KR102490530B1 - 화합물, 이를 포함하는 시스테인 탐지용 조성물, 및 시스테인 검출 방법 - Google Patents

화합물, 이를 포함하는 시스테인 탐지용 조성물, 및 시스테인 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화합물, 이를 포함하는 시스테인 탐지용 조성물, 및 시스테인 검출 방법에 관한 것으로, 시스테인이 과발현 되어있는 암 세포 및 조직을 가시화하여 종양을 빠르게 진단할 수 있다.

Description

화합물, 이를 포함하는 시스테인 탐지용 조성물, 및 시스테인 검출 방법{Compound, Composition for detecting cysteine comprising compound, and Method for detecting cystein}
본 발명은 화합물, 이를 포함하는 시스테인 탐지용 조성물, 및 시스테인 검출 방법에 관한 것이다.
시스테인(cysteine, cys)은 티올 작용기(thiol group)를 가진 대표적인 아미노산(amino acid) 중 하나로서 다양한 생물학적 과정에서 사용되며. 특히 암에서의 시스테인은 종양발생 (oncogenesis) 과정 중 종양의 증식을 촉진한다. 유방암 (breast cancer)에서 시스테인 트랜스포터 (cysteine transporter)의 종류 중 하나인 에스엘시3에이1 (SLC3A1, solute carrier family3 member1)이 과발현함에 따라 유방암의 종양형성 속도가 빨라지며, 이를 통해 시스테인의 세포 내 유입을 막는 것이 새로운 유방암 치료법이 될 수 있다. 또한, 난소암 (ovarian cancer) 환자의 혈액 안 시스테인의 레벨에 따라 환자가 치료 저항성을 가지는지 구별할 수 있고, 시스테인이 난소암의 증식에 중요한 역할을 하였다. 따라서 기초과학의 분야에서 생체 내 시스테인을 선택적으로 감지할 수 있는 소재 개발은 중요하며, 이 기술을 이용하여 시스테인을 선택적으로 감지하는 것, 더 나아가 특정 세포 내 소기관에서 시스테인을 특이적 감지하는 것은 시스테인과 관련된 질병의 이해와 더불어 기초 연구에 있어 그 활용 범위가 다양하다. 특히, 암 생물학 분야에서 시스테인과 암의 상관관계는 매우 중요하게 연구되고 있다. 세포 내 시스테인의 존재를 측정하는 방법으로 질량 분석법 (Mass spectrometer), 고성능 액체 크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC), 순환 전압 전류법 (Cyclic voltammetry), 모세관 전기 영동법 (capillary ectrophoresis) 등이 알려져 있으나, 그 분석 과정이 복잡할 뿐 아니라, 많은 시간과 비용이 소모된다는 단점이 있다.
형광 분자 탐침자는 분석 방법이 간편하고, 적은 시간과 비용이 소모되기 때문에 이러한 단점을 보완할 수 있다. 그러나 현재까지 개발된 시스테인 감지 기능의 형광 분자 탐침자는 호모시스테인(homocystein HCy), 글루타치온(glutathione, GSH) 등 -SH 그룹을 가지는 여러 화합물에도 감응하여 시스테인에 대한 선택적 감지가 어렵고 정확성이 떨어지는 단점이 있으며, 일부 선택성을 가진 형광 탐침자 역시 특정 조건 내에서 그 특성을 보였다. 시스테인의 선택적인 감지를 위해서는 다른 티올 그룹보다 높은 친전자핵과 특정 가림 효과(steric effect)가 필요하며, 분자 내 전하 이동 (intramolecular charge transfer, ICT), 포스터 공명 에너지 전달 (Forster resonance energy transfer, FRET), 광유발 앙성자 이동 (Photoinduced proton transfer, PET), 여기 상태 분자 내 양성자 이동 (excited state intramolecular proton transfer, ESIPT) 등과 같이 형광 신호를 유발할 수 있는 개념의 도입이 필요하다. 하지만 여전히 시스테인과 호모시스테인의 구조적 유사성으로 인해 시스테인만을 선택적으로 감지하는 것이 대단히 어려운 과제이다.
시스테인에 높은 선택성과 민감도를 가짐과 동시에 강한 형광을 발하는 탐침자는 그 중요성에도 불구하고 여전히 매우 도전적인 과제로 남아있으며, 현재까지 직접적으로 시스테인의 존재를 인간생체 유래물질 및 암 조직에서의 적용은 보고된 바 없다. 이에, 본 발명자들은 간단하고 빠른 시간의 합성법으로 생체 및 조직 내에서 높은 안정성을 보이며 낮은 세포 독성을 갖는 작은 분자 탐침자로서, 세포, 조직 나아가 인간유래 암 조직 내에서 시스테인과 상호작용하여 빠른 시간 내에 형광을 발하는 획기적인 형광 탐침자를 개발하였다.
본 발명의 일 예는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure 112021014145631-pat00001
상기 화학식 1에서, X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐일 수 있고, Y는 나이트로기 또는 설포닐기일 수 있다. 상기 할로겐은 예를 들어 F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다. 상기 X1 내지 X5 중 적어도 1개는 할로겐일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 시스테인 탐지용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 시스테인 과발현 조직, 세포, 또는 세포 소기관 가시화 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는 조성물을 시료와 접촉하는 단계; 및 상기 접촉에 의한 형광을 확인하는 단계를 포함하는, 시스테인을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 2]
Figure 112021014145631-pat00002
상기 화학식 2에서 Y는 나이트로기 또는 설포닐기일 수 있고, X6는 할로겐일 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112021014145631-pat00003
상기 화학식 3에서 X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐일 수 있다. 상기 X1 내지 X5 중 적어도 1개는 할로겐일 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure 112021014145631-pat00004
상기 화학식 1에서, X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐일 수 있고, Y는 나이트로기 또는 설포닐기일 수 있다. 상기 할로겐은 예를 들어 F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다. 상기 X1 내지 X5 중 적어도 1개는 할로겐일 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 1에서 X1 내지 X5는 각각 F이고, Y는 NO2일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 예에 따른 화합물은 플루오로페녹시기를 갖는 7-니트로벤조퓨라잔(7-nitrobenzofurazan) 구조를 포함하며, 일 예로 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole) 구조를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물은, 시스테인과 접촉하여 형광을 발하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자는 이광자 여기 (two-photon excitation) 특성을 가짐에 따라 깊은 조직 투과도, 낮은 조직 자체로부터의 형광 간섭, 높은 해상도, 낮은 세포 손상 등의 특징으로 이광자 현미경 기반 생체 영상화 연구에 적용이 가능하다.
이에, 본 발명의 또 다른 일 예는 상기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 시스테인 탐지용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는, 시스테인이 과발현된 조직, 세포 또는 세포 소기관, 예를 들면 소포체를 형광으로 가시화할 수 있는 가시화 조성물에 관한 것이다. 상기 화합물은 전술한 바와 같다. 본 발명의 일 예에 따른 가시화 조성물은 시스테인이 포함된 소포체, 뇌세포, 뇌조직 등을 선택적으로 탐지 가능하다.
