CN1902490A - 生物分子检测方法及其所用的标记染料和标记试剂盒 - Google Patents

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Abstract

使生物高分子样品与有机EL染料进行反应，测定用有机EL染料标记的该生物高分子样品的荧光。通过使用有机EL染料作为标记染料，能够以更低的成本、且高灵敏度地检测生物高分子。

Description

生物分子检测方法及其所用的标记染料和标记试剂盒
技术领域
本发明涉及采用荧光染料的核酸、蛋白质、肽类及糖类等生物分子的检测方法及该检测方法所用的标记染料和标记试剂盒。
背景技术
目前，全世界正盛行开展以特定基因分析技术、基因治疗、度身定制医疗(テ一ラ一メイド医瘵)为目的的后基因组研究。作为基因分析技术，例如应用采用DNA微阵列的DNA检测方法。通过这种检测方法，能够简便而迅速地进行多种基因表达、功能性、变异等的同时分析。
采用DNA微阵列的检测方法采用将大量DNA或寡核苷酸的序列(探针核酸)点样固定在玻璃或硅片等基板上的DNA芯片。通过将固定于基板上的探针核酸与标记的RNA样品(靶核酸)杂交，使具有与探针核酸互补的碱基序列的靶核酸选择性地与探针核酸相结合。接着将微阵列干燥后，测定被标记的靶核酸的荧光强度。
标记广泛采用荧光染料，要求其具有高荧光强度、即使在干燥状态(固体状态)下也能发光、而且具有水溶性等。荧光染料可采用例如Cy3或Cy5(例如参见非专利文献1)。
非专利文献1：Science 283，1，January，1999，83-87
发明内容
但是，Cy3或Cy5虽然具有高荧光强度、具有即使在固体状态下也能发光的优点，但由于价格非常昂贵，从而使检测方法不得不处于高成本。并且，荧光染料向RNA样品中的掺入率低，由于不能对RNA样品充分标记，故还存在检测灵敏度不足的问题。对此，尚未发现代替Cy3或Cy5的荧光染料是目前的现状。
因此，本发明的目的是解决上述课题，提供更低成本的、高灵敏度的生物分子检测方法。
本发明人在探索代替Cy3或Cy5的荧光染料的过程中，发现有机电致发光元件所使用的有机EL染料(有机电致发光染料)用作生物分子的标记时，具有高的荧光强度，由此完成了本发明。
即，本发明的生物分子检测方法的特征在于，使生物分子样品与有机EL染料反应，测定用该有机EL染料标记的该生物分子样品的荧光。在此，本发明的生物分子是指生物体中存在的分子种，包括用于构建生物体结构的分子种、涉及能量产生·转变的分子种以及掌控生物信息的分子种。具体地讲，包括核酸、蛋白质、糖类、脂质、肽类、核苷酸、代谢中间体或代谢酶类、激素及神经传递物质等。
此外，在有机EL染料和生物分子之间，能够形成酰胺键、酰亚胺键、尿烷键、酯键或胍键。而且，在与生物分子反应之前，能够向上述有机EL染料中引入选自异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种反应性基团。另外，生物分子样品可以采用选自核酸、蛋白质、肽类和糖类中的任意1种。
此外，本发明的生物分子检测方法的特征在于，用标记染料标记生物分子样品，测定该被标记的生物分子样品的荧光，所述标记染料含有具有共轭体系的含1种或更多种杂原子、硒原子或硼原子的五元环化合物。
此外，还可以采用含有上述五元环化合物和具有共轭体系的六元环化合物的稠环化合物。而且，上述五元环化合物可以采用唑衍生物或咪唑衍生物。而且，与上述生物分子反应之前，能够向有机EL染料中引入选自异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种官能团。
此外，本发明的标记染料是用于通过荧光检测来检测生物分子的，其特征在于，含有具有与生物分子结合的反应性基团的有机EL染料。该反应性基团可采用选自羧酸基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种官能团。另外，有机EL染料可采用含有具有共轭体系的五元环化合物的化合物，该五元环化合物含有1种或更多种杂原子、硒原子或硼原子。而且，还可以采用含有该五元环化合物和具有共轭体系的六元环化合物的稠环化合物。而且，该五元环化合物可以采用唑衍生物或咪唑衍生物。
此外，本发明的生物分子用标记试剂盒的特征在于，含有标记生物分子的有机EL染料。生物分子可以采用选自核酸、蛋白质、肽类和糖类中的任意1种。该反应性基团可采用选自羧酸基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种官能团。另外，有机EL染料可采用含有具有共轭体系的五元环化合物的化合物，该五元环化合物含有1种或更多种杂原子、硒原子或硼原子。而且，还可以采用含有该五元环化合物和具有共轭体系的六元环化合物的稠环化合物。而且，该五元环化合物可以采用唑衍生物或咪唑衍生物。
此外，本发明的另一生物分子检测方法的特征在于，使生物分子样品与用有机EL染料标记的探针反应，测定该生物分子样品的荧光。在此，上述生物体分子样品为核酸，上述探针可以采用与该核酸的碱基序列互补的寡核苷酸或PNA(肽核酸)。此外，上述寡核苷酸为引物或终止物时，能够使上述核酸扩增而进行荧光测定。另外，在扩增上述核酸之前，也可以用有机EL染料标记引物。并且，还可以通过分子信标构成上述寡核苷酸或PNA。
此外，本发明的另一生物分子检测方法的特征在于，包括通过电泳将生物分子样品按大小分离的工序，在进行电泳之前或电泳后用有机EL染料标记生物分子样品。在此，上述生物分子样品为核酸，根据被标记的核酸的电泳图能够确定该核酸的碱基序列。此外，上述生物分子样品为蛋白质，根据被标记的蛋白质的电泳图还能够对分离出的蛋白质进行质谱分析。
将本发明的标记试剂盒用作例如DNA微阵列的试剂盒时，生物分子样品采用核酸，将探针核酸固定在微阵列中，另一方面，还能够使作为样品的靶核酸与有机EL染料反应来进行标记，将该被标记的靶核酸点样在微阵列中进行杂交。此外，本发明的标记试剂盒还可以应用抗生物素蛋白(链霉亲和素)—生物素之间的结合，利用由该染料修饰的抗生物素蛋白，作为ELISA(酶联免疫吸附法)或蛋白质印迹法等生物学的分析试剂盒使用。此外，本发明的标记试剂盒还可以用作蛋白质微阵列的试剂盒。
此外，本发明的染色方法的特征在于，用有机EL染料标记组织或细胞样品中的生物分子。在此，上述生物分子可使用核酸或蛋白质。
本发明的染色染料是用于组织或细胞样品的染色的，其特征在于，含有具有与组织或细胞中的生物分子结合的反应性基团的有机EL染料。
本发明通过采用有机EL染料作为生物分子的标记染料，能够获得如下所述的效果。
