KR101333434B1 - 이량체 및 삼량체 핵산 염료, 그리고 관련 시스템 및 방법 - Google Patents

이량체 및 삼량체 핵산 염료, 그리고 관련 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이량체 및 삼량체 핵산 염료, 및 관련 시스템 및 방법을 제공한다. 그러한 염료는 예를 들어 요구형 방출 기전(release-on-demand mechanism)을 통해 그 염료가 핵산을 염색할 수 있도록 하는 헤어핀상 구조를 형성할 수 있다. 그러한 염료는 핵산의 부재하에 낮은 배경 형광을 가질 수 있고, 핵산의 존재하에 예를 들어 핵산과의 결합시 높은 형광을 가질 수 있다. 본원에 제공되는 염료는 예를 들어 실시간 PCR에서의 DNA 정량화와 같은 각종 용도들에서 유용할 수 있다.
Figure R1020077023864
이량체 및 삼량체 핵산 염료, 요구형 방출 기전

Description

이량체 및 삼량체 핵산 염료, 그리고 관련 시스템 및 방법{DIMERIC AND TRIMERIC NUCLEIC ACID DYES, AND ASSOCIATED SYSTEMS AND METHODS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제60/663,613호(Mao et al ., 발명의 명칭: "이량체 및 삼량체 핵산 염료, 그리고 관련 시스템 및 방법", 2005년 3월 17일 출원)의 이익을 주장하고, 역시 미국 가출원 제60/663,613호의 이익을 주장하는, 상기 출원과 동시 출원된 동시 계류 미국 출원 제 __/__호(2006년 3월 16일 출원)에 관한 것이다. 상기 가출원 및 상기 동시 계류 출원은 각각 전체적으로 본원에 참고로 인용된다.
공동 연구 계약에 관한 당사자 명칭에 대한 설명
바이오티움 인코포레이티드(Biotium, Inc.)(미국 캘리포니아주 헤이워드 소재) 및 알레로직 바이오사이언시스 코포레이션(AlleLogic Biosciences Corp.)(미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)은 본 발명에 관한 공동 연구 계약에 대한 당사자이다.
서열 목록에 관한 참조, 및 그에 관한 요청 및 참고 인용
본원에 개시된 서열 번호 1 내지 서열 번호 10에 대한 서열 목록을 함유하는, 원래의 아스키(ASCII) 디스켓 및 그 원래의 디스켓의 사본인 또 다른 아스키 디스켓 뿐만 아니라 서열 목록의 종이 복사본은 상기 미국 가출원 제60/663,613호 에서 그 내용을 비롯한 전체가 참고로 제출, 언급 및 인용되어 있다. 서열 목록의 종이 복사본이 상기 가출원과 함께 제출되어 있다. 이로써 상기 미국 가출원 제60/663,613호에 대해 이미 제출된 컴플라이언트(compliant) 컴퓨터 판독가능한 서열 목록이 본 출원에 사용될 것이 요청된다. 본 출원에서 서열 목록의 종이 또는 컴팩트 디스크 복사본, 및 그것의 내용은 상기 미국 가출원 제60/663,613호에 대해 제출된 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 복사본과 동일하다. 서열 목록, 상기 가출원과 함께 제출된 서열 목록의 종이 복사본, 및 상기 미국 가출원 제60/663,613호에 대해 이미 제출된 컴퓨터 판독가능한 서열 목록은 그 내용을 비롯한 전체가 참고로 본원에 인용된다.
형광성 염료는 생물학적 샘플의 검출 및 분석을 위해 사용되어 왔다. 형광성 염료는 매우 감도가 높아, 매우 적은 수의 형광 분자를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 형광성 염료는 세포와 결합되어 있는 50개 미만의 형광 분자를 검출하는데 사용될 수 있다. [Barak, et al., J. Cell Biol . 90, 595(1981)].
형광성 염료는 또한 살아 있는 세포 또는 조직 샘플에서의 영상화에 사용하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 점균류(Dictyostelium) 세포의 표면 상의 수용체에 결합된 형광-염료 프로브는 형광 표지화된 cAMP의 단일 분자의 영상화에 사용되었다. [Ueda, et al ., Science 294, 864 (2001)]. 상이한 형광 파장을 가지는 수가지 형광 프로브들이 살아 있는 세포 또는 조직에서 다색 영상화를 수행하는데 사용될 수 있다. 형광 프로브는 매우 감도가 높고, 비교적 독성이 낮으며, 방사능 프로브에 대해 처분이 용이하다.
형광성 염료는 DNA 및 RNA를 비롯한 핵산, 및 핵산을 수반하는 생물학적 샘플의 검출에 사용될 수 있다. DNA 및 RNA와 같은 핵산 중합체는 유전 정보를 한 세대에서 다음 세대로 전달하며 그리고 생유기체의 일상적인 기능화에 전달하는 것과 관련이 있다. 이에 따라, 핵산이 유익하고, 연구 대상이 된다. 핵산에 특이적으로 결합하고 매우 형광성인 복합체를 형성하는 형광성 핵산 염료는 그러한 연구를 위한 유용한 도구이다. 이 염료는 순수 용액, 세포 추출물, 전기영동 겔, 마이크로어레이 칩, 생세포 또는 고정 세포, 사멸 세포 및 환경 샘플을 비롯한, 각종 매질 내 DNA 및 RNA의 존재 및 양을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이 염료는 게놈 연구 및 의료 진단에 사용되는 기법인 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에서의 DNA의 정량적 검출에 사용될 수 있다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 시험관내 특이적 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 프라이머 연장 반응이다. 일반적으로, PCR에서, 반응 용액은 96℃, 60℃ 및 72℃의 각각의 3가지 온도에서 단시간 유지하여, 가닥 분리 또는 변성, 어닐링 및 사슬 연장이 각각 일어나도록 한다. 이들 3가지 온도 단계는, 반응 혼합물을 함유하는 관을 매우 급속히 가열 또는 냉각시킬 수 있는 자동화 써모-사이클러(thermo-cycler)를 이용하여 30 또는 40회 사이클로 반복된다. PCR 사이클을 반복함으로써, 일정 시간(hr) 내 단일 효소 반응 혼합물에서 백만배 복사체를 생산할 수 있고, 이로써 연구원은 표적 DNA의 크기 및 서열을 결정할 수 있게 된다. 이 DNA 증폭 기법 은 클로닝 및 기타 분자 생물학적 조작을 위해 사용되어 왔다. PCR의 추가 논의가 문헌[Mullis, et al., Methods Enzymol .(1987)] 및 문헌[Saiki, et al., Science(1985)]에 제공되어 있다.
한 유용한 PCR-기초한 기법은 정량적 실시간 PCR(qPCR)이다. 요약하건대, qPCR의 기전은 지수적 방식의 표적 DNA의 PCR 증폭에 기초한다. PCR 반응을 실행하고, 증폭 반응의 과정 동안 주어진 시점에의 DNA 복사체의 총수를 측정함으로써, 출발 DNA 물질의 양을 소급적으로 계산할 수 있다.