본 발명의 일 예에 따른 화합물 또는 조성물은 시스테인과 접촉하여 형광을 발하는 것일 수 있으며, 암 세포에 과발현되어 있는 시스테인과 반응하여 형광 켜짐(turn-on) 특성을 보이며 다른 티올 그룹에 간섭이 없음을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 일 예에 따른 화합물 또는 조성물은 형광 탐침자 (Fluorescence probe)일 수 있으며, 시스테인을 과발현하는 암 세포 또는 암 조직의 영상화 및 질병 진단에 이용될 수 있다. 즉, 상기 조성물은 시스테인에 의해 형광이 켜지는 형광-켜짐 특성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명자들은 시스테인을 세포 내 또는 조직에서 간편하게 감지할 수 있는 형광 분자 탐침자를 개발하고자 하였으며, 에테르 그룹이 티올 그룹에 반응하고 펜타플루오로페놀 (Pentafluorophenol) 그룹이 세포내 소포체를 표적한다는 것에 착안하여 본 발명의 형광 탐침자를 개발하였다.
상기 화학식 1의 화합물은 시스테인에 의해 상기 화학식 1의 화합물 내의 에테르 결합이 깨져 형광 신호를 발하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 시스테인의 티올 (-SH) 그룹에 의해 상기 화학식 1의 화합물 내의 에테르 결합이 깨져 형광 신호를 발하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물은 시스테인 (cysteine)의 티올 (-SH) 그룹에 의해 상기 화학식 1의 화합물 내의 에테르 결합이 깨져 시스테인의 아민(-NH2)과 티올 (-SH)이 치환되어 형광 신호를 발하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는 조성물은 사용 목적에 따라 용매를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 용매는 물, 완충액, 다이메틸 설폭사이드 (dimethyl sulfoxide), 알코올, 에틸 에테르 (ethyl ether), 및 다이에틸 에테르 (diethyl ether)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 화학식 1에 따른 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은, 티올 그룹을 가지는 시스테인이 아닌 분자를 포함하는 시료에서 시스테인을 탐지 가능한 것일 수 있다. 구체적으로, 본원 실시예에 의하면, 본 발명의 일 예에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은, 시스테인과 접촉하여 형광을 발하지만, 시스테인과 유사하게 티올 (-SH) 그룹을 가지는 화합물과 접촉할 경우에는 형광을 발하지 않아, 시스테인을 특이적으로 검출 가능했다. 상기 티올 그룹을 가지는 시스테인이 아닌 분자는, 예를 들어 호모시스테인 (homocysteine), 글루타치온 (glutathione), 소듐설페이트 (sodium sulfate), 황화수소, 시스테인을 제외한 아미노산, 및 HSA (Human serum albumin)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또는, 본 발명의 일 예에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은, 금속이온을 포함하는 시료에서 시스테인을 탐지 가능한 것일 수 있다. 구체적으로, 본원 실시예에 의하면, 본 발명의 일 예에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은, 시스테인과 접촉하여 형광을 발하지만, 금속이온을 포함하는 시료와 접촉할 경우 형광을 발하지 않아, 시스테인을 특이적으로 검출 가능했다. 상기 금속 이온은 예를 들어 PbCl2, MGCl2, FeCl3, Hg(NO3)2, CdCl2, ZnCl2, NiCl2, CoCl2, NaCl, AuCl3, AgCl, CuCl2, 및 KCl로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적으로, 상기 화합물 또는 상기 조성물은, 호모시스테인, 글루타치온, 및 황화수소로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 포함된 시료와 반응하였을 때보다, 시스테인이 포함된 시료와 반응하였을 때 더 높은 세기의 형광 신호를 발하는 것일 수 있다. 통상의 기술자라면 상기 더 높은 세기의 형광 신호를 명확히 이해하여 본 발명을 실시할 수 있을 것이며, 구체적으로 통상의 기술자라면 호모시스테인, 글루타치온, 및 황화수소로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고, 시스테인은 포함하지 않는 시료와 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물이 반응하였을 때 발생하는 형광 신호 세기와, 시스테인을 포함하는 시료와 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물이 반응하였을 때 발생하는 형광 신호 세기를 명확히 구별하여, 호모시스테인, 글루타치온, 및 황화수소로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 시료에서 시스테인을 검출할 수 있는 본 발명을 명확하게 실시 가능할 것이다.
더욱 구체적으로, 상기 화합물 또는 상기 조성물은, 호모시스테인 (예를 들어, DL-Homocysteine), 글루타치온 (예를 들어, L-Glutathion), 글루타민 (예를 들어, L-GLutamin), 라이신 (예를 들어, L-Lysine), HSA (Human serum albumin), PbCl2, MGCl2, FeCl3, Hg(NO3)2, CdCl2, ZnCl2, NiCl2, CoCl2, NaCl, AuCl3, AgCl, CuCl2, 및 KCl로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 포함된 시료와 반응하였을 때보다, 시스테인이 포함된 시료와 반응하였을 때 더 높은 세기의 형광 신호를 발하는 것일 수 있다. 상기 더 높은 세기의 형광 신호는 전술한 바와 같이 통상의 기술자가 명확히 이해하여 본 발명을 실시할 수 있을 것이다.
더욱 구체적으로, 상기 화합물 또는 상기 조성물이 시스테인 (cysteine)과 접촉할 경우 발하는 형광 신호의 세기는, 상기 화합물이 호모시스테인 (homocysteine), 글루타치온 (glutathione), 소듐설페이트 (sodium sulfate), 시스테인을 제외한 아미노산, 호모시스테인 (예를 들어, DL-Homocysteine), 글루타치온 (예를 들어, L-Glutathion), 글루타민 (예를 들어, L-GLutamin), 라이신 (예를 들어, L-Lysine), HSA (Human serum albumin), PbCl2, MGCl2, FeCl3, Hg(NO3)2, CdCl2, ZnCl2, NiCl2, CoCl2, NaCl, AuCl3, AgCl, CuCl2, 및 KCl로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과 접촉할 경우 발하는 형광 신호의 세기보다 높은 것일 수 있으며, 예를 들어 1배 초과, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 또는 100배 이상일 수 있으며, 이 때 상기 형광 신호의 세기의 상한값이 특정되지 않더라도 상기 화합물이 시스테인과 접촉하지 않은 경우와, 상기 화합물이 시스테인과 접촉한 경우를 구별하기 위한 목적에서 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 상한값은 200배 이하, 150배 이하, 100배 이하, 90배 이하, 80배 이하, 70배 이하, 60배 이하, 50배 이하, 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 또는 10배 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 상기 화합물 또는 상기 조성물은 호모시스테인 (예를 들어, DL-Homocysteine), 글루타치온 (예를 들어, L-Glutathion), 글루타민 (예를 들어, L-GLutamin), 라이신 (예를 들어, L-Lysine), HSA (Human serum albumin), PbCl2, MGCl2, FeCl3, Hg(NO3)2, CdCl2, ZnCl2, NiCl2, CoCl2, NaCl, AuCl3, AgCl, CuCl2, 및 KCl로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과 접촉할 경우 형광 신호를 발하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 화학식 1에 따른 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은, 시스테인을 포함하는 시료와 접촉하였을 때 빠르게 형광을 발하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물 또는 상기 조성물은 시스테인을 포함하는 시료와 접촉하여 10분 이내, 9분 이내, 8분 이내, 7분 이내, 6분 이내, 5분 이내, 4분 이내, 3분 이내, 2분 이내, 또는 1분 이내에 형광을 발하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 의하면, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 이용하여 시스테인을 특이적으로 탐지 가능하다. 이에, 본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 시스테인 과발현 조직, 세포, 또는 세포 소기관 가시화 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 시스테인에 대한 형광 탐침자로서, 이광자 여기 특성을 가지며, 일광자 (one-photon) 형광 탐침자 보다 높은 파장 (또는 낮은 파장의 에너지)을 이용해 들뜬 상태 (excited state)로 여기 (excitation) 시키는 특성으로 인하여 깊은 세포 투과성, 낮은 세포 파괴성, 생체 내 자가형광 등에 의한 간섭 등에 영향을 적게 받을 뿐 아니라, 초점 부위만 여기 시키므로 매우 높은 해상도를 구현할 수 있는 장점을 가진다. 이에, 본 발명에 따른 탐침자는 특정 조직, 세포, 또는 세포 소기관에 포함된 시스테인을 선택적으로 탐지하여 해당 조직, 세포 또는 세포 소기관을 가시화, 영상화 또는 조영할 수 있다.