即，有机EL染料在固体状态(包括固体和半固体)下具有高量子产率且具有高荧光强度。而且有机EL染料比Cy3和Cy5便宜，故能够更低成本地进行生物分子的检测。而且，有机EL染料与生物分子基本定量反应且具有高的掺入率，故能够得到高的检测灵敏度。此外，荧光波长选择的自由度增加，可采用橙、黄、绿、蓝等多种荧光波长。由此，可使用斯托克位移大(激发波长和荧光波长之间的差大)的2种或更多种的荧光染料，故还可同时检测一个样品中含有的多个靶核酸。此外，相对于Cy3和Cy5必需冷冻贮存，有机EL染料在化学方面稳定，能够经受常温下的长期保存，故容易操作。
附图说明
图1A是本发明实施例1中被标记的寡核苷酸的一张HPLC图谱。
图1B是本发明实施例1中被标记的寡核苷酸的目的物的一张UV图谱。
图2是本发明实施例1中被标记的寡核苷酸的一张TOF MS图谱。
图3是本发明实施例1中被标记的寡核苷酸的一张发光图案。(a)、(b)、(c)、(d)分别表示110fmol、10fmol、1fmol、0.5fmol的结果。
图4A是本发明实施例2中被标记的寡核苷酸的一张HPLC图谱。
图4B是本发明实施例2中被标记的寡核苷酸的目的物的一张UV图谱。
图5是本发明实施例2中被标记的寡核苷酸的一张发光图案。(a)、(b)、(c)、(d)、(e)分别表示500fmol、250fmol、100fmol、50fmol、10fmol的结果。
图6A是本发明实施例3中被标记的肽在纯化前的一张HPLC图谱。
图6B是本发明实施例3中被标记的肽在纯化后的一张HPLC图谱。
图7是本发明实施例3中被标记的肽的一张TOF MS图谱。
图8是本发明实施例3中被标记的肽的一张发光图案。(a)、(b)、(c)、(d)、(e)分别表示10fmol、5fmol、1fmol、0.5fmol、0.1fmol的结果。
图9A是本发明实施例4中被标记的蛋白质在标记前的一张TOF MS图谱。
图9B是本发明实施例4中被标记的蛋白质在标记后的一张TOF MS图谱。
图10是本发明实施例4中被标记的蛋白质的一张发光图案。
图11是表示本发明检测方法中探针中使用分子信标时的发光机制的模式图。
图12是表示本发明检测方法中一例制备IgG抗体的Fab’片段的方法的模式图。
图13是表示本发明检测方法中一例向IgG抗体的Fab’片段引入有机EL染料的方法的模式图。
符号说明
1 基板
2 电极
3 电极
4 探针核酸
4a 有机EL染料
5 靶核酸
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明所用的有机EL染料只要是以固体状态夹在一对阳极和阴极之间，通过从阳极注入的空穴和从阴极注入的电子再结合时产生的能量能够发光的染料就没有特殊限定。例如可采用：四苯基丁二烯或苝等多环芳香族化合物、环戊二烯衍生物、二苯乙烯基吡嗪衍生物、吖啶酮衍生物、喹吖啶酮衍生物、茋衍生物、吩噻嗪衍生物、吡嗪并吡啶衍生物、唑衍生物、咪唑衍生物、咔唑衍生物及四苯基噻吩衍生物等。并优选分子内含有羧酸基或可引入羧酸基的染料。如下所述，这是因为容易引入用于与生物分子结合的反应性基团的缘故。
有机EL染料优选具有用于与生物分子样品(以下称为靶分子)结合的反应性基团，该反应性基团优选具有能够与靶分子的氨基、亚氨基、巯基或羟基反应的官能团。优选在有机EL染料与生物分子之间形成酰胺键、酰亚胺键、尿烷键、酯键或胍键。该官能团可采用例如异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、环氧基、卤代磺酰基、酰氯基、卤代烷基、乙二醛基、醛基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基等。优选使用选自异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种。更优选使用选自异氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种。这是因为其能够与靶分子的氨基形成酰胺键，或能够与生物分子内的亚氨基直接结合。进一步优选为三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基。此外，当这些有机EL染料含有羧酸基时，在碳化二亚胺衍生物、三嗪衍生物的存在下，也可以直接修饰存在于生物分子中的氨基及亚氨基。而且，具有可含取代基的三嗪基、可含取代基的碳化二亚胺基的有机EL染料，可与DNA碱基中的鸟嘌呤、胸腺嘧啶中的亚氨基直接反应，故无须通过PCR(聚合酶链)法引入染料，就可以检出错配(检出不形成双链的碱基)，从而可以用作分析SNP(单核苷酸多态性)的试剂。
例如，经活性酯化的羰基可采用N-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺酯。由于使用N-羟基琥珀酰亚胺，因而如以下流程图1的式I所示，通过使用DCC作为缩合剂，经由N-羟基琥珀酰亚胺酯体，以酰胺键结合EL染料与靶分子。此外，如流程图1的式II所示，经活性酯化的羰基也可采用三嗪衍生物。另外，碳化二亚胺基可采用N，N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)或1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳化二亚胺等碳化二亚胺试剂。可以经由碳化二亚胺体以酰胺键使EL染料与靶分子结合(式III)。还可使在分子内预先引入有碳化二亚胺基、三嗪基的EL染料与生物分子内的氨基、亚氨基直接结合(式IV)。
此外，通过改变有机EL染料的取代基，可改变激发波长和发光波长，故还可利用多色化在所有基板上进行多种样品的同时检测。
[化学式1]
Figure A20048003877200161
                          流程图1
需要说明的是，能够使反应性基团与如下氨基残基结合，即当靶分子为DNA时的寡聚DNA末端被修饰的氨基残基、当靶分子为蛋白质时的氨基残基、当靶分子为肽类时的多肽的氨基、例如聚赖氨酸衍生物的氨基残基以及当靶分子为糖类时的多糖类衍生物骨架内的氨基。
本发明检测方法中优选使用的有机EL染料是含有具有共轭体系的五元环化合物的化合物，该五元环化合物可举出含有1种或更多种杂原子、硒原子或硼原子的五元环化合物。更详细地讲，可举出含有具有共轭体系的五元环化合物的单环化合物以及含有上述五元环化合物和具有共轭体系的六元环化合物的稠环化合物。这是因为这样的有机EL染料即使在固体状态下，量子产率也很大，从而显示强的荧光。五元环化合物优选唑衍生物或咪唑衍生物。进而唑衍生物和咪唑衍生物优选含有1个或更多个季铵基。这是因为能够使水溶性提高的缘故。
以下说明稠环化合物的具体例子。
(一唑衍生物1)
[化学式2]
