JP2008533491A - 二量体および三量体の核酸色素ならびに関連するシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、Maoらの米国仮特許出願第60/663,613号(発明の名称「Dimeric and Trimeric Nucleic Acid Dyes,and Associated Systems and Methods」、2005年3月17日出願)の優先権を主張し、かつ同時継続米国出願第__/___,___号(本明細書と同時に2006年3月16日に出願し、やはり米国仮特許出願第60/663,613号の優先権を主張する)に関連する。上述の仮出願および出願の各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
Biotium,Inc.(Hayward,California(CA))およびAlleLogic Biosciensces Corp.(Hayward,CA)は、本発明に関する共同研究の同意に対する関係者である。
本明細書中に開示される配列番号1から配列番号10の配列表が含まれている、オリジナルのASCIIディスケットおよび別のASCIIディスケット(これはオリジナルのディスケットの複製である)、さらには、配列表の紙によるコピーが提出され、記載され、そしてその内容を含むそれらの全体が米国仮特許出願番号60/663,613において引用により本明細書中に組み入れられる。配列表の紙によるコピーはそれと共に提出される。上記米国仮特許出願番号60/663,613がすでにファイルされている、適合するコンピュータで読み取ることができる配列表が、本出願と組み合わせて使用されることがここで要請される。本出願およびその内容の配列表の紙によるコピーまたはコンパクトディスクによるコピーは、上記米国仮特許出願番号60/663,613がファイルされている配列表のコンピュータで読み取ることができるコピーと同じである。配列表、それと共に提出される配列表の紙によるコピー、および上記米国仮特許出願番号60/663,613がすでにファイルされているコンピュータで読み取ることができる配列表は、その内容を含むそれらの全体が、この引用により本明細書中に組み入れられる。
蛍光色素は、生物学的試料の検出および分析のために使用されている。蛍光色素は感度が高いため、これは極めて少数の蛍光分子を検出するために使用することができる。例えば、このような蛍光色素を使用して、細胞と会合している50個未満の蛍光分子を検出することができる。非特許文献1)。
有用な用途(例えば、qPCRプロセスにおける用途)に適している蛍光色素を生産または設計する方法が提供される。この方法には、柔軟であり、そして実質的には中性(例えば、中性またはわずかに電化を有している)であり得る架橋を介して、2つまたは3つ以上の単量体色素を共有結合させることが含まれる。本明細書中で提供される色素を生産または設計する方法により、これまでは得ることができなかった波長および/または他のスペクトル特性を有している蛍光核酸色素の開発が可能となり得る。
様々な用途(例えば、核酸の検出)に有用であり得る蛍光色素または染色が本明細書中で記載される。このような色素は、例えば、二量体または三量体の核酸色素であり得、核酸が存在しない場合には低いバックグラウンドの蛍光を有しており、そして核酸の存在下では、高い蛍光を発するようになる。二量体および三量体の核酸色素は、様々な用途(例えば、本明細書中に記載されるような核酸の検出)に有用であり得る。蛍光色素または染色の調製ならびに使用に関する方法もまた、蛍光色素または染色を含む有用なシステムまたはキットと同様に、本明細書中に記載される。
構造1
構造2
構造3
BRIDGEは、わずかに1つの正電荷を有している、実質的に柔軟なリンカー分子であり得る。BRIDGEは実質的には中性であり得、実質的には柔軟なリンカー分子であり得る。BRIDGEの構成成分は、そのような限られた正電荷、またはそのような実質的な中性が得られるように選択され得る。実質的な中性(実際の中性を含む)の特性は以下でさらに議論される。実質的な柔軟性の特性は、一般的には、BRIDGEの実質的な脂肪族の性質(実際の脂肪族の性質を含む)と関係している。この実質的に脂肪族の性質は、一般的には、BRIDGEの非芳香性、またはBRIDGEの非剛性を意味する。
式1
式2
式3
式4
**アジ化アシルはまた、イソシアネートの位置を変えることもできる。
式5
二量体色素および三量体色素に使用される構成成分である単量体色素または機能性分子Q1、Q2、およびQ3のそれぞれは、別々に、以下から選択することができる:1)蛍光核酸色素;2)非蛍光核酸結合分子;3)蛍光非核酸色素;および4)非蛍光非核酸色素。一般的には、Q1、Q2、およびQ3は、DNAが存在しない条件での分子内二量体の形成、ならびにDNAに結合した場合の高度に蛍光を発するDNA−色素錯体の形成を促進または確実にする様式で選択され、そして、BRIDGEを介して共有結合させられ得る。分子内二量体の形成は、先に記載されたように、二量体色素の有用なヘアピン立体構造を提供するために十分であり得る。このような二量体色素は望ましい特性(例えば、低いバックグラウンドの蛍光と低いPCRの阻害)を有している場合がある。先に記載されたように、本明細書中に記載される二量体色素を比較的高濃度で使用して、望ましいまたは強い蛍光シグナルを生じさせることが可能である。
色素を構築するために適している単量体蛍光核酸色素の例としては、アクリジン色素、非対称シアニンをベースとする核酸染色、フェナントリジニウム色素、対照シアニン核酸染色、DAPIの誘導体、およびHoechst色素の誘導体が挙げられるが、これらに限定はされない。DAPIおよびHoechst色素は、一般的には、これらは結合の形成のための反応基を有していないとの理由から、BRIDGEに直接結合させることができない。この状況では、誘導(derivative)は、塩基色素(例えば、DAPIまたはHoechst色素)を意味し、これは、例えば、反応基の付加によって、結合の形成に十分であるように修飾される。
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造(構造4)を有しているアクリジン色素であり得る。
構造4
構造5
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造(構造6)を有している非対称シアニン色素であり得る。
構造6
構造7
構造8
単なる例ではあるが、単量体蛍光核酸色素は、すぐ下に示される一般的構造(構造9)を有している、フェナントリジニウム誘導体であり得る。
構造9
構造10
一般的には、非蛍光核酸結合分子は、蛍光を発しないか、または蛍光核酸色素として有用であるには弱すぎる蛍光を発する、核酸結合分子である。非蛍光核酸結合分子には、非蛍光核酸結合色素、および無色の合成もしくは天然の核酸結合分子が含まれる。
単量体色素Q1、Q2、およびQ3の1つは、蛍光非核酸色素であり得る。一般的に、通常は蛍光核酸色素とは考えられない全ての蛍光色素は、蛍光非核酸色素と考えられる。本明細書中では、用語「蛍光非核酸色素」は、一般的には、通常は核酸色素とは考えられない蛍光色素を意味する。例として、色素は、通常は、蛍光小溝結合剤または蛍光挿入剤とは考えることはできない。さらなる例として、いくつかの蛍光非核酸色素は、核酸といくらかの弱い相互作用を示す場合があるが、これらの挿入剤は、一般的には、色素を核酸の検出に有用とするための有意な蛍光スペクトルの変化を引き起こすには十分ではない。
一般的には、用語「非蛍光非核酸色素」は、蛍光を発することがなく、また、核酸に結合することもない色素を意味する。このような色素は、一般的には、FRETをベースとする用途において蛍光消光剤として使用される。例として、蛍光性ペプチダーゼ基質は、蛍光ドナー色素をペプチドの一方の末端に共有結合させ、そして、非蛍光非核酸色素である消光剤を、ドナーの蛍光を消光させるためにペプチドの他方の末端に共有結合させることによって構築されている。ペプチドが酵素によって切断されると、ドナーと消光剤は分離され、それによって、蛍光シグナルが放出される。さらなる例として、非蛍光非核酸色素は、qPCRのための、いわゆる、TaqManプローブを設計するために使用されている。TaqManプローブは、標的DNA配列に相補的であるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの一方の末端に結合させられた蛍光ドナー色素、およびドナー色素の蛍光を消光させるためのオリゴヌクレオチドの他方の末端に共有結合させられた消光剤から構成される。リアルタイムPCRの間に、標識されたオリゴヌクレオチドは標的DNAに結合し、これは、オリゴヌクレオチドの酵素による切断を引き起こし、それにより蛍光シグナルが生じる。