상기 시스테인 과발현 조직, 세포, 또는 세포 소기관은 암조직, 암세포, 또는 암세포 소기관인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 화합물은 암세포가 포함된 시료에 처리될 경우 형광을 발하는 것일 수 있으며, 상기 형광은 암세포 내에서 발하는 것일 수 있다.
상기 암은 뇌종양, 대장암, 위암, 간암, 유방암, 폐암, 췌장암, 담낭암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 난소암, 직장암, 중추신경계 종양, 척수 종양, 자궁경부암, 혈액암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 및 부신암으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 예로, 상기 암세포는 뇌종양 세포일 수 있다.
일 예로, 상기 세포 소기관은 소포체일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 시스테인을 특이적으로 감지하여 형광 영상화를 위해 공초점 현미경 (Confocal laser microscopy), 이광자 현미경 (Two photon excitation microscopy) 또는 형광 조직 이미징 시스템 (Fluorescence tissue imaging system, FTIS) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 화합물은 펜타플루오로페놀 (Pentafluorophenol) 그룹을 포함하여, 소포체를 표적하는 것일 수 있다. 본원 실시예에서 화학식 1의 화합물의 소표체 표적 특성을 확인하였으며, 종래의 소포체 표적 물질 (예를 들어, ER-Tracker™ Red, Invitrogen)과 0.7 이상 또는 0.8 이상의 높은 pcc 값 (Pearson correlation coefficient)을 보여, 높은 소포체 표적성 (Targetability)을 가지는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 일 예에 따른 화합물은 세포 내의 단백질 합성 부위인 소포체 (Endoplasmic Recticulum)에서의 시스테인을 특이적으로 탐지할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자는 작은 유기 분자로서 다른 티올 그룹의 간섭에 의한 문제점들을 극복하고, 시스테인과 결합할 때 형광 신호를 발할 수 있어, 세포소기관인 소포체를 탐지할 수 있고, 세포 내의 활성산소가 많은 종, 특히 암세포와 같이 활성산소에 대한 방어 기작으로 증가된 세포 내 시스테인에서 밝은 형광이 나타내게 되어, 세포 또는 조직, 생검 내에서 암 세포 또는 암 조직, 생검을 선택적 영상화 및 진단에 효율적으로 활용할 수 있으며, 나아가 시스테인이 과 발현되어있는 뇌종양 세포 및 뇌종양 조직 진단 및 뇌종양 환자 예후 확인에 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화합물은, 낮은 세포 독성 및 생체 내 독성을 가지고 있기 때문에 생물학적 적용 범위가 넓을 뿐 아니라 정맥 주사를 통한 암 영상화, 특히 뇌 혈관 벽을 통과할 수 있어 뇌종양 영상화 등이 가능하다.
이에, 본 발명의 일 예에 의하면 상기 형광 탐침자를 이용하여 시스테인이 과발현 되어있는 세포를 영상화하는 소재 및 이의 영상화 방법을 제공함과 동시에 상기 형광 탐침자를 이용하여 시스테인이 과발현 되어있는 암 세포 및 조직, 특히 뇌종양을 영상화하는 소재 및 이의 영상화 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는, 시스테인을 과발현하는 종양의 표적 조영제에 관한 것이다. 상기 화합물은 전술한 바와 같다. 상기 시스텐인을 과발현하는 종양은, 예를 들어 뇌종양, 일예로 교모세포종일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는, 암 진단용 조성물, 바람직하게는 뇌종양의 진단, 더욱 바람직하게는 교모세포종의 진단에 관한 것이다. 상기 화합물은 전술한 바와 같다. 뇌종양에서 시스테인의 양이 일반 조직에서보다 증가함을 형광 세기로 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 화합물은 전술한 바와 같다. 상기 생물학적 시료는 개체에서 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 시료는 세포, 조직, 혈액, 체액, 척수액, 뇌 척수액, 호흡기 분비물, 및 조직세척액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법은 추가로 형광을 적용하여 가시화하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 또한 상기 방법은 추가로 형광을 적용하여 가시화하는 단계 및 형광 세기를 측정하여 암을 정량적으로 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 예에 의하면, 상기 암 진단 방법에 더하여 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 이에, 본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 암 진단 방법에 더하여 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 암 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 암 진단 방법에 관한 것이다. 상기 화합물은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 암 진단 방법에 더하여 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 암 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 및 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 전술한 바와 같다.
일 예로, 상기 화학식 2에서 Y는 NO2이고, X6는 Cl일 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 3에서 X1 내지 X5는 F일 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 4-클로로-7-니트로벤조퓨라잔일 수 있고, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 2,3,4,5,6ㅡ펜타플루오로페놀일 수 있다.
구체적인 본 발명의 또 다른 일 예는, 4-클로로(Chloro)-7-니트로벤조퓨라잔(nitrobenzofurazan) 및 펜타플루오로페놀 (Pentafluorophenol) 을 반응하는 단계를 포함하는, 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole) 구조를 포함하는 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 제조방법은 N,N-디이소프로필에틸아민 (N,N-Diisopropylethylamine, DIPEA)를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자는 작은 유기 분자로서 시스테인과 결합할 때 형광 신호를 발할 수 있어, 기존의 시스테인을 감지하기 위한 복잡한 구조를 갖는 형광 탐침자의 문제점과 다른 티올 그룹 간의 간섭에 의한 문제점들을 극복하였을 뿐만 아니라, 세포소기관인 소포체를 탐지할 수 있고, 세포 내의 활성산소가 많은 종, 특히 암 세포와 같이 활성산소에 대한 방어 기작으로 증가된 세포 내 시스테인에서 밝은 형광이 나타내게 되어, 세포 또는 조직, 생검 내에서 암 세포 또는 암 조직, 생검을 선택적 영상화 및 진단에 효율적으로 활용할 수 있으며, 나아가 시스테인이 과 발현되어있는 뇌종양 세포 및 뇌종양 조직 진단 및 뇌종양 환자 예후 확인에 유용하게 활용될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자는 시스테인과 관련된 세포 내 기작 연구, 시스테인과 관련된 암 기작 연구, 시스테인과 관련된 치료제 개발 및 치료제 효능 연구 등 다양한 연구 분야에서 적용이 가능하다. 또한, 낮은 세포 독성 및 생체 내 독성을 가지고 있기 때문에 생물학적 적용 범위가 넓을 뿐 아니라 정맥 주사를 통한 암 영상화, 특히 뇌 혈관 벽을 통과할 수 있어 뇌종양 영상화 등이 가능하다. 인체유래 뇌종양 조직 샘플에서도 높은 형광 신호를 선택적으로 보였기에, “영상기반 수술”로도 적용이 가능하다. 이에, 본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자는 기초과학 및 임상학적 연구 분야에서 광범위하게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자는 짧은 시간 (예를 들어, 10분 이내)에 대량 합성이 가능하며, 시험관 테스트, 세포 내 영상화, 조직 영상화, 동물 영상화, 인체유래 조직 영상화 등에서 시스테인을 선택적으로 감지해 뇌종양 영상화로의 예를 보인 최초의 소재이다. 또한, 본 발명에 의해 밝혀진 세포 및 동물, 그리고 생검에서의 강한 형광의 효율, 세포 및 동물 내에서의 낮은 독성 등의 다양한 응용 연구 결과는 기술의 즉각적인 사업화가 가능함을 충분히 제시하였다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자는 기초연구 및 임상 연구에 활용 가능성과 전망이 매우 높기에, 향후 기술의 사업화 전망이 뚜렷하다.