Figure A20048003877200171
此处，式中R1、R2、R3、R4、R6、R7分别独立地表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基、或磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基。R1、R2、R3、R4、R6、R7可以相同也可以不同。
R’表示可含芳环的烷基或链烯基等脂肪烃基或芳烃基，An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -。以下通式中只要没有特别声明，含义与上述相同。
(一唑衍生物2)
[化学式3]
Figure A20048003877200181
此处，式中R8、R9分别表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基、磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基。R8、R9可以相同也可以不同。以下通式中只要没有特别声明，含义与上述相同。此外，n为1或更大的整数、优选为1～5，以下通式中也是同样的。
(二唑衍生物1)
[化学式4]
(二唑衍生物2)
[化学式5]
Figure A20048003877200201
(二唑衍生物3)
[化学式6]
Figure A20048003877200202
此处，式中R1、R2、R3、R4分别独立地表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基、或磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基。R1、R2、R3、R4、R6、R7可以相同也可以不同。R2、R3优选使用可含取代基的芳烃基，该取代基优选使用碳原子数1～4的烷基或烷氧基、或溴原子。进而，烷基优选使用甲基，烷氧基优选使用甲氧基。此外，X为可含取代基的氮原子、硫原子、氧原子、硒原子或硼原子，只要没有特别声明，以下通式中含义也与上述相同。
(二唑衍生物4)
[化学式7]
Figure A20048003877200211
(二唑衍生物5)
[化学式8]
Figure A20048003877200221
此处，N→O表示氮原子与氧原子形成配位键的状态。
(二唑衍生物6)
[化学式9]
(二唑衍生物7)
[化学式10]
(二唑衍生物8)
[化学式11-1]
[化学式11-2]
Figure A20048003877200241
此处，式中R10、R11分别表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基、或磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基。R10、R11可以相同也可以不同。此外，R12为可含取代基的链烯基或链烷基，n为1～3的整数、优选为1。以下通式中只要没有特别声明，含义与上述相同。
(二唑衍生物9)
[化学式12-1]
Figure A20048003877200251
[化学式12-2]
Figure A20048003877200261
只要是上述二唑衍生物就没有特殊限定，可优选使用以下述通式表示的二唑并吡啶衍生物。
[化学式13]
Figure A20048003877200271
唑并吡啶衍生物合成其羧酸衍生物后，例如，通过以下流程图2所示的反应，可以使用N，N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)作为缩合剂，使用衍生成包含N-羟基琥珀酰亚胺酯的活性酯体的衍生物。
[化学式14]
流程图2
(三唑衍生物1)
[化学式15]
(三唑衍生物2)
[化学式16]
五元环化合物还可使用含有噻吩基的以下衍生物。
(噻吩衍生物1)
[化学式17]
(噻吩衍生物2)
[化学式18]
Figure A20048003877200311
(噻吩衍生物3)
此外，当为噻吩衍生物时，还可使用非稠合类化合物，如用以下通式表示的2，3，4，5-四苯基噻吩衍生物。
[化学式19]
Figure A20048003877200321
此处，式中R13、R14、R15分别独立地表示氢原子，直链、支链或环状的烷基，取代或未取代芳基，或者取代或未取代芳烷基；Ar1和Ar2表示取代或未取代芳基，并且Ar1和Ar2可以与所结合的氮原子一起形成含氮杂环。此外，Y1和Y2表示氢原子，卤原子，直链、支链或环状的烷基，直链、支链或环状的烷氧基，取代或未取代芳基，取代或未取代芳烷基，或者取代或未取代的氨基。
(噻吩衍生物4)
此外，还可以采用以下述通式表示的2，3，4，5-四苯基噻吩衍生物。
[化学式20]
Figure A20048003877200322
此处，式中Ar1～Ar6分别独立地表示取代或未取代芳基，而且，Ar1和Ar2、Ar3和Ar4以及Ar5和Ar6可与所结合的氮原子一起形成含氮杂环。
此外，五元环化合物还可以采用咪唑、采用以下述下通式表示的咪唑衍生物。在此，构成咪唑衍生物的咪唑基优选含有季铵基。这是因为能使水溶性提高的缘故。而且，当含有吡啶基时，为进一步提高水溶性，吡啶基也可含有季铵基。另外，在以下通式中，R”表示可含芳环的烷基或链烯基等的脂肪烃基或芳烃基。
(咪唑衍生物1)
[化学式21]
Figure A20048003877200331
(咪唑衍生物1)
[化学式22]
Figure A20048003877200332
(咪唑衍生物2)
[化学式23]
(咪唑衍生物3)
[化学式24-1]
Figure A20048003877200351
[化学式24-2]
此处，咪唑骨架可在中央苯环R8、R9、R10、R11的任意位置结合多个单元。另外，R12为可含取代基的链烯基或链烷基，n为1～3的整数，优选为1。
(咔唑衍生物)
此外，也可使用以下述通式表示的咔唑衍生物。
[化学式25]
也可使用具有共轭体系的五元环化合物，即含有1种或更多种杂原子、硒原子或硼原子的单环化合物。没有特殊限定，例如可使用以下述通式表示的唑衍生物。
[化学式26]
此处，式中R1、R4、R5分别独立地表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基、或磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基。R1、R4、R5可以相同也可以不同。