本明細書中に記載される核酸色素は、定量的リアルタイムPCR(qPCR)に特に有用であり得る。蛍光核酸色素を介した蛍光をベースとするDNA検出と組み合わせてPCRを使用することにより、当業者は、PCRの実行を停止させることなく、またはPCRの実行の間に反応物をサンプリングすることなく、PCRプロセスの産物の量を決定することができる。qPCRを使用することにより、当業者は、DNA試料のもとの量を定量することができるだけではなく、配列情報をもまた得ることができる。qPCRの感度および特異性により、これは、疾患の診断および予後診断、ならびに、農業および法医学における種の特定を含む、多数の実用において非常に有用となる。
色素の合成は、単量体色素構成成分の合成、BRIDGEの合成、および単量体色素構成成分のBRIDGEへの結合に関して記載され得る。単量体色素、および官能基または反応基を含む単量体色素の合成がここで記載される。
適切な単量体色素、および官能基または反応基を含む単量体色素は、公知の手順または任意の適切な手順によって傷をつける(scratch)ことによって、あるいは、適切なもしくは所望されるコア構造をすでに有している市販されている材料を修飾することによって、調製することができる。多くの単量体アクリジン色素を、市販されているアクリジン色素から調製することができる。合成のための適切な出発材料となり得る市販されているアクリジン色素のいくつかの例が、すぐ下に示される。
反応1
スキーム1
構造11
スキーム3
スキーム5
BRIDGEは、通常、単量体色素がニ官能性の基または三官能性の基(多くの場合は、市販されている)に結合させられると形成される。一般的には、BRIDGEの末端部分は、単量体色素自体に由来し、一方、BRIDGEの中央部分は、商業的な供給業者から入手することができる二官能性または三官能性分子に由来する。いくつかの場合には、BRIDGEの有意な部分(例えば、約90%まで)は、二量体または三量体色素の最終的なアセンブリの前に単量体色素に予め結合させられ得る。いくつかの他の場合には、BRIDGEの大部分は、単量体色素が結合させられる前に別々に調製され得る。ヘテロ二量体の合成の場合には、一保護二官能性リンカー基が、通常は最初に1つの単量体色素に結合させられ、続いて、脱保護、および第2の単量体色素へのカップリングが行われる。ヘテロ三量体色素は、同様の段階的な保護−脱保護ストラテジーを使用して合成することができる。
一般的には、二量体色素および三量体色素は、ホモ二量体のいくつかについては1工程のカップリング反応において、あるいは、ヘテロ二量体および三量体、または複数の架橋エレメントAを含むホモ二量体のいくつかについては多工程の反応において、適切な反応基を有している単量体色素を、二官能性リンカーまたは三官能性リンカーと結合させることによってアセンブリさせることができる。選択されたホモ二量体およびヘテロ二量体への合成経路の例は、すぐ下のスキーム6に模式的に示される。
スキーム6
10−(3−ヨードプロピル)アクリジンオレンジ、ヨウ化物の調製
1等量の1,3−ジヨードプロパンを、10mLのクロロベンゼン中の5gのアクリジンオレンジ(Aldrich)の懸濁液に添加した。得られた混合物を、90〜100℃で一晩攪拌した。熱い反応混合物を約200mLのEtOAcに注いだ。オレンジ色の沈殿物を濾過によって回収し、減圧下で乾燥させると、約8gが得られた。
10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ、塩化物塩の調製
10−(5−エトキシカルボニルペンチル)アクリジンブロマイドを、1,3−ジヨードプロパンをエチル6−ブロモヘキサン酸で置き換えたことを除き、実施例1の手順を使用して調製した。粗生成物(5g)を、約100mLのメタノールと、30mLのH2Oに溶解させた3等量のNaOHの中に懸濁させた。懸濁液を、室温で24時間攪拌した。メタノールを蒸発によって除去し、そして残りの水溶液を濃HClで酸性化させた。約50mLの飽和NaClを生成物を沈殿させるために添加した。生成物を濾過によって回収し、その後、45℃で24時間、減圧下で乾燥させた。
DMAO(表2の色素番号1)の調製
10−(3−ヨードプロピル)アクリジンオレンジ、ヨウ化物(100mg)を、シールド管の中のメタノール中の20mLの2Mジメチルアミンの中に懸濁させ、その後、60℃で一晩攪拌した。混合物を室温に冷却し、その後、50mLのEtOAcに注いだ。沈殿を遠心分離によって回収し、その後、40℃で24時間、減圧下で乾燥させた。
TMAO(表2の色素番号2)の調製
CH3OH(2mL)中のDMAO(表2の色素番号1)(11mg、0.023mmol)とCH3I(0.5mL)の混合物を、4日間穏やかに還流させた。オレンジ色の生成物(10mg)を吸引濾過によって回収した。
PMAO(表2の色素番号5)の調製
CH3OH(10mL)中の10−(3−ヨードプロピル)アクリジンオレンジヨウ化物塩(100mg、0.18mmol)とN,N,N’N’−テトラメチル−1,3−プロパンジアミン(0.3mL、1.8mmol)の混合物を一晩還流させた。室温に冷却した後、沈殿を吸引濾過によって回収した。沈殿をCH3OH(5mL)中に再懸濁させ、一晩還流させて、そして吸引濾過によって回収した。これを、減圧下で恒量になるまで乾燥させると、濃い赤色の固形物(14mg)が得られた。
AOAO−2Q(表2の色素番号9)の調製:
DMF(1.5mL)中の10−(3−ヨードプロピル)アクリジンオレンジヨウ化物塩(81mg、0.15mmol)とPMAO(100mg、0.15mmol)の混合物を、130℃で7時間加熱した。室温に冷却した後、CH3OH(15mL)を添加し、懸濁液を1時間、還流させるために加熱した。吸引濾過すると、生成物が濃い赤色の固形物として得られた(83.1mg)。
AOAO−2(表2の色素番号7)の調製
Et3N(0.15mL、1.05mmol)およびTSTU(320mg、1.05mmol)を、室温のDMF(5mL)中の10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(438mg、1.03mmol)の懸濁液に添加した。混合物を室温で15分間攪拌し、その後、Et3N(0.1mL)と3,3’−ジアミノ−N−メチルジプロピルアミン(50mg、0.344mmol)を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した後、EtOAc(20mL)を添加して生成物を沈殿させた。粗生成物をDMFの中に再度溶解させ、EtOAcで再び沈殿させた。固形物(250mg)を遠心分離によって分離した。
AOAO−3(表2の色素番号8)の調製
色素(393mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ(432mg、1.03mmol)とエチレンジアミン(25mg、0.42mmol)からAOAO−2を合成するための手順を使用して調製した。
10−(8−ブロモオクチル)アクリジンオレンジブロマイドの調製
クロロベンゼン(15mL)中のアクリジンオレンジ(2g、7.53mmol)と1,8−ジブロモアセタン(1,8−dibromoactane)(12mL、67.8mmol)の混合物を、110℃で一晩加熱した。EtOAc(50mL)を添加し、そして懸濁液を1時間還流させた。室温に冷却させた後、吸引濾過すると、生成物がオレンジ色の固形物(3.56g)として得られた。
AOAO−5(表2の色素番号11)の調製
DMF(5mL)中の10−(8−ブロモアセチル)アクリジンオレンジブロマイド(10−(8−bromoactyl)acridine orange bromide)(0.5g、0.94mmol)とアクリジンオレンジ(0.3g、11.2mmol)の混合物を、130℃で一晩加熱した。EtOAcを添加して生成物を沈殿させた。DMFとEtOAcからの沈殿を繰り返すことにより、生成物が濃い赤色の固形物(214mg)として得られた。
AOAO−7(表2の色素番号13)の調製