도 1은 화학식 1에 따른 화합물의 흡수 및 형광 그래프를 나타낸 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 화학식 1에 따른 화합물의 시스테인에 대한 선택성을 형광 세기를 측정하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 화학식 1에 따른 화합물의 시스테인에 대한 반응을 LC-MS로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 화학식 1에 따른 화합물의 세포 독성을 다양한 세포에서 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 화학식 1에 따른 화합물이 뇌종양세포에서 형광이 증가함을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 화학식 1에 따른 화합물이 소포체 표적 능력이 있는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 화학식 1에 따른 화합물의 세포 내 시스테인의 선택성을 보여주는 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a 내지 도 8c는 화학식 1에 따른 화합물의 설치류에서의 독성을 테스트한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 화학식 1의 화합물을 뇌종양 모델에 처리한 후 뇌종양에서 형광이 켜짐을 형광 조직 이미징 시스템과 이 광자현미경을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 화학식 1의 화합물을 뇌종양 생검에 처리한 후 형광의 켜짐을 형광 조직 이미징 시스템과 이 광자현미경을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 일 예에 따르면 하기 화학식 1의 화합물을 이용하여 세포, 조직 그리고 인체 유래 물질에서의 시스테인 감지를 위한 형광 탐침자를 제공할 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112021014145631-pat00005
본 발명의 일 구현예에 있어, 상기 화합물은 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole) 구조를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 화합물은 시스테인이 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole)의 분자 내 탄소를 공격하여 에테르결합(ether linkage)이 깨어지고 시스테인과 결합하여 형광을 나타내는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자를 이용하여 다른 티올 그룹에 간섭을 받지 않고 높은 특이성으로 시스테인을 감지하는 탐침자와 이에 대한 세포 또는 조직 영상화, 생검 테스트 (biopsy test) 방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 화합물은 시스테인에 선택성을 가지며, 기타 티올 그룹을 포함한 아미노산 및 화합물, 금속 이온에는 형광변화를 보이지 않는 것을 특징으로 한다 (도 2a 및 도 2b 참조).
본 발명의 일 예에 따른 상기 화학식 1의 화합물에서 X1 내지 X5 중 1종 이상의 그룹, 예를 들어 -플루오로 (-fluoro) 에 의해 전자부족 상태에 도달하고, 이에 전자를 받는 Y 그룹, 예를 들어 이산화질소 (NO2) 그룹이 충분한 전자를 받지 못하게 된다. 따라서 이 상태에서는 형광을 내지 않지만, 시스테인과 반응을 할 때에는 분자 내의 에테르 결합이 시스테인의 티올 (-SH) 그룹에 의해 깨지게 되고, 분자 내 교환 (intramolecular exchange)이 일어나 시스테인의 아민 (-NH2)과 티올 (-SH)이 서로 치환되고, 이때 강한 형광이 발생하게 된다. 또한, 상기 화합물이 이광자에 의해 여기 될 수 있음을 확인하였고, 이를 통해 높은 해상도의 조직이미지 결과를 얻을 수 있었다 (도 9 및 도 10 참조). 이러한 특성은 전자주게-전자받게 구조의 형광단의 특성에 분자 내 에테르 결합을 포함하면서 전자가 부족한 구조를 도입함으로써 구현될 수 있었다.
본 발명의 일 실시예 8 에서, 본 발명에서 개발된 상기 화학식 1의 화합물을 형광 탐침자로 이용하였을 때, 세포 내 기작에서도 시스테인의 증가, 감소를 탐지할 수 있음을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 형광 탐침자가 시스테인과 반응하여 형광을 증가시킴으로써, 시스테인의 존재 여부 및 시스테인의 양 및 다양한 세포 영상화 방법에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다 (도 5 내지 도 7 참조). 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 형광 탐침자는 시스테인을 과 발현하는 세포 또는 조직의 영상화를 위한 조성물, 또는 영상화 방법 등에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광 탐침자를 이용하여 세포 또는 조직 내의 소포체를 탐지할 수 있는 형광을 측정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직의 영상화(imaging) 방법을 제공할 수 있다 (도 6 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1의 화합물이 사용되기 위해 세포 독성 측정 및 마우스 모델에서의 독성 테스트 등이 수행되었으며, 이를 통해 본 발명의 형광 탐침자가 낮은 독성을 가지고 생체 내 영상화 및 생체 외 영상화를 수행할 수 있음을 확인하였다 (도 4 내지 도 8 참조).
또한 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에서 개발된 상기 화학식 1의 투여 방식은 통상적으로 정맥 주사 (intravenous)에 의해 투여될 수 있으며, 사용 형태 및 목적, 적용 동물에 따라 이는 적절하게 조정될 수 있다. 통상의 방법에 따라 멸균 주사 용액 형태의 비 경구 제형으로 사용될 수 있다. 상기 제시된 화학식 1 화합물의 투여 용량 및 제형의 방법은 화학식 1 화합물을 사용하기 위한 바람직한 방법일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole) 합성 및 구조 분석
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 대표하여, 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole)의 합성 과정을 반응식 1에 나타내었다.
[반응식 1]
Figure 112021014145631-pat00006
구체적으로, 둥근 플라스크를 밀폐하고 내부의 수증기를 제거하기 위해서 진공펌프와 연결하였고 이후 토치로 열을 가해 주었다. 둥근 플라스크 벽면의 수증기가 사라진 후로부터 1시간 동안 둥근 플라스크의 내부를 진공상태로 유지하였다. 다음에 아르곤 (argon)이 들어있는 풍선을 둥근 플라스크에 꽂아 준 후, 진공 펌프를 개폐, 밀폐를 반복하였다.
합성 출발 물질인 4-클로로(Chloro)-7-니트로벤조퓨라잔(nitrobenzofurazan)　화합물 (200 mg, 0.001 mmol, Alfa, A14165)을 둥근 플라스크에 K2CO3 (207 mg, 0.0015 mol)와 회전막대 (stirring bar)를 함께 넣어주었다. 이후 아르곤 풍선을 꽂아주었다. 펜타플루오로페놀 (Pentafluorophenol) 화합물 (552 mg, 0.003 mol)을 20 mL 바이알에 넣어주었고 디메틸포름아마이드 (Dimethylformamide, DMF)를 5 mL을 넣어주었다. 이후 이를 둥근 플라스크 안으로 18G 주사기를 이용해 옮겨주었다.
60 ℃로 온도를 올려주면서 교반시켰다. 온도가 60 ℃에 도달했을 때, N,N-디이소프로필에틸아민 (N,N-Diisopropylethylamine, DIPEA) 0.3 mL를 23G 주사기를 이용하여 넣어주었다. 10 분의 교반 후 물 (H2O, 5 mL)을 넣어주어 반응을 멈추었다.
다음으로 아세트산에틸(Ethyl actate, EtOAc) 50 mL와 포화 소금물 (50 mL), 물 (50 mL)를 이용하여 추출과정을 수행했다. 소디움 메타바이설파이트 (Na2S2O5, 7.11 g, 37.4 mmol)추출을 통해 얻어진 유기층(EtOAc)은 무수황산나트륨(10 g)으로 유기층 내 존재하는 물을 건조하고, 흡기기를 이용하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 어두운 노란색의 고체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리(전개 액: 20% EtOAc/Hexane)하여 어두운 노란색의 고체 화합물(110.2 mg, 31.75 %)을 얻었다.