형광-기초한 DNA 검출은 qPCR에 사용되는, 일반적으로 감도 있고 다목적이며 편리한 검출 방법이다. qPCR에 사용되는 2가지 유형의 형광성 시약이 있다. 제1 유형은 하나 이상의 형광성 염료로, 또는 형광성 염료와 켄처(quencher) 염료와의 조합물로 표지화된 올리고뉴클레오티드를 기초로 한다. 이 표지화된 올리고뉴클레오티드는 표적 서열로의 혼성화 시에, 또는 존재하는 DNA의 양에 비례하는 방식으로의 혼성화 후의 올리고뉴클레오티드의 절단 시에, 형광을 방출한다. 올리고-기초한 형광성 시약의 기전 및 사용이 각종 특허 및 공보에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Holland, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA(1991); Lee, et al., Nucleic Acids Res.(1993); 및 미국 특허 제5,210,015호, 동 제5,538,848호, 동 제6,258,569호, 동 제5,691,146호, 동 제5,925,517호, 동 제5,118,801호, 동 제5,312,728호, 및 동 제6,635,427호]를 참고한다. qPCR에 대한 올리고-기초한 형광성 시약이 표적 서열에 대해 매우 특이적이라는 이점을 가지나, 그것은 설계가 매우 복잡하고, 궁극적으로 사용하기에 고가이다. qPCR용 제2 유형의 형광성 시약은 형광성 핵산 염료(dye) 또는 착색제(stain)으로서 통상 칭해지는 DNA-결합 형광성 염료에 기초한다. 형광성 핵산 염료는 비교적 간단한 분자이기 때문에, 제조하기 용이하고, 따라서 사용하기 저렴하다. 그 염료의 qPCR에서의 사용은 실험실에서의 통상의 유전 검출에 유용하다.
모든 통상 이용가능한 형광성 핵산 착색제들이 qPCR에 사용될 수 있는 것은 아니다. 이상적으로, 형광성 핵산 염료는 qPCR 사용에 적당하기 위한 그러한 염료의 특정 기준을 충족해야 한다. 첫 째, 그것은 PCR 및 저장 중에 화학적으로 안정해야 한다. PCR이 고온에서 수행되기 때문에, 염료는 열에 안정해야 한다. 부가적으로, PCR에 사용되는 트리스(Tris) 완충액의 pH가 저온(4℃)에서의 알칼리성(pH 8.5) 내지 고온에서의 중성 또는 약산성 범위에 걸쳐 상당히 가변적일 수 있기 때문에, 염료는 산 또는 염기-보조 분해에 대해 내성을 가져야 한다. 둘 째, 염료는 PCR 용액 내에 존재할 경우, PCR 공정을 억제해서는 안된다. 셋 째, 염료는 DNA의 부재 하에 비형광성이거나 최소 형광성이어야 하고, DNA의 존재 하에 매우 형광성으로 되어야 한다. 넷 째, 염료는 예를 들어 FAM, JOE, VIC(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)), TAMRA, ROX, 텍사스 레드(Texas Red), Cy3 및 Cy5와 같은 통상의 형광성 염료에 대해 최적화된 광학 채널이 통상 장착된 현존 기기들과 상용적인 흡수 및 방출 파장을 가져야 한다. 다섯 째, 염료는 거의 없거나 전혀 없는 서열 우선성으로 DNA에 결합해야 한다. 여섯 째, DNA-염료 복합체는 존재하는 DNA의 양과 일차적(선형) 관계가 있는 형광 강도를 가져야 한다.
상기 기준이 주어질 경우, 매우 적은 수의 핵산-결합 염료가 qPCR에 사용될 수 있다는 점은 놀라운 일이 아니다. 에티듐 브로마이드(EB)는 qPCR용 단순 염료를 사용하는 개연성을 입증하기 위해 사용되었던 DNA 염료이다. 문헌[Higuchi, et al., Bio- Technol 10(4), 413(1992)]. 그러나, EB는 저감도 및 부적합 파장의 문제가 있다. 널리 사용되는 qPCR용 염료는 몰레큘러 프로브즈 인코포레이티드(Molecular Probes, Inc.)(미국 오레곤주 유젠 소재) 제조의 SYBR 그린(Green) I이다. 문헌[Wittwer, et al., Biotechniques 22(1), 130(1997)]을 참조할 수 있다. SYBR 그린은 고리 치환된 비대칭 시아닌 염료이다. 문헌[Zipper, et al., Nucleic Acids Res. 32(12), e1O3 (2004)]; 및 미국 특허 제5,436,134호 및 동 제5,658,751호를 참조할 있다. SYBR 그린 I의 이점은, 그것이 기기 대부분이 상용적인 FAM의 여기 및 방출 파장과 매우 근접하게 매칭되는 여기 및 방출 파장을 가진다는 점과, DNA와의 결합시 매우 큰 형광성을 가진다는 점이다. 최근, LC 그린이라 불리는 DNA 염료가 qPCR에 사용되었으나, 그 염료의 구조는 개시되어 있지 않다. LC 그린 염료는 대부분의 PCR 기기들에서 통상 사용되는 FAM 광학 채널에 매칭되는 바람직한 파장을 가지는 것으로 보이나, 그것은 SYBR 그린 I보다 상당히 덜 민감하다. 더욱 최근, BEBO로 불리는 DNA 마이너 그루브-바인더 및 BOXTO로 불리는 관련 염료(이 양자 모두는 비대칭 시아닌 염료임)는 qPCR에서의 그 사용에 대해 보고되어 있다. 문헌[Bengtsson, et al., Nucleic Acids Res. 31(8), e45 (2003)]; 및 미국 특허 출원 공보 제2004/0132046호를 참조할 수 있다. LC 그린과 마찬가지로, BEBO 및 BOXTO는 모두 감도 측면에서 SYBR 그린 I보다 상당히 뒤떨어진다.
SYBR 그린 I이 qPCR용 DNA 염료로서 널리 사용되어 왔으나, 그것은 여전히 수가지 측면에서 부족하다. 한 측면으로서, SYBR 그린 I은 PCR 공정에 대한 억제 효과를 갖고 있는데, 이는 염료 농도를 증가시킴으로써 달성할 수 있는 최대 신호 강도를 제한한다. SYBR 그린 I을 이용하는 qPCR의 형광 신호 강도는, 염료 농도가 PCR 공정을 유의적으로 억제하기 시작하는 시점에 도달할 때까지, 초기에는 염료 농도에 비례한다. 염료 농도의 추가 증가는 DNA 증폭 감소로 인해, 실제로 신호 강도를 저하시키거나, 사이클 수(Ct)를 증가시킨다. 다른 한 측면으로서, SYBR 그린 I은 저온 저장 시, PCR 완충액의 알칼리성 조건과 같은 알칼리성 조건 하에서 화학적으로 불안정하다. 4℃에서 트리스 완충액 내 저장된 SYBR 그린 I은 수일 기간 동안 상당히 분해된다는 점, 그리고 염료 분해 생성물은 외양상 강한 억제제이다는 점이 보고되어 있다. 문헌[Karsai, et al., Biotechniques 32(4), 790 (2002)]을 참조할 수 있다. 또 다른 측면으로, SYBR 그린 I은 단 하나의 형광 색상을 제공한다. 많은 상업적으로 입수가능한 형광 검출 기기는 다중 광학 채널(FAM 광학 채널 및 부가적 기타 광학 채널)을 가지고, 이에 따라 다중 형광 색상을 검출할 수 있다.
형광성 염료의 개발, 또는 그것의 제조 또는 사용이 요구되고 있다.
발명의 개요
예를 들어 qPCR 공정에서와 같은 유용한 용도들에 적당한 형광성 염료의 생산 또는 설계 방법이 제공된다. 그 방법은 가요성이고 실질적으로 중성(예를 들어, 중성 또는 약간 하전)일 수 있는 브릿지(bridge)를 통해 2 또는 3개 단량체 염료를 공유 결합시키는 것을 포함한다. 본원에 제공되는 염료의 생산 또는 설계 방법은 지금까지 수득될 수 없었던 파장 및/또는 기타 분광 성질을 가지는 형광성 핵산 염료가 개발되도록 할 수 있다.