色素(30mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(121mg、0.29mmol)と1,5−ジアミノ−ペンタンジヒドロクロライド(20mg、0.12mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して合成した。
AOAO−8(表2の色素番号15)の調製
色素(182mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(241mg、0.58mmol)とピペラジン(20mg、0.23mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して合成した。
AOAO−11(表2の色素番号18)の調製
色素(112mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(180mg、0.43mmol)と1,8−ジアミノ−オクタン(25mg、0.17mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して合成した。
AOAO−12(表2の色素番号19)の調製
色素(76mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(147mg、0.35mmol)と2,2’オキシビス(エチル−アミン)ジヒドロクロライド(25mg、0.14mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して合成した。
AOAO−13(表2の色素番号20)の調製
色素(64mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(96mg、0.23mmol)と4,7,10−トリオキサ−1,13−トリデカンジアミン(20mg、0.09mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して合成した。
1,3−ジ−((2−(N−t−Boc−アミノ)エチル)アミノカルボニル)ベンゼン(色素番号101、すぐ下に示す)の調製
1,3−ジ−((2−アミノエチル)アミノカルボニル)ベンゼン、トロフルオロ酢酸塩(色素番号102、すぐ下に示す)の調製
AOAO−9(表2の色素番号16)の調製
色素(55mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(109mg、0.26mmol)と1,3−ジ((2−アミノエチル)アミノカルボニル)ベンゼン、トロフルオロ酢酸塩(50mg、0.1mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して調製した。
1,3−ジ((5−’N−t−Boc−アミノ)ペンチル)アミノカルボニル)ベンゼン(色素番号103、すぐ下に示す)の調製
1,3−ジ((5−アミノペンチル)アミノカルボニル)ベンゼン、トリフルオロ酢酸塩(色素番号104、すぐ下に示す)の調製
AOAO−10(表2の色素番号17)の調製
色素(22mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物(95mg、0.23mmol)と色素番号104(50mg、0.09mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して調製した。
AOAO−14(表2の色素番号21)の調製
色素(150mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物(166mg、0.40mmol)とジアミド−dPEG−ジアミン(Quanta Biodesign of Powell,Ohio)(100mg、0.15mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して調製した。
10−((((3−(N−Boc−アミノ)プロピル)−N,N−ジメチル)アンモニウム)プロピル)アクリジン、ニヨウ化物(色素番号105、すぐ下に示す)の調製
10−((((3−アンモニウム)プロピル)−N,N−ジメチル)アンモニウム)プロピル)アクリジン、トリフルオロ酢酸塩(色素番号106、すぐ下に示す)の調製
AOAO−4(表2の色素番号10)の調製
色素(23mg)を、10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(31mg、0.075mmol)と色素番号106(28mg、0.036mmol)からAOAO−2を作成するための手順を使用して調製した。
10−(6−(N−フタルイミド)ヘキシル)アクリジンオレンジ臭化物塩(色素番号107、すぐ下に示される)の調製
10−(5−((5−カルボキシペンチル)アミノカルボニル)ペンチル)アクリジンオレンジ、ヨウ化塩(色素番号108、すぐ下に示される)の調製
9−シアノ−10−(5−カルボキシペンチル)アクリジンオレンジ、塩化物(色素番号109、すぐ下に示す)の調製
AOAO−12R(表2の色素番号22)の調製
Et3N(32μL、0.23mmol)およびTSTU(68mg、0.227mmol)を、室温のDMF(2mL)中の色素番号109(98.3mg、0.223mmol)の溶液に添加した。混合物を室温で15分間攪拌した。その後、Et3N(100μL)と2,2’−オキシビス−(エチルアミン)ジヒドロクロライド(16mg、0.09mmol)を添加した。混合物を、室温で2日間攪拌した。溶液を約1mLにまで濃縮し、EtOAc(2mL)を添加した。沈殿を遠心分離によって回収した。生成物をDMF中に再度溶解させ、EtOAcで再び沈殿させると、色素番号22が濃い青色の固形物(54.4mg)として得られた。
9−アミノカルボニル−10−(5−カルボキシペンチル)アクリジン(色素番号110、すぐ下に示す)の調製
N−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ(すぐ下に示す)の調製
TOTO−3(表2の色素番号14)の調製
色素(354mg)を、N−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ(460mg、1.04mmol)とエチレンジアミン(25mg,0.42mmol)からAOAO−2を合成するための手順を使用して調製した。
10−(5−((2−N−t−Boc−アミノ)エチル)アミノカルボニル)ペンチル)アクリジンオレンジ塩化物塩(色素番号111、すぐ下に示す)の調製
10−(5−((2−アンモニウムメチル)アミノカルボニル)ペンチル)アクリジンオレンジ、トリフルオロ酢酸塩(色素番号112、すぐ下に示す)の調製
AOTO−3(表2の色素番号23)の調製
Et3N(20μL、0.142mmol)およびTSTU(42.2mg、0.142mmol)を、DMF(1mL)中のN−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ(62mg、0.142mmol)の溶液に添加した。混合物を室温で15分間攪拌した。その後、Et3N(70μL)と色素番号112(50mg、0.095mmol)を添加した。混合物を室温で2時間攪拌し、その後、減圧下で乾燥物となるまで濃縮した。残渣をDMF(1mL)中に再度溶解させ、そしてEtOAc(2mL)を添加した。沈殿を遠心分離によって回収した。DMFとEtOAcからの沈殿を繰り返すと、生成物がオレンジ赤色の固形物(50.4mg)として得られた。
TOTO−12(表2の色素番号24)の調製
色素(19.4mg)を、N−カルボキシペンチルチアゾールオレンジ(94.5mg、0.2145mmol)と2,2’オキシビス(エチルアミン)ジヒドロクロライド(15mg、0.085mmol)からAOAO−2を合成するための手順を使用して調製した。
TO(3)TO(3)−12(表2の色素番号25)の調製
色素(32.6mg)を、N−カルボキシペンチルチアゾールブルー(N−carboxypentyl thazole blue)(Carreon,et al.,Org.Let.6(4),517(2004);およびBenson,et al.,Nucleic Acid Res.21(24),5727(1993))(99mg、0.212mmol)と2,2’オキシビス(エチルアミン)ジヒドロクロライド(15mg、0.085mmol)からAOAO−2を合成するための手順を使用して調製した。