생성물인 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole)은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.46 (20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 가졌다. 또한, 상기 생성물을 1H-NMR, 13C-NMR 및 high resolution mass (HRMS) 로 다음과 같이 분석하였다.
1H-NMR 을 분석하기 위해서 1 mg 의 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole)을 200 μL의 듀테로화 클로로포름 (CDCl3)에 녹인 뒤 NMR 튜브 (Wilmad® NMR tube 5 mm diameter)에 옮기고 Bruker 사 AVANCE Ⅲ 400 MHz 로 측정하였다.
13C-NMR 을 찍기 위해서 100 mg의 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole)을 200 μL의 듀테로화 클로로포름 (CDCl3)에 녹인 뒤 NMR 튜브 (Wilmad® NMR tube 5 mm diameter)에 옮기고 Bruker 사 AVANCE Ⅲ 400 MHz 로 측정하였다.
High resolution mass spectrometer 는 JEOL JMS-700 spectrometer 로 측정하였다.
상기 생성물인 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole)의 1H-NMR, 13C-NMR 및 high resolution mass (HRMS) 분석 결과는 다음과 같았다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, 298.2 K): δ 8.50 (d, 1H), 6.83 (d, 1H).
13C NMR (CDCl3, 400 MHz, 294.2 K): δ 109.41, 127.39, 128.79, 130.96 131.45, 132.31, 132.66, 137.14, 140.14, 141.73, 142.67, 144.09, 150.70.
HRMS: m/z calcd for C12H2F5N3O4, 346.9965; found, 346.9964.
상기 제조된 4-니트로(nitro)-7-펄플루오로페녹시(perfluorophenoxy)벤조(benzo)[c][1,2,5]옥사다이아졸(oxadiazole)을 화합물 1이라 명명했다.
실시예 2. 흡수 및 형광 특성 확인
실시예 1에서 제조한 화합물 1의 물에서 흡수 및 형광 그래프를 측정하였다. 흡수 스펙트럼(UV/Vis absorption spectra) 분석을 위해서는 UV/Vis spectrophotometer (Agilent Technologies Cary 8454, US)를 사용하였고, 형광 스펙트럼 (fluorescence spectra) 분석을 위해서는 spectro-fluorophotometer (SHIMADZU CORP. RF-6000, Japan)을 사용하였다. 이때, 각 기기에 화합물 1을 넣어주는 cell은 1 cm 두께의 standard quartz cell (interanl volume= 0.1 cm, Hellma Analytics, Jena, Germany)을 이용하였다.
상기 분석 결과 얻어진 그래프를 도 1에 나타냈으며, 도 1은 물 용매 조건하에서 화합물 1의 흡수 및 형광 그래프를 각각 나타낸 것으로, 물 용매 조건하에서 흡수 스펙트럼(a)은 357 nm에서 최고 흡수 값을 가졌다. 하지만, 형광 스펙트럼(b)에서 살펴보면 화합물 1은 형광을 보이지 않았다.
실시예 3. 시스테인 결합 선택성 확인
화합물 1의 시스테인 결합 선택성을 형광 변화를 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
구체적으로, 화합물 1이 시스테인에 선택적으로 결합하는지의 여부를 확인하기 위하여, 티올 그룹 및 금속이온 등을 이용하여 그 형광 변화 여부를 확인하였다. 실험에 사용된 용매로는 물을 사용하였고, 각 티올 그룹 및 시스테인은 TCI (Tokyo chemical industry Co., Ltd) 사의 제품을 사용하였으며, 각 메탈이온은 Sigma aldrich, TCI, Alfa 사에서 제공한 제품을 사용하였다. 교반 (Incubation)은 TOS20 Shaker-Incubator　 (Ruicheng Instrument, Hangzhou, China)가 사용되었으며, 37℃에서 30 분 동안 300 rpm의 진동(shaking)으로 진행되었다. 화합물 1은 10 mM로 DMSO 용액에 녹여 사용되었으며, 최종 사용되는 용매 조건에서 다이메틸 설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)의 양이 각 용기별 동일하도록 통제되었다 (1% 미만).
도 2a 에서 안쪽의 사진은 365 nm exitation box에서 카메라로 촬영한 사진이며, 화합물 1 은 형광을 나타내지 않음을 보여준다. 반면, 화합물 1을 시스테인 (50 μM)이 포함된 물에 첨가하고 30 분간 37 ℃에서 교반해주었을 때 노란색의 강한 형광이 나타남을 확인할 수 있었다. 도 2a는 화합물 1 (검정선), 시스테인이 포함된 물에 화합물 1을 첨가했을 때 (빨간선), 호모시스테인이 포함된 물에 화합물 1을 첨가했을 때 (파란선), 글루타치온이 포함된 물에 화합물 1을 첨가했을 때 (분홍선), 및 소듐설페이트가 포함된 물에 화합물 1을 첨가했을 때 (녹색선)의 형광 변화를 나타낸 것이다. 화합물의 농도는 10 μM로 고정하였으며 각 티올 그룹의 농도는 50 μM로 고정하였다.
도 2b는 다양한 생체분자(티올 그룹 포함)와 금속이온이 포함된 물에 화합물 1을 첨가하고 형광 세기를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 각 실험에 사용한 화합물의 농도는 10 μM, 각 생체분자 및 금속이온은 화합물 농도의 5 당량인 50 μM로 고정한 뒤 실험하였고, 모든 형광세기는 30 분간 37℃ 에서의 반응을 거친 뒤 형광 스펙트럼 (spectro-fluorophotometer)으로 측정한 결과값이다. 도 2b의 가로축에 표시한 생체분자 및 금속이온의 종류는 다음과 같으며, 화합물 1은 Probe 1로 표기하였다:
(A) Probe 1;
(B) Probe 1 with L-cysteine;
(C) Probe 1 with DL-Homocysteine;
(D) Probe 1 with L-Glutathion;
(E) Probe 1 with L-GLutamin;
(F) Probe 1 with L-Lysine;
(G) Probe 1 with HSA (Human serum albumin);
(H) Probe 1 with PbCl2;
(I) Probe 1 with MGCl2;
(J) Probe 1 with FeCl3;
(K) Probe 1 with Hg(NO3)2;
(L) Probe 1 with CdCl2;
(M) Probe 1 with ZnCl2;
(N) Probe 1 with NiCl2;
(O) Probe 1 with CoCl2;
(P) Probe 1 with NaCl;
(Q) Probe 1 with AuCl3;
(R) Probe 1 with AgCl;
(S) Probe 1 with CuCl2;
(T) Probe 1 with KCl.
도 2b에 나타난 바와 같이, 화합물 1은 시스테인이 존재하는 (B)에서만 큰 형광 세기 값을 보였으며, 따라서 화합물 1은 시스테인에 상당한 결합력(binding affinity)을 가짐을 알 수 있다. 또한, 화합물 1이 암세포에 다량 존재하는 시스테인에 선택적으로 결합하여 형광 세기가 증가할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. LC-MS를 이용한 시스테인 반응 테스트
화합물 1의 시스테인에 대한 반응 및 반응물을 확인하기 위하여, Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS, Agilent HP 1260 system)로 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 측정 시 화합물은 물 용액에서 1 mM 의 농도를 사용하였으며, 시스테인은 5 mM 의 농도를 사용하여 1 시간 동안 37℃에서 교반 후 측정하였다.