本发明的检测方法只要是测定被标记的固体或半固体状态的生物分子的荧光的检测方法，就能适用于所有生物分子的检测方法中。通过采用有机EL染料代替以往的荧光染料，能够提供高灵敏度、化学稳定、操作性优异且低成本的检测方法。本发明中可使用的方法，既可以如前所述，使生物分子样品与有机EL染料直接反应来用有机EL染料标记生物分子样品，或者也可以使生物分子样品与用有机EL染料标记的探针反应来用有机EL染料标记生物分子样品。进而，还可采用通过电泳将用有机EL染料标记的生物分子样品按大小分离的方法。
例如，以核酸为检测对象的DNA微阵列法中可按以下次序进行。
(DNA微阵列法)
本检测方法使待测靶核酸与有机EL染料反应来用有机EL染料进行标记，另一方面，准备具有与靶核酸互补的碱基序列的单链探针核酸，将变成单链的靶核酸与探针核酸在基板上进行杂交，测定靶核酸的荧光。在本检测方法中，研究基因表达时，固定于基板上的探针核酸可以使用如下制成的物质：即以cDNA文库、基因组文库或全基因组作为模板，通过PCR法扩增cDNA而制成的物质。此外，研究基因变异等时，可使用以标准的已知序列为基础而合成与变异等对应的各种寡核苷酸的物质。
探针核酸在基板上的固定可根据核酸种类和基板种类选择适当的方法。例如，也可使用利用DNA的电荷，使其与经聚赖氨酸等阳离子表面处理过的基板静电结合的方法。另一方面，通过将变性为单链的靶核酸与有机EL染料混合而使之反应，制备用有机EL染料标记的靶核酸。优选按反应温度为室温～60℃、反应时间为2～48小时进行反应。
然后，将被标记的靶核酸点样于基板上，进行杂交。杂交优选在室温～70℃、2～48小时的范围进行。通过杂交，具有与探针核酸互补的碱基序列的靶核酸选择性与探针核酸结合。然后清洗基板，在室温下干燥。接着，用荧光激光扫描法测定干燥后的基板表面的荧光强度。通过荧光强度可以监测基因表达水平。上述杂交说明了有关将探针核酸固定于基板上的方法，也可以使用将预先用有机EL染料标记的靶核酸固定在基板上，在基板上点样探针核酸的方法。
此外，同样以核酸为检测对象，采用引物和终止物的PCR法可以按如下次序进行。
(PCR法)
(PCR法)
本检测方法将与待测靶核酸的碱基序列互补的探针用有机EL染料标记，在靶核酸扩增之前或使其扩增之后，使靶核酸与探针反应，测定靶核酸的荧光。具体来说，靶核酸的延伸反应通过酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶)进行，此时，靶核酸与含有寡核苷酸的引物所形成的2条链的核酸序列由酶进行识别，从该识别位置开始进行延伸反应，只使目标基因区域扩增。酶进行合成时以核苷酸(dNTP、NTP)为原料进行合成反应。此时，在普通的核苷酸(dNTP、NTP)中，例如图27所示，以任意比例混合含有染料的核苷酸时，能够合成引入了该比例染料的核酸。而且，也可以通过PCR，以任意比例引入含有氨基的核苷酸后与有机EL染料结合，合成引入了有机EL染料的核酸。
[化学式27]
Figure A20048003877200391
酶进行合成时以核苷酸为原料进行合成反应，但此时如果使用将核苷酸3’端上的OH变为H的核苷酸，则核酸的延伸反应不再进行，在该时刻反应终止。该核苷酸，即双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)被称为终止物。在普通的核苷酸中掺入终止物进行核酸的合成反应时，以一定概率掺入终止物，因反应终止而合成不同长度的核酸。将所得核酸通过凝胶电泳按大小进行分离时，DNA按长短顺序排列。在此，根据终止物各碱基的种类而用不同的有机EL染料进行标记，则在合成反应的终点(3’端)观察到对各碱基的依赖倾向，以终止物上标记的有机EL染料作为基点读取荧光信息，从而能够获得该靶核酸的碱基序列信息。此外，也可以使用预先用有机EL染料标记的引物代替终止物，与靶核酸进行杂交。
此外，也可以使用PNA(肽核酸)作为探针。PNA是将作为核酸的基本骨架结构的五单糖·磷酸骨架置换为以甘氨酸为单元的聚酰胺骨架的物质，具有极类似于核酸的三维结构，对具有互补碱基序列的核酸可非常特异性且牢固地结合。因此，作为用于检测特定核酸的探针是有效的。因此，不仅可用于原位杂交法等原有的DNA分析方法，而且通过应用于端粒PNA探针，还可作为端粒研究的试剂使用。
检测可按如下方式进行：例如，使双链DNA与具有与DNA碱基序列的全部或部分互补的碱基序列、且用有机EL染料标记的PNA相接触而进行杂交，加热该混合物，使其生成单链DNA，将混合物缓慢冷却至室温，制成PNA-DNA复合物，测定其荧光。
上述例中说明了通过PCR法扩增靶核酸，测定产物荧光的方法，该方法通过电泳确认产物的大小，其后必须通过测定荧光强度来调查扩增产物量。对此，利用荧光染料的能量转换，为了与PCR法的产物进行杂交从而产生荧光，使用经设计的探针，还可以实时测定产物的量。其中，例如可使用标记供体和受体的DNA。具体的检测方法可举出确认特定序列的核酸存在的分子信标法或TaqMan-PCR法或循环探针法等。
例如，关于分子信标法的发光机制，采用图11说明将分子信标固定在基板上与目标基因进行杂交的例子。在具有特定DNA序列的DNA(探针)的一端用有机EL染料F标记，在另一端用淬灭剂Q标记。淬灭剂Q被固定在基板上，在引入目标基因前，淬灭剂Q与有机EL染料F靠近、荧光染料的荧光消失。在此，引入具有与标记的DNA互补的序列的目标基因时，标记的DNA与目标基因进行杂交，由此分开有机EL染料F与淬灭剂Q之间的距离，能够观察到有机EL染料F的荧光。由此可以观察DNA的杂交并测定杂交量。
另外，当以蛋白质为检测对象时，电泳后的蛋白质检测采用染色染料。通常采用在泳动后的凝胶中渗透例如考马斯亮蓝(CBB)的染色染料来对蛋白质进行染色，照射紫外线使之发光的方法。然而，使用以往染色染料的方法虽然简便，但灵敏度却低达100ng左右而不适于微量蛋白质的检测。并且，由于经由凝胶渗透染色染料，存在染色需要长时间的问题。
对此，本发明利用电泳使蛋白质按大小分离后，通过使分离出的蛋白质与有机EL染料结合来标记蛋白质。本发明的有机EL染料具有反应性基团，能与蛋白质迅速而定量地反应，而且灵敏度高，很适于微量蛋白质的检测。并且也可以通过对按大小分离出的蛋白质进行质谱分析来进行鉴定。
在此，以下任意蛋白质均可作为检测对象：白蛋白、球蛋白、谷蛋白、组蛋白、精蛋白及胶原蛋白等简单蛋白质，核蛋白质、糖蛋白质、脂蛋白质、磷蛋白质、金属蛋白质等结合蛋白质。例如，使用与磷蛋白质、糖蛋白质、总蛋白质的染色染料相对应的3种有机EL染料，在由二维电泳分离出的蛋白质样品中，可对磷蛋白质、糖蛋白质及总蛋白质进行染色。另外，通过进行TOF-Mass等质谱分析，可以对蛋白质进行鉴定，因而可应用于诊断或治疗产生特殊蛋白质的、由癌或病毒引起的传染病等疾病。另外，胶原蛋白是构成动物结缔组织的蛋白质，具有独特的纤维状结构。即，其由3条聚肽链组成，这些肽链交织在一起形成三重链。胶原蛋白一般来说是免疫原性极低的蛋白质，可广泛应用于食品、化妆品、医药品等领域。但即使向胶原蛋白的肽链中导入荧光染料，对以往的荧光染料来说也称不上稳定性充分，必需更稳定的荧光染料。因此，通过使用有机EL染料作为标记胶原蛋白的荧光染料，可以稳定且高灵敏度地进行检测。
