JP2002327130A - 新規蛍光色素及び核酸の測定方法 - Google Patents
新規蛍光色素及び核酸の測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】核酸検出において二本鎖核酸にインターカレー
トしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光
波長の差が大きい（すなわちストークスシフトの大き
い）新規なインターカレーター性蛍光色素等を提供す
る。 【解決手段】下記一般式１で表される化合物具体的に
は、例えば化合物１、その塩、その水和物、その溶媒和
物又はその立体異性体、これら化合物の製造方法、これ
ら化合物を核酸と接触させ、またはこれら化合物を一本
鎖オリゴヌクレオチドと化学的に結合した核酸プローブ
の提供により、前期課題を解決する。 例えば
トしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光
波長の差が大きい（すなわちストークスシフトの大き
い）新規なインターカレーター性蛍光色素等を提供す
る。 【解決手段】下記一般式１で表される化合物具体的に
は、例えば化合物１、その塩、その水和物、その溶媒和
物又はその立体異性体、これら化合物の製造方法、これ
ら化合物を核酸と接触させ、またはこれら化合物を一本
鎖オリゴヌクレオチドと化学的に結合した核酸プローブ
の提供により、前期課題を解決する。 例えば
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、新規な蛍光色
素、その製造方法、該色素を化学結合で結合した核酸プ
ローブ、そしてこれを使用することを特徴とする核酸の
測定方法に関するものである。本願発明は、詳しくはス
トークスシフトが大きく、しかも二本鎖核酸存在時に蛍
光強度が著しく増大する新規蛍光性色素、その製造方
法、該色素を化学結合で結合した核酸プローブ、そして
これを使用することを特徴とする核酸の測定方法に関す
るものである。
素、その製造方法、該色素を化学結合で結合した核酸プ
ローブ、そしてこれを使用することを特徴とする核酸の
測定方法に関するものである。本願発明は、詳しくはス
トークスシフトが大きく、しかも二本鎖核酸存在時に蛍
光強度が著しく増大する新規蛍光性色素、その製造方
法、該色素を化学結合で結合した核酸プローブ、そして
これを使用することを特徴とする核酸の測定方法に関す
るものである。
【０００２】なお、本願発明の測定法は、ＤＮＡやＲＮ
Ａ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定塩
基配列を含む標的ＲＮＡの定性又は定量分析方法に関す
るものであり、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に
有用で、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋
中等の環境中の微生物の定性又は定量に有用な測定法で
ある。
Ａ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定塩
基配列を含む標的ＲＮＡの定性又は定量分析方法に関す
るものであり、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に
有用で、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋
中等の環境中の微生物の定性又は定量に有用な測定法で
ある。
【０００３】
【従来の技術】一般的に、生体成分の分析には高い特異
性と感度が求められる。特定塩基配列を含む核酸（標的
核酸）の分析では、該核酸が特定塩基配列に相補的な配
列を有する核酸（核酸プローブ）と配列特異的に複合体
を形成する性質が利用される。
性と感度が求められる。特定塩基配列を含む核酸（標的
核酸）の分析では、該核酸が特定塩基配列に相補的な配
列を有する核酸（核酸プローブ）と配列特異的に複合体
を形成する性質が利用される。
【０００４】特定塩基配列を有する標的核酸の定量に
は、形成された複合体の量に関連した測定可能な信号を
得る手段が重要であり、更に臨床診断等の目的において
は、試料中に存在し得る標的核酸量は極微量であること
から、該手段は極微量核酸を増幅する工程が必要とな
る。
は、形成された複合体の量に関連した測定可能な信号を
得る手段が重要であり、更に臨床診断等の目的において
は、試料中に存在し得る標的核酸量は極微量であること
から、該手段は極微量核酸を増幅する工程が必要とな
る。
【０００５】特にウイルス感染症の診断では、臨床試薬
中の標的核酸（ウイルス核酸）は極微量であることが多
いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するため
に信号強度を向上し高感度化する目的から、ポリメレー
スチェインリアクション（ＰＣＲ）法等によって標的核
酸を増幅しておく方法が試みられている。また、ＲＮＡ
の増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法（例えば特許第２６５
０１５９号公報参照）や３ＳＲ法（例えば欧州公開特許
第３７３９６０号公報参照）と呼ばれる方法も知られて
いる。
中の標的核酸（ウイルス核酸）は極微量であることが多
いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するため
に信号強度を向上し高感度化する目的から、ポリメレー
スチェインリアクション（ＰＣＲ）法等によって標的核
酸を増幅しておく方法が試みられている。また、ＲＮＡ
の増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法（例えば特許第２６５
０１５９号公報参照）や３ＳＲ法（例えば欧州公開特許
第３７３９６０号公報参照）と呼ばれる方法も知られて
いる。
【０００６】標的核酸の特定塩基配列に相補的な核酸配
列を有し、標的核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信
号を発するようにインターカレーター性蛍光色素を標識
した核酸プローブ（例えば特開平８−２１１０５０号公
報参照）は、標的核酸と相補結合を形成することで測定
可能な蛍光信号を発するため、相補結合の形成の有無、
及び相補結合体の定量を可能とするものであり、相補結
合していないプローブを反応系から分離する必要がない
ために、増幅された試料を反応容器から取り出す必要が
なく、増幅産物の飛散等に由来する偽陽性を惹起しない
という利点がある。
列を有し、標的核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信
号を発するようにインターカレーター性蛍光色素を標識
した核酸プローブ（例えば特開平８−２１１０５０号公
報参照）は、標的核酸と相補結合を形成することで測定
可能な蛍光信号を発するため、相補結合の形成の有無、
及び相補結合体の定量を可能とするものであり、相補結
合していないプローブを反応系から分離する必要がない
ために、増幅された試料を反応容器から取り出す必要が
なく、増幅産物の飛散等に由来する偽陽性を惹起しない
という利点がある。
【０００７】そして核酸プライマー及び核酸ポリメレー
スの作用により、特定塩基配列から成るＲＮＡを一定温
度にて増幅する工程を、この核酸プローブ共存下で実施
することによって、標的ＲＮＡの増幅とその分析を一定
温度条件下で、担体を使用することなく、しかも、密閉
条件で行う方法も開発されている。（特願２０００−１
４４００号公報参照）。
スの作用により、特定塩基配列から成るＲＮＡを一定温
度にて増幅する工程を、この核酸プローブ共存下で実施
することによって、標的ＲＮＡの増幅とその分析を一定
温度条件下で、担体を使用することなく、しかも、密閉
条件で行う方法も開発されている。（特願２０００−１
４４００号公報参照）。
【０００８】インターカレーター性蛍光色素は、二本鎖
核酸にインターカレーションし、インターカレーション
によって遊離状態とは蛍光特性が変化する物質である。
この様な性質を持つ化合物としては、エチジウムブロミ
ド、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ等が知
られている。更に、これらの化合物をリンカーで結合し
て、二量化することにより得られるエチジウムダイマ
ー、ＹＯＹＯ等も、二本鎖核酸にインターカレートし蛍
光増感を示すことが知られている。従って、識別可能な
蛍光特性の変化を引き起こす二種類以上のインターカレ
ーター性蛍光色素を用いて複数の核酸を同時に増幅し、
増幅産物を同時に測定することができれば、産業上、有
意義な用途が数多く考えられる。例えば、一つの試料中
に含まれる複数の標的核酸を同時に検出したり、既知量
の標準核酸を標的核酸と同時に増幅することで、増幅反
応等の正否の判定、又は、標的核酸の定量を可能とする
ことが例示できる。
核酸にインターカレーションし、インターカレーション
によって遊離状態とは蛍光特性が変化する物質である。
この様な性質を持つ化合物としては、エチジウムブロミ
ド、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ等が知
られている。更に、これらの化合物をリンカーで結合し
て、二量化することにより得られるエチジウムダイマ
ー、ＹＯＹＯ等も、二本鎖核酸にインターカレートし蛍
光増感を示すことが知られている。従って、識別可能な
蛍光特性の変化を引き起こす二種類以上のインターカレ
ーター性蛍光色素を用いて複数の核酸を同時に増幅し、
増幅産物を同時に測定することができれば、産業上、有
意義な用途が数多く考えられる。例えば、一つの試料中
に含まれる複数の標的核酸を同時に検出したり、既知量
の標準核酸を標的核酸と同時に増幅することで、増幅反
応等の正否の判定、又は、標的核酸の定量を可能とする
ことが例示できる。
【０００９】しかしながら、インターカレーター性蛍光
色素の種類には限りがあり、それらが発する蛍光は、極
大波長を中心とした幅を持ったスペクトルとして観察さ
れ、かつ、その蛍光量子収率は、一般的に蛍光色素によ
って異なる。従って、蛍光スペクトルが互いに重なり合
うインターカレーター性蛍光色素では、特定の波長にお
ける蛍光強度を精密に測定することは困難である。ま
た、インターカレーター性蛍光色素を励起するための光
源には、レーザーや、発光ダイオード等が考えられる
が、これも種類に制限があり、至適な励起用光源の組み
合わせから考えた場合、蛍光スペクトルが互いに重なら
ない二種類以上のインターカレーター性蛍光色素を選択
する事は非常に困難であった。例えば、公知のインター
カレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローやチ
アゾールオレンジ等のシアニン系色素において、二つの
蛍光スペクトルが重なり合わないためには、両者の蛍光
極大波長の差が約１００ｎｍ以上なければならないが、
シアニン系蛍光物質の蛍光極大波長と励起極大波長の差
は２０から４０ｎｍ程度であり、また、両者を蛍光測定
が可能なように励起するためには、二つの励起光源が必
要となって、該測定を実施するうえでの制約となる。
色素の種類には限りがあり、それらが発する蛍光は、極
大波長を中心とした幅を持ったスペクトルとして観察さ
れ、かつ、その蛍光量子収率は、一般的に蛍光色素によ
って異なる。従って、蛍光スペクトルが互いに重なり合
うインターカレーター性蛍光色素では、特定の波長にお
ける蛍光強度を精密に測定することは困難である。ま
た、インターカレーター性蛍光色素を励起するための光
源には、レーザーや、発光ダイオード等が考えられる
が、これも種類に制限があり、至適な励起用光源の組み
合わせから考えた場合、蛍光スペクトルが互いに重なら
ない二種類以上のインターカレーター性蛍光色素を選択
する事は非常に困難であった。例えば、公知のインター
カレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローやチ
アゾールオレンジ等のシアニン系色素において、二つの
蛍光スペクトルが重なり合わないためには、両者の蛍光
極大波長の差が約１００ｎｍ以上なければならないが、
シアニン系蛍光物質の蛍光極大波長と励起極大波長の差
は２０から４０ｎｍ程度であり、また、両者を蛍光測定
が可能なように励起するためには、二つの励起光源が必
要となって、該測定を実施するうえでの制約となる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本願発明の第１の目的
は、核酸検出において二本鎖核酸にインターカレートし
たときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長
の差が大きい（すなわちストークスシフトの大きい）新
規なインターカレーター性蛍光色素であって、従来公知
のインターカレーター性蛍光色素とは蛍光スペクトルが
重なり合わないという特徴を有する化合物を提供するこ
とにある。また本願発明の第２の目的は、該蛍光色素を
化学結合で結合した新規な核酸プローブを提供すること
にある。そして本願発明の第３の目的は、該核酸プロー
ブを用いた核酸の測定法（定性、定量法）であって、試
料の中に含まれる一種以上の標的核酸を増幅し、分離操
作を行うことなしに、増幅産物を密閉容器内で測定する
方法を提供し、標的核酸の存在の有無、及び量を高精度
に決定する測定法、特に、二種類以上の標的核酸の同時
測定等を可能とする測定法を提供することにある。
は、核酸検出において二本鎖核酸にインターカレートし
たときの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長
の差が大きい（すなわちストークスシフトの大きい）新
規なインターカレーター性蛍光色素であって、従来公知
のインターカレーター性蛍光色素とは蛍光スペクトルが
重なり合わないという特徴を有する化合物を提供するこ
とにある。また本願発明の第２の目的は、該蛍光色素を
化学結合で結合した新規な核酸プローブを提供すること
にある。そして本願発明の第３の目的は、該核酸プロー
ブを用いた核酸の測定法（定性、定量法）であって、試
料の中に含まれる一種以上の標的核酸を増幅し、分離操
作を行うことなしに、増幅産物を密閉容器内で測定する
方法を提供し、標的核酸の存在の有無、及び量を高精度
に決定する測定法、特に、二種類以上の標的核酸の同時
測定等を可能とする測定法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】特定の条件を満たす近接
した二つの化合物の一方を励起すると、他方にエネルギ
ートランスファーが起こり、エネルギーを受け取った化
合物（アクセプター）が蛍光を発することは広く知られ
ている。本願発明者らは、このエネルギートランスファ
ーを分子内で効率的に起こす物質について研究を重ね、
核酸検出において核酸二本鎖にインターカレートしたと
きの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長の差
が大きい、すなわちストークシフトの大きい新規な蛍光
色素を見い出すに至った。このようにして前記目的を実
現すべく完成された本願請求項１の発明は、従来はその
構造、合成法、蛍光特性等が全く知られていない、新規
な前記一般式１（式中、Ｒ1は低級アルキル基を表す。
Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で
表される基（該式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基
又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表
す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（該式中、Ｒ3は水
素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された
低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で
表される基（該式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なっ
て、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級
アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯ
で表される基（該式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロ
ゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は
式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ7は低級アルキ
ル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低
級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子を表す。ｌ、
ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数を表
す。Ｚは酸素原子又は硫黄原子を表す。Ｘ1及びＸ2は、
同一又は相異なって、ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで
表される基（該式中、Ｒ8は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：
Ｒ9ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ9は低級アルキル
基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級
アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）で表されることを特徴とする化合物、
その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体
である。
した二つの化合物の一方を励起すると、他方にエネルギ
ートランスファーが起こり、エネルギーを受け取った化
合物（アクセプター）が蛍光を発することは広く知られ
ている。本願発明者らは、このエネルギートランスファ
ーを分子内で効率的に起こす物質について研究を重ね、
核酸検出において核酸二本鎖にインターカレートしたと
きの蛍光増感が大きく、しかも励起波長と蛍光波長の差
が大きい、すなわちストークシフトの大きい新規な蛍光
色素を見い出すに至った。このようにして前記目的を実
現すべく完成された本願請求項１の発明は、従来はその
構造、合成法、蛍光特性等が全く知られていない、新規
な前記一般式１（式中、Ｒ1は低級アルキル基を表す。
Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で
表される基（該式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基
又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表
す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（該式中、Ｒ3は水
素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された
低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で
表される基（該式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なっ
て、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級
アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯ
で表される基（該式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロ
ゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は
式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ7は低級アルキ
ル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低
級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子を表す。ｌ、
ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数を表
す。Ｚは酸素原子又は硫黄原子を表す。Ｘ1及びＸ2は、
同一又は相異なって、ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで
表される基（該式中、Ｒ8は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：
Ｒ9ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ9は低級アルキル
基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級
アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）で表されることを特徴とする化合物、
その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性体
である。
【００１２】本願請求項２の発明は、前記請求項1に記
載の化合物、その塩、その水和物、その溶媒和物又はそ
の立体異性体の製造方法である。
載の化合物、その塩、その水和物、その溶媒和物又はそ
の立体異性体の製造方法である。
【００１３】本願請求項３の発明は、試料中に含まれる
と予想される核酸の有無又は量を測定する方法であっ
て、前記請求項1に記載の化合物を用いることを特徴と
する。本願請求項４の発明は、請求項３の発明に係り、
前記核酸が、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡハイブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合
物である測定法である。
と予想される核酸の有無又は量を測定する方法であっ
て、前記請求項1に記載の化合物を用いることを特徴と
する。本願請求項４の発明は、請求項３の発明に係り、
前記核酸が、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡハイブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合
物である測定法である。
【００１４】本願請求項５の発明は、特定の核酸配列を
有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な
核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドと前記一般
式１で表わされる化合物を化学結合で結合した核酸プロ
ーブである。本願請求項６の発明は、前記請求項５の発
明に係り、前記一本鎖オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリ
ゴマーである核酸プローブである。本願請求項７の発明
は、前記請求項６の発明に係り、ＤＮＡオリゴマー中の
リン部分からリンカーを介して前記化学結合を形成した
ことを特徴とする。本願請求項８の発明は、前記請求項
７の発明に係り、前記一般式１で表わされる化合物が、
標的核酸と一本鎖ＤＮＡプローブとの相補結合部分にイ
ンターカレーションすることにより蛍光特性が変化する
ことを特徴とする。
有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な
核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドと前記一般
式１で表わされる化合物を化学結合で結合した核酸プロ
ーブである。本願請求項６の発明は、前記請求項５の発
明に係り、前記一本鎖オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリ
ゴマーである核酸プローブである。本願請求項７の発明
は、前記請求項６の発明に係り、ＤＮＡオリゴマー中の
リン部分からリンカーを介して前記化学結合を形成した
ことを特徴とする。本願請求項８の発明は、前記請求項
７の発明に係り、前記一般式１で表わされる化合物が、
標的核酸と一本鎖ＤＮＡプローブとの相補結合部分にイ
ンターカレーションすることにより蛍光特性が変化する
ことを特徴とする。
【００１５】本願請求項９の発明は、試料中に含まれる
少なくとも一種類以上の特定核酸配列を有する核酸（標
的核酸）を測定する方法であって、前記請求項６の核酸
プローブを用いることを特徴とする。
少なくとも一種類以上の特定核酸配列を有する核酸（標
的核酸）を測定する方法であって、前記請求項６の核酸
プローブを用いることを特徴とする。
【００１６】本願請求項１０の発明は、試料中に含まれ
る二種類以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮ
Ａ）を測定する方法であって、二種類以上の標的ＲＮＡ
を同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程
は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるイ
ンターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在
下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合
部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレー
トすることにより変化した蛍光強度を測定する工程を含
み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一
般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異
なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレ
ーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする
標的核酸の測定法である。本願請求項１１の発明は、試
料中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有
するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該
試料に既知量の標準核酸を添加し、標的ＲＮＡと標準核
酸を同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工
程は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なる
インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存
在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結
合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレ
ートすることにより変化した蛍光強度を測定し、別途測
定した既知量の標準核酸の蛍光強度と比較する工程を含
み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一
般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異
なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレ
ーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする
標的核酸の測定法である。
る二種類以上の特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮ
Ａ）を測定する方法であって、二種類以上の標的ＲＮＡ
を同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程
は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるイ
ンターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在
下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結合
部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレー
トすることにより変化した蛍光強度を測定する工程を含
み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一
般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異
なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレ
ーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする
標的核酸の測定法である。本願請求項１１の発明は、試
料中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有
するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該
試料に既知量の標準核酸を添加し、標的ＲＮＡと標準核
酸を同時に増幅する工程を含み、ここで該ＲＮＡ増幅工
程は、各々の増幅産物に相補的な配列を有する、異なる
インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存
在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成する相補結
合部分にインターカレーター性蛍光色素がインターカレ
ートすることにより変化した蛍光強度を測定し、別途測
定した既知量の標準核酸の蛍光強度と比較する工程を含
み、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一
般式１で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異
なり、かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレ
ーター性蛍光色素の組み合わせであることを特徴とする
標的核酸の測定法である。
【００１７】本願請求項１２の発明は、前記請求項１０
又は１１の発明に係り、前記他のインターカレーター性
蛍光色素の少なくとも１つがオキサゾールイエローであ
ることを特徴とする。そして本願請求項１３の発明は、
前記請求項１２の発明に係り、測定におけるインターカ
レーター性蛍光色素の励起波長が４５０から５００ｎｍ
であることを特徴とする。以下、本願の各発明を詳細に
説明する。なお本願明細書では、特に断らない限り「低
級」なる用語は炭素数が１〜６個の直鎖又は分枝した炭
素鎖を意味する。
又は１１の発明に係り、前記他のインターカレーター性
蛍光色素の少なくとも１つがオキサゾールイエローであ
ることを特徴とする。そして本願請求項１３の発明は、
前記請求項１２の発明に係り、測定におけるインターカ
レーター性蛍光色素の励起波長が４５０から５００ｎｍ
であることを特徴とする。以下、本願の各発明を詳細に
説明する。なお本願明細書では、特に断らない限り「低
級」なる用語は炭素数が１〜６個の直鎖又は分枝した炭
素鎖を意味する。
【００１８】一般式１において、低級アルキル基として
は、具体的には例えばメチル基、エチル基、プロピル
基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ
−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル（アミル）
基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペン
チル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、
１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシ
ル基、３−メチルペンチル基等が挙げられ、好ましく
は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ブチル基、ペンチル（アミル）基、ヘキシル基等を
例示できる。また一般式１において、ハロゲン原子で置
換された低級アルキル基としては、例えばフルオロメチ
ル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、３
−フルオロプロピル基、クロロメチル基、ジクロロメチ
ル基、トリクロロメチル基、３−クロロプロピル基、４
−クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロ
ヘキシル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモブチル
基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル基、３
−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨード
ペンチル基、６−ヨードヘキシル基等を例示できる。そ
して一般式１において、ハロゲン原子としては、フッ素
原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を例示できる。
は、具体的には例えばメチル基、エチル基、プロピル
基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ
−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル（アミル）
基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペン
チル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、
１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシ
ル基、３−メチルペンチル基等が挙げられ、好ましく
は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ブチル基、ペンチル（アミル）基、ヘキシル基等を
例示できる。また一般式１において、ハロゲン原子で置
換された低級アルキル基としては、例えばフルオロメチ
ル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、３
−フルオロプロピル基、クロロメチル基、ジクロロメチ
ル基、トリクロロメチル基、３−クロロプロピル基、４
−クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロ
ヘキシル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモブチル
基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル基、３
−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨード
ペンチル基、６−ヨードヘキシル基等を例示できる。そ
して一般式１において、ハロゲン原子としては、フッ素
原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を例示できる。
【００１９】前記一般式１で表される本願発明の化合物
（芳香族化合物誘導体、その塩、その水和物、その溶媒
和物又はその立体異性体）を具体的に説明するために、
一般式１において用いられる各種記号について、その好
適な具体例を挙げて詳細に説明する。
（芳香族化合物誘導体、その塩、その水和物、その溶媒
和物又はその立体異性体）を具体的に説明するために、
一般式１において用いられる各種記号について、その好
適な具体例を挙げて詳細に説明する。
【００２０】Ｒ1は低級アルキル基を表す。かかるアル
キル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プ
ロピル基等の炭素数１〜４個の直鎖状又は分枝状のアル
キル基で、より好ましくはメチル基、エチル基である
が、中でもメチル基はＲ1として最も好ましい低級アル
キル基である。
キル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プ
ロピル基等の炭素数１〜４個の直鎖状又は分枝状のアル
キル基で、より好ましくはメチル基、エチル基である
が、中でもメチル基はＲ1として最も好ましい低級アル
キル基である。
【００２１】Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−
ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子、低級ア
ルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基
を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は
水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換され
た低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−
で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なっ
て、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級
アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ 6ＣＯＯ
で表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：
Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、
ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アル
キル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を
表す。）、酸素原子又は硫黄原子である。Ａ及びＤは、
好ましくは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表
される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又は
ハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、
式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及び
Ｒ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロ
ゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロ
ゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低
級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキ
ル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、
Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級
アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよい
フェニル基を表す。）を表す。）、又は酸素原子であ
る。Ａ及びＤは、更に好ましくは、同一又は相異なっ
て、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原
子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級
アルキル基を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表
される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、
低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アル
キル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表
される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原
子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7
ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロ
ゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル
基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表
す。）である。
ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子、低級ア
ルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基
を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は
水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換され
た低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−
で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なっ
て、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級
アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ 6ＣＯＯ
で表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：
Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、
ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アル
キル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を
表す。）、酸素原子又は硫黄原子である。Ａ及びＤは、
好ましくは、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表
される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又は
ハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、
式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及び
Ｒ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロ
ゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロ
ゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低
級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキ
ル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、
Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級
アルキル基又は低級アルキル基で置換されていてもよい
フェニル基を表す。）を表す。）、又は酸素原子であ
る。Ａ及びＤは、更に好ましくは、同一又は相異なっ
て、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原
子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級
アルキル基を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表
される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、
低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アル
キル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表
される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原
子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7
ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロ
ゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル
基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）を表
す。）である。
【００２２】前記Ｑは、ハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯ
で表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：
Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、
ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アル
キル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）
で、好ましくは、ハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表さ
れる基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で
置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換さ
れていてもよいフェニル基を表す。）であるが、ハロゲ
ン原子であることが最も好ましい。
で表される基（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：
Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、
ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アル
キル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）
で、好ましくは、ハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表さ
れる基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で
置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換さ
れていてもよいフェニル基を表す。）であるが、ハロゲ
ン原子であることが最も好ましい。
【００２３】前記ｌ、ｍ及びｎは、同一又は相異なっ
て、２〜５の整数を表すが、好ましくは同一又は相異な
って、２〜４の整数であり、特に好ましくは同一又は相
異なって、２又は３である。
て、２〜５の整数を表すが、好ましくは同一又は相異な
って、２〜４の整数であり、特に好ましくは同一又は相
異なって、２又は３である。
【００２４】前記Ｒ2は、水素原子、低級アルキル基又
はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であるが、
好ましくは水素原子又は低級アルキル基であり、特に好
ましくは水素原子、メチル基、エチル基である。中でも
水素原子が最も好ましい。
はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であるが、
好ましくは水素原子又は低級アルキル基であり、特に好
ましくは水素原子、メチル基、エチル基である。中でも
水素原子が最も好ましい。
【００２５】前記Ｒ3は、水素原子、低級アルキル基又
はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であるが、
好ましくは水素原子；メチル基、エチル基、プロピル
基、又は、２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル
基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−
ヨードヘキシル基、２−ブロモエチル基、３−ブロモプ
ロピル基、４−ブロモブチル基、５−ブロモペンチル
基、６−ブロモヘキシル基、２−クロロエチル基、３−
クロロプロピル基、４−クロロブチル基、５−クロロペ
ンチル基、６−クロロヘキシル基等のハロゲン原子で置
換された低級アルキル基である。Ｒ3は、より好ましく
は水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基、又は、
２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨー
ドブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシ
ル基等のヨード原子で置換された低級アルキル基等であ
る。中でも、水素原子、又は、メチル基、エチル基；２
−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨード
ブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル
基が最も好ましい。
はハロゲン原子で置換された低級アルキル基であるが、
好ましくは水素原子；メチル基、エチル基、プロピル
基、又は、２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル
基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−
ヨードヘキシル基、２−ブロモエチル基、３−ブロモプ
ロピル基、４−ブロモブチル基、５−ブロモペンチル
基、６−ブロモヘキシル基、２−クロロエチル基、３−
クロロプロピル基、４−クロロブチル基、５−クロロペ
ンチル基、６−クロロヘキシル基等のハロゲン原子で置
換された低級アルキル基である。Ｒ3は、より好ましく
は水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基、又は、
２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨー
ドブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシ
ル基等のヨード原子で置換された低級アルキル基等であ
る。中でも、水素原子、又は、メチル基、エチル基；２
−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨード
ブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル
基が最も好ましい。
【００２６】前記Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、
低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アル
キル基である。Ｒ4及びＲ5は、好ましくは、同一又は相
異なって、メチル基、エチル基、プロピル基；２−ヨー
ドエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル
基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基、２
−ブロモエチル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモ
ブチル基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル
基、２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、４−
クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘ
キシル基等である。Ｒ4及びＲ5は、より好ましくは、同
一又は相異なって、メチル基、エチル基、プロピル基；
２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨー
ドブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシ
ル基等である。Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、メ
チル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプ
ロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル
基、６−ヨードヘキシル基であることが最も好ましい。
低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アル
キル基である。Ｒ4及びＲ5は、好ましくは、同一又は相
異なって、メチル基、エチル基、プロピル基；２−ヨー
ドエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル
基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基、２
−ブロモエチル基、３−ブロモプロピル基、４−ブロモ
ブチル基、５−ブロモペンチル基、６−ブロモヘキシル
基、２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、４−
クロロブチル基、５−クロロペンチル基、６−クロロヘ
キシル基等である。Ｒ4及びＲ5は、より好ましくは、同
一又は相異なって、メチル基、エチル基、プロピル基；
２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨー
ドブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシ
ル基等である。Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、メ