예를 들어 상기 기재된 것과 같은 유용한 용도들에 적당한 형광성 염료가 제공된다. 본원에 기재된 방법에 따라 생산될 수 있는 이량체 또는 삼량체 염료는, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이, 염료가 요구형 방출 기전(release-on demand mechanism)을 통해 핵산을 염색할 수 있도록 하는 것으로 사료되는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 본원에 기재된 염료는 하기 특성들 중 하나 이상 또는 모든 특성을 가질 수 있다: 형광 배경이 있는 경우, 비교적 낮은 "형광 배경"(핵산 부재 하에서의 형광), 및 이상적으로는 형광 배경 부재; 비교적 낮은 PCR 억제, 및 이상적으로는 PCR 비억제; 비교적 높은 형광 신호 강도; 및 상대적 높은 안정성. 염료는 단지 한 예로서 SYBR 그린 I과 같은 현존 염료보다 상기 특성들 중 하나 이상, 또는 상기 특성들 모두에 대해 더 양호할 수 있다. 본원에 기재된 염료는 지금까지 수득될 수 없었던, 예를 들어 파장 및/또는 또 다른 분광 성질과 같은 성질을 가질 수 있다.
분자내 이량체 형성, 또는 헤어핀 구조의 형성이 가능한 이량체 및/또는 삼량체 핵산 염료 또는 착색제가 제공된다. 헤어핀-형상의 염료(hairpin-shaped dye)는 그 자체가 비형광성이거나 최소의 형광성일 수 있으나, 핵산의 존재 하에서 매우 형광성으로 될 수 있는 것으로 사료된다. 염료의 핵산 결합은 염료가 부분적으로 개방 무작위 입체형태(open random confirmation)를 형성하는 중간 상태를 경유하여 일어날 수 있는 것으로 사료된다. 또한, 염료의 이 개방 무작위 입체형태는 헤어핀 상태로 소량으로 또한 평형 상태로 존재할 수 있는 것으로 사료된다. 핵산의 양이 증가함에 따라, 염료의 핵산-결합 상태로의 헤어핀 상태의 평형 이동이 일어날 수 있어, 수득되는 형광 신호의 강도가 존재하는 핵산의 양에 실질적으로 일차적으로 비례할 수 있는 것으로 사료된다.
DNA 염색의 요구형 방출 기전으로 일컬어질 수 있는 상술된 기전은, 예를 들어 정량적 실시간 PCR(qPCR)과 같은 각종 용도들에 바람직할 수 있다. 단지 예로서, 헤어핀 구조의 형성은 "효과적 염료 농도"를 낮게 할 수 있어, 본원에 기재된 염료가 PCR 공정을 거의 간섭하지 않을 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 예를 들어 SYBR 그린 I과 같은 기존의 염료에 비해, 보다 높은 농도의 본원에 기재된 염료가 qPCR에 사용될 수 있다. 이 보다 높은 농도의 염료는 DNA 검출 감도를 아마도 상당히 증가시킬 수 있을 것이다.
샘플 내 핵산 형성 또는 그것의 결여를 결정하는 방법이 제공된다. 그 샘플은 표적 핵산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그러한 방법은 샘플 및 하기 화학식을 갖는 형광성 핵산 염료를 포함하는 시험 용액을 제공하는 단계를 포함할 수 있다:
Figure 112007074347589-pct00001
식 중에서, 브릿지는 약 8 내지 약 150개의 비-수소 원자를 포함하는 실질적으로 지방족이고 실질적으로 중성인 링커이고; Q1은 형광성 핵산 염료 성분, 비형광성 핵산 염료 성분, 형광성 비핵산 염료 성분 및 비형광성 비핵산 염료 성분으로부터 선택되는 염료 성분이며; Q2는 형광성 핵산 염료 성분, 비형광성 핵산 염료 성분, 형광성 비핵산 염료 성분 및 비형광성 비핵산 염료 성분으로부터 선택되는 염료 성분이다. 염료 성분은 예를 들어 본원에 기재된 것들과 같은 적당한 염료 성분들 중 임의의 것일 수 있다. 단지 예로서, 형광성 핵산 염료 성분은 아크리딘 염료, 비대칭 시아닌 염료, 대칭 시아닌 염료, 페난트리디늄 염료, 피로닌 염료, 및 스티릴 염료로부터 선택될 수 있다. Q1 염료 성분 및 Q2 염료 성분 중 하나 이상의 염료 성분은 리포터 염료 성분이고, Q1 염료 성분 및 Q2 염료 성분 중 하나 이상의 염료 성분은 형광성 핵산 염료 성분 또는 비형광성 핵산 염료 성분이다. 리포터 염료 성분 및 형광성 핵산 염료 성분은 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 그 방법은, 샘플이 표적 핵산을 포함하는 경우, 표적 핵산의 증폭에 충분한 시험 용액을 이용하여 공정을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 단지 예로서, 공정은 예를 들어 실시간 PCR 공정과 같은 PCR 공정일 수 있다. 방법은 리포터 염료 성분에 의한 흡수에 충분한 파장의 광으로 시험 용액을 조명하고, 형광 방출 또는 그것의 결여를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
샘플 내 핵산 형성 또는 그것의 결여를 결정하는 또 다른 방법이 제공된다. 그 샘플은 표적 핵산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그러한 방법은 샘플, 및 하기 화학식을 갖는 형광성 핵산 염료를 포함하는 시험 용액을 제공하는 단계를 포함할 수 있다:
Figure 112007074347589-pct00002
식 중에서, 브릿지는 약 15 내지 약 150개의 비-수소 원자를 포함하는 실질적으로 지방족이고 실질적으로 중성인 링커이고; Q1은 형광성 핵산 염료 성분, 비형광성 핵산 염료 성분, 형광성 비핵산 염료 성분 및 비형광성 비핵산 염료 성분으로부터 선택되는 염료 성분이며; Q2는 형광성 핵산 염료 성분, 비형광성 핵산 염료 성분, 형광성 비핵산 염료 성분 및 비형광성 비핵산 염료 성분으로부터 선택되는 염료 성분이고; Q3은 형광성 핵산 염료 성분, 비형광성 핵산 염료 성분, 형광성 비핵산 염료 성분 및 비형광성 비핵산 염료 성분으로부터 선택되는 염료 성분이다. 염료 성분은 예를 들어 본원에 기재된 것들과 같은 적당한 염료 성분들 중 임의의 것일 수 있다. 단지 예로서, 형광성 핵산 염료 성분은 아크리딘 염료, 비대칭 시아닌 염료, 대칭 시아닌 염료, 페난트리디늄 염료, 피로닌 염료, 및 스티릴 염료로부터 선택될 수 있다. Q1 염료 성분, Q2 염료 성분 및 Q3 염료 성분 중 하나 이상의 염료 성분은 리포터 염료 성분이고, Q1 염료 성분, Q2 염료 성분 및 Q3 염료 성분 중 하나 이상의 염료 성분은 형광성 핵산 염료 성분 또는 비형광성 핵산 염료 성분이다. 리포터 염료 성분 및 형광성 핵산 염료 성분은 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 방법은, 샘플이 표적 핵산을 포함하는 경우, 표적 핵산의 증폭에 충분한 시험 용액을 이용하여 공정을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 단지 예로서, 공정은 예를 들어 실시간 PCR 공정과 같은 PCR 공정일 수 있다. 방법은 리포터 염료 성분에 의한 흡수에 충분한 파장의 광으로 시험 용액을 조명하고, 형광 방출 또는 그것의 결여를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 화학식들에서, 브릿지는 하기 기재된 화학식을 가질 수 있다:
Figure 112007074347589-pct00003
이 화학식에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단일 결합을 포함하는 부분; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 탄소수 1 내지 약 12(한계 수치 포함)의 폴리메틸렌 단위; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴이고; A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10는 각각 독립적으로 핵산-결합-증진기(NABEG: nucleic-acid-binding-enhancing-group)); N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 분지형 알킬; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 하나 이상의 포화된 5- 또는 6-원 환이고; α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ 및 ι는 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 약 20(한계 수치 포함)의 정수이고;
a, b, c, d, e, f, g, h 및 i는 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 약 20개(한계 수치 포함)의 정수이다. 브릿지는 단지 예시로서 약 8 내지 약 100 또는 약 150개(한계 수치 포함), 약 12 내지 약 60개(한계 수치 포함), 또는 약 15 내지 약 40개(한계 수치 포함)와 같은 적당한 수의 비-수소 원자를 포함할 수 있다. 브릿지는 단지 예시로서 1 이하의 양 전하를 포함할 수 있다. 브릿지는 예를 들어 본원에 기재된 임의의 것과 같은 임의의 적당한 링커 분자일 수 있다. 한 예에서, 브릿지는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112007074347589-pct00004
식 중에서, x는 각각 독립적으로 1 내지 11(한계 수치 포함)으로부터 선택되는 정수이고; α는 2 내지 약 20(한계 수치 포함)으로부터 선택되는 정수이며; β 및 γ는 각각 독립적으로 2 또는 3이고; b는 0, 또는 1 내지 약 20(한계 수치 포함)의 정수이고; c는 0 또는 1이다.
