した。次いで、摘出した胚をプローブ溶液に浸し、５％ＣＯ_２下、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、インキュベート後の胚をＤＭＥＭで２回洗浄した。

次いで、ガラスボトムディッシュにゲルを張り、胚を固定する穴を開けた。次いで、ＤＭＥＭ（５０％ラットＩＣ血清含有）中で染色した胚を、共焦点蛍光顕微鏡（型番：ＴＣＳ　ＳＰ５、ライカマイクロシステムズ社製）を用いて、観察した。結果を図６Ａ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）及び図６Ｂ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）に示す。図６Ａ及び図６Ｂにおいて、左側の図は蛍光像であり、真ん中の図は明視野像であり、右側の図は、左側の図の破線で囲った部分の拡大図である。また、図６Ａ及び図６Ｂの左側の図及び真ん中の図において、スケールバーは２００μｍを示す。右側の図において、スケールバーは５０μｍを示す。

　図６Ａ及び図６Ｂから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１は、神経管閉鎖部で他の部位より強いシグナルが観察された（図６Ａの左の蛍光像の破線で囲った部分、及び、右の蛍光像）。

　一方、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２は、図６Ｂの左の蛍光像の破線で囲った部分、すなわち、胚の縁に当たる部分から強い蛍光が観察され、その拡大図である図６Ｂの右の蛍光像からは死細胞で見られるような凝集斑が胚のほぼ全体で観察された。図６Ａ及び図６Ｂを比較すると、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２の結果は、明らかにＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１の結果とは異なっていた。また、この結果はＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１と同様に、培養細胞での実験で見られた葉酸受容体非依存的な細胞内からの強い蛍光を反映した結果と考えられた。

［実施例５］マウス胚の蛍光イメージング２
　マウス胚にＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１をロードした際に神経管閉鎖部で観察された蛍光の上昇が葉酸受容体に由来するものかを調べるため、過剰量の葉酸を用いた競合阻害実験を行った。

１．競合阻害実験１
まず、１０μＭのＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及び１ｍＭの葉酸を含むＤＭＥＭ（１０％ラットＩＣ血清含有）を調製した。また、コントロールとして、１ｍＭの葉酸を不含であり、１０μＭのＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を含むＤＭＥＭ（１０％ラットＩＣ血清含有）も調製した。次いで、実施例４と同様の方法を用いて、マウスから胚を摘出した。次いで、実施例４と同様の方法を用いて、摘出した胚を染色及び洗浄した。次いで、実施例４と同様の方法を用いて、ＤＭＥＭ（５０％ラットＩＣ血清含有）中で染色した胚を、共焦点蛍光顕微鏡（型番：ＴＣＳ　ＳＰ５、ライカマイクロシステムズ社製）を用いて、観察した。結果を図７Ａ（１ｍＭの葉酸非存在下）及び図７Ｂ（１ｍＭの葉酸存在下）に示す。なお、図７Ａ及び図７Ｂにおいて、左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、図７Ａ及び図７Ｂにおいて、スケールバーは５０μｍを示す。

　図７Ａ及び図７Ｂから、１ｍＭの葉酸の存在により、蛍光シグナルが減弱することが確認された。

２．固定処理の蛍光シグナルへの影響確認試験
　次いで、蛍光プローブの染色後に固定処理を行った場合においても、蛍光シグナルが保持しているかについて、ＫＢ細胞を用いた培養実験での実験によって確認した。

　まず、ＫＢ細胞を、ＨＢＳＳを用いて、３回洗浄した。次いで、ＫＢ細胞に、５μＭのＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を含むＥＭＥＭ（０．５％ＤＭＳＯ含有）を添加して、１時間インキュベートした。次いで、ＫＢ細胞を、ＨＢＳＳを用いて、３回洗浄した。次いで、洗浄後のＫＢ細胞を、４％ホルムアルデヒド溶液を用いて固定化処理した（以下、「インキュベーション後固定化あり群」と称する場合がある）。また、コントロールとして、上記５μＭのＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を含むＥＭＥＭ（０．５％ＤＭＳＯ含有）とインキュベーションせずに、４％ホルムアルデヒド溶液で固定化した細胞（以下、「インキュベーションなし群」と称する場合がある）を準備した。さらに、４％ホルムアルデヒド溶液で固定化した後に、上記５μＭのＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を含むＥＭＥＭ（０．５％ＤＭＳＯ含有）とインキュベーションした細胞（以下、「固定化後インキュベーションあり群」と称する場合がある）を準備した。