チル基、エチル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプ
ロピル基、４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル
基、６−ヨードヘキシル基であることが最も好ましい。
【００２７】前記Ｒ6は、低級アルキル基又はハロゲン
原子で置換された低級アルキル基であり、好ましくはメ
チル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジ
フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチ
ル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基等であ
り、更に好ましくはメチル基、トリフルオロメチル基、
トリクロロメチル基である。
原子で置換された低級アルキル基であり、好ましくはメ
チル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジ
フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチ
ル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基等であ
り、更に好ましくはメチル基、トリフルオロメチル基、
トリクロロメチル基である。
【００２８】前記Ｒ7は、低級アルキル基、ハロゲン原
子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置
換されていても良いフェニル基であり、好ましくは、メ
チル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジ
フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチ
ル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、フェニ
ル基、ｐ−メチルフェニル基等であり、更に好ましくは
メチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル
基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基である。
子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置
換されていても良いフェニル基であり、好ましくは、メ
チル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジ
フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチ
ル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、フェニ
ル基、ｐ−メチルフェニル基等であり、更に好ましくは
メチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル
基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基である。
【００２９】前記Ｚは、酸素原子又は硫黄原子であり、
好ましくは硫黄原子である。
好ましくは硫黄原子である。
【００３０】前記Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、
ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ8
は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級ア
ルキル基を表す。）又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式
中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された
低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていても
よいフェニル基を表す。）である。Ｘ1及びＸ2は、好ま
しくは、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ
9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハ
ロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキ
ル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）であ
る。Ｘ1及びＸ2は、更に好ましくは、同一又は相異なっ
て、ハロゲン原子である。
ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ8
は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級ア
ルキル基を表す。）又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式
中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された
低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていても
よいフェニル基を表す。）である。Ｘ1及びＸ2は、好ま
しくは、同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ
9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハ
ロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級アルキ
ル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）であ
る。Ｘ1及びＸ2は、更に好ましくは、同一又は相異なっ
て、ハロゲン原子である。
【００３１】前記Ｒ8は、低級アルキル基又はハロゲン
原子で置換された低級アルキル基であり、好ましくはメ
チル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジ
フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチ
ル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基等で、更
に好ましくはメチル基、トリフルオロメチル基、トリク
ロロメチル基である。
原子で置換された低級アルキル基であり、好ましくはメ
チル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジ
フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチ
ル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基等で、更
に好ましくはメチル基、トリフルオロメチル基、トリク
ロロメチル基である。
【００３２】前記Ｒ9は、低級アルキル基、ハロゲン原
子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置
換されていても良いフェニル基であり、好ましくはメチ
ル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフ
ルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル
基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル
基、ｐ−メチルフェニル基等で、更に好ましくはメチル
基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェ
ニル基、ｐ−メチルフェニル基である。
子で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置
換されていても良いフェニル基であり、好ましくはメチ
ル基、エチル基、プロピル基；フルオロメチル基、ジフ
ルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル
基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基；フェニル
基、ｐ−メチルフェニル基等で、更に好ましくはメチル
基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基；フェ
ニル基、ｐ−メチルフェニル基である。
【００３３】上記一般式１で表される本願発明の化合物
において、好ましい例としては、Ｒ 1が低級アルキル基
であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨ
Ｒ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子又は低級アル
キル基を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式
中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子
で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4
Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又
は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換
された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は
式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル
基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級
アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子であり、ｌ、
ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数であ
り、Ｚは酸素原子又は硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、
同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で
表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原
子で置換されていても良い低級アルキル基又は低級アル
キル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）で
あるものが例示できる。更に好ましい化合物として、Ｒ
1が低級アルキル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異
なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水
素原子表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、
Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置
換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5
・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は
相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基を表す。Ｑは、ハロゲン原子又は
式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル
基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級
アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）又は酸素原子であり、ｌ、ｍ及びｎ
は、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは酸
素原子又は硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相
異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基
（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されてい
てもよいフェニル基を表す。）であるものが例示でき
る。そしてより好ましい化合物として、Ｒ1が低級アル
キル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：
−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級ア
ルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基
を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基
（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アル
キル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を
表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基
（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されてい
てもよいフェニル基を表す。）を表す。）であり、ｌ、
ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であ
り、Ｚは硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異
なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基
（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されてい
てもよいフェニル基を表す。）である化合物が例示でき
る。
において、好ましい例としては、Ｒ 1が低級アルキル基
であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−ＣＨ
Ｒ2−で表される基（式中、Ｒ2は水素原子又は低級アル
キル基を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式
中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子
で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4
Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又
は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換
された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は
式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル
基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級
アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子であり、ｌ、
ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数であ
り、Ｚは酸素原子又は硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、
同一又は相異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で
表される基（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原
子で置換されていても良い低級アルキル基又は低級アル
キル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）で
あるものが例示できる。更に好ましい化合物として、Ｒ
1が低級アルキル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異
なって、式：−ＣＨＲ2−で表される基（式中、Ｒ2は水
素原子表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、
Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置
換された低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5
・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は
相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基を表す。Ｑは、ハロゲン原子又は
式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は低級アルキル
基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級
アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）又は酸素原子であり、ｌ、ｍ及びｎ
は、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは酸
素原子又は硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相
異なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基
（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されてい
てもよいフェニル基を表す。）であるものが例示でき
る。そしてより好ましい化合物として、Ｒ1が低級アル
キル基であり、Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：
−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級ア
ルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基
を表す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基
（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アル
キル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を
表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基
（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されてい
てもよいフェニル基を表す。）を表す。）であり、ｌ、
ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であ
り、Ｚは硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異
なって、ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基
（式中、Ｒ9は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されてい
てもよいフェニル基を表す。）である化合物が例示でき
る。
【００３４】上記具体的な一般式１の化合物のうちで
も、Ｒ1がメチル基又はエチル基であり、Ａ及びＤは、
同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式
中、Ｒ3は水素原子；メチル基、エチル基；２−ヨード
エチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル
基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基を表
す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式
中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、メチル基、エ
チル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、
４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨー
ドヘキシル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7Ｓ
Ｏ3で表される基（式中、Ｒ7はメチル基；トリフルオロ
メチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチ
ルフェニル基を表す。）を表す。）であり、ｌ、ｍ及び
ｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは
硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、
ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ
9はメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチ
ル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基を表す。）で
あるものが特に好ましい。
も、Ｒ1がメチル基又はエチル基であり、Ａ及びＤは、
同一又は相異なって、式：−ＮＲ3−で表される基（式
中、Ｒ3は水素原子；メチル基、エチル基；２−ヨード
エチル基、３−ヨードプロピル基、４−ヨードブチル
基、５−ヨードペンチル基、６−ヨードヘキシル基を表
す。）又は式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式
中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、メチル基、エ
チル基；２−ヨードエチル基、３−ヨードプロピル基、
４−ヨードブチル基、５−ヨードペンチル基、６−ヨー
ドヘキシル基を表す。Ｑはハロゲン原子又は式：Ｒ7Ｓ
Ｏ3で表される基（式中、Ｒ7はメチル基；トリフルオロ
メチル基、トリクロロメチル基；フェニル基、ｐ−メチ
ルフェニル基を表す。）を表す。）であり、ｌ、ｍ及び
ｎは、同一又は相異なって、２〜４の整数であり、Ｚは
硫黄原子であり、Ｘ1及びＸ2は、同一又は相異なって、
ハロゲン原子又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ
9はメチル基；トリフルオロメチル基、トリクロロメチ
ル基；フェニル基、ｐ−メチルフェニル基を表す。）で
あるものが特に好ましい。
【００３５】一般式１で示される化合物は、不斉炭素を
含む化合物も含む。即ち、本願発明の一般式１で示され
る化合物は、光学活性体、ラセミ体、ジアステレオマー
等の各種光学異性体の混合物及びそれらの単離されたも
のを含む。
含む化合物も含む。即ち、本願発明の一般式１で示され
る化合物は、光学活性体、ラセミ体、ジアステレオマー
等の各種光学異性体の混合物及びそれらの単離されたも
のを含む。
【００３６】また、一般式１の化合物にはアミン残基が
存在するが、これらのアミン誘導体は酸付加体を形成す
る場合がある。その結果、一般式１で示される化合物
は、そのような塩、例えば、塩化水素、臭化水素、硫
酸、燐酸等の鉱酸、蟻酸、酢酸、蓚酸、マロン酸、コハ
ク酸、フマール酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石
酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタン
スルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸
等の有機酸等との酸付加体塩を含むものである。また更
には、一般式１で示される化合物は、各種水和物、溶媒
和物や結晶多形の物質も含むものである。
存在するが、これらのアミン誘導体は酸付加体を形成す
る場合がある。その結果、一般式１で示される化合物
は、そのような塩、例えば、塩化水素、臭化水素、硫
酸、燐酸等の鉱酸、蟻酸、酢酸、蓚酸、マロン酸、コハ
ク酸、フマール酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石
酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタン
スルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸
等の有機酸等との酸付加体塩を含むものである。また更
には、一般式１で示される化合物は、各種水和物、溶媒
和物や結晶多形の物質も含むものである。
【００３７】次に、前記一般式１で表される化合物の製
造方法について説明する。本願発明化合物は、種々の方
法により製造できるが、以下の製造方法は例示であっ
て、本願発明の製造方法を限定するものではない。な
お、反応式中において、Ａｃはアセチル基、Ｂｏｃはｔ
−ブトキシカルボニル基を表すものである。
造方法について説明する。本願発明化合物は、種々の方
法により製造できるが、以下の製造方法は例示であっ
て、本願発明の製造方法を限定するものではない。な
お、反応式中において、Ａｃはアセチル基、Ｂｏｃはｔ
−ブトキシカルボニル基を表すものである。
【００３８】第１の製造法は、下記反応式１（式中、Ｒ
1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ、ｎは前記と同一の意味を表
す。Ａ1及びＤ1は、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3
−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル
基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表
す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、
Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又
はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑ
はハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中Ｒ6
は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級ア
ルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式
中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された