상술된 방법과 관련된 조성물이 또한 제공된다. 단지 예로서, 하기 화학식의 구조들 중 임의의 구조의 염료가 제공된다:
Figure 112007074347589-pct00005
Figure 112007074347589-pct00006
상기 염료 구조들에서, Ψ는 단지 예시로서 요오다이드 또는 염소 음이온과 같은 음이온을 나타낸다.
하기 나타낸 화학식을 가지는 조성물도 또한 제공된다:
Figure 112007074347589-pct00007
이 화학식에서, 브릿지는 약 15 내지 약 150개의 비-수소 원자 및 1 이하의 양 전하를 포함하는 실질적으로 지방족인 링커이고; Q1은 형광성 핵산 염료 성분이며; Q2는 형광성 핵산 염료 성분이고; Rr은 반응기 또는 작용기이다. 반응기 또는 작용기는 예를 들어 본원에 기재된 것들과 같은 그러한 적당한 기들 중 임의의 것일 수 있다. 조성물은 예를 들어 본원에 기재된 것들 중 임의의 것과 같은 임의의 적당한 조성물일 수 있다. 조성물 또는 염료의 사용 방법은, 조성물을 기질 분자, 예컨대 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 합텐, 약물, 마이크로입자, 합성 중합체, 천연 중합체, 생물학적 세포, 바이러스, 및 고체 표면의 분자로부터 선택되는 기질 분자에 접합시키는 단계를 포함할 수 있다.
핵산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 샘플의 제조 방법도 또한 제공된다. 그 방법은 샘플과 본원에 기재된 것들과 같은 조성물 또는 염료와의 조합물을 제공하는 단계로서, 샘플 내 핵산이 존재하는 경우, 핵산-염료 복합체가 형성되는 것인 단계를 포함한다. 그 방법은 그 조합물을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 방법도 또한 제공된다. 그 방법은 샘플 및 본원에 기재된 것들과 같은 조성물 또는 염료를 포함하는 조합물을 제공하는 단계로서, 샘플 내 핵산이 존재할 경우, 핵산-염료 복합체가 형성되는 것인 단계; 핵산-복합체가 형성될 경우, 광이 이로 인하여 흡수되도록 하기에 충분한 파장의 광으로 조합물을 조명하고, 형광 방출 또는 그것의 결여를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플 내 핵산 형성 또는 그것의 결여를 결정하기 위한 키트도 또한 제공된다. 그 키트는, 샘플이 표적 핵산을 포함하는 경우, 샘플 내 표적 핵산의 증폭에 충분한 하나 이상의 조성물, 및 본원에 기재된 것들과 같은 조성물 또는 염료를 포함할 수 있다.
이들 및 기타 각종 측면, 특성 및 실시양태가 본원에 추가로 포함된다.
도면의 간단한 설명
각종 측면, 특성 및 실시양태에 대한 상세한 설명이 첨부된 도면을 참고로 하여 본원에 제공되며, 그 도면은 이하 간략히 설명된다. 도면은 예시적이며, 반드시 비례에 정확히 맞는 것은 아니다. 도면은 각종 측면 또는 특성을 예시하고, 전체적으로 또는 부분적으로 하나 이상의 실시양태(들) 또는 실시예(들)을 예시할 수 있다. 특별한 요소 또는 특성을 가리키기 위해 한 도면에 사용된 참조 숫자, 문자 및/또는 기호는 유사 요소 또는 특성을 가리키기 위해 또 다른 도면에서 사용될 수 있다.
도 1은 염료의 3가지 입체형태 상태가 실질적으로 평형 상태에 있는, 요구형 방출 기전을 통한 DNA 결합의 개략적 도면이다.
도 2는 PBS 완충액 내 a) 이량체 염료인 AOAO-7(○) 및 b) 단량체 AO 염료인 DMAO(△)의 정규화 흡광도 vs. 파장(nm), 또는 정규화 흡수 스펙트럼의 그래프 도면이다.
도 3은 완충액 내, 또한 DNA의 존재 하에서의, a) 이량체 염료인 AOAO-7(●), 및 b) 단량체 AO 염료인 DMAO(▲)의 정규화 흡광도 vs. 파장(nm), 또는 정규화 흡수 스펙트럼의 그래프 도면이다.
도 4는 DNA 부가 전 PBS 완충액 내, DMAO(△) 및 AOAO-7(○)(각기 a) 및 c)), 및 DNA 첨가 후 PBS 완충액 내, DMAO(▲) 및 AOAO-7(●)(각기 b) 및 d))의 상대적 형광 vs. 파장(nm), 또는 형광 방출 스펙트럼의 그래프 도면이다.
도 5는 완충액 내, a)(미국 특허 제5,582,977호에 따라 제조된) TOTO-1(보다 짙은 선), 및 b) TOTO-3(보다 밝은 선)의 정규화 흡광도 vs. 파장(nm), 즉 정규화 흡수 스펙트럼의 그래프 도면이다.
도 6은 완충액 내, 또한 DNA의 존재 하에서의, a) 미국 특허 제5,582,977호에 따른 TOTO-1(보다 짙은 선), 및 b) TOTO-3(보다 밝은 선)의 정규화 흡광도 vs. 파장(nm), 또는 정규화 흡수 스펙트럼의 그래프 도면이다.
도 7은 용액 내, 또한 AOAO-12(0.2 μM)의 존재 하에서의, 단일 가닥 DNA(◇) 및 이중 가닥 DNA(◆)의 상대적 형광 vs. DNA 농도(μg/mL), 또는 적정의 그래프 도면을 포함한다. 도 7은 또한 양자 사이의 실질적으로 일차적인 관계를 나타내는 상대적 형광 vs. DNA 농도의 삽입(inset) 그래프 도면을 포함한다.