도 3의 (a) 는 LC-MS 스펙트럼을 보여준다. 구체적으로, 화합물 1 은 이동상을 흘려준 10 분 이후 피크 값이 나타났으며, 화합물 1이 시스테인과 반응 후의 부산물로 예상되는 펜타플루오로페놀은 10 분에 피크 값이 나타난 것을 확인 할 수 있었다. 화합물 1과 시스테인을 반응시킨 후 이동상을 흘려주었을 때, a, b, c의 피크, 그리고 펜타플루오로페놀 피크 값이 나오는 것을 확인 할 수 있었다.
도 3의 (b)는 도 3의 (a)에 표시된 a, b, c 피크에 해당하는 예상 화합물 구조이며, 이는 도 3의 (c) 에 기재된 positive, negative 그리고 exact mass 값을 비교하여 추측할 수 있었다.
이를 통해, 화합물 1이 시스테인에 대한 반응 및 반응 후 물질의 구조를 확인 할 수 있으며, 상기 실시예 3의 결과와 비교하여 화합물 1은 시스테인에 대해 강한 반응성을 가지고, 시스테인에 의해 강한 형광 증가가 유발됨을 알 수 있었다.
실시예 5. 뇌종양 세포에 대한 세포 독성 확인
실시예 1에서 합성된 화합물 1의 세포 독성 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
세포 독성 실험은 CCK-8 assay kit (dojindo molecular technologies, Inc., CatNO: CK04-13)을 사용하였으며, 방법을 dojindo 사에서 제공하는 프로토콜을 따랐다. 구체적으로, 96 well plate (SPL, 30096)에 같은 세포량을 분주한 뒤, 24 시간 동안 37℃ 5% CO2를 유지하는 배양기(Thermo Scientific Forma Series3) 에서 세포를 키웠다. 다음으로 24 시간 후, 배양액을 혈청이 없는 배양액으로 바꾸어 준 뒤 30 분간 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 이후 화합물 1을 농도별로 넣어주었다. 이후 다시 30 분간 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거한 뒤, 남은 배양액을 제거하기 위해 조심스럽게 1번의 세척과정을 거쳤다. 세척은 1xPBS 로 진행하였다. 이후 혈청이 없는 배양액을 각 well 에 90 μL 씩 넣어주었고, 10 μL의 CCK-8 solution을 각각 넣어주었다. 2 시간 동안 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 450 nm에서 흡광값을 측정하였다. 흡광값은 마이크로플레이트 리더기 (Microplate reader, Multiskan FC, Thermo Fisher)로 측정하였으며, 세포 독성 백분율은 (샘플의 흡광값 *100)/(대조군의 흡광값)으로 계산하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 화합물 1은 HEK293, HeLa 그리고 COV-318에서 세포 독성이 나타나지 않았지만, SNU4098 과 U87MG에서 세포독성이 있음을 확인하였다. 이는 교모세포종(뇌종양)에서의 시스테인 발현 수준이 타 암세포 (예를 들어, HeLa, COV-318 등)에 비하여 상당이 높다는 것을 의미하며, 화합물 1은 시스테인 발현량이 높은 뇌종양의 선택적 탐지능을 가지는 것을 알 수 있었다. SNU4098 은 텔로미어 역전사효소 (Telomere reverse transcriptase, TERT) 유전자의 228번째 사이토신 (C, cytosine)이 티민 (T, thymine)으로 점 돌연변이가 일어난 상태 (C228T) 의 인간 유래 뇌종양 세포주이며, 한국 세포주 은행으로부터 분양받았다. U87MG 는 악성 교모세포종 세포주 (뇌종양)이며, 한국 세포주 은행으로부터 분양받았다. 세포 정보 및 사용한 배양액 정보를 아래에 명시한다.
세포정보;
HEK293: Human embryonic kidney 293 cell;
HeLa: Human cell derived from cervial cancer;
COV-318: Ovarian serous adenocarcinoma cell;
SNU4098: Human glioblastoma cell derived from patient;
U87MG: Glioblastoma cell.
배양액;
HEK293, HeLa, COV-318, U87MG - Dulbecco’s modified Eagle’s media (Hyclone, US) supplemented with 10% fetal bovine serum (Hyclone) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco);
SNU4098 - Opti-MEM supplemented with 5% fetal bovine serum (GibcoTM, US) and 1% antibiotic-antimycotic (GibcoTM, US).
실시예 6. 뇌종양 (Glioblastoma) 세포에 대한 선택성 확인
화합물 1이 시스테인에 선택성을 가지고 결합함에 따라 형광 켜짐 현상이 나타나는 것을 도 2a 및 도 2b에서 확인하였으며, 그에 따라 세포 별 형광 세기에 따라 시스테인의 정량이 가능한지 확인해보았다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
구체적으로, 형광의 세기는 공초점 레이저 현미경 (LSM-800, Carl Zeiss, Germany)을 사용하였고 형광 세기 통계 및 측정은 Image J program 과 GraphPad Prism 5 program을 이용하였다 (통계 값 명시하지 않음). 사용된 배양액은 실시예 5에 명시된 바와 동일하게 사용하였다. 세포는 35-mm confocal dish (SPL)에 같은 양을 분주하여 24 시간 동안 배양 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후 화합물 1을 30 μM을 30 분간 처리 후 배양액을 제거하고 4 % PFA 로 고정한 뒤 공초점 레이저 현미경을 측정하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 뇌종양 세포인 SNU4098, U87M에서 강한 형광을 보였으며, 즉 SNU4098 과 U87MG 는 다른 세포보다 많은 양의 시스테인을 함유하는 것으로 확인하였다.
실시예 7. 소포체 표적 능력 확인
화합물 1의 펜타플루오로페놀 구조가 소포체를 표적할 수 있는지 확인하기 위해서 시중에 판매되고 있는 소포체 표적 물질을 구입하여 종래의 소포체 표적 물질과 화합물 1 사이의 PCC (Pearson correlation coefficient) 값을 확인하였다. PCC 값은 1에 가까워질수록 두 물질의 표적 및 탐지능이 유사한 것을 의미하며, PCC 값은 0.7 이상 유의미한 값으로 인정된다.
구체적으로, 뇌종양 세포 SNU4098 및 U87MG 세포를 각각 35-mm confocal dish (SPL)에 같은 양을 분주하여 24 시간 동안 배양 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후 화합물 1 30 μM 을 30 분간 처리 후 종래의 소포체 표적물질 (ER-Tracker™ Red, Invitrogen)을 1000x (v/v)으로 10분간 처리해주었다. ER Tracker와 화합물 1의 형광 발현 조건 (파장 대)가 다르므로, ER Tracker와 화합물 1을 동시에 처리한 후 각각의 발현 조건에서 소포체 표적 여부를 비교할 수 있다. 1xPBS를 사용하여 배양액을 제거하고 4 % PFA 로 고정한 뒤 공초점 레이저 현미경으로 측정하였다. 사용된 배양액은 실시예 5에 명시된 바와 동일하게 사용하였다.
종래의 소포체 표적 물질과 화합물 1 사이의 PCC 값을 도 6에 나타냈다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 소포체 표적물질과 높은 PCC 값을 보임에 따라 세포 내 소포체를 표적할 수 있는 것으로 확인하였다.