TO(3)TO(3)−2(表2の色素番号26)の調製
色素(28.4mg)を、N−カルボキシペンチルチアゾールブルー(76mg、0.173mmol)と3,3’−ジアミノ−N−メチルジ−プロピルアミン(10mg、0.069mmol)からAOAO−2を合成するための手順を使用して調製した。
10−(5−((5−(N−t−Boc−アミノ)ペンチル)アミノカルボニル)ペンチル)−アクリジンオレンジ、塩化物(色素番号113、すぐ下に示す)の調製
10−(5−((5−アンモニウムペンチル)アミノカルボニル)ペンチル)アクリジンオレンジ、トリフルオロ酢酸塩(色素番号114、すぐ下に示す)の調製
AORO−7(表2の色素番号27)の調製
化合物(29mg)を、化合物番号114(35mg、0.061mmol)とロサミン色素(Biotium,Inc.(Hayward,CA))(40mg、0.063mmol)からAOTO−3を合成するための手順を使用して調製した。
DMAOおよびAOAO−7の吸光度および蛍光
DMAOおよびAOAO−7の、図2および図3に示す吸収スペクトル、ならびに図4に示す蛍光放射スペクトルを、PBS緩衝液中で、DNAの存在を伴わずに、またはDNAの存在(2mg/mLのサケ精子DNA)を伴って、別々に測定した。色素濃度は全て、495nmで0.05の光学密度となるように調整した。スペクトルを、吸光度のプロットにおいては1に正規化した。DMAOと比較すると、AOAO−7は、吸光度において471nmに新しい短い波長のピークを示し、これは、AOAO−7の中での2つのアクリジン単量体の凝集を示している。DNAに結合すると、AOAO−7とDMAOの吸光度は、それぞれ、遊離の色素と比較すると5nmおよび10nmの赤色のシフトを示した。遊離のAOAO−7の蛍光は、DMAOの蛍光よりも約5倍少ない。AOAO−7のより低いバックグラウンドの蛍光は、リアルタイムqPCRにおいては有利である。AOAO−7のアクリジン単量体1つあたりの蛍光はDMAOの蛍光に近く、これは、DNAに結合すると、AOAO−7の2つの単量体はもはや互いに消光することはなく、2つの間のリンカーは、量子収量に対してネガティブな作用は示さないことを示している。
TOTO−1およびTOTO3の吸収スペクトル
実施例42に関して記載した様式と同様の様式において、TOTO−1およびTOTO−3の吸収スペクトルを、PBS緩衝液の中で、図5に示すようにDNAの存在を伴わずに、または図6に示すように、2mg/mLのサケ精子DNAの存在下で測定した。図5に示すように、遊離の色素のスペクトルは、中性であるかまたは実質的に正電荷を含まないBRIDGEを有しているTOTO−3は分子内H二量体またはヘアピン構造を形成するが、複数の正電荷を有しているTOTO−1は、ほとんどスペクトルがシフトしないことを示している。図6に示すように、DNAの存在下では、TOTO−1およびTOTO−3のいずれの吸収スペクトルもほぼ同じ位置にシフトし、これは、TOTO−3二量体のヘアピン構造がDNAに結合すると開くこと、およびTOTO−1とTOTO−3はいずれも、同様のタイプのDNA−色素錯体を形成することを示している。
様々な量のDNAに対して応答するAOAO−12の蛍光
0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、および10μg/mLの最終濃度のサケ精子DNAまたは一本鎖の20マーのオリゴヌクレオチドの混合物の存在下での、200mLのPBS中の0.1μMのAOAO−12の蛍光を、マイクロタイタープレートリーダー(SpectraMax of Molecular Devices Corporation(Sunnyvale,CA))上で測定した。蛍光を図7に示すように、DNAの濃度に対してプロットした。蛍光が2.0μg/mLまでのDNAに対して直線的に反応したことを見ることができる(差し込み図)。さらに高いDNA濃度では、反応は、非直線的になる。AOAO−12は、二本鎖のDNAに結合した場合には、一本鎖のDNAに結合した場合よりも強い蛍光を発する。
qPCRにおけるAOAO−12およびSYBR Green Iのシグナル強度の比較
本実施例では、qPCRにおける蛍光シグナルの強度において、SYBR Green Iよりも優れたAOAO−12の特性を明らかにする。全てのリアルタイム増幅を、10mMのTris(pH 8.0)、50mMのKCl、3.5mMのMgCl2、2mMの各dNTP、および1単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼ(ABI,Foster City,CA)、および様々な濃度の蛍光をモニターするための色素を含む、20μLの反応溶液の中で行った。pTOPOプラスミド中のATPB断片(配列番号1)を、0.5μMの正方向プライマー5’−GAGGTCTTCACAGGTCATA−3’(配列番号2)、0.5μMの逆方向プライマー5’−CTCTTCAGCCAGCTTATC−3’(配列番号3)を用いて増幅させた。熱によるレジュメは、95℃で1分間、続いて、95℃で15秒間、55℃で15秒間、および72℃で15秒間のサイクルを50サイクルと設定した。蛍光は、55℃の段階で測定した。以前の報告(Nath,K.,et al.,Effects of ethidium bromide and SYBR Green I on different polymerase chain reaction systems,J.Biochem Biophys Methods 42,15(2000))と一致して、SYBR Green Iは、図8に示すように、PCR反応に対する阻害を示した。ここでは、Ctは、より高いSYBR Green I濃度では遅れた。SYBR Green I濃度と比較すると、より高いAOAO−12濃度を、阻害を示すことなく反応に添加することができた。結果として、AOAO−12を用いた場合の最終的な蛍光強度は数倍高くなる場合があり、これによって、より感度の高い検出が可能となる。あるいは、AOAO−12を用いた場合には、感度の低い光学デバイスを、サーマルサイクラー蛍光光度計(thermal cycling fluorometer)において使用することができ、それによって、より安価な機器がもたらされる。
ヒトゲノムDNAの滴定
ヒトゲノムDNAからのUBC断片(配列番号8)の増幅を、(1)異なる正方向プライマーと逆方向プライマーのセット(5’−ACTGGTAAGACCATCACC−3’(配列番号9)および5’−GCAATGAAATTTGTTGAA−3’(配列番号10))を使用したこと、ならびに、(2)ヒトDNAの10倍稀釈物のシリーズを鋳型としたことを除いて、SYBR Green I(495nmでの最終的な吸収ピークは0.025の光学密度に相当する、すなわち、A495=0.025)またはAOAO−12(最終A495=0.1)を用いて、実施例45に示した条件と同様の条件下で行った。図8は、SYBR Green IまたはAOAO−12のいずれかを用いて、ヒトDNAの105コピーで始めて10コピーまで減少する複数の反応の増幅プロットを示す。差し込み図は、Ct値は、いずれの色素を用いた場合も、モニターした最初のコピー数の対数と逆の相関関係にあることを示している。AOAO−12は、シグナル強度においてはSYBR Green Iよりも明らかに優れている。
qPCRにおけるTO、TOTO−1、およびTOTO12
本実施例は、qPCRにおける、TO(チアゾールオレンジ、非対称シアニン色素)またはTOTO−1を上回る改良されたTOTO−12の特性を明らかにする。リアルタイム増幅は全て、TO、TOTO−1、およびTOTO−12を使用したことを除いて、実施例5に記載したように行った。図11に示すように、TOTO−1は、PCR反応を完全に阻害したが、TOTO−12は、qPCRにおいては、TOと比較すると、改善されたCt値と改善された蛍光強度を生じた。TOTO−12二量体色素は、TOおよびTOTO−1色素のそれぞれよりも優れている。
AORO−7の吸光度および蛍光