도 8은 보다 높은 염료 농도(△) 및 보다 높은 염료 농도(▲)의 SYBR 그린 I, 및 보다 낮은 염료 농도(□) 및 보다 높은 염료 농도(■)의 AOAO-12를 이용한, 상대적 형광 vs. 사이클 수(Ct), 또는 PCR 증폭의 그래프 도면이고, 여기에서 Ct는 일반적으로 형광 신호가 임의 역치에 도달하는 사이클 수를 가리키고, PCR 증폭 플롯에서는 형광 신호가 일반적으로 기준선으로부터 상승하기 막 시작하는 지점에 상응한다. 각 염료에 대해, 상대 염료 농도를 PBS 완충액 내 염료의 흡수 최대에서의 광학 밀도(OD)로 측정하였는데, 이 때 471 nm에서의 1X 및 2X AOAO-12의 염료 농도는 각기 OD 0.1 및 0.2에 상응하였고, 495 nm에서의 0.5X 및 1X SYBR 그린 I의 염료 농도는 각기 OD 0.025 및 0.05에 상응하였다.
도 9는 각기 최적 농도에서, 형광 프로브로서 AOAO-12(□) 및 SYBR 그린 I(△)를 이용한, 상대적 형광 vs. 사이클 수(Ct), 또는 PCR 증폭의 그래프 도면을 포함한다. 각 염료에 대해, 상대 염료 농도를 PBS 완충액 내 염료의 흡수 최대에서의 광학 밀도(OD)에서 측정하였는데, 이 때 471 nm에서의 AOAO-12의 염료 농도는 OD 0.4에 상응하였고, 495 nm에서의 SYBR 그린 I의 염료 농도는 OD 0.025에 상응하였다. 도 9은 또한 각 경우에 양자 간에 실질적으로 일차적인 관계를 나타내는, AOAO-12(■) 및 SYBR 그린 I(▲)을 이용한, Ct vs. DNA 샘플 복제수의 대수(log)의 삽입 그래프 도면을 포함한다.
도 10은 이량체 염료를 형성하기 위한, 단량체 염료 Q1 및 Q2의 가능한 조합들, A, B, C, D 및 E의 개략도이다. 조합 A는 2개의 동일한 리포터 형광성 핵산 염료, 또는 유사한 스펙트럼의 2개의 리포터 형광성 핵산 염료를 포함한다. 조합 B는 하나의 리포터 형광성 핵산 염료 및 하나의 비-리포터 DNA-결합 분자를 포함한다. 조합 C는 하나의 비-리포터 DNA-결합 분자 및 하나의 리포터 비-DNA-결합 염료를 포함한다. 조합 D는 하나의 리포터 형광성 핵산 염료 및 하나의 비-리포터 비형광성 비핵산 염료를 포함한다. 조합 E는 하나의 리포터 형광성 핵산 염료 및 하나의 리포터 형광성 비핵산 염료를 포함한다.
도 11은 TO 단량체 염료(○), TOTO-1 단량체 염료(△) 및 TOTO-12 이량체 염료(□)(화합물 No. 24, 표 2)를 이용한, 형광 강도 vs. 사이클 수(Ct), 또는 PCR 증폭의 그래프 도면이다.
도 12는 PBS 완충액 내 이종이량체 염료 AORO-7(○), 및 PBS 완충액 내 또한 DNA의 존재 하에서의 이종이량체 염료 AORO-7(+)의 흡광도 vs. 파장(nm), 또는 흡수 스펙트럼의 그래프 도면이다.
도 13은 분리하여 기록된 500 nm(실선, 보다 짙은 선) 또는 약 560 nm(파선, 보다 밝은 선)에서 여기하는, 이종이량체 염료 AORO-7의 임의 형광 강도 vs. 파장(nm), 또는 방출 스펙트럼의 그래프 도면이다.
도 14는 이종이량체 염료 AORO-7을 이용한, 상대적 형광 vs. 사이클 수(Ct), 또는 PCR 증폭의 그래프 도면을 포함한다. 도 14는 또한 상대적 형광 신호 vs. 온도(℃)의 삽입 그래프 도면 또는 용융 곡선 플롯을 포함한다.
도 15는 4개의 증폭산물, 즉 TBP(○), SDHA(△), RPL4(◇), 및 HMBS(□)의, A) AOAO- 12(파선) 모니터링, 및 B) SYBR 그린 I(실선) 모니터링을 이용한, 상대적 형광 변화 vs. 온도(℃)의 그래프 도면, 또는 용융 곡선 플롯이다.
도 16은 AOAO-12의 60℃에서 모니터링된 상대적 형광 vs. 96℃에서의 분(min) 즉 96℃에서의 열-안정성의 그래프도이다.
발명의 상세한 설명
예를 들어 핵산 검출과 같은 각종 용도들에 유용할 수 있는 형광성 염료 또는 염색이 본원에 기재되어 있다. 그러한 염료는 핵산의 부재 하에서 낮은 배경 형광을 가지나, 핵산의 존재 하에서는 매우 형광성으로 되는, 예를 들어 이량체 또는 삼량체 핵산 염료일 수 있다. 이량체 및 삼량체 핵산 염료는 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 핵산 검출과 같은 각종 용도들에 유용할 수 있다. 형광성 염료 또는 염색의 제조 및 사용과 관련된 방법도 또한 형광성 염료 또는 염색을 포함하는 유용한 시스템 또는 키트와 같이 본원에 기재되어 있다.
본원에서, 함축적으로나 명시적으로 달리 이해되어지거나 언급되지 않는 한, 단수로 나와 있는 단어는 그것의 복수 상대들도 포괄하고, 복수로 나와 있는 단어는 그것의 단수 상대도 포괄하는 것으로 이해한다. 또한, 함축적으로나 명시적으로 달리 이해되어지거나 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 임의의 주어진 성분에 대해, 그 성분에 대한 가능한 후보물질 또는 대안물질 중 임의의 것이 일반적으로 개별적으로 또는 상호 조합되어 사용될 수 있는 것으로 이해한다. 부가적으로, 함축적으로나 명시적으로 달리 이해되어지거나 언급되지 않는 한, 그러한 후보물질 또는 대안물질의 임의의 목록이 단지 예시적이며 제한적이지 않음을 이해한다. 또한, 함축적으로나 명시적으로 달리 이해되어지거나 언급되지 않는 한, 본원에 제시된 임의의 값 또는 수가 대략적이고, 임의의 수 범위는 용어 "한계 수치 포함(inclusive)" 등이 나와있는지의 여부와 상관 없이 그 범위를 한정하는 최소의 수 및 최대의 수를 포함하는 것으로 이해한다. 부가적으로, 함축적으로나 명시적으로 달리 이해되어지거나 언급되지 않는 한, 임의의 허용적, 개방 또는 개방-말단 용어는 임의의 비교적 허용가능한 내지 제한적 용어, 개방 내지 폐쇄 용어, 또는 개방-말단 용어 내지 폐쇄-말단 용어를 포괄하는 것으로 이해한다. 단지 예로서, 단어 "포함하는"은 "~을 포함하는(comprising ~)", "~로 본질적으로 이루어지는(consisting essentially of ~)"-, 및/또는 "~로 이루어진(consisting of ~)" 유형의 언어를 포괄할 수 있다.
각종 용어들은 일반적으로 이해를 돕기 위해 이하 기재되거나 본원에 사용된다. 이들 각종 용어의 상응하는 일반적 설명은 이들 각종 용어의 상응하는 언어적 또는 문법적 변형 또는 형태에도 적용됨을 이해한다. 또한, 이하 임의의 용어의 일반적 기재는 그 용어가 일반적이지 않거나 더욱 특정적인 방식으로 사용될 때, 적용되지 않거나 충분히 적용되지 않을 수 있음도 이해한다. 또한, 예를 들어 각종 실시양태들과 관련한 것과 같이 본원에 사용된 용어 또는 본원에 제공된 기재는 제한적이지 않은 것으로 이해한다. 또한, 본원에 기재된 실시양태 또는 본원에 기재된 용어들은 제한적이지 않고 변화될 수 있음을 이해한다.