另外，通过用有机EL染料标记与蛋白质特异性结合的抗体，也可以标记蛋白质。例如，如图12所示，将IgG抗体用胃蛋白酶处理，获得被称为F(ab’)2的片段。将该片段用二硫苏糖醇等还原，获得被称为Fab’的片段。Fab’片段具有1或2个巯基(-SH)。对于该巯基，可以使其与马来酰亚胺基作用而进行特异性反应。即，如图13所示，通过使引入马来酰亚胺基的有机EL染料与片段中的巯基反应，可以用有机EL染料标记抗体。此时，抗体的生理活性(捕捉抗原能力)不会丧失。
本发明检测方法，在探针中还可使用与特定生物分子(特别是蛋白质)特异性结合的适配子。适配子含有寡核苷酸，能获得具有依赖于碱基序列的各种特征的立体结构，因此可以通过这种立体结构与含有蛋白质的所有生物分子结合。利用这一性质，可以使经有机EL染料标记的适配子与特定的蛋白质结合，通过与被检测物质的结合使该蛋白质的结构发生变化，伴随着此种结构变化荧光也发生变化，从而能间接检测出被检测物质。例如，提出了采用用荧光染料标记的适配子、利用能量转换的可卡因检测用生物传感器(J.Am.Chem.Soc.2001，123，4928-4931)。通过使用有机EL染料代替上述荧光染料，可以提供高灵敏度的、容易操作的生物传感器。
此外，还可以使用本发明检测方法进行金属离子的检测。体内的DNA和蛋白质等的稳定性和高级结构的维持、功能表现以及掌管生物体内所有化学反应的酶的活化等在生物体内产生的所有生命现象都与金属离子有关。因此，可以实时观察生物体内金属离子活动的金属离子传感器被宣传以医疗领域为代表的重要性。以往，已知向生物分子中引入荧光染料的金属离子传感器。例如，提出了在K+离子的存在下，利用核酸的金属离子传感器，该核酸具有组入K+离子而形成特殊结构的序列(J.AM.CHEM.SOC.2002，124，14286-14287)。将引起能量转换的荧光染料导入核酸两端。通常由于存在染料之间的距离而不会引起能量转换。但在K+离子的存在下，核酸形成特殊的形状，结果荧光染料向引起能量转换的距离靠近，从而能观察到荧光。此外，还提出了向肽中导入荧光染料的锌离子传感器(J.Am.Chem.Soc.1996，118，3053-3054)。通过采用由本发明有机EL染料构成的标记染料代替这些以往的荧光染料，可以提供比以往灵敏度高的、容易操作的金属离子传感器。只要是生物体内存在的金属离子，就可以检测出所有的金属离子。
另外，还可以采用本发明的检测方法进行细胞内的信号观察。在对内部信号和环境信息的细胞应答中涉及从离子到酶的巨大分子。已知在信号传递过程中，特殊的蛋白激酶活化，导致特殊的细胞蛋白质的磷酸化，从而承担着各种细胞应答的初始应答。核苷酸的结合与水解对它们的活性发挥重大作用，通过使用核苷酸衍生物，能够迅速观察到信号传递变动。例如，蛋白激酶C(PKC)在细胞膜中的信号传递中发挥重要作用。该Ca2+依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在如二酰基甘油或磷脂酰丝氨酸那样的膜构成脂质上被活化，通过将存在于离子通道或细胞骨架蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸的磷酸化，改变膜表面电化来进行信号传递。
通过在活体细胞中动态观察能够进行细胞的信号传递的观察。
此处，核苷酸衍生物作为酶的底物或抑制剂被供给，与线粒体这样的细胞器、去肌膜纤维类组织的核苷酸结合蛋白质部分相结合，对孤立性蛋白质的结构和力学的探测、膜结合蛋白酶的重构进行其调节。此外，最近逐渐了解到还存在像G-蛋白质的抑制剂或活化剂这样的影响信号传递的化合物。通过向该核苷酸衍生物中导入由本发明有机EL染料构成的标记染料，可以高灵敏度且容易操作地进行这些细胞内信号传递的动态观察。
此外，还可将本发明的检测方法用于利用RNA干扰作用(RNAi)的基因表达状况的观察中。RNAi是指将RNA引入细胞时，与其具有相同序列的基因的表达被抑制的现象。RNAi通过向细胞中引入双链RNA(dsRNA)，分解靶基因的mRNA、抑制表达。在该过程中，首先长链的dsRNA(双链RNA)被具有核糖核酸酶活性的切酶切割成21～23mer的短siRNA。已知生成的siRNA通过中间复合物(RNA诱导性沉默复合物(RISC))被重组，进行具有与该复合物重组的siRNA反义链相互补的序列的mRNA的切断。即使在该领域，为了观察基因表达状况等，也使用荧光染料。通过使用有机EL染料作为标记荧光染料，可以进行稳定且高灵敏度的检测。
本发明的标记试剂盒含有标记生物分子的有机EL染料或其衍生物，根据需要可含有用于使染料与作为对象的生物分子进行反应的试剂、酶、溶剂等。作为对象的生物分子为核酸、蛋白质、肽类或糖类。此外，有机EL染料优选具有能与生物分子的氨基发生反应的官能团的衍生物，若要例示其官能团，优选选自异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种。进一步优选把含有三嗪基、碳化二亚胺体及经活性酯化的羰基的活性酯作为有机EL染料的衍生物来含有。
本发明的标记染料还可在组织或细胞样品中的靶核酸或靶蛋白质的表达水平的研究中用作组织或细胞的染色染料。组织或细胞的染色如上所述，可以通过反应性基团使有机EL染料与靶核酸或靶蛋白质结合而进行。
即，本发明的染色染料，例如将有机EL染料用于真核细胞的染色时，从即使在干燥状态下也能发出荧光到标记后保存等方面来看，显示比以往染料更优异的性能。而且，不仅可用于真核细胞，也可充分用作细胞骨架用染料。除此以外，还可用于线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体、脂双层膜等的标记。这些被标记的细胞等由于在湿润及干燥的所有条件下均可以观测，因此通用性大。观测时可使用荧光显微镜等。
另外，在临床阶段，采自人体的组织用切片机等仪器切成薄膜后，进行染色。此时常使用Cy染料和Alexa染料。然而，原有染料的稳定性极差，复诊时必需重新制作样品。此外，制成的样品不能作为标本保存。而与上述以往染料相比，有机EL染料是非常稳定的染料，因而可将经染色的组织作为标本进行保存。
实施例1
以下，用实施例更详细地说明本发明。
合成例1
有机EL染料采用1，2，5-二唑并-[3，4-c]吡啶衍生物。
以下示出1，2，5-二唑并-[3，4-c]吡啶的活性酯体(以下简称为EL-OSu)的合成流程。
[化学式28]