実施例42に関して記載した様式と同様の様式において、AORO−7の吸収スペクトルを、図12に示すように、PBS緩衝液中で単独で、または2μg/mLのサケ精子DNAの存在下で得た。DNAに結合したAORO−7の放射スペクトルを図13に示す。ヘテロ二量体色素AORO−7には単量体AO色素と、蛍光非核酸ロサミンRO色素が含まれる。2つの放射ピーク(それぞれ、AO部分とRO部分による)が記録された。Bio−Rad Laboratories(Hercules,CA)によるChromo4上での、490nmに設定された励起と530nmで回収される放射、すなわち、Ex490/Em530を用いたチャンネル1において、あるいは、Ex580/Em630を用いたチャンネル3においては、AORO−7を用いてqPCRを記録することができたが、チャンネル2(Ex520/Em570)では弱かった(データは示さない)。蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の効果は無視できるほどであるため、単量体色素構成成分であるAOまたはROのいずれをも、レポーター色素として選択することができる。
qPCRにおけるヘテロ二量体色素AORO−7
本実施例は、qPCRにおけるAORO−7の有用性を示す。リアルタイム増幅を、最終的な溶液中で600nmで0.025の光学密度を有しているAORO−7を使用したことを除いて、実施例5のように行った。図14に示すように、AORO−7は、qPCRの反応経過をモニターするために、そしてアンプリコンの融解曲線(差し込み図)を検出するために、有効に使用することができる。このqPCRが、Bio−Rad Laboratories(Hercules,CA)によるiCycle IQ Multiple−Color Real−Time PCR Detection Systemのチャンネル3(Ex580/Em630)でモニターできたという知見は、所望される波長のほとんどの全ての色素が、本明細書中に開示される方法によるqPCRでのDNAレポーター色素に合い、したがって、スペクトルの使用をqPCRのモニタリングに拡大することができることの一例を提供する。現在、ほとんどのTaqManプローブにはFAMまたなVICが使用されている。これらは、SYBR GreenIと同じチャンネルを占めている。配列特異的プローブ(例えば、TaqManプローブ)と、異なる波長の配列非特異的色素(例えば、AORO−7)をqPCRにおいて使用することが有利である。この場合、プローブによっては、配列特異性が提供され、そして色素によっては、アンプリコンの他のパラメーター(例えば、融点)が提供される。
AOAO−12を用いてモニターした融解ピーク
SYBR Green Iは、アンプリコンの融点をqPCR増幅の後に検出することができるという点で有利であることが報告されている。融点は、アンプリコンについての有用な情報を提供する。なぜなら、これは、アンプリコンの大きさとGC含有量の関数であるからである。融点は、TaqMan反応からは得ることはできない。4種類のアンプリコン、すなわち、HMBS(配列番号4)、RPL4(配列番号5)、SDHA(配列番号6)、およびTBP(配列番号7)による融解曲線を、AOAO−12(パネルA)またはSYBR Green(パネルB)の存在下で増幅させた反応から測定し、そして図15に示す。AOAO−12を用いて得られた融解ピークは、SYBR Green Iを用いて得られたピークと相関関係があった。AOAO−12は、SYBR Green Iよりも弱いが、高い親和性でDNAに結合するため、AOAO−12による融点は、SYBR Green Iによる融点よりも約2℃低い。より高い濃度のAOAO−12をリアルタイムPCR反応において使用することができるため、融解ピークは顕著により高い。データは、AOAO−12の相対的な有用性を示している。
AOAO色素の安定性
単量体AOを含む二量体色素の安定性を明らかにした。具体的には、AOAO−12を、PCR産物を含むPCR反応緩衝液の中で維持した。混合物を96℃で40分間加熱した。加熱過程の間に、混合物を、蛍光をモニターするために一時的に60℃に冷却した。図16に示すように、AOAO−12は、96℃で40分間安定であり、実質的な蛍光の消失はない。データは、PCRにおけるAOAO−12の構造安定性を示している。
TOTO−13(表2の色素番号29)の調製
色素(102mg)を、Nカルボキシペンチルチアゾールオレンジ(102mg、0.23ミリモル)(実施例31)と4,7,10−トリオキサ−1,13−トリデカンジアミン(23mg、0.1モル)からAOAO−2(表2の色素番号7)を合成するための手順を使用して調製した。
N−(5−カルボキシペンチル)−4−(4−(ジメチルアミノ)スチリル)ピリジニウムブロマイドの調製
エタノール(100mL)中の4−N,N−ジメチルアミノベンズアルデヒド(3g、20ミリモル)、N−(5−カルボキシ−ペンチル)ピコリニウムブロマイド(5.6g、20ミリモル)、およびピペリジン(2mL)の混合物を、60℃で一晩加熱した。混合物を減圧下で乾燥物となるまで蒸発させた。残渣をメタノールの中に再度溶解させ、その後、エーテルで沈殿させると、生成物(6.7g)が得られた。
STST−19(表2の色素番号31)の調製
色素(85mg)を、N−(5−カルボキシペンチル)−4−(4−(ジメチルアミノ)スチリル)ピリジニウムブロマイド(実施例53)(200mg、0.5ミリモル)と2,2’−オキシビス(エチルアミン)ジヒドロクロライド(36mg、0.2ミリモル)からAOAO−2(実施例7)を調製するための手順を使用して調製した。
STST−27(表2の色素番号30)の調製
色素(81.8mg)を、N−(5−カルボキシペンチル)−4−(4−ジメチルアミノ)スチリル)ピリジニウムブロマイド(実施例53)(200mg、0.5ミリモル)と4,7,10−トリオキサ−1,13−トリデカンジアミン(44mg、0.2ミリモル)からAOAO−2(実施例7)を調製するための手順を使用して調製した。
Claims (50)
- 標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する方法であって:
該試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程であって、該蛍光核酸色素は以下の式を有しており:
該標的核酸の増幅のために十分である該試験溶液を使用してプロセスを実行する工程であって、該試料には、該標的核酸が含まれるはずである、工程;ならびに、
該レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で該試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。 - 標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定する方法であって:
該試料と蛍光核酸色素を含む試験溶液を提供する工程であって、該蛍光核酸色素は以下の式を有しており:
該標的核酸の増幅のために十分である該試験溶液を使用してプロセスを実行する工程であって、該試料には、該標的核酸が含まれるはずである、工程;ならびに、
該レポーター色素構成成分による吸収に十分な波長の光で該試験溶液を照射する工程と、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。 - 前記蛍光核酸色素構成成分が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される、請求項1および2のいずれかに記載の方法。
- 前記実行工程に、リアルタイムPCRプロセスを実行する工程が含まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記Q1色素構成成分および前記Q2色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造:
R2とR3の一方は、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R2が、BRIDGEが該構造に結合していることを示す場合には、R3はHまたは−CH3であり;
R3が、BRIDGEが該構造に結合していることを示す場合には、R2は、H、−CH3、−NH2、−NHCH3、−CN、および−C(=O)NH2から選択され;
R6はそれぞれ独立して、HまたはC1〜C2(C1、C2を含む)アルキルであり;
R7はそれぞれ独立して、HまたはC1〜C2(C1、C2を含む)アルキルであり;
隣接しているR6またはR7とR1のそれぞれの対について、R6またはR7とR1は独立して、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成し;そして、