일반적으로, 용어 "착색제" 및 "염료"는 혼용될 수 있고, 이는 약 250 nm 내지 약 1,200 nm의 분광 범위의 광을 흡수할 수 있는 방향족 분자를 가리킨다. 일반적으로, 용어 "염료"는 형광성 염료, 비형광성 염료, 또는 양자 모두를 가리킬 수 있다. 일반적으로, 용어 "형광성 염료"는 또 다른 적당한 파장의 광에 의해 여기될 때 광을 방출할 수 있는 염료를 가리킨다.
일반적으로, 용어 "형광 켄처(quencher)"는 또 다른 형광 분자의 형광을 켄칭할 수 있는 분자를 가리킨다. 형광 켄칭은 3가지 방식들 중 하나 이상을 통해 일어날 수 있다. 제1 유형의 형광 켄칭은 형광 공명 에너지 전이(FRET: fluorescence resonance energy trasfer)를 통해 일어나고(Forster, Ann. Phys.(1948); 및 Stryer, et al., Proc . Natl . Acad . Sci .(1967)), 여기에서 켄처는 형광 분자로부터의 방출 광을 흡수한다. FRET 켄처의 흡수 피크는 통상 FRET 켄처가 효율적인 형광 켄처이기 위한 형광성 염료의 방출 피크와 상당히 중첩(overlap)되어야 한다. FRET 켄처는 전형적으로 비형광성 염료이나, 형광성 염료일 수도 있다. 켄처가 형광성 염료인 경우, 염료의 단지 흡수 성질만이 이용된다. 제2 유형의 형광 켄칭은 광-유도 전자 전달(PET:photo-induced electron transfer)을 통해 일어나고, 여기에서 켄처는 전자에 의해 여기된 염료에 전자를 전달함으로써 형광 분자의 형광을 켄칭하는 전자-풍부 분자이다. 제3 유형의 형광 켄칭은 H-이량체 형성과 같은 염료 응집을 통해 일어나고, 여기에서 2개 이상의 염료 분자는 서로 물리적으로 접촉되어 있으며, 이로써 분자의 진동 방식으로 전자 에너지를 파송한다. 이 유형의 접촉 형광 켄칭은 2개의 동일한 형광성 염료 사이, 또는 2개의 상이한 형광성 염료 사이, 또는 한 형광성 염료와 한 FRET 켄처 사이, 또는 한 형광성 염료와 한 PET 켄처 사이에 일어날 수 있다. 다른 유형의 형광 켄처는 통상적으로 이용되지는 않으나, 이에는 안정한 유리 라디칼 화합물 및 특정 중금속 복합체가 포함된다.
일반적으로, 용어 "핵산"은 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA), 및/또는 이들의 유도체를 가리킨다. 핵산은 천연 또는 합성일 수 있다.
일반적으로, 용어 "형광성 핵산 착색제" 또는 "형광성 핵산 염료"는 핵산에 결합하여 형광성 염료-핵산 복합체를 형성할 수 있는 염료를 가리킨다. 형광성 핵산 염료는 전형적으로 그 자체가 비형광성이거나 약한 형광성이나, 결합 시에 매우 형광성으로 된다. 일반적으로, 용어 "비형광성 핵산-결합 분자"는 염료이거나 염료가 아닐 수 있고, 핵산에 결합할 때 형광성으로 되지 않는 핵산-결합 분자를 가리킨다. 일반적으로, 용어 "형광성 DNA 염료"는 DNA에 결합할 때 형광성으로 되는 염료를 가리킨다. 일반적으로, 용어 "형광성 비핵산 염료"는 핵산에 결합하지 않는 형광성 염료를 가리킨다. 일반적으로, 용어 "비형광성 비핵산 염료"는 형광성도 아니고 핵산-결합도 아닌 염료를 가리킨다. 그러한 염료는 통상 형광 켄처로 불린다. 빈번하게, 형광 켄처는 형광성 염료와 FRET 쌍을 형성하기 위해 사용된다. 일반적으로, 용어 "리포터 염료"는 최종 검출된 형광 신호에 기여하는 방출 형광을 가지는 형광성 염료를 가리킨다.
일반적으로, 용어 "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 DNA의 양을 증폭시키기 위한 기법을 가리킨다. 일반적으로, 용어 "정량적 실시간 PCR" 또는 "qPCR"은 PCR 과정 중 DNA의 증가하는 양을 모니터링하기 위한 기법을 가리킨다.
일반적으로, 형광성 핵산 염료는 2가지 주요 부류, 즉 인터칼레이터(intercalator) 및 마이너 그루브-바인더(minor groove-binder)로 분류될 수 있다. 일반적으로, 형광 인터칼레이터는 이웃하는 염기 쌍 사이에 그 자체를 삽입함으로써 이중 가닥 DNA 또는 이중 가닥 RNA에 결합하는 염료이다. 일반적으로, 마이너 그루브-바인더는 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 염료이다. 양 하전 염료와 음 하전 핵산 간의 정전 상호작용을 포함한, 다중 방식을 통해 핵산에 결합할 수 있는 또 다른 염료가 있다.
각종 형광성 핵산 염료들이 상업적으로 입수가능하게 되었고, 비-qPCR용 염료의 개선 방법이 개발되었으나, 모든 핵산 염색이 qPCR 용도에 적당한 것은 아니다. 부가적으로, 어떠한 구조적 요소가 양호한 qPCR 염료에 필요한지에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
일반적으로, 성능 관점에서 볼 때 qPCR에 대한 이상적 염료가 지금부터 기재되는 바와 같이 각종 기준을 충족해야 한다. 염료는 PCR 완충액 내 고온(약 60℃ 내지 약 96℃)에서 열에 대해 안정해야 하고, 매질이 알칼리성으로 될 때 저온(약 -20℃ 내지 약 4℃)에서 가수분해에 대해 안정해야 한다. 염료는 PCR 공정을 억제해서는 안되며, 이는 일반적으로 가장 중요한 기준인데, 그 이유는 PCR 억제의 가장 심각한 경우들에서 PCR 공정이 개시되지조차 안될 수 있고, 보다 온화한 경우에는 Ct 수가 지연될 수 있거나, 단지 매우 낮은 염료 농도가 이용될 수 있어, 형광 신호가 제한되기 때문이다. 염료는 DNA의 부재 시에서는 비형광성 또는 최소의 형광성이나, DNA의 존재 하에서는 고형광성이 된다. 염료의 흡수 및 방출 파장은 전술된 현존 기기들과 같은 qPCR과 관련하여 사용되는 기기와 상용적이어야 한다. 염료의 DNA 결합은 서열 우선성이 거의 없거나 전혀 없어야 한다. DNA-염료 복합체의 형광 강도는 존재하는 DNA의 양에 일차적인 관계가 있어야 한다. 본원에 기재된 염료는 상술된 기준들 중 하나 이상을 충족하거나 충족하지 않아도 된다.