低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていても
よいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫
黄原子を表す。）によるものである。
1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ、ｎは前記と同一の意味を表
す。Ａ1及びＤ1は、同一又は相異なって、式：−ＮＲ3
−で表される基（式中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル
基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表
す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、
Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アルキル基又
はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。Ｑ
はハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中Ｒ6
は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級ア
ルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式
中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された
低級アルキル基又は低級アルキル基で置換されていても
よいフェニル基を表す。）を表す。）、酸素原子又は硫
黄原子を表す。）によるものである。
【００３９】前記一般式１の化合物（上記反応式１にお
ける化合物ＩＩ）は、化合物４と化合物５を、ＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホ
キシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あ
るいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０
時間反応することにより製造することが出来る。化合物
４は、化合物３と化合物６を、ＤＭＦ（ジメチルホルム
アミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタ
ノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、
０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応すること
に製造することが出来る。化合物３は、化合物２を臭化
水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成でき
る。化合物２は、相当するジヨード化合物と化合物１を
ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチル
スルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中あるいは
無溶媒で、室温ないし２００℃で、数分から３０時間反
応することで製造することができる。
ける化合物ＩＩ）は、化合物４と化合物５を、ＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホ
キシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あ
るいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０
時間反応することにより製造することが出来る。化合物
４は、化合物３と化合物６を、ＤＭＦ（ジメチルホルム
アミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタ
ノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、
０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応すること
に製造することが出来る。化合物３は、化合物２を臭化
水素、塩化水素等の酸と加熱することにより合成でき
る。化合物２は、相当するジヨード化合物と化合物１を
ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチル
スルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中あるいは
無溶媒で、室温ないし２００℃で、数分から３０時間反
応することで製造することができる。
【００４０】以上、反応式１の製造方法で用いられる塩
基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸
カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリ
エチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミ
ン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸
カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリ
エチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミ
ン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００４１】
【化２】 第２の製造法は、下記反応式２（式中、Ｒ1、Ａ1、
Ｄ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは前記と同一の意味
を表す。）によるものである。
Ｄ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは前記と同一の意味
を表す。）によるものである。
【００４２】前記一般式１の化合物（上記反応式２にお
ける化合物ＩＩ）は、化合物９を臭化水素、塩化水素等
の酸と加熱することにより合成できる。化合物９は、化
合物７と化合物２を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミ
ド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノー
ル等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃
ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにり
製造することが出来る。化合物７は、化合物５と化合物
６を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジ
メチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中あ
るいは無溶媒で、塩基存在下あるいは非存在下、０℃な
いし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより
製造することが出来る。また、化合物９は、化合物１０
と化合物５を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭ
ＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性
溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５
０℃で、数分から３０時間反応することによっても製造
することが出来る。化合物１０は、化合物２と化合物６
を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメ
チルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩
基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数
分から３０時間反応することにより製造することが出来
る。
ける化合物ＩＩ）は、化合物９を臭化水素、塩化水素等
の酸と加熱することにより合成できる。化合物９は、化
合物７と化合物２を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミ
ド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノー
ル等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃
ないし１５０℃で、数分から３０時間反応することにり
製造することが出来る。化合物７は、化合物５と化合物
６を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジ
メチルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中あ
るいは無溶媒で、塩基存在下あるいは非存在下、０℃な
いし１５０℃で、数分から３０時間反応することにより
製造することが出来る。また、化合物９は、化合物１０
と化合物５を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭ
ＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタノール等の極性
溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５
０℃で、数分から３０時間反応することによっても製造
することが出来る。化合物１０は、化合物２と化合物６
を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメ
チルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩
基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数
分から３０時間反応することにより製造することが出来
る。
【００４３】以上、反応式２の製造方法で用いられる塩
基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸
カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリ
エチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミ
ン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸
カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリ
エチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミ
ン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００４４】
【化３】 第３の製造法は、下記反応式３（式中、Ｒ1、Ａ1、
Ｄ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは、前記と同一の意
味を表す。）によるものである。
Ｄ1、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは、前記と同一の意
味を表す。）によるものである。
【００４５】前記一般式１の化合物（上記反応式２にお
ける化合物ＩＩ）は、化合物７と化合物３を、ＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホ
キシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あ
るいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０
時間反応することにより製造することが出来る。以上、
反応式３の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナト
リウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリ
ジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム
等を例示することが出来る。
ける化合物ＩＩ）は、化合物７と化合物３を、ＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホ
キシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あ
るいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０
時間反応することにより製造することが出来る。以上、
反応式３の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナト
リウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリ
ジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム
等を例示することが出来る。
【００４６】
【化４】 第４の製造法は、下記反応式４（式中、Ｒ1、Ｚ、Ｘ1、
Ｘ2、ｌ、ｍ、ｎは前記と同一の意味を表す。Ａ2及びＤ
2は、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される
基（式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、酸素原
子又は硫黄原子を表す。）によるものである。
Ｘ2、ｌ、ｍ、ｎは前記と同一の意味を表す。Ａ2及びＤ
2は、同一又は相異なって、式：−ＣＨＲ2−で表される
基（式中、Ｒ2は水素原子、低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、酸素原
子又は硫黄原子を表す。）によるものである。
【００４７】前記一般式１の化合物（上記反応式２にお
ける化合物ＩＩＩ）は、化合物１４を臭化水素、塩化水
素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１４
は、化合物１３と化合物１を、ＤＭＦ（ジメチルホルム
アミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタ
ノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、
０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応すること
により製造することが出来る。
ける化合物ＩＩＩ）は、化合物１４を臭化水素、塩化水
素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１４
は、化合物１３と化合物１を、ＤＭＦ（ジメチルホルム
アミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はメタ
ノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非存在下、
０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応すること
により製造することが出来る。
【００４８】化合物１３は、４−メチルキノリンから化
合物１２を経て既知の方法に準じて合成出来る。（Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６４，１９９（１９４
２））。
合物１２を経て既知の方法に準じて合成出来る。（Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６４，１９９（１９４
２））。
【００４９】以上、反応式４の製造方法で用いられる塩
基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸
カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリ
エチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミ
ン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸
カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリ
エチルアミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミ
ン、水素化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５０】
【化５】 第５の製造法は、下記反応式５（式中、Ｒ1、Ａ、Ｚ、
Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは前記と同じ意味を表す。Ｄ3
は、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原
子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級
アルキル基を表す。）を表す。Ｄ4は、式：−ＮＲ10−
で表される基（式中、Ｒ10は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−
Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、
同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子
で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原
子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アル
キル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を
表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は
低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキ
ル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニ
ル基を表す。）を表す。）を表す。Ｘ3は、ハロゲン原
子、又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級
アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基
又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基
を表す。）を表す。Ｒ11は、低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）によるも
のである。
Ｘ1、Ｘ2、ｌ、ｍ及びｎは前記と同じ意味を表す。Ｄ3
は、式：−ＮＲ3−で表される基（式中、Ｒ3は水素原
子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級
アルキル基を表す。）を表す。Ｄ4は、式：−ＮＲ10−
で表される基（式中、Ｒ10は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）、式：−
Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基（式中、Ｒ4及びＲ5は、
同一又は相異なって、低級アルキル基又はハロゲン原子
で置換された低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原
子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基（式中、Ｒ6は低級アル
キル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を
表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ7は
低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキ
ル基又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニ
ル基を表す。）を表す。）を表す。Ｘ3は、ハロゲン原
子、又は式：Ｒ9ＳＯ3で表される基（式中、Ｒ9は低級
アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基
又は低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基
を表す。）を表す。Ｒ11は、低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）によるも
のである。
【００５１】前記一般式１の化合物（上記反応式２にお
ける化合物ＩＶ）は、化合物１７を臭化水素、塩化水素
等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１７
は、化合物１６とアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチ
ルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非
存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応
することにより製造することが出来る。以上、反応式５
の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エ
チルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示
することが出来る。
ける化合物ＩＶ）は、化合物１７を臭化水素、塩化水素
等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１７
は、化合物１６とアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチ
ルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非
存在下、０℃ないし１５０℃で、数分から３０時間反応
することにより製造することが出来る。以上、反応式５
の製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エ
チルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示
することが出来る。
【００５２】
【化６】 第６の製造法は、下記反応式６（式中、Ｒ1、Ｒ11、
Ａ、Ｄ3、Ｄ4、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前
記と同じ意味を表す。）によるものである。
Ａ、Ｄ3、Ｄ4、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前
記と同じ意味を表す。）によるものである。
【００５３】前記一般式１の化合物（上記反応式２にお
ける化合物ＩＶ）は、化合物Ｖとアルキル化剤２０を、
ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチル
スルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存
在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で数分から
３０時間反応することにより製造することが出来る。以
上、反応式６の製造方法で用いられる塩基としては、水
酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、
ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリ
ウム等を例示することが出来る。
ける化合物ＩＶ）は、化合物Ｖとアルキル化剤２０を、
ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチル
スルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存
在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で数分から
３０時間反応することにより製造することが出来る。以
上、反応式６の製造方法で用いられる塩基としては、水
酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、
ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素化ナトリ
ウム等を例示することが出来る。
【００５４】
【化７】 第７の製造方法は、下記反応式７（式中、Ｒ1、Ｒ11、
Ｄ、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前記と同一の
意味を表す。Ａ3は、式：−ＮＲ3−で表される基（式
中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子
で置換された低級アルキル基を表す。）を表す。Ａ
4は、式：−ＮＲ10−で表される基（式中、Ｒ10は低級
アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル
基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基
（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アル
キル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を
表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基
（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換
された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表
される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子
で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換
されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）を表
す。）によるものである。
Ｄ、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前記と同一の
意味を表す。Ａ3は、式：−ＮＲ3−で表される基（式
中、Ｒ3は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子
で置換された低級アルキル基を表す。）を表す。Ａ
4は、式：−ＮＲ10−で表される基（式中、Ｒ10は低級
アルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル
基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-−で表される基