次いで、ＨＢＳＳ中のＫＢ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡（型番：ＴＣＳ　ＳＰ５、ライカマイクロシステムズ社製）（Ｅｍ．６５０ｎｍ、Ｅｘ．６７０－７５０ｎｍ）を用いて、観察した。結果を図８Ａ（インキュベーションなし群）、図８Ｂ（インキュベーション後固定化あり群）及び図２Ｂ（固定化後インキュベーションあり群）に示す。なお、図８Ａ～図８Ｃにおいて、左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは２０μｍを示す。

　図８Ａ～図８Ｃから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１で染色後に固定化処理を行った場合に、細胞膜上の葉酸受容体を選択的に染色できた。

３．競合阻害実験２
　次いで、上記「２．」の結果を踏まえて、時間経過に伴う染色パターンの変化を防止するために、上記「１．」と同様の方法を用いて、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１での染色後、胚を４％ホルムアルデヒド溶液で固定処理を行った。それ以外は、上記「１．」と同様の方法を用いて、１ｍＭの葉酸存在下及び非存在下での競合阻害実験を行った。結果を図９Ａ～図９Ｉに示す。

図９Ａ～図９Ｆは、１ｍＭの葉酸非存在下でのＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。図９Ｇ～図９Ｉは、１ｍＭの葉酸存在下でのＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたマウス胚の蛍光イメージングの結果を示す画像である。図９Ｂ、図９Ｄ、図９Ｆ及び図９Ｈは、それぞれ図９Ａ、図９Ｃ、図９Ｅ及び図９Ｇの拡大像である。また、図９Ａ、図９Ｃ及び図９Ｅにおいて、破線で囲んだ部分は、葉酸受容体が発現していると思われる領域を示す。さらに、実線で囲んだ部分は、死細胞と思われる領域を示す。なお、図９Ａ～図９Ｉにおいて、左側は蛍光像であり、右側は明視野像である。また、スケールバーは５０μｍを示す。

　図９Ａ～図９Ｆから、葉酸受容体の存在に由来すると思われる蛍光シグナルが観察された。一方、図９Ｇ～図９Ｉから、葉酸受容体の存在に由来すると思われる蛍光シグナルは観察されなかった。

　また、葉酸非存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１による染色を行った場合は、図９Ａ、図９Ｃ及び図９Ｅの破線で囲んだ部分のように、神経管が融合する箇所で蛍光シグナルが強くなっている様子が観察された。一方、葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１による染色を行った場合（図９Ｇ参照）では、神経管が融合する箇所において強い蛍光シグナルは観察されなかった。

したがって、先行研究の知見と合わせると、神経管の形成が進行している箇所で見られる強い蛍光シグナルは葉酸受容体にプローブが結合したことに由来すると考えられた。

また、胚全体から見られる蛍光は葉酸競合によっても観察されたことから一部のプローブは胚に吸着したもの（又は、非特異的に細胞内に取り込まれたもの）と考えられた。

さらに、図９Ｃに見られる神経管形成部位以外の斑点（実線で囲んだ部分）は、図９Ｅにも観察されており、死細胞が染まっているものと考えられた。

また、この神経管形成部位以外の斑点（実線で囲んだ部分）の染色パターンと神経管形成部位（破線で囲んだ部分）で見られる染色パターンとは異なっていることから、神経管形成部でのシグナルは死細胞由来ではないことも考えられた。

　以上のことから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いた蛍光イメージングによってマウス胚神経管閉鎖部の葉酸受容体の発現が示唆された。なお、マウス胚の神経管閉鎖部における葉酸受容体の発現についての報告は先述したｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる報告の一報のみであり、今回の結果は蛍光イメージングによって葉酸受容体の発現を示唆した初の報告である。

［実施例６］腫瘍モデルマウスの蛍光イメージング１
　次いで、腫瘍モデルマウスを作成し、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いてｉｎ　ｖｉｖｏイメージングを行った。