예를 들어 qPCR에 적당한 것과 같은 형광성 핵산 염료의 설계 방법이 제공된다. 그 방법은 적당한 링커를 이용하여 2 또는 3개 단량체 염료를 공유 결합시켜, 이량체 염료 또는 삼량체 염료를 형성하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 염료는, 용액 내 있을 때에는, 분자내 이량체 형성으로 인해 우세하게 헤어핀상인 입체형태를 띠는 것으로 보인다. 염료의 이 헤어핀상 입체형태 또는 상태는 핵산에 대해 불활성이거나, 핵산과 상호작용할 수 없다. 염료는, 용액 내 있고 또한 핵산이 존재하는 경우에, 소량 존재하고 헤어핀 입체형태와 실질적으로 평형인 상태로 존재하는 개방 무작위 입체형태 또는 상태를 띠는 것으로 사료된다. 염료의 개방 무작위 입체형태 또는 상태는 핵산에 대해 활성이거나, 핵산과 상호작용하거나 핵산에 결합할 수 있다. 염료가 증가량의 핵산의 존재 하에 있을 때, 헤어핀 상태가 중간, 개방 무작위 상태, 또는 DNA-결합 상태로 평형 이동되는 것으로 사료된다. 경우에 따라 "요구형 방출 DNA-결합 기전"으로 일컬어지는 이 기전은 염료와 다른 방식으로 관련될 수 있는 PCR 억제를 감소시키는 것으로 사료된다. 결과적으로, 염료는 다른 방식으로 가능할 수 있는 농도보다 높은 농도에서 PCR 공정에 사용될 수 있고, 따라서 다른 방식으로 가능할 수 있는 핵산 검출 감도보다 큰 핵산 검출 감도를 제공할 수 있다. PCR 억제의 감소는 현저할 수 있고, 핵산 검출 감도의 증가가 상당할 수 있다.
본원에 기재된 이량체 염료 또는 삼량체 염료는 임의의 수의 바람직한 특성들을 가질 수 있다. 예로서, 그러한 염료는 그것의 단량체 염료 성분의 배경 형광에 비해 감소된 배경 형광을 가질 수 있다. 비교적 낮은 배경 형광은 일반적으로 비교적 증진된 핵산 검출 감도에 상응한다. 따라서, 그러한 염료는 일반적으로 증진된 핵산 검출 감도와 관련된다. 추가 예로서, 본원에 기재된 염료는 SYBR 그린 I보다 열 및/또는 가수분해에 대해 더 안정할 수 있다. 추가 예로서, 본원에 기재된 염료는 현존 qPCR 염료와 관련된 흡수 및 방출 파장 외의 흡수 및 방출 파장을 가질 수 있다.
형광성 이량체 핵산 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 1)를 가질 수 있다:
구조 1
Figure 112007074347589-pct00008
구조 1에서, 염료 Q1 및 염료 Q2의 각 염료는 독립적으로 형광성 핵산 염료, 비형광성 핵산 염료, 형광성 비핵산 염료, 및 비형광성 비핵산 염료로부터 선택된다. Q1 및 Q2는 수득된 이량체 염료의 요망되는 성질을 확실히 하거나 고무하는 방식으로 선택되어 조합될 수 있다. 염료 Q1 및 염료 Q2 중 하나 이상의 염료는 리포터 염료이다. 또한, 염료 Q1 및 염료 Q2 중 하나 이상의 염료는 형광성 핵산 염료 또는 비형광성 핵산 염료이다. 리포터 염료 및 형광성 핵산 염료는 동일하거나 상이할 수 있다. 브릿지는 비교적 제한된 정도로 양 하전되거나, 실질적으로 중성인 하전 상태일 수 있고, 분자내 이량체 형성을 촉진하여 이량체 염료를 생성하도록 하는 실질적으로 가요성인 성분일 수 있다.
형광성 삼량체 핵산 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 2)를 가질 수 있다.
구조 2
Figure 112007074347589-pct00009
구조 2에서, 염료 Q1, 염료 Q2 및 염료 Q3의 각 염료는 독립적으로 형광성 핵산 염료, 비형광성 핵산 염료, 형광성 비핵산 염료, 및 비형광성 비핵산 염료로부터 선택된다. Q1, Q2 및 Q3은 수득된 삼량체 염료의 요망되는 성질을 확실히 하거나 고무하는 방식으로 선택되어 조합될 수 있다. 염료 Q1, 염료 Q2 및 염료 Q3 중 하나 이상의 염료는 리포터 염료이다. 또한, 염료 Q1, 염료 Q2 및 염료 Q3 중 하나 이상의 염료는 형광성 핵산 염료 또는 비형광성 핵산 염료이다. 리포터 염료 및 형광성 핵산 염료는 동일하거나 상이할 수 있다. 브릿지는 비교적 제한된 정도로 양 하전되거나, 실질적으로 중성인 하전 상태일 수 있고, 분자내 이량체 형성을 촉진하여 삼량체 염료를 생성하도록 하는 실질적으로 가요성인 성분일 수 있다.
형광성 핵산 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 3)를 가질 수 있다.
구조 3
Figure 112007074347589-pct00010
구조 3에서, 염료 Q1 및 염료 Q2의 각 염료는 독립적으로 구조 1 및 구조 2와 관련하여 상기 기재된 바와 같을 수 있고; 브릿지는 전술된 바와 같은 실질적으로 지방족인 링커일 수 있고; Rr은 반응기 또는 작용기일 수 있다. 단지 예로서, Q1은 형광성 핵산 염료 성분일 수 있고; Q2는 형광성 핵산 염료 성분일 수 있으며; 브릿지는 약 15 내지 약 150개의 비-수소 원자 및 1 이하의 양 전하를 포함하는 실질적으로 지방족인 링커일 수 있으며; Rr은 본원에 기재된 바와 같은 반응기 또는 작용기일 수 있다.
브릿지
브릿지는 1 이하의 양 전하를 가지는, 실질적으로 가요성인 링커 분자일 수 있다. 브릿지는 실질적으로 중성이고 실질적으로 가요성인 링커 분자일 수 있다. 브릿지의 성분은 그러한 제한된 양 전하 또는 그러한 실질적 중성을 달성하기 위해 선택될 수 있다. 실제 중성 성질을 포함한, 실질적 중성 성질이 이하 추가 논의된다. 실질적 가요성의 성질은 일반적으로 브릿지의, 실제 지방족 성질을 포함한, 실질적 지방족 성질과 관련된다. 이 실질적 지방족 성질은 일반적으로 브릿지의 비방향성, 또는 브릿지의 비강성을 가리킨다.
구조 1에서, 브릿지는 Q1 및 Q2에 공유 결합된다. 이량체 염료의 경우, 브릿지는 예를 들어 약 8 내지 약 150개의 비-수소 원자, 약 8 내지 약 100개의 비-수소 원자, 약 12 내지 약 60개의 비-수소 원자, 또는 약 15 또는 약 20 내지 약 40 또는 약 50 비-수소 원자를 가질 수 있다. 구조 2에서, 브릿지는 Q1, Q2 및 Q3에 공유 결합된다. 삼량체 염료의 경우, 브릿지는 예를 들어 약 15 내지 약 150개의 비-수소 원자, 약 20 내지 약 150개의 비-수소 원자, 약 20 내지 약 100개의 비-수소 원자, 또는 약 30 내지 약 70개의 비-수소 원자를 가질 수 있다.