（式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異なって、低級アル
キル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基を
表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6ＣＯＯで表される基
（式中、Ｒ6は低級アルキル基又はハロゲン原子で置換
された低級アルキル基を表す。）又は式：Ｒ7ＳＯ3で表
される基（式中、Ｒ7は低級アルキル基、ハロゲン原子
で置換された低級アルキル基又は低級アルキル基で置換
されていてもよいフェニル基を表す。）を表す。）を表
す。）によるものである。
【００５５】前記一般式１の化合物（上記反応式２にお
ける化合物ＶＩＩ）は、化合物１９を臭化水素、塩化水
素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１９
は、化合物１８とアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチ
ルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非
存在下、０℃ないし１５０℃で数分から３０時間反応す
ることにより製造することが出来る。以上、反応式７の
製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エ
チルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示
することが出来る。
ける化合物ＶＩＩ）は、化合物１９を臭化水素、塩化水
素等の酸と加熱することにより合成できる。化合物１９
は、化合物１８とアルキル化剤２０を、ＤＭＦ（ジメチ
ルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
又はメタノール等の極性溶媒中、塩基存在下あるいは非
存在下、０℃ないし１５０℃で数分から３０時間反応す
ることにより製造することが出来る。以上、反応式７の
製造方法で用いられる塩基としては、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、エ
チルジイソプロピルアミン、水素化ナトリウム等を例示
することが出来る。
【００５６】
【化８】 第８の製造方法は、下記反応式８（式中、Ｒ1、Ｒ11、
Ａ3、Ａ4、Ｄ、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前
記と同一の意味を表す。）によるものである。
Ａ3、Ａ4、Ｄ、Ｚ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ｌ、ｍ及びｎは前
記と同一の意味を表す。）によるものである。
【００５７】前記一般式１の化合物（上記反応式２にお
ける化合物ＶＩＩ）は、化合物ＶＩとアルキル化剤２０
を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメ
チルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩
基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数
分から３０時間反応することにより製造することが出来
る。以上、反応式８の製造方法で用いられる塩基として
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチル
アミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素
化ナトリウム等を例示することが出来る。
ける化合物ＶＩＩ）は、化合物ＶＩとアルキル化剤２０
を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメ
チルスルホキシド）又はメタノール等の極性溶媒中、塩
基存在下あるいは非存在下、０℃ないし１５０℃で、数
分から３０時間反応することにより製造することが出来
る。以上、反応式８の製造方法で用いられる塩基として
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチル
アミン、ピリジン、エチルジイソプロピルアミン、水素
化ナトリウム等を例示することが出来る。
【００５８】
【化９】 以上に説明した各反応式中の各工程で得られる生成物
は、必要ならば公知の精製法、例えばクロマトグラフィ
ー、再結晶法、沈殿法又は蒸留法等を、単独又は適宜組
み合わせて行うことにより、精製又は単離する事ができ
る。また、場合によっては、各工程で得られる生成物は
単離精製操作を行わずに次の反応に供することも可能で
ある。
は、必要ならば公知の精製法、例えばクロマトグラフィ
ー、再結晶法、沈殿法又は蒸留法等を、単独又は適宜組
み合わせて行うことにより、精製又は単離する事ができ
る。また、場合によっては、各工程で得られる生成物は
単離精製操作を行わずに次の反応に供することも可能で
ある。
【００５９】一般式１で表わされる化合物は、励起波長
帯が幅広いエチジウムブロマイド（フェニルフェナンス
リジン）誘導体と、６６０ｎｍ付近に蛍光極大を持つチ
アゾール誘導体又は６３０nm付近に極大を持つオキサゾ
ール誘導体をリンカーで結合した構造を有するものであ
る。従って、該化合物に励起光を照射すると、まず、エ
チジウム誘導体が励起される。励起されたエネルギー
は、いわゆる蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって
チアゾール又はオキサゾール誘導体に移動する。そして
この結果励起されたチアゾール又はオキサゾール誘導体
が蛍光を発するのである。
帯が幅広いエチジウムブロマイド（フェニルフェナンス
リジン）誘導体と、６６０ｎｍ付近に蛍光極大を持つチ
アゾール誘導体又は６３０nm付近に極大を持つオキサゾ
ール誘導体をリンカーで結合した構造を有するものであ
る。従って、該化合物に励起光を照射すると、まず、エ
チジウム誘導体が励起される。励起されたエネルギー
は、いわゆる蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって
チアゾール又はオキサゾール誘導体に移動する。そして
この結果励起されたチアゾール又はオキサゾール誘導体
が蛍光を発するのである。
【００６０】エチジウムブロマイドは、５３５ｎｍ付近
に極大吸収波長を持つ化合物であるが、その吸収スペク
トルは、幅広いピークを示す。従って一般式１で表わさ
れる化合物は、幅広い波長で励起することが可能であ
る。チアゾール誘導体等が発する蛍光はシャープなピー
クを有するため、一般式１で表わされる化合物を励起し
た場合には、チアゾール誘導体等が発する該シャープな
ピークの蛍光が観察される。従って、一般式１で表され
る化合物を用いることにより、試料中に含まれると予想
される核酸の有無又は量を測定することが可能となる。
に極大吸収波長を持つ化合物であるが、その吸収スペク
トルは、幅広いピークを示す。従って一般式１で表わさ
れる化合物は、幅広い波長で励起することが可能であ
る。チアゾール誘導体等が発する蛍光はシャープなピー
クを有するため、一般式１で表わされる化合物を励起し
た場合には、チアゾール誘導体等が発する該シャープな
ピークの蛍光が観察される。従って、一般式１で表され
る化合物を用いることにより、試料中に含まれると予想
される核酸の有無又は量を測定することが可能となる。
【００６１】例えば、一般式１の化合物は、二本鎖核酸
と混合することにより、二本鎖核酸の相補鎖間にインタ
ーカレーションし、顕著な蛍光増感を示す（一般式１の
化合物と二本鎖核酸との混合水溶液の蛍光は、一般式１
のみの水溶液の蛍光強度と比較して顕著に大きい）。従
って、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合物が存
在する試料中に添加するだけで、前記核酸の有無を知る
ことができる。また既知量の二本鎖核酸について比較試
験を行えば、試料中に存在する前記核酸の量を定量する
こともできる。
と混合することにより、二本鎖核酸の相補鎖間にインタ
ーカレーションし、顕著な蛍光増感を示す（一般式１の
化合物と二本鎖核酸との混合水溶液の蛍光は、一般式１
のみの水溶液の蛍光強度と比較して顕著に大きい）。従
って、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッドのいずれか一つ、又は、これらの混合物が存
在する試料中に添加するだけで、前記核酸の有無を知る
ことができる。また既知量の二本鎖核酸について比較試
験を行えば、試料中に存在する前記核酸の量を定量する
こともできる。
【００６２】また例えば、一般式１の化合物を、特定の
核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列
に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド
（好ましくはＤＮＡ）と化学結合で結合して核酸プロー
ブとすることができる。該核酸プローブでは、一般式１
の化合物を、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとの
相補結合部分にインターカレーション可能に結合するこ
とが特に好ましい。この核酸プローブは、前記一本鎖オ
リゴヌクレオチドと結合しているため、標的核酸に対す
る十分な特異性を有しており、しかも、試料中の標的核
酸との相補結合部分に一般式１の化合物がインターカレ
ーションし、その結果、顕著な蛍光増感を示すため、標
的核酸と未結合の核酸プローブを除去する操作を行うこ
となく、密閉容器中で標的核酸を測定することが可能と
なる。なお、一般式１の化合物を、標的核酸と一本鎖オ
リゴヌクレオチドとの相補結合部分にインターカレーシ
ョン可能に結合する方法は特に限定されないが、オリゴ
ヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）オリゴマー中のリン
部分から適当なリンカーを介して化学結合させることが
好ましい。ここで、リンカーについても特に限定されな
いが、例えば、アミノ基で修飾したＤＮＡオリゴマー
に、公知の二架橋性リンカーであるＳＰＤＰ（Ｓ-ｐｙ
ｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐａｎｙｌ ｓｕｃｃｉ
ｎｉｍｉｄｅ）を結合しておき、一方で一般式１の化合
物には、ＳＨ基と反応性の官能基を結合した化合物を結
合させておき、両者を反応させる等すればよい。
核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列
に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド
（好ましくはＤＮＡ）と化学結合で結合して核酸プロー
ブとすることができる。該核酸プローブでは、一般式１
の化合物を、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとの
相補結合部分にインターカレーション可能に結合するこ
とが特に好ましい。この核酸プローブは、前記一本鎖オ
リゴヌクレオチドと結合しているため、標的核酸に対す
る十分な特異性を有しており、しかも、試料中の標的核
酸との相補結合部分に一般式１の化合物がインターカレ
ーションし、その結果、顕著な蛍光増感を示すため、標
的核酸と未結合の核酸プローブを除去する操作を行うこ
となく、密閉容器中で標的核酸を測定することが可能と
なる。なお、一般式１の化合物を、標的核酸と一本鎖オ
リゴヌクレオチドとの相補結合部分にインターカレーシ
ョン可能に結合する方法は特に限定されないが、オリゴ
ヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）オリゴマー中のリン
部分から適当なリンカーを介して化学結合させることが
好ましい。ここで、リンカーについても特に限定されな
いが、例えば、アミノ基で修飾したＤＮＡオリゴマー
に、公知の二架橋性リンカーであるＳＰＤＰ（Ｓ-ｐｙ
ｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐａｎｙｌ ｓｕｃｃｉ
ｎｉｍｉｄｅ）を結合しておき、一方で一般式１の化合
物には、ＳＨ基と反応性の官能基を結合した化合物を結
合させておき、両者を反応させる等すればよい。
【００６３】前記本願発明の核酸プローブは、標的ＲＮ
Ａの増幅工程を行う際に反応液中に共存させることが可
能である。従って、この核酸プローブを用いれば、標的
ＲＮＡの増幅から測定までを、密閉容器中で、一段階で
行うこと（最初に必要な試薬を容器中に投入することに
より、後に試薬を加えたり、不要な試薬を除去する操作
を行うことなく標的ＲＮＡの測定を行うこと）が可能で
ある。ここで、増幅工程自体は、例えば特許第２６５０
１５９号公報に記載されたもの、例えば欧州公開特許第
３７３９６０号公報に記載されたもの、そして更には、
例えば特開平８−２１１０５０号公報に記載されたもの
を採用することができる。
Ａの増幅工程を行う際に反応液中に共存させることが可
能である。従って、この核酸プローブを用いれば、標的
ＲＮＡの増幅から測定までを、密閉容器中で、一段階で
行うこと（最初に必要な試薬を容器中に投入することに
より、後に試薬を加えたり、不要な試薬を除去する操作
を行うことなく標的ＲＮＡの測定を行うこと）が可能で
ある。ここで、増幅工程自体は、例えば特許第２６５０
１５９号公報に記載されたもの、例えば欧州公開特許第
３７３９６０号公報に記載されたもの、そして更には、
例えば特開平８−２１１０５０号公報に記載されたもの
を採用することができる。
【００６４】一般式１の化合物の蛍光スペクトルは、従
来公知のインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾ
ールイエローの蛍光スペクトルと重なり合わない。この
ように、一般式１の化合物と、これとは蛍光スペクトル
が重なり合わない従来公知のインターカレーター性蛍光
色素を用いることにより、従来は困難であった二種類以
上の標的ＲＮＡの測定等が可能になる。オキサゾールイ
エローは、４８８ｎｍに吸収極大、５１０ｎｍに蛍光極
大を持つことが知られている。これに対して一般式１の
化合物もまた４８８ｎｍで励起することが可能である
が、その蛍光は６６０ｎｍに極大を持つスペクトルとし
て観察され、両者の蛍光極大波長には１５０ｎｍの差が
あるために互いの蛍光スペクトルは重なり合わない。ま
た一般式１の化合物とオキサゾールイエローの組み合わ
せでは、ともに４７０ｎｍ付近で励起することが出来る
ため、励起光源として、安価で、小型の発光ダイオード
共用できるという利点もある。
来公知のインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾ
ールイエローの蛍光スペクトルと重なり合わない。この
ように、一般式１の化合物と、これとは蛍光スペクトル
が重なり合わない従来公知のインターカレーター性蛍光
色素を用いることにより、従来は困難であった二種類以
上の標的ＲＮＡの測定等が可能になる。オキサゾールイ
エローは、４８８ｎｍに吸収極大、５１０ｎｍに蛍光極
大を持つことが知られている。これに対して一般式１の
化合物もまた４８８ｎｍで励起することが可能である
が、その蛍光は６６０ｎｍに極大を持つスペクトルとし
て観察され、両者の蛍光極大波長には１５０ｎｍの差が
あるために互いの蛍光スペクトルは重なり合わない。ま
た一般式１の化合物とオキサゾールイエローの組み合わ
せでは、ともに４７０ｎｍ付近で励起することが出来る
ため、励起光源として、安価で、小型の発光ダイオード
共用できるという利点もある。
【００６５】上記した、一般式１の化合物と従来公知の
インターカレーター性蛍光色素を使用する測定法は、両
色素を一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）
に結合した核酸プローブを用いるものである。具体的に
は、試料中に含まれる二種類以上の特定核酸配列を有す
るＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を同時に増幅する工程を、各々
の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカ
レーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じ
させ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にイ
ンターカレーター性蛍光色素がインターカレートするこ
とにより変化した蛍光強度を測定することからなる。こ
こで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１
で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、
かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター
性蛍光色素の組み合わせである。また具体的には、試料
中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有す
るＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該試
料に既知量の標準核酸（標準核酸は、標的ＲＮＡとは配
列が異なる）を添加し、標的ＲＮＡと標準核酸を同時に
増幅する工程を、各々の増幅産物に相補的な配列を有す
る、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識された
プローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成
する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がイ
ンターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定
し、別途測定した既知量の標準核酸について、同様の試
薬を用いて同様の測定を行ったときの蛍光強度（増幅工
程の進行に伴う蛍光強度の増大を示した増幅曲線）等と
比較することからなる。ここで該インターカレーター性
蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合
物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起さ
れ得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせであ
る。これら測定法は、血清、血漿、体液、尿、糞便、等
の生物学的試料、更には食品、室内、土壌、河川水、海
水等の環境中の微生物を含むと予想される試料や、これ
らから核酸成分を抽出した抽出試料について実施可能で
ある。
インターカレーター性蛍光色素を使用する測定法は、両
色素を一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）
に結合した核酸プローブを用いるものである。具体的に
は、試料中に含まれる二種類以上の特定核酸配列を有す
るＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を同時に増幅する工程を、各々
の増幅産物に相補的な配列を有する、異なるインターカ
レーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じ
させ、増幅産物とプローブが形成する相補結合部分にイ
ンターカレーター性蛍光色素がインターカレートするこ
とにより変化した蛍光強度を測定することからなる。こ
こで該インターカレーター性蛍光色素は、前記一般式１
で表される化合物と、該化合物とは蛍光波長が異なり、
かつ、同一の波長帯で励起され得るインターカレーター
性蛍光色素の組み合わせである。また具体的には、試料
中に含まれる少なくとも一つ以上の特定核酸配列を有す
るＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であって、該試
料に既知量の標準核酸（標準核酸は、標的ＲＮＡとは配
列が異なる）を添加し、標的ＲＮＡと標準核酸を同時に
増幅する工程を、各々の増幅産物に相補的な配列を有す
る、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識された
プローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブが形成
する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色素がイ
ンターカレートすることにより変化した蛍光強度を測定
し、別途測定した既知量の標準核酸について、同様の試
薬を用いて同様の測定を行ったときの蛍光強度（増幅工
程の進行に伴う蛍光強度の増大を示した増幅曲線）等と
比較することからなる。ここで該インターカレーター性
蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合
物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起さ
れ得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせであ
る。これら測定法は、血清、血漿、体液、尿、糞便、等
の生物学的試料、更には食品、室内、土壌、河川水、海
水等の環境中の微生物を含むと予想される試料や、これ
らから核酸成分を抽出した抽出試料について実施可能で
ある。
【００６６】増幅の方法は限定的ではないが、ＲＮＡを
原料として、ＲＮＡを産生する反応が、概ね一定温度で
進行する方法が好ましい。
原料として、ＲＮＡを産生する反応が、概ね一定温度で
進行する方法が好ましい。
【００６７】前記したように、従来公知のインターカレ
ーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローは、一般
式１の化合物と同一波長帯で励起可能で、かつ、蛍光波
長が異なるため、前記測定法を実施するうえで好ましい
インターカレーター性蛍光色素として例示できる。一般
式１の化合物とオキサゾールイエローを組み合わせて使
用する場合には、４５０から５００ｎｍの励起波長を用
いれば、単一の励起光源で両者を同時に励起できるとい
う利点もある。
ーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローは、一般
式１の化合物と同一波長帯で励起可能で、かつ、蛍光波
長が異なるため、前記測定法を実施するうえで好ましい
インターカレーター性蛍光色素として例示できる。一般
式１の化合物とオキサゾールイエローを組み合わせて使
用する場合には、４５０から５００ｎｍの励起波長を用
いれば、単一の励起光源で両者を同時に励起できるとい
う利点もある。
【００６８】前記測定法のうち、同時に二種類以上の標
的核酸を測定する測定法では、例えば複数のウイルス、
微生物等に由来する複数のＲＮＡ、一つのＲＮＡ上の複
数の特定の配列を標的核酸とすることで、短時間のうち
にこれらの有無や存在量を測定することが可能となる。
また前記測定法のうち、試料に既知量の標準核酸を加
え、標的核酸と標準核酸を同時に増幅し測定する前記測
定法では、標的核酸が存在しているにもかかわらず、増
幅反応が、例えば反応用酵素の失活、基質及びプライマ
ー類の分解等の理由で進行しないために測定できないと
いう、いわゆる偽陰性の問題を回避して、高い信頼性が
要求される臨床診断に適用可能な測定法を提供すること
ができる。なお標準核酸を試料に直接添加した後、該試
料から核酸成分を抽出した抽出試料を増幅反応に供する
ことにより、増幅反応の正否のみならず、抽出工程の正
否及び効率を決定することも可能である。
的核酸を測定する測定法では、例えば複数のウイルス、
微生物等に由来する複数のＲＮＡ、一つのＲＮＡ上の複
数の特定の配列を標的核酸とすることで、短時間のうち
にこれらの有無や存在量を測定することが可能となる。
また前記測定法のうち、試料に既知量の標準核酸を加
え、標的核酸と標準核酸を同時に増幅し測定する前記測
定法では、標的核酸が存在しているにもかかわらず、増
幅反応が、例えば反応用酵素の失活、基質及びプライマ
ー類の分解等の理由で進行しないために測定できないと
いう、いわゆる偽陰性の問題を回避して、高い信頼性が
要求される臨床診断に適用可能な測定法を提供すること
ができる。なお標準核酸を試料に直接添加した後、該試
料から核酸成分を抽出した抽出試料を増幅反応に供する
ことにより、増幅反応の正否のみならず、抽出工程の正
否及び効率を決定することも可能である。
【００６９】
【発明の実施の形態】以下、本願発明を実施例により更
に詳細に説明するが、これらの実施例は本願発明の一例
であり、本願発明を限定するものではない。
に詳細に説明するが、これらの実施例は本願発明の一例
であり、本願発明を限定するものではない。
【００７０】実施例１ 以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この
反応工程を下記反応式９に示す。 （１）反応式９中の化合物１の合成 ３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジン
（１．２ｇ）の酢酸（７ｍｌ）溶液に、無水酢酸（３．
３ｍｌ）を加え、１．５時間撹拌した。水（２６ｍｌ）
を加えた後、氷冷下、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）
を滴下した。生じた固体を減圧濾過後、水洗し乾燥し
た。得られた粗生成物を熱エタノールに溶かし、室温下
放置した。生じた固体を濾過して、目的とする化合物１
を０．７８ｇ得た。
反応工程を下記反応式９に示す。 （１）反応式９中の化合物１の合成 ３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナンスリジン
（１．２ｇ）の酢酸（７ｍｌ）溶液に、無水酢酸（３．
３ｍｌ）を加え、１．５時間撹拌した。水（２６ｍｌ）
を加えた後、氷冷下、２８％アンモニア水（２０ｍｌ）
を滴下した。生じた固体を減圧濾過後、水洗し乾燥し
た。得られた粗生成物を熱エタノールに溶かし、室温下
放置した。生じた固体を濾過して、目的とする化合物１
を０．７８ｇ得た。
【００７１】なお化合物１は淡褐色固体であり、ＮＭＲ
測定において下記のような特性を示した。
測定において下記のような特性を示した。
【００７２】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） ２．０５（ｂｓ、３Ｈ）、２．１３（ｂｓ、３Ｈ）、
７．４２−７．９５（ｍ、６Ｈ） ８．１０−８．５０（ｍ、３Ｈ）、８．５５−８．８２
（ｍ、２Ｈ） １０．３０（ｂｓ、２Ｈ） （２）反応式９中の化合物２の合成 得られた化合物１（５００ｍｇ）を１，３−ジヨードプ
ロパン（１０ｍｌ）に懸濁し、１５５℃で６時間撹拌し
た。放冷後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生
成物を熱メタノールに溶かし、室温下放置した。生じた
固体を濾過して、目的とする化合物２を３２０ｍｇ得
た。
ｄ６、δｐｐｍ） ２．０５（ｂｓ、３Ｈ）、２．１３（ｂｓ、３Ｈ）、
７．４２−７．９５（ｍ、６Ｈ） ８．１０−８．５０（ｍ、３Ｈ）、８．５５−８．８２
（ｍ、２Ｈ） １０．３０（ｂｓ、２Ｈ） （２）反応式９中の化合物２の合成 得られた化合物１（５００ｍｇ）を１，３−ジヨードプ
ロパン（１０ｍｌ）に懸濁し、１５５℃で６時間撹拌し
た。放冷後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生
成物を熱メタノールに溶かし、室温下放置した。生じた
固体を濾過して、目的とする化合物２を３２０ｍｇ得
た。
【００７３】なお化合物２は淡褐色固体であり、ＮＭＲ
測定において下記のような特性を示した。
測定において下記のような特性を示した。