　まず、腫瘍モデルマウスの作製は、先行論文（参考文献４：「Moon WK et al., “Enhanced tumor detection using a folate receptor-targeted near-infrared fluorochrome conjugate.”, Bioconjug Chem., Vol. 14, No. 3, p539-545, 2003.」）に基づいて行った。具体的には、葉酸受容体発現細胞としてＫＢ細胞をマウスの前足の付け根に皮下注射して７～１０日間飼育することで、ＫＢ細胞腫瘍モデルマウスを得た。

　次いで、各蛍光プローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）は、生理食塩水１００μＬに１００μＭとなるように溶解させた。次いで、各蛍光プローブ溶液を尾静注によって投与し、蛍光の経時変化をｉｎ　ｖｉｖｏイメージャー（Ｅｘ．６６１ｎｍ、Ｅｍ．７００～８００ｎｍ）にて観察した（各蛍光プローブについて、ｎ＝３で行った）。なお、投与前、並びに、投与から０、０．５、１、２、３及び６時間後にＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの撮影を行った。結果を図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。

図１０Ａは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたＫＢ細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。図１１Ａは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたＫＢ細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。図１０Ａ及び図１１Ａにおいて、Ｔは腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）を示し、Ｍは非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）を示す。また、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。

　図１０Ｂは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図１１Ｂは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。

　また、時間経過観察後、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させ、取り出した臓器の蛍光イメージングを行うことでプローブの体内分布を調べた。結果を図１０Ｃ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）及び図１１Ｃ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）に示す。図１０Ｃ及び図１１Ｃにおいて、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。

　図１０Ａ及び図１０Ｂから、ＫＢ細胞腫瘍モデルマウスにＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与した直後は全身から蛍光が観測されたが、３０分経過後には非腫瘍部である筋肉における蛍光は十分に低下し、Ｓ／Ｎ高いイメージングが達成できた。

一方、腫瘍部における蛍光は投与後２時間で最大となったが、投与後６時間まで蛍光が残り続けた。

経時変化を観察後のＫＢ細胞腫瘍モデルマウスを安楽死して、蛍光観察からＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１の臓器分布を調べたところ、腫瘍部と胃から蛍光が観察された（図１０Ｃ参照）。胃に蛍光が見えるのは、食物に含まれる成分の自家蛍光と考えられる。

図１１Ａ及び図１１Ｂから、ＫＢ細胞腫瘍モデルマウスにＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を投与した場合では、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１と同様に、プローブの投与直後は全身から蛍光が観察された。

一方、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２では、非腫瘍部である筋肉における蛍光は投与後６時間までバックグラウンドレベルには落ちきらなかった。腫瘍部における蛍光は緩やかに低下した後、２時間経過したところで上昇に転じ、６時間経過後まで上昇し続けた。これは、一度、腫瘍細胞に非特異的に吸着したＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２が乖離し再度血流に乗った後、改めて葉酸受容体に結合したためであると考えられる。

ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１の場合と同様に、経時変化を観察後に安楽死させ開腹したところ、腫瘍の他に腸と腎臓からも蛍光が観察された。腸における蛍光が糞の形状であることから、プローブの一部は胆汁中に排泄された後に、糞に混入したものと考えられる。また、プローブが尿からも排泄されることが分かった。

［実施例７］腫瘍モデルマウスの蛍光イメージング２
　葉酸非発現細胞としてヒト繊維肉腫由来のＨＴ１０８０細胞を用いた以外は、実施例６と同様の方法を用いて、ＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスを作製した。次いで、得られた腫瘍モデルマウスについて、実施例６と同様の方法を用いて、各蛍光プローブ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）を用いた蛍光イメージングを行った。結果を図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。

図１２Ａは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いたＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。図１３Ａは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を用いたＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。図１２Ａ及び図１３Ａにおいて、Ｔは腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）を示し、Ｍは非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）を示す。また、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。

　図１２Ｂは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。図１３Ｂは、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を投与したＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。

　また、時間経過観察後、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させ、取り出した臓器の蛍光イメージングを行うことでプローブの体内分布を調べた。結果を図１２Ｃ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１）及び図１３Ｃ（ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２）に示す。図１２Ｃ及び図１３Ｃにおいて、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。