Ψは、陰イオンである、
構造を有している、請求項1に記載の方法。 - R1はそれぞれHであり;R2はHであり:R3は、BRIDGEが前記構造に結合していることを示し;R6がそれぞれ−CH3であり;そしてR7はそれぞれ−CH3である、請求項5に記載の方法。
- 前記Q1色素構成成分および前記Q2色素構成成分の少なくとも一方の色素構成成分が以下の構造:
R1’に、R9、R10、R11、R12、R13、R14、および、R15の少なくとも1つが含まれている場合には、前記R9、R10、R11、R12、R13、R14、および、R15のうちの任意のものは、独立して、H、または、状況に応じて1個から2個(1、2を含む)の窒素が組み込まれている、1個の炭素から12個の炭素(1、12を含む)を有しているアルキル;または、アリールであり;
R1’にR11とR12が含まれている場合には、R11とR12は、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、NおよびOから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれ;
Xは、OおよびSから選択され;
nは、0、1、および2から選択され;
R6は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R7は、H;状況に応じて、アリールと、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個(1、10を含むの炭素)を有しているアルキルもしくはアルケニル;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R8は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R8’は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり;
R8とR8’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、C1〜C2(C1、C2を含む)アルキル、C1〜C2(C1、C2を含む)アルコキシ、C1〜C2(C1、C2を含む)アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに1回から4回(1回、4回を含む)置換することができ;
R16およびR17の少なくとも一方が含まれている任意のR6、R8、およびR8’については、該R16およびR17の任意のものは、独立して、H;状況に応じて1個から2個の窒素が組み込まれている、1個の炭素から12個の炭素(1、12を含む)を有しているアルキル、またはアリールであり;
R16およびR17が含まれている任意のR6、R8、およびR8’については、該R16およびR17は、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、NおよびOから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれ;
R1’、R6、R7、およびR8の1つだけが、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;そして
Ψは、陰イオンである、
構造を有している、請求項1に記載の方法。 - BRIDGEが以下の式:
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、0、または1から約20(1、20を含む)までの整数であり;そして
a、b、c、d、e、f、g、h、およびiはそれぞれ独立して、0、または1から約20(1、20を含む)までの整数である、
式を有している、請求項1に記載の方法。 - BRIDGEに、約8個から約100個(1、100を含む)の水素以外の原子が含まれている、請求項10に記載の方法。
- A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、およびA10がそれぞれ独立して、少なくとも1つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、チオ尿素結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合が含まれている少なくとも1つの連結結合が含まれている部分を含むNABEG;あるいは、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれているアリールである、請求項10に記載の方法。
- 式中、xが5であり;αとγが同じであり、2または3であり、;βは2であり;bは0、1、2、または3であり;そして、cは1である、請求項13に記載の方法。
- Q1およびQ2が同じである、請求項13に記載の方法。
- 前記Q1色素構成成分および前記Q2色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造:
R1’に、R9、R10、R11、R12、R13、R14、および、R15の少なくとも1つが含まれている場合には、該R9、R10、R11、R12、R13、R14、および、R15のうちの任意のものは、独立して、H、または、状況に応じて1個から2個(1、2を含む)の窒素が組み込まれている、1個の炭素から12個の炭素(1、12を含む)を有しているアルキル;または、アリールであり;
R1’にR11とR12が含まれている場合には、R11とR12は、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、NおよびOから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれ;
Xは、OおよびSから選択され;
nは、0、1、および2から選択され;
R6は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R7は、H;状況に応じて、アリールと、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R8は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R8’は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり;
R8とR8’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、C1〜C2(C1、C2を含む)アルキル、C1〜C2(C1、C2を含む)アルコキシ、C1〜C2(C1、C2を含む)アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに1回から4回(1回、4回を含む)置換することができ;
R16およびR17の少なくとも一方が含まれている任意のR6、R8、およびR8’については、該R16およびR17の任意のものは、独立して、H;状況に応じて1個から2個の窒素が組み込まれている、1個の炭素から12個の炭素(1、12を含む)を有しているアルキル、またはアリールであり;
R16およびR17が含まれている任意のR6、R8、およびR8’については、該R16およびR17は、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、NおよびOから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれ;
R1’、R6、R7、およびR8の1つだけが、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項13に記載の方法。 - 以下の式:
BRIDGEには約8個から約150個の水素以外の原子と、1個までの正電荷が含まれており、そして以下の式を有しており:
A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、およびA10はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基(NABEG);状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル;あるいは、状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている少なくとも1つの飽和した5員環または6員環であり;