Figure A20048003877200451
                          流程图3
(1)二酮衍生物(2)的合成
在500mL三口瓶中使4-甲氧基乙酰苯(1)37.5g(0.25mol)、亚硝酸钠0.15g溶于100mL醋酸。在水浴条件下，将在100mL醋酸中溶解有100mL的HNO3的物质以2小时滴入三口瓶中。然后，在室温下搅拌2天。将反应混合物缓缓加入到500mL的水中，使其生成沉淀。将沉淀过滤，溶解在氯仿中。将氯仿相用饱和碳酸氢钠水清洗，再用10％的NaCl水溶液清洗2次。用MgSO4脱水后，减压下馏去氯仿，得到二唑-N-氧化物(2)34.5g(产率78％)。
(2)二酮衍生物(3)的合成
在500mL三口瓶中使二唑-N-氧化物(2)17.7g(0.05mol)溶于400mL乙腈。向其中添加12.0g的Zn、7mL的AcOH、20mL的Ac2O。在水浴中冷却至反应温度不超过30℃。搅拌12小时至反应终点。过滤反应混合物，除去不溶成分。在减压下馏去乙腈，得到残渣。将残渣用氯仿重结晶，得到二唑-N-氧化物(3)10.2g(产率60％)。
(3)唑并吡啶乙酯(4)的合成
在500mL三口瓶中使二唑-N-氧化物(3)15.6g(0.046mol)溶于300mL丁醇。向其中添加32.0g(0.23mol)甘氨基乙酯盐酸盐。进行24小时加热回流。在减压下馏去丁醇，得到残渣。将残渣溶于200mL的氯仿中，用10％HCl、饱和NaHCO3、10％NaCl清洗。用MgSO4干燥，馏去溶剂。将所得残渣用氯仿重结晶，得到二唑并吡啶乙酯(4)13.0g(产率70％)。
(4)唑并吡啶乙基酯(4)的水解
在500mL三口瓶中使二唑并吡啶乙酯(4)3.0g(0.007mol)溶于200mL乙醇。向其中添加0.62g(0.01mol)KOH。进行5小时加热回流后，将反应混合物添加到200mL的水中。向该水溶液中滴入浓盐酸，调整pH到1之后生成沉淀。将沉淀物过滤，溶解在氯仿中。将氯仿相用10％的NaHCO3水溶液、水清洗。馏去氯仿，得到残渣。将残渣用水-乙醇(1∶1)重结晶。得到二唑并吡啶羧酸(5)2.1g(产率81％)。
活性酯(6)的合成
在50mL三口瓶中使二唑并吡啶羧酸(5)1.0g(0.0026mol)和N-羟基琥珀酰亚胺0.30g(0.0026mol)溶于20mL的DMF。以30分钟向其中滴入N，N’-二环己基碳化二亚胺0.54g(0.0026mol)。滴入后，在室温下搅拌30小时。减压下馏去DMF。用硅胶柱色谱(氯仿)分离纯化残渣，得到二唑并吡啶活性酯体(6)0.76g(产率62％)。
合成例2
有机EL染料使用咪唑并吡啶乙酯衍生物。以下示出咪唑并吡啶乙酯的活性酯体(以下简称为im-EL-OSu)的合成流程。
[化学式29]
                        流程图4
(1)咪唑并吡啶乙酯(1)的水解
在500mL三口瓶中使0.5g(1.5mol)酯体1溶于50mL乙醇。向其中添加0.12g(2.1mol)KOH。进行5小时加热回流之后，将反应混合物添加到50mL的水中。向该水溶液中滴入浓盐酸，调整到pH到1之后生成沉淀。将沉淀物过滤，溶解在氯仿中。将氯仿相用10％的NaHCO3水溶液、水清洗。馏去氯仿，得到残渣。将残渣用水重结晶，得到0.3g(产率63％)的羧酸2。
(2)活性酯(3)的合成
在50mL三口瓶中使0.2g(0.6mmol)羧酸衍生物2和N-羟基琥珀酰亚胺0.07g(0.6mmol)溶于10mL的DMF。以30分钟向其中滴入N，N’-二环己基碳化二亚胺0.12g(0.6mmol)。滴入后，在室温下搅拌30小时。减压下馏去DMF。用硅胶柱色谱(氯仿)分离纯化残渣，得到0.14g(产率55％)活性酯体3。
实施例1
<寡核苷酸的染料标记和检测(1)>
1.寡核苷酸的染料标记
寡核苷酸的染料标记用以下流程图4进行。
[化学式30]
                        流程图4
(实验操作)
向含有H2N-dT2O(40mmol)的Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH9.0)40μl中加入含有机EL染料的活性酯5.0μmol(2.4mg)的无水DMSO溶液12μl，在室温下振荡6小时。振荡后，加入0.1M的TEAA(乙酸三乙胺盐)缓冲液(pH7.0)至总量达1ml。使用NAP-10柱(Parmacia Sephadex G-25)分离出来自寡核苷酸的成分。此时，NAP-10柱预先用0.1M的TEAA缓冲液15ml平衡后使用。将混匀后的样品填充入柱中，至总量达1ml，洗脱出1ml的溶液后，再注入0.1M的TEAA缓冲液1.5ml。立即收集其后的洗脱液1.5ml。将该所得溶液冻干过夜，加入减压蒸馏水20μl，用反相HPLC进行分析。向HPLC中注入的溶液稀释至40分之一来进行分析。
(HPLC测定条件)
色谱柱：Lichrospher RP-18(Cica-MERCK)  流速：1ml/min
检测波长：260nm  样品注入所用溶剂：超纯水
洗脱液A：0.1M TEAA缓冲液(pH7.0)，10％ CH3CN溶液
洗脱液B：0.1M TEAA缓冲液(pH7.0)，40％ CH3CN溶液
[表1]
  0   30   35   40(分)
  A   100   0   0   100(％)
  B   0   100   100   0(％)
HPLC测定的梯度条件
被标记的寡核苷酸的HPLC图谱和目的物的UV图谱分别示于图1A和图1B。HPLC的结果为，判断在RT＝30min附近可获得来自目的物的峰，进行HPLC分离。所得目的物的鉴定通过MALDI TOF MASS进行。其结果如图2所示。由HPLC图谱的峰面积算出反应率，结果为约90％，EL染料的活性酯(6)与寡聚DNA基本定量反应。
2.被标记的寡核苷酸的检测
以下如表2所示，制备不同浓度的被标记寡核苷酸的溶液。然后，将1nL该溶液点样(5×5)在玻璃基板上。点样后干燥玻璃基板。
[表2]
 溶液浓度(μM)   被标记寡核苷酸的相对浓度(fmol)
 110   110
 11   11
 1   1
 0.5   0.5
然后，用荧光扫描仪检查其检测限。结果如图3所示。(a)、(b)、(c)、(d)分别表示110fmol、10fmol、1fmol、0.5fmol的结果。
在此，检测仪使用BIO-RAD Molecular Imager FX Pro。激光波长为488nm，扫描间隔为50nm。
(结果)
本次用于检测的激发光为488nm的激光，荧光染料的激发波长为438nm。尽管如此，被标记的寡核苷酸的相对浓度的检测限为0.5fmol(500amol)，可以高灵敏度地检测。此外，与DNA的反应基本定量，反应时间也可以从原来的24小时左右缩短到6小时左右。而且，该EL染料稳定，即使使用在室温下保存了15天的EL染料进行再测定，也能得到同等的结果。