【００７４】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） ２．０２（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、２．３
６−２．４５（ｍ、２Ｈ） ３．２６（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．３３
（ｓ、３Ｈ） ４．６７（ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．７２−
７．８２（ｍ、５Ｈ） ７．８８（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．１２（ｄｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ） ８．４２（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ） ８．９２（ｓ、１Ｈ）、９．０３（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈ
ｚ、１Ｈ） ９．０９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、１０．５
（ｓ、１Ｈ）、１０．８（ｓ、１Ｈ） （３）反応式９中の化合物４の合成 まず、既知の方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６
４，１９９（１９４２））に準じて化合物３を合成し
た。化合物３（７４ｍｇ）のＤＭＦ（０．５ｍｌ）溶液
に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−１，３−プロパンジア
ミン（０．２ｍｌ）を加え、室温下１時間撹拌した。反
応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物を
カラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮ
Ｈ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）
製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で
精製し、目的とする化合物４を６０ｍｇ得た。
ｄ６、δｐｐｍ） ２．０２（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、２．３
６−２．４５（ｍ、２Ｈ） ３．２６（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．３３
（ｓ、３Ｈ） ４．６７（ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．７２−
７．８２（ｍ、５Ｈ） ７．８８（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．１２（ｄｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ） ８．４２（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ） ８．９２（ｓ、１Ｈ）、９．０３（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈ
ｚ、１Ｈ） ９．０９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、１０．５
（ｓ、１Ｈ）、１０．８（ｓ、１Ｈ） （３）反応式９中の化合物４の合成 まず、既知の方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６
４，１９９（１９４２））に準じて化合物３を合成し
た。化合物３（７４ｍｇ）のＤＭＦ（０．５ｍｌ）溶液
に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−１，３−プロパンジア
ミン（０．２ｍｌ）を加え、室温下１時間撹拌した。反
応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物を
カラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮ
Ｈ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）
製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で
精製し、目的とする化合物４を６０ｍｇ得た。
【００７５】なお化合物４はＮＭＲ測定において下記の
ような特性を示した。
ような特性を示した。
【００７６】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．４８−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．９２−２．０１
（ｍ、２Ｈ）、２．１１（ｓ、６Ｈ） ２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．１９（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈ
ｚ、２Ｈ） ２．２８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３４
（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ） ３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．４７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ、２Ｈ） ６．４９（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．１１
（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ） ７．３１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９
（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．５９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１
（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ） ７．８４（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８
（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．９５（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．０９
（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．１５（ｔ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３９
（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．４７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ） （４）一般式１の化合物（反応式９中の「化合物１」）
の合成 化合物４（２０ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に化合物
２（２２ｍｇ）を加え、１３０℃で１時間撹拌した。反
応後、真空ポンプで減圧濃縮し、粗生成物５を得た。得
られた粗生成物５を４７％臭化水素水に溶かし、１７０
℃で１時間撹拌した。反応後、減圧濃縮し、得られた粗
生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリ
カゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学
（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９／
１）で精製し、目的とする一般式１の化合物を６ｍｇ得
た。
ｄ６、δｐｐｍ） １．４８−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．９２−２．０１
（ｍ、２Ｈ）、２．１１（ｓ、６Ｈ） ２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．１９（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈ
ｚ、２Ｈ） ２．２８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３４
（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ） ３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．４７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ、２Ｈ） ６．４９（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．１１
（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ） ７．３１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９
（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．５９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１
（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ） ７．８４（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８
（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．９５（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．０９
（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．１５（ｔ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３９
（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．４７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ） （４）一般式１の化合物（反応式９中の「化合物１」）
の合成 化合物４（２０ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に化合物
２（２２ｍｇ）を加え、１３０℃で１時間撹拌した。反
応後、真空ポンプで減圧濃縮し、粗生成物５を得た。得
られた粗生成物５を４７％臭化水素水に溶かし、１７０
℃で１時間撹拌した。反応後、減圧濃縮し、得られた粗
生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリ
カゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学
（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９／
１）で精製し、目的とする一般式１の化合物を６ｍｇ得
た。
【００７７】なお一般式１の化合物（反応式９中の「化
合物１」）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示
した。
合物１」）はＮＭＲ測定において下記のような特性を示
した。
【００７８】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．７９−１．９０（ｍ、２Ｈ）、１．９２−２．０１
（ｍ、２Ｈ） ２．０５−２．１４（ｍ、２Ｈ）、２．１５（ｓ、３
Ｈ）、２．２３−２．４２（ｍ、８Ｈ） ３．０４（ｓ、６Ｈ）、３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．３
５−４．４５（ｍ、２Ｈ） ４．５２−４．６０（ｍ、２Ｈ）、５．９１（ｓ、１
Ｈ）、６．２２（ｓ、１Ｈ） ６．４２（ｄ、１Ｈ）、６．５４（ｓ、１Ｈ）、７．０
４（ｄ、１Ｈ）、７．２０（ｄ、１Ｈ） ７．３１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５−
８．１５（ｍ、１３Ｈ） ８．３２（ｄ、１Ｈ）、８．４２（ｄ、１Ｈ）、８．５
４（ｄ、２Ｈ）
ｄ６、δｐｐｍ） １．７９−１．９０（ｍ、２Ｈ）、１．９２−２．０１
（ｍ、２Ｈ） ２．０５−２．１４（ｍ、２Ｈ）、２．１５（ｓ、３
Ｈ）、２．２３−２．４２（ｍ、８Ｈ） ３．０４（ｓ、６Ｈ）、３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．３
５−４．４５（ｍ、２Ｈ） ４．５２−４．６０（ｍ、２Ｈ）、５．９１（ｓ、１
Ｈ）、６．２２（ｓ、１Ｈ） ６．４２（ｄ、１Ｈ）、６．５４（ｓ、１Ｈ）、７．０
４（ｄ、１Ｈ）、７．２０（ｄ、１Ｈ） ７．３１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５−
８．１５（ｍ、１３Ｈ） ８．３２（ｄ、１Ｈ）、８．４２（ｄ、１Ｈ）、８．５
４（ｄ、２Ｈ）
【００７９】
【化１０】 実施例２ 以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この
反応工程を下記反応式１０に示す。 （１）反応式１０中の化合物６の合成 前記化合物２（２０６ｍｇ）を４７％ＨＢｒ水溶液（６
ｍｌ）に溶かし、１．５時間撹拌した。放冷後、減圧濃
縮した。得られた粗生成物を酢酸エチル（１０ｍｌ）に
懸濁した後、生じた固体を濾過して、目的とする化合物
６を２１５ｍｇ得た。
反応工程を下記反応式１０に示す。 （１）反応式１０中の化合物６の合成 前記化合物２（２０６ｍｇ）を４７％ＨＢｒ水溶液（６
ｍｌ）に溶かし、１．５時間撹拌した。放冷後、減圧濃
縮した。得られた粗生成物を酢酸エチル（１０ｍｌ）に
懸濁した後、生じた固体を濾過して、目的とする化合物
６を２１５ｍｇ得た。
【００８０】なお化合物６はＮＭＲ測定において下記の
ような特性を示した。
ような特性を示した。
【００８１】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） ２．３３−２．４３（ｍ、２Ｈ）、３．５６（ｔ、Ｊ＝
６．０Ｈｚ、２Ｈ） ４．５７（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．４６
（ｓ、１Ｈ） ７．３８（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５
（ｓ、１Ｈ） ７．６２（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．６８−７．７４（ｍ、２Ｈ）、７．７４−７．８０
（ｍ、３Ｈ） ８．６８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．７１
（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ） （２）反応式１０中の化合物７の合成 前記化合物３（１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．７ｍｌ）溶液
にＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン
（０．１５ｍｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。反応
後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカ
ラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ
−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；
展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製
し、目的とする化合物７を１２ｍｇ得た。
ｄ６、δｐｐｍ） ２．３３−２．４３（ｍ、２Ｈ）、３．５６（ｔ、Ｊ＝
６．０Ｈｚ、２Ｈ） ４．５７（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．４６
（ｓ、１Ｈ） ７．３８（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５
（ｓ、１Ｈ） ７．６２（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．６８−７．７４（ｍ、２Ｈ）、７．７４−７．８０
（ｍ、３Ｈ） ８．６８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．７１
（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ） （２）反応式１０中の化合物７の合成 前記化合物３（１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．７ｍｌ）溶液
にＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン
（０．１５ｍｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。反応
後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカ
ラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ
−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；
展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製
し、目的とする化合物７を１２ｍｇ得た。
【００８２】なお化合物７はＮＭＲ測定において下記の
ような特性を示した。
ような特性を示した。
【００８３】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．６６−１．７６（ｍ、２Ｈ）、１．９９−２．０７
（ｍ、２Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ） ２．４１（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．４７
（ｓ、３Ｈ） ２．６６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０
（ｓ、３Ｈ） ４．５２（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．５７
（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ） ７．０１−７．０７（ｍ、２Ｈ）、７．１４（ｔ、Ｊ＝
７．５Ｈｚ、１Ｈ） ７．３０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４８−
７．５５（ｍ、２Ｈ） ７．６２（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−
７．７４（ｍ、２Ｈ） ７．８８（ｔ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４
（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．５５（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ） （３）一般式１の化合物（反応式１０中の「化合物
２」）の合成 化合物７（１２ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に、Ｎ−
エチルジイソプロピルアミン（０．０７ｍｌ）及び化合
物６（１４ｍｇ）を加え、７０℃で２時間撹拌した。反
応後、真空ポンプで減圧濃縮した。
ｄ６、δｐｐｍ） １．６６−１．７６（ｍ、２Ｈ）、１．９９−２．０７
（ｍ、２Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ） ２．４１（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．４７
（ｓ、３Ｈ） ２．６６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０
（ｓ、３Ｈ） ４．５２（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．５７
（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ） ７．０１−７．０７（ｍ、２Ｈ）、７．１４（ｔ、Ｊ＝
７．５Ｈｚ、１Ｈ） ７．３０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４８−
７．５５（ｍ、２Ｈ） ７．６２（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−
７．７４（ｍ、２Ｈ） ７．８８（ｔ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４
（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．５５（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ） （３）一般式１の化合物（反応式１０中の「化合物
２」）の合成 化合物７（１２ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に、Ｎ−
エチルジイソプロピルアミン（０．０７ｍｌ）及び化合
物６（１４ｍｇ）を加え、７０℃で２時間撹拌した。反
応後、真空ポンプで減圧濃縮した。
【００８４】得られた粗生成物をカラムクロマトグラフ
ィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商
品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホル
ム／メタノール＝９７／３）で精製し、目的とする一般
式１の化合物を４ｍｇ得た。
ィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商
品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶媒クロロホル
ム／メタノール＝９７／３）で精製し、目的とする一般
式１の化合物を４ｍｇ得た。
【００８５】なお一般式１の化合物（反応式１０中の
「化合物２」）はＮＭＲ測定において下記のような特性
を示した。
「化合物２」）はＮＭＲ測定において下記のような特性
を示した。
【００８６】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．３０−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．８８（ｓ、３
Ｈ）、１．９１−２．０１（ｍ、４Ｈ） ２．０７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．１１
（ｓ、３Ｈ） ２．１４（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）２．２８（ｔ、
２Ｈ） ２．３３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．３１−
４．３８（ｍ、２Ｈ） ４．５５（ｔ、２Ｈ）、５．９２（ｓ、１Ｈ）、６．２
２（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ） ６．３６（ｓ、１Ｈ）、６．４３（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈ
ｚ、１Ｈ） ７．０５（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．２３−
７．３３（ｍ、３Ｈ） ７．４６−７．５３（ｍ、２Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝
８．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．６３−７．７３（ｍ、４Ｈ）、７．８１（ｔ、Ｊ＝
８．５Ｈｚ、２Ｈ） ７．９３（ｔ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０７
（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．１０（ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３５
（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．４３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５３
（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．５８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
ｄ６、δｐｐｍ） １．３０−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．８８（ｓ、３
Ｈ）、１．９１−２．０１（ｍ、４Ｈ） ２．０７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．１１
（ｓ、３Ｈ） ２．１４（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）２．２８（ｔ、
２Ｈ） ２．３３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．３１−
４．３８（ｍ、２Ｈ） ４．５５（ｔ、２Ｈ）、５．９２（ｓ、１Ｈ）、６．２
２（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ） ６．３６（ｓ、１Ｈ）、６．４３（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈ
ｚ、１Ｈ） ７．０５（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．２３−
７．３３（ｍ、３Ｈ） ７．４６−７．５３（ｍ、２Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝
８．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．６３−７．７３（ｍ、４Ｈ）、７．８１（ｔ、Ｊ＝
８．５Ｈｚ、２Ｈ） ７．９３（ｔ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０７
（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．１０（ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．３５