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、0、または1から約20(1、20を含む)までの整数であり;そして
a、b、c、d、e、f、g、h、およびiはそれぞれ独立して、0、または1から約20(1、20を含む)までの整数であり;
式中、該Q1色素構成成分が非対称シアニン色素であり、該Q2色素構成成分が非対称シアニン色素である場合には、a、b、c、d、e、f、g、h、およびiの合計は、3よりも大きい数であり、または、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、およびA10の少なくとも1つは、少なくとも1つのアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、またはチオ尿素結合が含まれている少なくとも1つの連結結合が含まれている部分を含むNABEG;あるいは、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれているアリールである
式を有している組成物。 - BRIDGEに、約12個から約60個(12、60を含む)の水素以外の原子が含まれている、請求項21に記載の組成物。
- BRIDGEに、約15個から約40個(15、40を含む)の水素以外の原子が含まれている、請求項21に記載の組成物。
- Q1が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される蛍光核酸色素構成成分であり、そしてQ2が、アクリジン色素、非対称シアニン色素、対称シアニン色素、フェナントリジニウム色素、およびピロニン色素、およびスチリル色素から選択される蛍光核酸色素構成成分である、請求項21に記載の組成物。
- 前記アクリジン色素が以下の構造:
R2とR3の一方は、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R2がBRIDGEが該構造に結合していることを示す場合には、R3はHまたは−CH3であり;
R3がBRIDGEが該構造に結合していることを示す場合には、R2は、H、−CH3、−NH2、−NHCH3、−CN、および−C(=O)NH2から選択され;
R6はそれぞれ独立して、HまたはC1〜C2(C1、C2を含む)アルキルであり;
R7はそれぞれ独立して、HまたはC1〜C2(C1、C2を含む)アルキルであり;
隣接しているR6またはR7とR1のそれぞれの対について、R6またはR7とR1は独立して、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成し;そして、
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項24に記載の組成物。 - R1はそれぞれHであり;R2はHであり:R3は、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;R6はそれぞれ−CH3であり;そしてR7はそれぞれ−CH3である、請求項25に記載の組成物。
- 前記非対称シアニン色素が以下の構造:
R1’に、R9、R10、R11、R12、R13、R14、および、R15の少なくとも1つが含まれている場合には、該R9、R10、R11、R12、R13、R14、および、R15のうちの任意のものは、独立して、H、または、状況に応じて1個から2個(1、2を含む)の窒素が組み込まれている、1個の炭素から12個の炭素(1、12を含む)を有しているアルキル;または、アリールであり;
R1’にR11とR12が含まれている場合には、R11とR12は、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、NおよびOから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれ;
Xは、OおよびSから選択され;
nは、0、1、および2から選択され;
R6は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R7は、H;状況に応じて、アリールと、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個のヘテロ原子(1、3を含む)が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R8は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R8’は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり;
R8とR8’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、C1〜C2(C1、C2を含む)アルキル、C1〜C2(C1、C2を含む)アルコキシ、C1〜C2(C1、C2を含む)アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに1回から4回(1回、4回を含む)置換することができ;
R16およびR17の少なくとも一方が含まれている任意のR6、R8、およびR8’については、該R16およびR17の任意のものは、独立して、H;状況に応じて1個から2個の窒素が組み込まれている、1個の炭素から12個の炭素(1、12を含む)を有しているアルキル、またはアリールであり;
R16およびR17が含まれている任意のR6、R8、およびR8’については、そのR16およびR17は、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、NおよびOから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれ;
R1’、R6、R7、およびR8の1つだけが、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項24に記載の組成物。 - 式中、xが5であり;αとγが同じであり、2または3であり、;βは2であり;bは0、1、2、または3であり;そして、cは1である、請求項30に記載の組成物。
- Q1およびQ2が同じである、請求項30に記載の組成物。
- 前記Q1色素構成成分および前記Q2色素構成成分のそれぞれの色素構成成分が以下の構造:
R1’に、R9、R10、R11、R12、R13、R14、および、R15の少なくとも1つが含まれている場合には、該R9、R10、R11、R12、R13、R14、および、R15のうちの任意のものは、独立して、H、または、状況に応じて1個から2個(1、2を含む)の窒素が組み込まれている、1個の炭素から12個の炭素(1、12を含む)を有しているアルキル;または、アリールであり;
R1’にR11とR12が含まれている場合には、R11とR12は、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、NおよびOから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれ;
Xは、OおよびSから選択され;
nは、0、1、および2から選択され;
R6は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R7は、H;状況に応じて、アリールと、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R8は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであるか;あるいは、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;
R8’は、H;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から10個の炭素(1、10を含む)を有しているアルキルもしくはアルケニル;ハロゲン;−OR16;−SR16;−NR16R17;または、状況に応じて、ハロゲン、N、O、およびSから選択される1個から3個(1、3を含む)のヘテロ原子が含まれている、置換されたもしくは未置換のアリールであり;