实施例2
<寡核苷酸的染料标记和检测(2)>
1.寡核苷酸的染料标记
寡核苷酸的染料标记用以下流程图4进行。标记的条件与实施例1相同，咪唑衍生物的加成反应迅速且基本定量地进行。
[化学式31]
                      流程图5
(HPLC测定条件)
色谱柱：Lichrospher RP-18(Cica-MERCK)流速：1ml/min
检测波长：260nm  样品注入所有溶剂：超纯水
洗脱液A：0.1M TEAA缓冲液(pH7.0)，10％ CH3CN溶液
洗脱液B：0.1M TEAA缓冲液(pH7.0)，40％ CH3CN溶液
HPLC测定的梯度条件与实施例1相同。被标记的寡核苷酸的HPLC图谱和目的物的UV图谱分别示于图4A和图4B。HPLC的结果为，判断在RT＝25min附近获得来自目的物的峰，进行HPLC分离。
然后，与实施例同样用荧光扫描仪检查其检测限。结果如图5所示。此处，(a)、(b)、(c)、(d)、(e)分别表示500fmol、250fmol、100fmol、50fmol、10fmol的发光图案。
(结果)
被标记的寡核苷酸的相对浓度的检测限为10fmol，可以高灵敏度地检测。此外，寡核苷酸与EL染料的反应基本定量。
实施例3
(肽类的标记与检测)
1.Ac-Lys(EL)-Lys-Lys-Lys(Acr)-Lys-Lys-Lys(Acr)-Lys-Lys-NH2的合成
(1)Ac-Lys(Mtt)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-树脂的合成
(实验操作)
向反应器中加入Fmoc-NH-SAL树脂0.15g(0.61mmol/g)，在第3、6号筒中分别加入0.26g的Fmoc-Lys(Acr)-OH，在第1、2、4、5、7、8号筒中加入0.18g的Fmoc-Lys(Boc)-OH，在第9号筒中加入0.23g的Fmoc-Lys(Mtt)-OH。然后使用Applied Biosystems公司的431A型肽合成仪进行合成。方法采用standard Fmoc法进行，N末端进行乙酰化。获得黄色固体的肽树脂，产量为0.30g。
(2)Ac-Lys(Mtt)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-树脂的Mtt基的脱保护、EL的修饰以及从树脂中的切出，及侧链的脱保护
(实验操作)
i)Mtt基的脱保护
向螺旋管1中加入合成得到的肽树脂0.30g，向其中加入过量的二氯甲烷(DCM)使之膨润30分钟后，用氮气除去过剩的DCM。然后加入DCM∶TFA∶TIPS(三异丙基硅烷)＝94∶1∶5的混合溶液4ml，搅拌2分钟，用氮气除去溶剂。将该操作重复5次后，抽滤，用DCM、三乙胺、DCM清洗后，进行减压干燥。
ii)甲氧基型有机EL染料的修饰
向减压干燥后的肽树脂中加入6ml的NMP，搅拌30分钟使之膨润，加入三乙胺0.15ml进行搅拌。再加入活性酯(6)0.2g，在室温下搅拌24小时。然后抽滤，用NMP、DCM清洗后进行减压干燥。
iii)从树脂中的切出及侧链的脱保护
向减压干燥后的肽树脂中加入间甲酚0.08ml、茴香硫醚0.48ml、TFA3.44ml，在室温下搅拌1.5小时。然后抽滤，用TFA清洗。将TFA减压馏去后，在冰浴条件下加入15ml醚。用超声波处理后，短暂放置，分离除去上清液。再在冰浴条件下加入15ml乙酸乙酯，超声波处理后短暂放置。然后抽滤、用醚清洗后，进行减压干燥。
得到黄橙色固体，产量为0.29g。图6A和图6B分别表示产物纯化前和纯化后的HPLC图谱。对R.T.＝12.5min附近的峰的样品进行TOF-Mass测定，观察到与EL染料和肽的复合物(EL-Peptide)的分子量：2055.30相对应的峰为2057.33，确认了目的物的生成。(Matrix：α-CHCA；图7)
2.肽的检测
通过与实施例1同样的方法，对在玻璃基板上点样的标记肽进行检测。检测仪使用BIO-RAD Molecular Imager FX Pro。激光波长为488nm，扫描间隔为50nm。
(结果)
图8为被标记的肽的发光图案。(a)、(b)、(c)、(d)、(e)分别表示10fmol、5fmol、1fmol、0.5fmol、0.1fmol的结果。被标记的肽的相对浓度的检测限为0.1fmol(100amol)，可以高灵敏度地检测。此外，肽与EL染料的反应基本定量。
实施例4
<蛋白质的染料标记和检测>
1.蛋白质的染料标记
使BSA的赖氨酸残基的氨基与有机EL染料的活性酯反应，形成酰胺键，对BSA进行标记。具体来说，向含有BSA(牛血清白蛋白)4.0mg(58nmol)的碳酸缓冲液(pH9.0)58μl中加入含有3.6mg(8.6μmol)有机EL染料活性酯(EL-OSu)的DMSO溶液40μl，在37℃下振荡24小时。加入0.1M的TEAA缓冲液(pH7.0)至总量达1ml。使用NAP-10柱(Parmacia Sephadex G-25)分离出来自BSA的成分，将分离得到的溶液冻干过夜。
通过MALDI TOF MS，对标记了有机EL染料的BSA进行鉴定。如图9所示，被标记的BSA(图9B)与原料(图9A)相比，分子量增加2200左右，可知有机EL染料约5个结合在一起。
2.蛋白质的检测
(结果)
制成的BSA如图10所示，在固体状态下发出荧光，由此可知，通过有机EL染料活性酯能够对蛋白质进行标记。

Claims (32)

1.生物分子的检测方法，其特征为，使生物分子样品与有机EL染料反应，测定用该有机EL染料标记的该生物分子样品的荧光。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征为，使所述有机EL染料与所述生物分子之间形成酰胺键、酰亚胺键、尿烷键、酯键或胍键。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征为，在与所述生物分子反应之前，向所述有机EL染料中引入选自异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种反应性基团。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述生物分子样品使用选自核酸、蛋白质、肽类和糖类中的任意1种。