　図１２Ａ及び図１２Ｂから、ＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスにＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与した場合には、プローブ投与直後から速やかに蛍光が消失し、その後は腫瘍部で蛍光が上昇することはなかった。

また、安楽死した後に開腹してプローブの臓器分布を調べたところ、腸と胃以外からの蛍光は観察されなかった（図１２Ｃ参照）。

このことから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１が腫瘍に集積する理由は、腫瘍細胞に発現している葉酸受容体に結合しているためであることが明らかとなった。

一方、図１３Ａ及び図１３Ｂから、ＨＴ１０８０細胞腫瘍モデルマウスにＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２を投与した場合には、プローブ投与直後から、全身から蛍光が観察され、その後、時間経過に伴い蛍光が低下する様子が観察された。一方、腫瘍部では蛍光が上昇する様子は観察されなかった。

また、腫瘍部から蛍光が観察されなかった以外は、ＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの結果と同じで、安楽死の後の摘出臓器の蛍光観察によるプローブの体内分布の検討の結果、胃、腸及び腎臓から蛍光が観察された（図１３Ｃ参照）。

［実施例８］腫瘍モデルマウスの蛍光イメージング３
　次いで、ＫＢ細胞腫瘍モデルマウスでの過剰量の葉酸及びＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いた競合阻害実験を行った。

　まず、実施例６と同様の方法を用いて、ＫＢ細胞腫瘍モデルマウスを作製した。次いで、葉酸を生理食塩水１００μＬに６ｍＭとなるように溶解させて、葉酸溶液を調製した。また、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を生理食塩水１００μＬに１００μＭとなるように溶解させて蛍光プローブ溶液を調製した。次いで、葉酸溶液をを尾静注によって投与した。その後、蛍光プローブ溶液を尾静注によって投与し、蛍光の経時変化をｉｎ　ｖｉｖｏイメージャー（Ｅｘ．６６１ｎｍ、Ｅｍ．７００～８００ｎｍ）にて観察した（ｎ＝３）。なお、投与前、並びに、投与から０、０．５、１、２、３及び６時間後にＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの撮影を行った。結果を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。

図１４Ａは、６ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージングの結果を示す画像である。図１４Ａにおいて、Ｔは腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）を示し、Ｍは非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）を示す。また、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。

　図１４Ｂは、６ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位（Ｔｕｍｏｒ）及び非腫瘍部位（Ｍｕｓｃｌｅ）における蛍光強度の時間変化を示すグラフである。

　また、時間経過観察後、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させ、取り出した臓器の蛍光イメージングを行うことでプローブの体内分布を調べた。結果を図１４Ｃに示す。図１４Ｃにおいて、上側は白色光下での明視野像であり、下側は蛍光像である。

　図１４Ａ及び図１４Ｂから、６ｍＭの葉酸存在下で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を投与したＫＢ細胞腫瘍モデルマウスの腫瘍部位から蛍光は観察されなかった。

また、時間経過観察後、安楽死させてプローブの各臓器への分布を観察したところ、腸の糞と胃とから蛍光が観察された（図１４Ｃ参照）。

これらのことから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１は葉酸受容体に結合することで腫瘍を選択的に可視化していることが確かめられた。

　また、以上の結果から、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１は投与後わずか３０分で葉酸受容体が発現している腫瘍部位を高いＳ／Ｎ比で観察できる化合物であることが示された。このように、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１において、早いタイムコースで感度の高いイメージングが達成された。

一方、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２においては、非腫瘍部位での蛍光も高く、腫瘍部位及び非腫瘍部位のＳ／Ｎ比は低かった。これは、上記のＦｏｌａｔｅＳｉＲ－２の葉酸受容体非依存的な細胞内への取り込みに起因すると考えられる。また、他の理由としては、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を構成する蛍光団である２－ＣＯＯＨ　ＳｉＲのスピロ環化の形成にも関係すると考えられる。

［実施例９］ヒト腫瘍組織の蛍光イメージング
　ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１を用いて、市販のヒト卵巣腫瘍組織アレイ（Ｏｖａｒｙ　Ｔｕｍｏｒ　Ｆｒｏｚｅｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｒｒａｙ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ６２３５１８３－５；Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｂ７０５０６１；ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））の蛍光イメージングを行った。