（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．４３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５３
（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ） ８．５８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
【００８７】
【化１１】 実施例３ 以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この
反応工程を下記反応式１１に示す。 （１）反応式１１中の化合物８の合成 前記化合物６（１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．７ｍｌ）溶液
にＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン
（０．１５ｍｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。反応
後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカ
ラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ
−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；
展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製
し、目的とする化合物８を９ｍｇ得た。
反応工程を下記反応式１１に示す。 （１）反応式１１中の化合物８の合成 前記化合物６（１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．７ｍｌ）溶液
にＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン
（０．１５ｍｌ）を加え、室温下３時間撹拌した。反応
後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生成物をカ
ラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ
−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；
展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製
し、目的とする化合物８を９ｍｇ得た。
【００８８】なお化合物８はＮＭＲ測定において下記の
ような特性を示した。
ような特性を示した。
【００８９】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．３８（ｔ、２Ｈ）、１．８５−２．００（ｍ、５
Ｈ）、２．１０−２．１８（ｍ、２Ｈ） ２．２０−２．３８（ｍ、７Ｈ）、４．４０（ｔ、２
Ｈ）、５．９４（ｓ、１Ｈ） ６．２７（ｓ、１Ｈ）、６．４１（ｓ、１Ｈ）、７．２
８−７．３６（ｍ、２Ｈ） ７．５１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−
７．７８（ｍ、３Ｈ） ８．５９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４
（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ） （２）一般式１の化合物（反応式１１中の「化合物
２」）の合成 化合物８（９ｍｇ）のＤＭＦ（１．２ｍｌ）溶液に、前
記化合物３（１０ｍｇ）を加え、７０℃で２時間撹拌し
た。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生
成物５をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリ
カゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学
（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９７／
３）で精製し、目的とする一般式１の化合物（反応式１
１中の「化合物２」）を５ｍｇ得た。
ｄ６、δｐｐｍ） １．３８（ｔ、２Ｈ）、１．８５−２．００（ｍ、５
Ｈ）、２．１０−２．１８（ｍ、２Ｈ） ２．２０−２．３８（ｍ、７Ｈ）、４．４０（ｔ、２
Ｈ）、５．９４（ｓ、１Ｈ） ６．２７（ｓ、１Ｈ）、６．４１（ｓ、１Ｈ）、７．２
８−７．３６（ｍ、２Ｈ） ７．５１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５−
７．７８（ｍ、３Ｈ） ８．５９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４
（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ） （２）一般式１の化合物（反応式１１中の「化合物
２」）の合成 化合物８（９ｍｇ）のＤＭＦ（１．２ｍｌ）溶液に、前
記化合物３（１０ｍｇ）を加え、７０℃で２時間撹拌し
た。反応後、真空ポンプで減圧濃縮した。得られた粗生
成物５をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリ
カゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学
（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９７／
３）で精製し、目的とする一般式１の化合物（反応式１
１中の「化合物２」）を５ｍｇ得た。
【００９０】
【化１２】 実施例４ 以下に示す方法で、一般式１の化合物を製造した。この
反応工程を下記反応式１２に示す。 （１）反応式１２中の化合物１０の合成 Ｎ−メチル−１，３−プロパンジアミン（２ｇ）と二炭
酸ジ−ｔ−ブチル（１．１ｇ）をメタノール（１６ｍ
ｌ）に溶解し、室温下１時間撹拌した。減圧濃縮後、得
られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
で精製することにより目的とする化合物１０を１４０ｍ
ｇ得た。
反応工程を下記反応式１２に示す。 （１）反応式１２中の化合物１０の合成 Ｎ−メチル−１，３−プロパンジアミン（２ｇ）と二炭
酸ジ−ｔ−ブチル（１．１ｇ）をメタノール（１６ｍ
ｌ）に溶解し、室温下１時間撹拌した。減圧濃縮後、得
られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
で精製することにより目的とする化合物１０を１４０ｍ
ｇ得た。
【００９１】なお化合物１０はＮＭＲ測定において下記
のような特性を示した。
のような特性を示した。
【００９２】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ
３、δｐｐｍ） １．４４（ｓ、９Ｈ）、１．７０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ、２Ｈ）２．４４（ｓ、３Ｈ） ２．６６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．１７−
３．２４（ｍ、２Ｈ） ３．１７−３．２４（ｍ、２Ｈ）、３．４２（ｂｓ、１
Ｈ）、５．０８（ｂｓ、１Ｈ） （２）反応式１２中の化合物１１の合成 得られた化合物１０（１４０ｍｇ）と前記化合物６（４
０ｍｇ）をＤＭＦ（１．８ｍｌ）に溶解し、室温下３時
間撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をカラムク
ロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ
１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶
媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製するこ
とにより目的とする化合物１１を２９ｍｇ得た。
３、δｐｐｍ） １．４４（ｓ、９Ｈ）、１．７０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ、２Ｈ）２．４４（ｓ、３Ｈ） ２．６６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．１７−
３．２４（ｍ、２Ｈ） ３．１７−３．２４（ｍ、２Ｈ）、３．４２（ｂｓ、１
Ｈ）、５．０８（ｂｓ、１Ｈ） （２）反応式１２中の化合物１１の合成 得られた化合物１０（１４０ｍｇ）と前記化合物６（４
０ｍｇ）をＤＭＦ（１．８ｍｌ）に溶解し、室温下３時
間撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をカラムク
ロマトグラフィー（アミノ基修飾シリカゲルＮＨ−ＤＭ
１０２０、商品名、富士シリシア化学（株）製；展開溶
媒クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製するこ
とにより目的とする化合物１１を２９ｍｇ得た。
【００９３】なお化合物１１はＮＭＲ測定において下記
のような特性を示した。
のような特性を示した。
【００９４】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．３４−１．４２（ｍ、５Ｈ）、１．９０（ｓ、３
Ｈ）、１．９１−１．９８（ｍ、２Ｈ） ２．１０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．２８
（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ） ２．８３（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．３６（ｂ
ｓ、１Ｈ） ４．３７−４．４５（ｍ、２Ｈ）、５．９３（ｓ、１
Ｈ）、６．２７（ｓ、１Ｈ） ６．４０（ｓ、１Ｈ）、７．３０−７．３８（ｍ、２
Ｈ） ７．５２（ｄｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１
Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、３Ｈ） ８．５９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．６５
（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ） （３）反応式１２中の化合物１２の合成 得られた化合物１１（２９ｍｇ）をメタノール（２ｍ
ｌ）に溶かし、４７％ＨＢｒ水溶液（１ｍｌ）を加え
た。室温下１時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた
粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シ
リカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化
学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５
／５）で精製し、目的とする化合物１２を１５ｍｇ得
た。
ｄ６、δｐｐｍ） １．３４−１．４２（ｍ、５Ｈ）、１．９０（ｓ、３
Ｈ）、１．９１−１．９８（ｍ、２Ｈ） ２．１０（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．２８
（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ） ２．８３（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．３６（ｂ
ｓ、１Ｈ） ４．３７−４．４５（ｍ、２Ｈ）、５．９３（ｓ、１
Ｈ）、６．２７（ｓ、１Ｈ） ６．４０（ｓ、１Ｈ）、７．３０−７．３８（ｍ、２
Ｈ） ７．５２（ｄｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、９．０Ｈｚ、１
Ｈ）、７．６５−７．８０（ｍ、３Ｈ） ８．５９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．６５
（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ） （３）反応式１２中の化合物１２の合成 得られた化合物１１（２９ｍｇ）をメタノール（２ｍ
ｌ）に溶かし、４７％ＨＢｒ水溶液（１ｍｌ）を加え
た。室温下１時間撹拌した後、減圧濃縮した。得られた
粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シ
リカゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化
学（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５
／５）で精製し、目的とする化合物１２を１５ｍｇ得
た。
【００９５】なお化合物１２はＮＭＲ測定において下記
のような特性を示した。
のような特性を示した。
【００９６】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．２９−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．８０−２．０１
（ｍ、４Ｈ） ２．１３（ｔ、２Ｈ）、２．２２−２．３５（ｍ、５
Ｈ） ４．３５−４．４８（ｍ、２Ｈ）、５．９４（ｓ、１
Ｈ）、６．２６（ｓ、１Ｈ） ６．４３（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３５（ｍ、２
Ｈ） ７．４８−７．５２（ｍ、１Ｈ）、７．６８−７．８０
（ｍ、３Ｈ） ８．５７−８．６７（ｍ、２Ｈ） （４）一般式１の化合物（反応式１２中の「化合物
３」）の合成 化合物１２（１５ｍｇ）及び前記化合物３（１９ｍｇ）
を、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶かし、室温下で２３時間
反応した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮、得られた粗
生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリ
カゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学
（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／
５）で精製し、目的とする一般式１の化合物３を６ｍｇ
得た。
ｄ６、δｐｐｍ） １．２９−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．８０−２．０１
（ｍ、４Ｈ） ２．１３（ｔ、２Ｈ）、２．２２−２．３５（ｍ、５
Ｈ） ４．３５−４．４８（ｍ、２Ｈ）、５．９４（ｓ、１
Ｈ）、６．２６（ｓ、１Ｈ） ６．４３（ｓ、１Ｈ）、７．２６−７．３５（ｍ、２
Ｈ） ７．４８−７．５２（ｍ、１Ｈ）、７．６８−７．８０
（ｍ、３Ｈ） ８．５７−８．６７（ｍ、２Ｈ） （４）一般式１の化合物（反応式１２中の「化合物
３」）の合成 化合物１２（１５ｍｇ）及び前記化合物３（１９ｍｇ）
を、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶かし、室温下で２３時間
反応した。反応後、真空ポンプで減圧濃縮、得られた粗
生成物をカラムクロマトグラフィー（アミノ基修飾シリ
カゲルＮＨ−ＤＭ１０２０、商品名、富士シリシア化学
（株）製；展開溶媒クロロホルム／メタノール＝９５／
５）で精製し、目的とする一般式１の化合物３を６ｍｇ
得た。
【００９７】なお一般式１の化合物（反応式１２中の
「化合物３」）はＮＭＲ測定において下記のような特性
を示した。
「化合物３」）はＮＭＲ測定において下記のような特性
を示した。
【００９８】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．３８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．８３−
２．０５（ｍ、９Ｈ） ２．１１（ｔ、７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．２４−２．３
３（ｍ、２Ｈ） ２．３６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２
（ｓ、３Ｈ） ４．３１−４．４１（ｍ、２Ｈ）、４．６０（ｔ、Ｊ＝
７．０Ｈｚ、２Ｈ） ５．９４（ｓ、１Ｈ）、６．２３（ｓ、１Ｈ）、６．３
８（ｓ、１Ｈ） ６．４６（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．０９
（ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．２４−７．３６（ｍ、３Ｈ）、７．４４−７．５４
（ｍ、２Ｈ） ７．５６−７．７７（ｍ、７Ｈ）、７．８０−７．８６
（ｍ、１Ｈ） ７．９２（ｔ、１Ｈ）、８．０６−８．１４（ｍ、１
Ｈ） ８．３８（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．４５
（ｄ、１Ｈ） ８．５６（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６１
（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
ｄ６、δｐｐｍ） １．３８（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．８３−
２．０５（ｍ、９Ｈ） ２．１１（ｔ、７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．２４−２．３
３（ｍ、２Ｈ） ２．３６（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７２
（ｓ、３Ｈ） ４．３１−４．４１（ｍ、２Ｈ）、４．６０（ｔ、Ｊ＝
７．０Ｈｚ、２Ｈ） ５．９４（ｓ、１Ｈ）、６．２３（ｓ、１Ｈ）、６．３
８（ｓ、１Ｈ） ６．４６（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．０９
（ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、１Ｈ） ７．２４−７．３６（ｍ、３Ｈ）、７．４４−７．５４
（ｍ、２Ｈ） ７．５６−７．７７（ｍ、７Ｈ）、７．８０−７．８６
（ｍ、１Ｈ） ７．９２（ｔ、１Ｈ）、８．０６−８．１４（ｍ、１
Ｈ） ８．３８（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．４５
（ｄ、１Ｈ） ８．５６（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６１
（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）
【００９９】
【化１３】 実施例５ 二本鎖核酸の検出１ 実施例１で合成した一般式１の化合物（反応式９におけ
る「化合物１」）を用いて、二本鎖核酸の測定を行っ
た。用いた二本鎖核酸の核酸配列は、ｄＴ３０ｍｅｒが
配列番号１、ｄＡ３０ｍｅｒが配列番号２に記載した通
りのものである。
る「化合物１」）を用いて、二本鎖核酸の測定を行っ
た。用いた二本鎖核酸の核酸配列は、ｄＴ３０ｍｅｒが
配列番号１、ｄＡ３０ｍｅｒが配列番号２に記載した通
りのものである。
【０１００】一般式１の化合物（反応式９における「化
合物１」）の０．３ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２μ
ｌ）に溶解し、×２０ ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．
５ＭＥＤＴＡ（０．３μｌ）を加えた。７５℃で３０分
インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励
起波長４８８nmでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強
度を室温下で測定したところ、２．５であった。
合物１」）の０．３ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２μ
ｌ）に溶解し、×２０ ＳＳＣ（７．５μｌ）及び０．
５ＭＥＤＴＡ（０．３μｌ）を加えた。７５℃で３０分
インキュベートした後、室温まで放冷した。その後、励
起波長４８８nmでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強
度を室温下で測定したところ、２．５であった。
【０１０１】次に、一般式１の化合物（反応式９におけ
る「化合物１」）の０．３ｎｍｏｌ、ｄＴ３０ｍｅｒの
０．０４ｎｍｏｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏ
ｌをＨ２Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０ ＳＳ
Ｃ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ（０．３μ
ｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、
室温まで放冷した。その後、励起波長４７０ｎｍ又は４
８８ｎｍでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室
温下で測定したところ、それぞれ５３．６４及び１０
４．７であり、二本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の
増大が確認された。図1に測定された蛍光スペクトルを
示す。
る「化合物１」）の０．３ｎｍｏｌ、ｄＴ３０ｍｅｒの
０．０４ｎｍｏｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍｏ
ｌをＨ２Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０ ＳＳ
Ｃ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ（０．３μ
ｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、
室温まで放冷した。その後、励起波長４７０ｎｍ又は４
８８ｎｍでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室
温下で測定したところ、それぞれ５３．６４及び１０
４．７であり、二本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の
増大が確認された。図1に測定された蛍光スペクトルを
示す。
【０１０２】実施例６ 二本鎖核酸の検出２ 実施例２で合成した一般式１の化合物（反応式１０にお
ける「化合物２」）を用いて、二本鎖核酸の測定を行っ
た。なお用いた二本鎖核酸の核酸配列は実施例５と同一
である。
ける「化合物２」）を用いて、二本鎖核酸の測定を行っ
た。なお用いた二本鎖核酸の核酸配列は実施例５と同一
である。
【０１０３】一般式１の化合物（反応式１０における
「化合物２」）の０．３ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２
μｌ）に溶解し、×２０ ＳＳＣ（７．５μｌ）及び
０．５ＭＥＤＴＡ（０．３μＭ）を加えた。７５℃で３
０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その
後、励起波長４８８8nmでの蛍光波長６５５ｎｍにおけ
る蛍光強度を室温下で測定したところ、３．５であっ
た。
「化合物２」）の０．３ｎｍｏｌをＨ２Ｏ（１４２．２
μｌ）に溶解し、×２０ ＳＳＣ（７．５μｌ）及び
０．５ＭＥＤＴＡ（０．３μＭ）を加えた。７５℃で３
０分インキュベートした後、室温まで放冷した。その
後、励起波長４８８8nmでの蛍光波長６５５ｎｍにおけ
る蛍光強度を室温下で測定したところ、３．５であっ
た。
【０１０４】次に、一般式１の化合物（反応式１０にお
ける「化合物２」）の０．３ｎｍｏｌ、ｄＴ３０ｍｅｒ
の０．０４ｎｍｏｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍ
ｏｌをＨ2Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０ Ｓ
ＳＣ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ（０．３μ
ｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、
室温まで放冷した。その後、励起波長４７０ｎｍ又は４
８８ｎｍでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室
温下で測定したところ、それぞれ、３８．３及び７６．
０であり、二本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大
が確認された。図２に測定された蛍光スペクトルを示
す。
ける「化合物２」）の０．３ｎｍｏｌ、ｄＴ３０ｍｅｒ
の０．０４ｎｍｏｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの０．０４ｎｍ
ｏｌをＨ2Ｏ（１４２．２μｌ）に溶解し、×２０ Ｓ
ＳＣ（７．５μｌ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ（０．３μ
ｌ）を加えた。７５℃で３０分インキュベートした後、
室温まで放冷した。その後、励起波長４７０ｎｍ又は４
８８ｎｍでの蛍光波長６５５ｎｍにおける蛍光強度を室
温下で測定したところ、それぞれ、３８．３及び７６．
０であり、二本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大
が確認された。図２に測定された蛍光スペクトルを示
す。
【０１０５】実施例７ 以下に示す方法で、一般式１の化合物を合成した。この
反応を下記反応式１３に示す。 （１）化合物（１３）の合成 化合物（１）（０．２０ｇ）とジヨードヘキサン（１．
８ｍｌ）をニトロベンゼン１．８ｍｌに懸濁し、１６０
℃２．５時間撹拌した。放冷後、塩化メチレンを添加
し、析出した固体を熱メタノールに溶かし、エーテルを
加え、氷冷下放置した。生じた固体をろ過して、目的と
する化合物（１３ａ）を０．１７１ｇ得た。得られた化
合物（１３ａ）はＮＭＲ測定において下記のような特性
を示した。
反応を下記反応式１３に示す。 （１）化合物（１３）の合成 化合物（１）（０．２０ｇ）とジヨードヘキサン（１．
８ｍｌ）をニトロベンゼン１．８ｍｌに懸濁し、１６０
℃２．５時間撹拌した。放冷後、塩化メチレンを添加
し、析出した固体を熱メタノールに溶かし、エーテルを
加え、氷冷下放置した。生じた固体をろ過して、目的と
する化合物（１３ａ）を０．１７１ｇ得た。得られた化
合物（１３ａ）はＮＭＲ測定において下記のような特性
を示した。
【０１０６】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．１９（ｍ、２Ｈ）、１．２４（ｍ、２Ｈ）１．６２
（ｍ、２Ｈ）、１．９２（ｍ、２Ｈ）、２．０１（ｓ、
３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、３．１９（ｔ、２
Ｈ）、４．５４（ｍ、２Ｈ）、７．７−９．２（ｍ、１