5.生物分子的检测方法，其特征为，使用标记染料标记生物分子样品，测定该被标记生物分子样品的荧光，所述标记染料含有具有共轭体系的含1种或更多种杂原子、硒原子或硼原子的五元环化合物。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征为，所述标记染料含有含所述五元环化合物和具有共轭体系的六元环化合物的稠环化合物。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征为，所述稠环化合物为唑衍生物或咪唑衍生物。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征为，所述唑衍生物为用以下通式(1)、(2)或(3)中的任意1种表示的化合物，
Figure A2004800387720003C1
式中，R1、R2、R3、R4分别独立地表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基或磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基，X表示可含取代基的氮原子或硫原子或氧原子或硒原子，R’表示可含芳环的烷基或链烯基等脂肪烃基或芳烃基，An-表示Cl-、Br-、I等卤化物离子、CF3SO3 -、BE4 -、PF6 -。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征为，所述咪唑衍生物为用以下通式(4)、(5)、(6)、(7)或(8)中的任意1种表示的化合物，
式中，R1、R2、R3、R4、R5分别表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基或磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基，R1、R2、R3、R4、R5可以相同也可以不同，R’、R”表示可含芳环的烷基或链烯基等脂肪烃基或芳烃基，An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -。
10.如权利要求5所述的检测方法，其特征为，在与所述生物分子反应之前，向所述标记染料中引入选自异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种反应性基团。
11.标记染料，其是用于通过荧光测定来检测生物分子的标记染料，其特征为，包含具有与生物分子结合的反应性基团的有机EL染料。
12.如权利要求11所述的标记染料，其特征为，所述反应性基团选自羧酸基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种。
13.如权利要求11所述的标记染料，其特征为，所述有机EL染料为含有具有共轭体系的五元环化合物的化合物，该五元环化合物含有1种或更多种杂原子、硒原子或硼原子。
14.如权利要求13所述的标记染料，其特征为，所述有机EL染料为含有所述五元环化合物和具有共轭体系的六元环化合物的稠环化合物。
15.如权利要求13所述的标记染料，其特征为，所述稠环化合物为唑衍生物或咪唑衍生物。
16.如权利要求15所述的标记染料，其特征为，所述唑衍生物为用以下通式(1)、(2)或(3)中的任意1种表示的化合物，
Figure A2004800387720005C1
式中，R1、R2、R3、R4分别独立地表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基或磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基，X表示可含取代基的氮原子或硫原子或氧原子或硒原子，R’表示可含芳环的烷基或链烯基等脂肪烃基或芳烃基，An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -。
17.如权利要求15所述的标记染料，其特征为，所述咪唑衍生物为用以下通式(4)、(5)、(6)、(7)或(8)中的任意1种表示的化合物，
Figure A2004800387720006C1
式中，R1、R2、R3、R4、R5分别独立地表示可含有氢原子、卤原子、羟基、氰基或磺酰基等取代基的芳烃基或烃基或杂环基或环内含杂原子的芳基，R1、R2、R3、R4、R5可以相同也可以不同，R’、R”表示可含芳环的烷基或链烯基等脂肪烃基或芳烃基，An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -。
18.生物分子用标记试剂盒，其特征为，含有标记生物分子的有机EL染料。
19.如权利要求18所述的标记试剂盒，其特征为，所述有机EL染料含有选自羧酸基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳化二亚胺基及经活性酯化的羰基中的任意1种反应性基团。
20.如权利要求18所述的标记试剂盒，其特征为，所述有机EL染料为含有具有共轭体系的五元环化合物的化合物，该五元环化合物含有1种或更多种杂原子、硒原子或硼原子。
21.如权利要求18所述的标记试剂盒，其特征为，所述有机EL染料为含有所述五元环化合物和具有共轭体系的六元环化合物的稠环化合物。
22.生物分子的检测方法，其特征为，使生物分子样品与用有机EL染料标记的探针反应，测定该生物分子样品的荧光。
23.如权利要求22所述的检测方法，其特征为，所述生物分子样品为核酸，所述探针使用与该核酸的碱基序列互补的寡核苷酸或PNA。
24.如权利要求23所述的检测方法，其特征为，所述寡核苷酸为引物或终止物，使所述核酸扩增来进行荧光检测。
25.如权利要求24所述的检测方法，其特征为，在所述核酸扩增之前，用有机EL染料标记引物。
26.如权利要求23所述的检测方法，其特征为，所述寡核苷酸或PNA为分子信标。
27.生物分子的检测方法，其特征为，包括通过电泳把生物分子样品按大小分离的工序，在进行该电泳之前或进行该电泳之后，用有机EL染料标记生物分子样品。
28.如权利要求27所述的检测方法，其特征为，所述生物分子样品为核酸，根据电泳图确定该核酸的碱基序列。
29.如权利要求27所述的检测方法，其特征为，所述生物分子样品为蛋白质，对根据电泳图分离出来的蛋白质进行质量分析。
30.组织或细胞的染色方法，其特征为，将组织或细胞样品中的生物分子用有机EL染料标记。
31.如权利要求30所述的染色方法，其特征为，所述生物分子为核酸或蛋白质。
32.染色染料，其是用于组织或细胞样品的染色的染色染料，其特征为，含有有机EL染料，该有机EL染料含有与组织或细胞中的生物分子相结合的反应性基团。
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