실시예 8. 세포 내 시스테인 선택성 확인
화합물 1이 시스테인에 대한 선택성을 가지고 결합함에 따라 형광이 증가하며, 화합물 1이 시스테인을 많이 내포하고 있는 SNU4098, U87MG와 같은 뇌종양 세포에서 다른 세포에서보다 강한 형광이 나타남을 도 5에서 확인하였다. 이에, 화합물 1의 시스테인에 대한 선택성이 세포 내에서도 일어나는지 확인하였다.
세포 내에서도 화합물 1이 시스테인에 대한 선택성을 갖는지 확인하기 위해서, 시스틴 (Cystine, 2개의 cysteine), 시스테인, 노르말-에틸말레이미드(N-Ethylmaleimide, NEM) 그리고 에라스틴 (Erastin, SystemXc transpoter blocker)을 사용하여 세포 내 시스테인 증가 또는 감소를 확인하였다.
시스테인과 노르말-에틸말레이미드 은 TCI 사에서 구입하였으며, 에라스틴은 sigma aldrich 사에서 구매하였다. 사용된 시약의 농도는 시스틴 600 μM, 시스테인 500 μM, 노르말-에틸말레이미드 500 μM 그리고 에라스틴 20 μM을 사용하여 진행하였다. 도 7의 그래프 (a)에서는 SNU4098 cell에 시스테인, 노르말-에틸말레이미드를 추가하여 cysteine을 직접적으로 증가 또는 감소시켰다. 도 7의 그래프 (b)에서는 시스틴, 에라스틴을 SNU4098 cell 에 처리하여 시스테인 메커니즘 상에서 간접적으로 시스테인을 증가 또는 감소시켰다.
도 7에서 보는 바와 같이, 화합물 1은 세포 내에서도 시스테인을 선택적으로 감지하여 강한 형광을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 9. 화합물 1의 설치류 독성 테스트 확인
화합물 1의 설치류에서의 독성 정도를 화합물 1을 정맥주사 후 24, 48 시간 혈액순환 뒤 간과 신장의 형태학적 특징을 확인하였다 (도 8a 및 도 8b). 또한, 화합물 1을 정맥주사 후 일반적인 간 독성 테스트를 아스파테이트아미노전이효소 (aspartate aminotransferase, AST) and 알라인 전달 효소 (alanine aminotransferase, ALT)의 수치로써 확인하였다 (도 8c).
구체적으로, 화합물1 의 농도를 5 mg/kg 으로 하여 C57BL/6J 종에 정맥 주사하였고 이를 24, 48 시간 혈액순환 후 형태학적 변화를 측정한 결과는 도 8a 및 도 8b에 명시하였다. 도 8b의 위쪽이 간, 도 8b의 아래쪽이 신장의 결과이다. 또한, 간 독성을 확인하기 위해서 화합물 1을 상기 같은 농도로 처리 후 2시간에 AST, 6시간의 혈액순환 후 ALT를 확인하여 도 8c에 나타냈다. 이에 대한 대조군으로는 리포 다당류(Lipopolysaccharide, LPS)를 10 μg/animal 의 농도로 고정하고 실험을 진행하였다.
도 8a 및 도 8b에서 보는 바와 같이 대조군인 LPS 그룹을 처리하였을 때에는 변화된 형태학적 소견이 보였으나, 화합물 1을 처리한 경우 형태학적 변형이 일어나지 않았고, 도 8c에 나타난 바와 같이 대조군인 LPS 그룹을 처리하였을 때에는 높은 간수치 (AST, ALT) 가 측정되었으나, 화합물 1에 대해서는 독성을 보이지 않음을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명에 따른 화합물 1에 의해 윤리적 동물 실험이 가능하고, 더 나아가 안전한 임상적 접근 가능성을 확인하였다.
실시예 10. 뇌종양 동물모델을 이용한 뇌종양 표적 조영
SNU4098 cell 및 U87MG cell을 마우스 뇌에 주입하여 뇌조양 모델을 확보하였으며, 확보된 뇌종양 모델에 화합물 1을 처리하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
구체적으로, 우뇌에 뇌종양 세포 (SNU4098, U87MG)가 주입된 마우스 뇌종양 모델에 꼬리 정맥으로 5 mg/kg (99% PBS/1% DMSO)의 화합물 1을 주입하였다. 그리고 45 분의 혈액 순환 후 마우스를 희생시켜 마우스의 뇌 조직 및 주요 장기들을 적출 하였다. 이후, PBS 로 조직을 씻어준 후, 형광 조직 이미징 시스템 (fluorescence tissue imaging system, FTIS)를 이용하여 형광이미지를 측정하였다. 실험군으로는 1) 건강한 모델의 뇌에 화합물 1을 처리한 그룹, 2) 뇌종양 모델의 뇌에 화합물 1을 처리한 그룹으로 하였다.
아울러, 뇌종양 모델에 정맥주사를 실행하지 않고 PBS 로 관류하여 뇌를 포함한 주요 장기들을 적출하였고 이를 화합물 1 (100 μM)로 염색하여 이광자 현미경으로 형광의 세기를 측정해보았다. 실험 군으로는 1) 건강한 모델의 뇌에 화합물1을 처리한 그룹, 2) 뇌종양 모델의 뇌에 화합물 1을 처리한 그룹으로 하였다. 화합물 1을 처리한 후 37 ℃에서 rpm 100 으로 40 분간 교반하였다.
도 9의 (a) 에서 모든 데이터는 꼬리 정맥주사 후 장기를 적출하여 형광 조직 이미징 기계를 이용하여 측정한 결과이다. 가장 좌측 그림은 건강한 모델의 뇌에 화합물 1을 처리한 그룹이다. 중앙의 그림은 U87MG를 우뇌에 주입한 마우스에 화합물 1을 처리한 그룹이다. 가장 우측 그림은 SNU4098을 우뇌에 주입한 마우스에 화합물 1을 처리한 그룹이다. 도 9의 (a)에 나타난 바와 같이, 대조군인 가장 좌측 그림에 비해 중앙과 우측의 그림의 우뇌 부분에 강한 형광이 나타남을 확인 할 수 있다.
도 9의 (b) 그림에서 모든 데이터는 꼬리 정맥주사를 실시하지 않고 관류하여 적출한 조직을 화합물 1로 염색하여 이광자 현미경 (TPM, Leica, Nussloch, Germany)으로 도출한 이미지이다. 이광자 현미경의 레이져는 Titanium Sapphire laser를 사용하였다. 가장 좌측 그림은 건강한 모델의 뇌에 화합물 1을 처리한 그룹이다. 중앙의 그림은 U87MG를 우뇌에 주입한 마우스에 화합물 1을 처리한 그룹이다. 가장 우측 그림은 SNU4098을 우뇌에 주입한 마우스에 화합물 1을 처리한 그룹이다. 도 9의 (b)에서 보는 바와 같이, 화합물 1은 건강한 그룹의 뇌조직에서 보다 뇌종양이 있는 조직에서 더 강한 형광이 나타남을 확인하였다.
이를 통해, 신규 뇌종양 표적 조영제를 개발함에 있어, 본 발명의 화합물 1을 이용할 수 있으며, 뇌종양에서 시스테인의 양이 일반 조직에서보다 증가함을 형광 세기로 확인 할 수 있었다.
실시예 11. 분리된 뇌종양 조직 (생검)에 화합물 1을 처리한 후 형광 켜짐 현상 확인
뇌종양 환자로부터 분리된 생검 조직에 화합물 1을 처리하고 이를 형광 조직 이미징 시스템과 이 광자현미경으로 조직의 형광 측정을 수행하였다.