３Ｈ）、１０．５２（ｓ、１Ｈ）、１０．８０（ｓ、１
Ｈ）。
ｄ６、δｐｐｍ） １．１９（ｍ、２Ｈ）、１．２４（ｍ、２Ｈ）１．６２
（ｍ、２Ｈ）、１．９２（ｍ、２Ｈ）、２．０１（ｓ、
３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、３．１９（ｔ、２
Ｈ）、４．５４（ｍ、２Ｈ）、７．７−９．２（ｍ、１
３Ｈ）、１０．５２（ｓ、１Ｈ）、１０．８０（ｓ、１
Ｈ）。
【０１０７】同様に、化合物（１）（０．１０ｇ）とジ
ヨードヘプタン（３ｍｌ）から、目的とする化合物（１
３ｂ）を０．１１３ｇ、化合物（１）（０．１ｇ）とジ
ヨードオクタン（３ｍｌ）から、目的とする化合物（１
３ｃ）を０．１３９ｇ得た。 （２）化合物（１４）の合成 得られた化合物（１３ａ）（１１７ｍｇ）と３−アミノ
プロパノール（０．１６ｍｌ）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶
解し、１２０℃ ３時間撹拌した。減圧濃縮後、得られ
た粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展
開溶媒クロロホルム／メタノール＝９０／１０）で精製
することにより目的とする化合物（１４ａ）を１２８ｍ
ｇ得た。得られた化合物（１４ａ）はＮＭＲ測定におい
て下記のような特性を示した。
ヨードヘプタン（３ｍｌ）から、目的とする化合物（１
３ｂ）を０．１１３ｇ、化合物（１）（０．１ｇ）とジ
ヨードオクタン（３ｍｌ）から、目的とする化合物（１
３ｃ）を０．１３９ｇ得た。 （２）化合物（１４）の合成 得られた化合物（１３ａ）（１１７ｍｇ）と３−アミノ
プロパノール（０．１６ｍｌ）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶
解し、１２０℃ ３時間撹拌した。減圧濃縮後、得られ
た粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展
開溶媒クロロホルム／メタノール＝９０／１０）で精製
することにより目的とする化合物（１４ａ）を１２８ｍ
ｇ得た。得られた化合物（１４ａ）はＮＭＲ測定におい
て下記のような特性を示した。
【０１０８】１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ６、δｐｐｍ） １．１９（ｍ、２Ｈ）、１．２５（ｍ、２Ｈ）、１．５
５（ｍ、２Ｈ）、１．７７（ｍ、２Ｈ）、１．９２
（ｍ、２Ｈ）、２．０２（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、
３Ｈ）、２．７５−３．００（ｍ、４Ｈ）、３．４８
（ｍ、２Ｈ）、４．４８（ｍ、２Ｈ）、７．６０−９．
２０（ｍ、１３Ｈ）、１０．６２（ｓ、１Ｈ）、１１．
１９（ｓ、１Ｈ）。
ｄ６、δｐｐｍ） １．１９（ｍ、２Ｈ）、１．２５（ｍ、２Ｈ）、１．５
５（ｍ、２Ｈ）、１．７７（ｍ、２Ｈ）、１．９２
（ｍ、２Ｈ）、２．０２（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、
３Ｈ）、２．７５−３．００（ｍ、４Ｈ）、３．４８
（ｍ、２Ｈ）、４．４８（ｍ、２Ｈ）、７．６０−９．
２０（ｍ、１３Ｈ）、１０．６２（ｓ、１Ｈ）、１１．
１９（ｓ、１Ｈ）。
【０１０９】同様に、化合物（１３ｂ） （１１３ｍ
ｇ）から、目的とする化合物（１４ｂ）を４０ｍｇ、化
合物（１３ｃ）（１３９ｍｇ）から、目的とする化合物
（１４ｃ）を５６ｍｇ得た。 （３）化合物（１５）の合成 得られた化合物（１４ａ）（１２８ｍｇ）と１当量の化
合物（３）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶かし、１３０℃２．
５時間加熱した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒酢酸エチル
／酢酸／水＝６０／３０／２０）で精製することにより
目的とする化合物（１５ａ）を３５ｍｇ得た。
ｇ）から、目的とする化合物（１４ｂ）を４０ｍｇ、化
合物（１３ｃ）（１３９ｍｇ）から、目的とする化合物
（１４ｃ）を５６ｍｇ得た。 （３）化合物（１５）の合成 得られた化合物（１４ａ）（１２８ｍｇ）と１当量の化
合物（３）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶かし、１３０℃２．
５時間加熱した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒酢酸エチル
／酢酸／水＝６０／３０／２０）で精製することにより
目的とする化合物（１５ａ）を３５ｍｇ得た。
【０１１０】同様に、化合物（１４ｂ）（４０ｍｇ）か
ら、目的とする化合物（１５ｂ）を７ｍｇ、化合物（１
４ｃ）から、目的とする化合物（１５ｃ）を８ｍｇ得
た。 （４）化合物（１６）の合成 得られた化合物（１５ａ）に４８％ＨＢｒ水溶液（１．
５ｍｌ）を加えた。１４５℃、１時間撹拌した後、減圧
濃縮した。エタノールで共沸し、残さ（化合物（１６
ａ）；１．４ｍｇ）を得た。
ら、目的とする化合物（１５ｂ）を７ｍｇ、化合物（１
４ｃ）から、目的とする化合物（１５ｃ）を８ｍｇ得
た。 （４）化合物（１６）の合成 得られた化合物（１５ａ）に４８％ＨＢｒ水溶液（１．
５ｍｌ）を加えた。１４５℃、１時間撹拌した後、減圧
濃縮した。エタノールで共沸し、残さ（化合物（１６
ａ）；１．４ｍｇ）を得た。
【０１１１】同様に、化合物（１５ｂ）から、化合物
（１６ｂ） を含む残さ ８ｍｇ、化合物（１５ｃ）か
ら、化合物（１６ｃ）を含む残さ ８ｍｇを得た。
（１６ｂ） を含む残さ ８ｍｇ、化合物（１５ｃ）か
ら、化合物（１６ｃ）を含む残さ ８ｍｇを得た。
【０１１２】
【化１４】 実施例８ 以下に示す方法で、本発明の核酸プローブを合成した。
この反応を下記反応式１４に示す。
この反応を下記反応式１４に示す。
【０１１３】ＤＮＡオリゴマー（化合物（１７））（３
７ｎｍｏｌ）を蒸留水 １００μｌ、ＤＭＦ ３００μ
ｌ に溶解し、ジチオスレイトールのＤＭＦ溶液（１
Ｍ）４０μｌを添加した。１時間後、反応液１３３μｌ
を採取し、化合物（１６ｃ）のＤＭＦ溶液（２ｍｇ／ｍ
ｌ）１００μｌ及び、トリエチルアミン１１０μｌを添
加した。反応液を室温下一晩静置した後、減圧濃縮し
た。残さをｎ―ブタノール−水で分配した。水層をブタ
ノール濃縮した後、エタノールを添加し、−７８℃で３
０分静置した。析出した固体を遠心分離により集めた。
得られた沈殿をＨＰＬＣ（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、東ソー
製）により精製し、目的の化合物（１８）を０．９４ｎ
ｍｏｌ得た。
７ｎｍｏｌ）を蒸留水 １００μｌ、ＤＭＦ ３００μ
ｌ に溶解し、ジチオスレイトールのＤＭＦ溶液（１
Ｍ）４０μｌを添加した。１時間後、反応液１３３μｌ
を採取し、化合物（１６ｃ）のＤＭＦ溶液（２ｍｇ／ｍ
ｌ）１００μｌ及び、トリエチルアミン１１０μｌを添
加した。反応液を室温下一晩静置した後、減圧濃縮し
た。残さをｎ―ブタノール−水で分配した。水層をブタ
ノール濃縮した後、エタノールを添加し、−７８℃で３
０分静置した。析出した固体を遠心分離により集めた。
得られた沈殿をＨＰＬＣ（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、東ソー
製）により精製し、目的の化合物（１８）を０．９４ｎ
ｍｏｌ得た。
【０１１４】
【化１５】 実施例９ 実施例７で合成した一般式１の化合物（反応式１３にお
ける化合物（１６ｃ））を用いて、二本鎖核酸の検出を
行った。なお用いた二本鎖核酸の核酸配列は実施例５と
同じである。 （１）一般式１の化合物（反応式１３における化合物
（１６ｃ））の２５μＭ溶液 ６０μｌに、×２０ Ｓ
ＳＣ（３０μｌ）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（１．２μｌ）
及び、蒸留水（４８４．８μｌ）を加えた。 （２）（１）の反応液を１４４μｌ採取し、ＴＥ バッ
ファー ６μｌを添加した。 （３）（１）の反応液を１４４μｌ採取し、ｄＴ３０ｍ
ｅｒの１２．５μＭ溶液３μｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの１
２．５μｌ溶液３μｌを添加した。 （４）（２）及び（３）の反応液を７５℃で３０分イン
キュベートした後、室温まで放冷した。 （５）励起波長４７０ｎｍにおける蛍光強度を室温下で
測定した。
ける化合物（１６ｃ））を用いて、二本鎖核酸の検出を
行った。なお用いた二本鎖核酸の核酸配列は実施例５と
同じである。 （１）一般式１の化合物（反応式１３における化合物
（１６ｃ））の２５μＭ溶液 ６０μｌに、×２０ Ｓ
ＳＣ（３０μｌ）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（１．２μｌ）
及び、蒸留水（４８４．８μｌ）を加えた。 （２）（１）の反応液を１４４μｌ採取し、ＴＥ バッ
ファー ６μｌを添加した。 （３）（１）の反応液を１４４μｌ採取し、ｄＴ３０ｍ
ｅｒの１２．５μＭ溶液３μｌ及びｄＡ３０ｍｅｒの１
２．５μｌ溶液３μｌを添加した。 （４）（２）及び（３）の反応液を７５℃で３０分イン
キュベートした後、室温まで放冷した。 （５）励起波長４７０ｎｍにおける蛍光強度を室温下で
測定した。
【０１１５】図３に測定された蛍光スペクトルを示す。
（２）の反応液の蛍光波長６５４ｎｍにおける蛍光強度
（図中の（１））は５．７９であり、（３）の反応液の
蛍光強度（図中の（２））は、５８．２６であった。２
本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認され
た。
（２）の反応液の蛍光波長６５４ｎｍにおける蛍光強度
（図中の（１））は５．７９であり、（３）の反応液の
蛍光強度（図中の（２））は、５８．２６であった。２
本鎖核酸存在下で、有意な蛍光強度の増大が確認され
た。
【０１１６】実施例１０ 実施例８で合成した本発明の核酸プローブ（反応式１４
における化合物（１８））を用いて、標的核酸（ＤＮ
Ａ）の検出を行った。プローブの核酸配列は、配列番号
３、標的核酸の核酸配列は、配列番号４に記載したとお
りのものである。 （１）本発明の核酸プローブ（反応式１４における化合
物（１８））の２．５μＭ 溶液 １０μＭ溶液 ３
１．５μｌに、蒸留水 ２６０．８μｌ、２０×ＳＳＣ
１５．８μｌ、及び、０．５μＭ ＥＤＴＡ ０．６
μｌを添加した。 （２）（１）の反応液を１４７μｌ 採取し、ＴＥバッ
ファー ３μｌ添加した。 （３）（１）の反応液を１４７μｌ 採取し、標的核酸
の５０μＭ 溶液 ３μｌを添加した。 （４）励起波長４７０ｎｍにおける蛍光強度を４１℃で
測定した。
における化合物（１８））を用いて、標的核酸（ＤＮ
Ａ）の検出を行った。プローブの核酸配列は、配列番号
３、標的核酸の核酸配列は、配列番号４に記載したとお
りのものである。 （１）本発明の核酸プローブ（反応式１４における化合
物（１８））の２．５μＭ 溶液 １０μＭ溶液 ３
１．５μｌに、蒸留水 ２６０．８μｌ、２０×ＳＳＣ
１５．８μｌ、及び、０．５μＭ ＥＤＴＡ ０．６
μｌを添加した。 （２）（１）の反応液を１４７μｌ 採取し、ＴＥバッ
ファー ３μｌ添加した。 （３）（１）の反応液を１４７μｌ 採取し、標的核酸
の５０μＭ 溶液 ３μｌを添加した。 （４）励起波長４７０ｎｍにおける蛍光強度を４１℃で
測定した。
【０１１７】図４に測定された蛍光スペクトルを示す。
（２）の反応液の６５６ｎｍにおける蛍光強度（図中の
（１））は、１．８であり、（３）の反応液の蛍光強度
（図中の（２））は、５．７であった。標的核酸存在下
で、有意な蛍光強度の増大が確認された。
（２）の反応液の６５６ｎｍにおける蛍光強度（図中の
（１））は、１．８であり、（３）の反応液の蛍光強度
（図中の（２））は、５．７であった。標的核酸存在下
で、有意な蛍光強度の増大が確認された。
【０１１８】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本願発
明によれば、従来知られていないインターカレーター性
蛍光色素であって、核酸検出において二本鎖核酸にイン
ターカレートしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起
波長と蛍光波長の差が大きい（すなわちストークスシフ
トの大きい）新規な化合物が提供される。この化合物
は、二本鎖核酸と接触させたり、一本鎖オリゴヌクレオ
チドと結合して核酸プローブとすることにより、従来か
ら実施されている核酸の測定に供することが可能であ
る。
明によれば、従来知られていないインターカレーター性
蛍光色素であって、核酸検出において二本鎖核酸にイン
ターカレートしたときの蛍光増感が大きく、しかも励起
波長と蛍光波長の差が大きい（すなわちストークスシフ
トの大きい）新規な化合物が提供される。この化合物
は、二本鎖核酸と接触させたり、一本鎖オリゴヌクレオ
チドと結合して核酸プローブとすることにより、従来か
ら実施されている核酸の測定に供することが可能であ
る。
【０１１９】特に本願発明の化合物を適当なリンカーを
介して一本鎖オリゴヌクレオチドと結合した核酸プロー
ブ等では、特定の配列を有する核酸と該一本鎖オリゴヌ
クレオチドが相補結合を形成した場合にのみ蛍光増感が
起こるため、未結合の核酸プローブを分離する操作を行
う必要がなく、従って均一系での簡便な一段階の操作に
よる核酸測定方法を実施することができる。
介して一本鎖オリゴヌクレオチドと結合した核酸プロー
ブ等では、特定の配列を有する核酸と該一本鎖オリゴヌ
クレオチドが相補結合を形成した場合にのみ蛍光増感が
起こるため、未結合の核酸プローブを分離する操作を行
う必要がなく、従って均一系での簡便な一段階の操作に
よる核酸測定方法を実施することができる。
【０１２０】また本願発明の化合物は、従来公知のイン
ターカレーター性蛍光色素とは蛍光スペクトルが重なり
合わないという特徴を有する。このため、本願発明の化
合物と従来から知られているインターカレーター性蛍光
色素を用いて製造した２種類以上の核酸プローブを用い
ることにより、試料の中に含まれる二種以上の標的核酸
を増幅し、分離操作を行うことなしに、増幅産物を密閉
容器内で測定する方法、即ち二種類以上の標的核酸の同
時測定等を可能とする測定法を提供することができる。
ターカレーター性蛍光色素とは蛍光スペクトルが重なり
合わないという特徴を有する。このため、本願発明の化
合物と従来から知られているインターカレーター性蛍光
色素を用いて製造した２種類以上の核酸プローブを用い
ることにより、試料の中に含まれる二種以上の標的核酸
を増幅し、分離操作を行うことなしに、増幅産物を密閉
容器内で測定する方法、即ち二種類以上の標的核酸の同
時測定等を可能とする測定法を提供することができる。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> 新規蛍光色素及び核酸の測定方法 <130> PA211-0669 <160> 4 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｄＴ３０ｍｅｒ <400> 1 tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｄＡ３０ｍｅｒ <400> 2 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プローブ <400> 3 tgtttgaggg tggatagcag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 標的核酸 <400> 4 ctgctatcca ccctcaaaca 20
【図1】図１は、実施例5における化合物１の蛍光スペク
トルである。図中（１）は二本鎖核酸なし、励起波長４
８８ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ
（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎ
ｍｏｌ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、
（３）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ
３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４８
８ｎｍでの結果である。
トルである。図中（１）は二本鎖核酸なし、励起波長４
８８ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ
（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎ
ｍｏｌ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、
（３）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ
３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４８
８ｎｍでの結果である。
【図２】実施例６における化合物２の蛍光スペクトルで
ある。図中、（１）は二本鎖核酸なし、励起波長４８８
ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．
０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏ
ｌ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、
（３）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ
３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４８
８ｎｍでの結果である。
ある。図中、（１）は二本鎖核酸なし、励起波長４８８
ｎｍでの結果であり、（２）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．
０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏ
ｌ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、
（３）はｄＴ３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）及びｄＡ
３０ｍｅｒ（０．０４ｎｍｏｌ）存在下、励起波長４８
８ｎｍでの結果である。
【図３】実施例９における化合物（１６ｃ）（２．５μ
Ｍ）の蛍光スペクトルである。図中（１）は、二本鎖核
酸なし、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（２）は
ｄＴ３０ｍｅｒ（０．２５μＭ）及びｄＡ３０ｍｅｒ
（０．２５μＭ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果
である。
Ｍ）の蛍光スペクトルである。図中（１）は、二本鎖核
酸なし、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（２）は
ｄＴ３０ｍｅｒ（０．２５μＭ）及びｄＡ３０ｍｅｒ
（０．２５μＭ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果
である。
【図４】実施例１０における化合物（１８）（１μＭ）
の蛍光スペクトルである。図中（１）は、標的核酸な
し、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（２）は、標
的核酸（１μＭ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果
である。
の蛍光スペクトルである。図中（１）は、標的核酸な
し、励起波長４７０ｎｍでの結果であり、（２）は、標
的核酸（１μＭ）存在下、励起波長４７０ｎｍでの結果
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ ４Ｈ０５６ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 堀江 隆一 神奈川県座間市相模が丘１−27−22−1405 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 CB21 DA12 DA13 DA14 FA29 FB02 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ16 QQ18 QQ19 QQ42 QQ52 QR32 QR56 QR63 QS03 QS34 QX02 4C057 BB02 CC01 DD01 MM05 4C063 AA03 BB03 CC62 DD14 EE10 4H056 CA01 CC02 CC08 CE03 DD04 DD19 FA08
Claims (13)
- 【請求項１】下記一般式１（式中、Ｒ1は低級アルキル
基を表す。Ａ及びＤは、同一又は相異なって、式：−Ｃ
ＨＲ2−で表される基（該式中、Ｒ2は水素原子、低級ア
ルキル基又はハロゲン原子で置換された低級アルキル基
を表す。）、式：−ＮＲ3−で表される基（該式中、Ｒ3
は水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換さ
れた低級アルキル基を表す。）、式：−Ｎ+Ｒ4Ｒ5・Ｑ-
−で表される基（該式中、Ｒ4及びＲ5は、同一又は相異
なって、低級アルキル基又はハロゲン原子で置換された
低級アルキル基を表す。Ｑはハロゲン原子、式：Ｒ6Ｃ
ＯＯで表される基（該式中、Ｒ6は低級アルキル基又は
ハロゲン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又
は式：Ｒ7ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ7は低級アル
キル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は
低級アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）、酸素原子又は硫黄原子を表す。ｌ、
ｍ及びｎは、同一又は相異なって、２〜５の整数を表
す。Ｚは酸素原子又は硫黄原子を表す。Ｘ1及びＸ2は、
同一又は相異なって、ハロゲン原子、式：Ｒ8ＣＯＯで
表される基（該式中、Ｒ8は低級アルキル基又はハロゲ
ン原子で置換された低級アルキル基を表す。）又は式：
Ｒ9ＳＯ3で表される基（該式中、Ｒ 9は低級アルキル
基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基又は低級
アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表
す。）を表す。）で表されることを特徴とする化合物、
その塩、その水和物、その溶媒和物又はその立体異性
体。 【化１】 - 【請求項２】請求項1に記載の化合物、その塩、その水
和物、その溶媒和物又はその立体異性体の製造方法。 - 【請求項３】試料中に含まれると予想される核酸の有無
又は量を測定する方法であって、請求項1に記載の化合
物を用いることを特徴とする方法。 - 【請求項４】前記核酸が、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮ
Ａ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか一つ、又
は、これらの混合物である請求項３の測定法。 - 【請求項５】特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）
中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖
オリゴヌクレオチドと一般式１で表わされる化合物を化
学結合で結合した核酸プローブ。 - 【請求項６】一本鎖オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴ
マーである請求項５の核酸プローブ - 【請求項７】ＤＮＡオリゴマー中のリン部分からリンカ
ーを介して前記化学結合を形成したことを特徴とする請
求項６の核酸プローブ - 【請求項８】一般式１で表わされる化合物が、標的核酸
と一本鎖ＤＮＡプローブとの相補結合部分にインターカ
レーションすることにより蛍光特性が変化することを特
徴とする請求項７の核酸プローブ。 - 【請求項９】試料中に含まれる少なくとも一種類以上の
特定核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定する方法
であって、請求項６の核酸プローブを用いることを特徴
とする標的核酸の測定法。 - 【請求項１０】試料中に含まれる二種類以上の特定核酸
配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する方法であ
って、二種類以上の標的ＲＮＡを同時に増幅する工程を
含み、ここで該ＲＮＡ増幅工程は、各々の増幅産物に相
補的な配列を有する、異なるインターカレーター性蛍光
色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物
とプローブが形成する相補結合部分にインターカレータ
ー性蛍光色素がインターカレートすることにより変化し
た蛍光強度を測定する工程を含み、ここで該インターカ
レーター性蛍光色素は、前記一般式１で表される化合物
と、該化合物とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長
帯で励起され得るインターカレーター性蛍光色素の組み
合わせであることを特徴とする標的核酸の測定法。 - 【請求項１１】試料中に含まれる少なくとも一つ以上の
特定核酸配列を有するＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定する
方法であって、該試料に既知量の標準核酸を添加し、標
的ＲＮＡと標準核酸を同時に増幅する工程を含み、ここ
で該ＲＮＡ増幅工程は、各々の増幅産物に相補的な配列
を有する、異なるインターカレーター性蛍光色素で標識
されたプローブ存在下で生じさせ、増幅産物とプローブ
が形成する相補結合部分にインターカレーター性蛍光色
素がインターカレートすることにより変化した蛍光強度
を測定し、別途測定した既知量の標準核酸の蛍光強度と
比較する工程を含み、ここで該インターカレーター性蛍
光色素は、前記一般式１で表される化合物と、該化合物
とは蛍光波長が異なり、かつ、同一の波長帯で励起され
得るインターカレーター性蛍光色素の組み合わせである
ことを特徴とする標的核酸の測定法。 - 【請求項１２】前記他のインターカレーター性蛍光色素
の少なくとも１つがオキサゾールイエローである請求項
１０又は１１の測定法。 - 【請求項１３】測定におけるインターカレーター性蛍光
色素の励起波長が４５０から５００ｎｍである請求項１
２の測定法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JP2001-3432 | 2001-01-11 | ||
| JP2002005267A JP4265134B2 (ja) | 2001-01-11 | 2002-01-11 | 新規蛍光色素及び核酸の測定方法 |
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|---|---|
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| JP2009171935A (ja) * | 2007-03-09 | 2009-08-06 | Institute Of Physical & Chemical Research | プライマー、プライマーセット、それを用いた核酸増幅方法および変異検出方法 |
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