R8とR8’は、一緒に、縮合された芳香環を形成することができ、これは、C1〜C2(C1、C2を含む)アルキル、C1〜C2(C1、C2を含む)アルコキシ、C1〜C2(C1、C2を含む)アルキルメルカプト、またはハロゲンで、独立してさらに1回から4回(1回、4回を含む)置換することができ;
R16およびR17の少なくとも一方が含まれている任意のR6、R8、およびR8’については、該R16およびR17の任意のものは、独立して、H;状況に応じて1個から2個の窒素が組み込まれている、1個の炭素から12個の炭素(1、12を含む)を有しているアルキル、またはアリールであり;
R16およびR17が含まれている任意のR6、R8、およびR8’については、該R16およびR17は、一緒に、5員環または6員環の飽和または不飽和環を形成することができ、これには、状況に応じて、NおよびOから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれ;
R1’、R6、R7、およびR8の1つだけが、BRIDGEが該構造に結合していることを示し;そして
Ψは、陰イオンである
構造を有している、請求項30に記載の組成物。 - 以下の式:
式を有している組成物。 - BRIDGEに以下:
L1は、前記Q1色素構成成分および前記Q2色素構成成分のうちの一方の色素構成成分に共有結合させられており;
L2は、該一方の色素構成成分ではないQ1色素構成成分およびQ2色素構成成分のうちの色素構成成分に共有結合させられており;
A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、およびA10はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基(NABEG);状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル;あるいは、状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている少なくとも1つの飽和した5員環または6員環であり;
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、0、または1から約20(1、20を含む)までの整数であり;そして
a、b、c、d、e、f、g、h、およびiはそれぞれ独立して、0、または1から約20(1、20を含む)までの整数であり;
A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、およびA10の1つは、以下の式を有しており:
L3は、Q3に共有結合させられており、単結合を含む部分;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から約12個の炭素(1、12を含む)を有しているポリメチレン単位;または、状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれているアリールであり;そして、
B’は、以下の式を有しており:
A11、A12、A13、およびA14はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基(NABEG);状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル;あるいは、状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている少なくとも1つの飽和した5員環または6員環であり;
α’、β’、γ’、およびδ’はそれぞれ独立して、0、または1から約20まで(1、20を含む)の整数であり;そして
a’、b’、およびc’はそれぞれ独立して、0、または1から約20まで(1、20を含む)の整数である、
請求項41に記載の組成物。 - BRIDGEに以下:
L1は、前記Q1色素構成成分および前記Q2色素構成成分のうちの一方の色素構成成分に共有結合させられており;
L2は、該一方の色素構成成分ではないQ1色素構成成分およびQ2色素構成成分のうちの色素構成成分に共有結合させられており;
A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、およびA10はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基(NABEG);状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル;あるいは、状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている少なくとも1つの飽和した5員環または6員環であり;
α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、およびιはそれぞれ独立して、0、または1から約20(1、20を含む)までの整数であり;そして
a、b、c、d、e、f、g、h、およびiはそれぞれ独立して、0、または1から約20(1、20を含む)までの整数であり;そして、
A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、およびA10の1つは、以下の式を有しており:
L3は、Rrに共有結合させられており、単結合を含む部分;状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている、1個の炭素から約12個の炭素(1、12を含む)を有しているポリメチレン単位;または、状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれているアリールであり;そして、
B’は、以下の式を有しており:
A11、A12、A13、およびA14はそれぞれ独立して、核酸の結合を促進する基(NABEG);状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている分岐したアルキル;あるいは、状況に応じて、N、O、およびSから選択される少なくとも1つのヘテロ原子が含まれている少なくとも1つの飽和した5員環または6員環であり;
α’、β’、γ’、およびδ’はそれぞれ独立して、0、または1から約20まで(1、20を含む)の整数であり;そして
a’、b’、およびc’はそれぞれ独立して、0、または1から約20まで(1、20を含む)の整数である、
請求項43に記載の組成物。 - 請求項44に記載の組成物を基質分子に結合させる工程が含まれる、色素を使用する方法。
- 前記基質分子が、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ハプテン、薬剤、マイクロ粒子、合成ポリマー、天然ポリマー、生物学的細胞、ウイルス、および固体表面の分子から選択される、請求項45に記載の方法。
- 核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある、試料を調製する方法であって:
該試料と、請求項21、30、および41のいずれかに記載の組成物の組み合わせを提供する工程であって、ここでは、核酸が該試料中に存在している場合には、核酸−色素錯体が形成される工程、
が含まれる、方法。 - 前記組み合わせをインキュベートする工程がさらに含まれる、請求項47に記載の方法。
- 試料中の核酸の存在またはそれが存在しないことを決定する方法であって:
該試料と、請求項21、30、および41のいずれかに記載の組成物の組み合わせを提供する工程であって、ここでは、核酸が該試料中に存在している場合には、核酸−色素錯体が形成される工程;ならびに、
核酸錯体が形成された場合には、それによって光が吸収されるように、十分な波長の光で該組み合わせを照射し、そして、蛍光の放射またはそれがないことを決定する工程、
が含まれる、方法。 - 標的核酸が含まれている場合も、また、含まれていない場合もある、試料中の核酸の形成またはそれがないことを決定するためのキットであって:
該標的核酸が含まれているはずである該試料中の該標的核酸の増幅のために十分な少なくとも1つの組成物;および
請求項21、30、および41のいずれかに記載の組成物
が含まれている、キット。
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