구체적으로, 뇌종양 환자 15 명, 정상 군 15명, 환자의 뇌종양과 정상조직이 섞인 군 5명에서 유래한 조직 시료에 화합물 1을 처리하였으며, 이후 그 형광 영상을 형광 조직 이미징 시스템과 이광자현미경 장비를 통해 측정하였다. 각 조직은 추가 고정을 하지 않고 -80 ℃ 보관을 해둔 상태에서 조직을 안전하게 녹여 실험을 진행하였다. 각 조직을 6 well 에 올려 1xPBS 로 3번 워싱 (washing) 해주었고 이후 화합물 1을 100 μM의 농도로 PBS 용액 상으로 처리해주었다. 이후, 각 조직은 37℃에서 60분간 rpm 100 으로 교반해주었다. 교반 후 PBS로 3번의 워싱 (washing)을 해주고, 형광 조직 이미징 시스템을 측정하였다.
또한 각 조직을 11호 수술용 나이프 (Reather safety razor Co., LTD, Japan)를 이용하여 약 100 μm의 두께로 일정하게 절편하였다. 이후 24 웰 플레이트 (24 well plate)에 옮겨 PBS 로 세 번의 세척을 해주었고, 화합물 1을 μM의 농도로 PBS 용액 상으로 처리해주었다. 이후, 각 조직은 37 ℃에서 60분간 rpm 100 으로 교반해주었다. 교반 후 PBS 로 3번 세척해주었고 4% PFA 로 조직을 고정해주었다. 고정된 조직을 슬라이드 글라이스로 옮겨 커버 슬립을 덮고 양쪽을 투명 테이프로 고정해주었다. 그리고 이 광자현미경을 측정하였다. 이 광자 현미경의 여기파장은 900 nm 로 여기 해주었다.
그 결과, 도 10 (a)에서 보는 바와 같이, 화합물 1을 뇌종양 생검에 처리하여 주었을 때 화합물 1의 100 μM 농도에 대하여 뇌종양에서 뚜렷한 형광 증가를 보였으며, 도 10의 (b) 의 3D 이미지 결과를 통해서도 정상에 비해 뇌종양에서 더 뚜렷한 형광 증가를 보였다. 눈금 막대 바는 100 μm을 나타낸다.
이를 통해 화합물 1이 인간 유래의 뇌종양 생검에서도 뇌종양 진단용으로서 사용이 가능함을 보였고. 3D 영상 결과에서도 암 조직에 화합물 1을 처리했을 경우 넓은 조직에 걸쳐 형광이 강하게 나오는 것을 확인할 수 있다.
기술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (22)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 하기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하며,
    시료에 포함된 호모시스테인 (homocysteine)과 구별하여 시스테인을 선택적으로 탐지하는, 시스테인 탐지용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112022065727667-pat00008

    상기 화학식 1에서,
    X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고, X1 내지 X5 중 적어도 2개는 할로겐이며,
    Y는 나이트로기 또는 설포닐기이다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 시스테인과 접촉하여 형광을 발하는 것인, 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 화합물은 시스테인에 의해 에테르 결합이 깨져 형광을 발하는 것인, 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 시스테인에 의해 형광이 켜지는 형광-켜짐 특성을 가지는 것인, 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 물, 완충액, 다이메틸 설폭사이드 (dimethyl sulfoxide), 알코올, 에틸 에테르 (ethyl ether), 및 다이에틸 에테르 (diethyl ether)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 티올 그룹을 가지는 시스테인이 아닌 분자를 추가로 포함하는 시료에서 시스테인을 선택적으로 탐지 가능한 것인, 조성물.
  9. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 글루타치온 (glutathione), 소듐설페이트 (sodium sulfate), 황화수소, 시스테인을 제외한 아미노산, HSA (Human serum albumin), 및 금속이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 시료에서 시스테인을 선택적으로 탐지 가능한 것인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 금속이온은 PbCl2, MGCl2, FeCl3, Hg(NO3)2, CdCl2, ZnCl2, NiCl2, CoCl2, NaCl, AuCl3, AgCl, CuCl2, 및 KCl로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 조성물.
  11. 하기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 소포체 내의 시스테인 탐지용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112022065727667-pat00029

    상기 화학식 1에서,
    X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고, X1 내지 X5 중 적어도 1개는 할로겐이며,
    Y는 나이트로기 또는 설포닐기이다.
  12. 하기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하며,
    호모시스테인 (homocysteine)과 구별하여 시스테인을 선택적으로 가시화하는, 시스테인 과발현 조직, 세포, 또는 세포 소기관 가시화 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112022065727667-pat00009

    상기 화학식 1에서,
    X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고, X1 내지 X5 중 적어도 2개는 할로겐이며,
    Y는 나이트로기 또는 설포닐기이다.
  13. 제12항에 있어서, 상기 시스테인 과발현 조직, 세포, 또는 세포 소기관은 암조직, 암세포, 또는 암세포 소기관인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 대장암, 위암, 간암, 유방암, 폐암, 췌장암, 담낭암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 난소암, 직장암, 중추신경계 종양, 척수 종양, 자궁경부암, 혈액암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 및 부신암으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
  15. 하기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 시스테인 과발현 소포체 가시화 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112022065727667-pat00030

    상기 화학식 1에서,
    X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고, X1 내지 X5 중 적어도 1개는 할로겐이며,
    Y는 나이트로기 또는 설포닐기이다.
  16. 하기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하며,
    시료에 포함된 호모시스테인 (homocysteine)과 구별하여 시스테인을 선택적으로 탐지하는, 암 진단용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112022065727667-pat00010

    상기 화학식 1에서,
    X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고, X1 내지 X5 중 적어도 2개는 할로겐이며,
    Y는 나이트로기 또는 설포닐기이다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 대장암, 위암, 간암, 유방암, 폐암, 췌장암, 담낭암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 난소암, 직장암, 중추신경계 종양, 척수 종양, 자궁경부암, 혈액암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 및 부신암으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
  18. 하기 화학식 1의 화합물, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는 조성물을 시료와 접촉하는 단계; 및
    상기 접촉에 의한 형광을 확인하는 단계를 포함하며,
    시료에 포함된 호모시스테인 (homocysteine)과 구별하여 시스테인을 선택적으로 검출하는, 시스테인을 검출하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112022065727667-pat00011

    상기 화학식 1에서,
    X1 내지 X5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고, X1 내지 X5 중 적어도 2개는 할로겐이며,
    Y는 나이트로기 또는 설포닐기이다.
  19. 제18항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료인, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 시료는 분리된 세포, 조직, 혈액, 체액, 척수액, 뇌 척수액, 호흡기 분비물, 및 조직세척액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 방법.
  21. 제16항 또는 제17항에 따른 조성물을 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  22. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102650187B1 (ko) 2021-08-02 2024-03-20 (주)엘레노바 신규 화합물 또는 이의 염, 이를 포함하는 시스테인 탐지용 조성물, 형광 프로브 및 암 진단용 조성물, 시스테인 검출방법, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 신규 화합물의 제조방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184601A1 (en) * 2007-09-14 2010-07-22 University Of Durham Method and Means Relating to Multiple Herbicide Resistance in Plants

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9664696B1 (en) * 2013-05-30 2017-05-30 University Of Oregon Compounds for determining the presence of hydrogen sulfide and methods of use
KR101872155B1 (ko) * 2016-04-15 2018-06-27 고려대학교 산학협력단 시스테인 검출용 이광자 형광 프로브 화합물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184601A1 (en) * 2007-09-14 2010-07-22 University Of Durham Method and Means Relating to Multiple Herbicide Resistance in Plants

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lihui Zhai et al., Dyes and Pigments, 2019, Vol. 165, pp 164-171. 1부.*

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