　具体的には、３個の正常卵巣組織と３７個の卵巣腫瘍組織との計４０組織のアレイをＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１にて蛍光染色した。結果を図１５Ａに示す。

　図１５Ａから、正常検体（３検体）からは蛍光が観察されなかったが、卵巣腫瘍検体（３７検体）の多くで蛍光が観察された。

さらに、上記市販のヒト卵巣腫瘍組織アレイを抗葉酸受容体抗体を用いて免疫染色した。結果を図１５Ｂに示す。

図１５Ａ及び図１５Ｂから、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１の蛍光が観察された卵巣腫瘍検体と免疫染色の結果とは、高い相関を示した。

以上のことから、ヒト卵巣腫瘍で高発現する葉酸受容体もＦｏｌａｔｅＳｉＲ－１によって検出できる可能性が示された。

　本実施形態の化合物は、葉酸受容体イメージングプローブ、がん検出用マーカー（特に、卵巣癌検出用マーカー）、神経管閉鎖検出用マーカー等に利用可能である。

Claims

　下記一般式（１）で表される化合物。

（式中、ＸはＳｉＲ_２、ＧｅＲ_２、ＳｎＲ_２、ＣＲ_２、ＳＯ_２又はＰＯＲ’である。前記Ｒは炭素数１以上１０以下のアルキル基である。前記Ｒ’は炭素数１以上１０以下のアルキル基、水酸基又はフェニル基である。Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１７はそれぞれ独立にハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成していてもよい。Ｒ^１８は下記式（２）で表される基である。ｎ^１１は０以上４以下の整数である。ｎ^１２及びｎ^１３は０以上３以下の整数である。）
（式中、Ｙ^１１は側鎖にアミノ基を有する親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１２は単結合又は親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１３は水酸基又は親水性アミノ酸残基である。）
　前記ＸはＳｉＲ_２である請求項１に記載の化合物。
　前記Ｙ^１１はアスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基又はアルギニン残基である請求項１又は２に記載の化合物。
　複数あるＲ^１１のうち少なくとも一つがメチル基又はカルボキシ基である請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
前記Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はメチル基又はエチル基である請求項１～４のいずれ一項に記載の化合物。
前記Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成している請求項１～４のいずれ一項に記載の化合物。
　下記一般式（１－１）で表される化合物。

（式中、Ｒ^１１１はメチル基又はカルボキシ基である。Ｒ^１２及びＲ^１７はそれぞれ独立にハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１以上１０以下のアルキル基、炭素数１以上１０以下のアルコキシ基、炭素数１以上１０以下のヒドロキシアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又はアミド基である。Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成していてもよい。Ｒ^１８は下記式（２）で表される基である。Ｒ^１９及びＲ^２０はそれぞれ独立に炭素数１以上１０以下のアルキル基である。ｎ^１２及びｎ^１３は０以上３以下の整数である。）

（式中、Ｙ^１１は側鎖にアミノ基を有する親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１２は単結合又は親水性アミノ酸残基である。Ｙ^１３は水酸基又は親水性アミノ酸残基である。）
　前記Ｙ^１１はアスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、オルニチン残基又はアルギニン残基である請求項７に記載の化合物。
　前記Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はメチル基又はエチル基である請求項７又は８に記載の化合物。
　前記Ｒ^１２及びＲ^１３、並びに、Ｒ^１６及びＲ^１７はそれぞれつながって環を形成している請求項７又は８に記載の化合物。
　下記式（１－１－１）又は（１－１－２）で表される化合物。
　請求項１～１１に記載の化合物を含む葉酸受容体イメージングプローブ。
　請求項１２に記載の葉酸受容体イメージングプローブを用いる葉酸受容体の検出方法。
　請求項１２に記載の葉酸受容体イメージングプローブを備える葉酸受容体検出用キット。
　請求項１２に記載の葉酸受容体イメージングプローブを含むがん検出用マーカー。
　前記がんが、卵巣癌又は子宮内膜腫瘍である請求項１５に記載のがん検出用マーカー。
　請求項１２に記載の葉酸受容体イメージングプローブを含む神経管閉鎖検出用マーカー。