브릿지는 하나 이상의 독립적 핵산-결합-증진기(NABEG)를 혼입하고 있을 수 있다. NABEG는 정전성, 소수성 또는 수소-결합 상호작용의 형태로 핵산에 결합할 수 있는 부분이다. 단지 예로서, NABEG는 일차 아민; 2차 아민; 3차 아민; 암모늄; 아미딘; N, O, S, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴기; 높은 전기음성도의 이종 원자를 포함하는 결합을 가지는 부분; 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
1차, 2차 및 3차 아민, 및 아미딘은 염기성 기이며, 이에 따라 생리학적 pH에서 양 하전 또는 적어도 부분적으로 양 하전된다. 암모늄기 또는 4차화 질소기는 우세하게 양 하전된다. 일반적으로 말해, 양 하전 또는 부분적으로 양 하전된 기는 고감도 형광성 핵산 염색의 개발에 이용될 수 있는 성질인, 정전기 상호작용을 통한 염료의 핵산 결합을 증진시킨다. 일반적으로 본 발명의 염료를 생산하기 위해 과도 양 전하를 가지는 브릿지를 사용하는 것은 바람직하지 않다. 예를 들어, 본 발명의 이량체 염료 또는 삼량체 염료의 적당한 브릿지는 1 이하의 양 전하를 포함할 수 있다. 브릿지는 실질적으로 가요성이면서 중성이거나 실질적으로 중성인 링커일 수 있다. 이 맥락에서, 실질적 중성은 약간의 전하를 가리킨다. 예로서, 브릿지는 예를 들어 피리딘기 또는 피라진기와 같은 약염기성 성분을 포함할 수 있어, 그것이 수용액 내 있을 때, 매우 소량의 양 전하가 존재할 수 있다. 추가 예로서, 브릿지가 하나 이상의 중성 NABEG를 포함하는 (임의적) 경우에, 정확한 양의 양 전하는 일반적으로 NABEG의 pKa와 관계가 있을 수 있다. 일반적으로, NABEG의 pKa가 높을수록, NABEG가 양성자화되기 쉬우며, 이에 따라 양 하전된다. 예로서, 적당한 약염기성 NABEG기는 pKa가 약 11 이하, 약 8 이하, 또는 약 7 이하일 수 있다.
생성된 핵산 염료에서 특히 유용한 성질일 수 있는 분자내 이량체, 주로는 H-이량체를 형성하는 경향이 있을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 이량체 염료의 경우, H-이량체 형성은 헤어핀상 구조를 생성시킬 수 있고, 여기에서 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이, H-이량체는 헤어핀의 줄기 부분을 형성하고, 브릿지는 굽어진 부분을 형성한다. 특정 염료와 연결된 H-이량체 형성의 현상이 문헌[West, et al., J. Phys. Chem .(1965); Rohatgi, et al., J. Phys. Chem .(1966); Rohatgi, et al ., Chem . Phys . Lett .(1971); 및 Khairutdinov, et al ., J. Phys . Chem.(1997)]에 기재되었다. 분자내 H-이량체의 형성은 브릿지가 하나 이상의 중성 NABEG(들)을 임의적으로 포함하는, 가요성이면서 중성이거나, 실질적으로 중성인 탄화수소 링커일 때 촉진될 수 있다.
H-이량체 형성은 염료 흡수 스펙트럼의 큰 청색 편이를 그 특징으로 할 수 있다. 예로서, 단량체 염료 AO(아크리딘 오렌지), 및 분자내 이량체를 형성하는 관련 이량체 염료인 AOAO-7의 흡수 스펙트럼이 도 2에 나와 있다. AOAO-7 이량체와 관련된 471 nm 피크는 분자내 H-이량체 형성을 가리킨다. 일단 DNA-결합이 일어나면, 단량체 및 이량체 모두의 흡수 스펙트럼이 유사해지며, 이는 헤어핀 구조의 개방을 가리킨다. 예로서, 도 3에 도시된 바와 같이, AOAO-7 이량체로부터 471 nm 피크가 사라짐은 DNA 결합 시의 헤어핀 구조의 개방을 가리킨다.
본원에 기재된 염료에 있어 H-이량체 형성은 2가지 주요 이익과 관련될 수 있다. 주요 이점 중 하나는 형광 신호의 큰 증가에 의해 입증되는 바와 같이, DNA 결합 시의 형광의 실질적 증가와 결부된, 배경 형광의 감소(경우에 따라서는 극단적인 감소)이다. 이 이익은 DNA의 부재 및 존재 하에서의 단량체 아크리딘 오렌지 염료인 DMAO와 이량체 아크리딘 오렌지 염료인 AOAO-7의 형광 스펙트럼을 비교함으로써 인식될 수 있다. 예를 들어, 도 4에서 보는 바와 같이, 단량체 DMAO 염료에 비해, 이량체 AOAO-7 염료는 DNA 결합 시의 보다 낮은 배경 형광 및 보다 높은 형광과 관련된다.
분자내 이량체-관련 형광 켄칭은 매우 효율적이어서, 본원에 기재된 염료가, 예를 들어 높은 배경 형광을 가지는 하나 이상의 단량체 염료와 같은, 매우 바람직한 것으로 통상 간주되지 않는 하나 이상의 단량체 염료로부터 구성될 수 있다. 이의 한 예가 아크리딘 오렌지(AO) 및 그것의 이량체를 묘사한 도 4에 나와 있다. AO가 최초로 공지된 핵산-결합 염료들 중 하나이고 바람직한 파장을 가지나, 그것은 비교적 높은 배경 형광으로 인해 핵산 검출을 위해 널리 사용되지 않았다. 도 4에 도시된 바와 같이, 단량체 AO 염료에 비해, 이량체 염료 AOAO-7가 훨씬 낮은 배경 형광을 가진다.
H-이량체 형성은 분자간보다는 분자내 상호작용을 통해 일어난다. H-이량체 형성은 예를 들어 한 쌍의 바람직한 단량체 염료와 같은 2 또는 3개 염료의 공유 결합을 통해 일어난다. H-이량체 형성은 예를 들어 염료의 유용한 용도를 간섭할 수 있는 부가적 시약과 같은 부가적 시약의 필요없이 비교적 용이하게 달성될 수 있다. 예로서, 이량체 염료는 부가적 시약을 사용하지 않으면서 용액 내 하나의 핵산-결합 염료 성분과 하나의 비핵산-결합 형광성 염료 성분의 쌍 형성을 통해 형성될 수 있다. 추가 예로서, 삼량체 염료는 역시 부가적 시약을 사용하지 않으면서 용액 내 2개의 핵산-결합 염료 성분과 하나의 비핵산-결합 형광성 염료 성분으로부터 제조될 수 있다. H-이량체 형성은 PCR에 대한 억제 효과가 없고 DNA가 존재할 때만 개방 무작위 상태 또는 DNA-결합 상태로 이동하는 비-DNA-결합 상태에서 염료를 포착하는 유용한 방식을 제공한다. 따라서, 효과적인 염료 농도, 또는 개방 무작위 상태에서의 염료의 농도는, 높은 총 염료 농도를 사용하여 qPCR 감도를 증가시킬지라도, 낮게 유지될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 염료에서의 H-이량체 형성은 또 다른 주요 이익과 관련될 수 있다. 이 예기치 못한 이익은 염료 내 H-이량체 형성이 qPCR 용도에서 PCR에 대한 염료의 억제 효과를 상당히 감소시킬 수 있다는 것이다. 예로서, 통상 주어진 농도의 DNA 샘플에 대해, 형광성 DNA 염료로부터의 형광 신호가 염료 포화 시까지 염료 농도에 비례한다. 예로서, 보다 높은 염료 농도는 염료 포화 시까지의 DNA-염료 복합체의 보다 큰 형성, 및 이에 따른 보다 크거나 보다 밝은 형광과 관련된다. 그러므로, 이상적으로, qPCR 용도에서 최대 감도를 위해 충분히 높은 염료 농도로 시작하고자 할 것이다. 그러나, 실제로 qPCR을 위해 종래 사용된 모든 DNA 염료는 여러 정도로 DNA 증폭 공정을 억제한다. 전형적으로, 그러한 종래 염료의 보다 높은 농도는 증폭 또는 PCR 공정의 보다 큰 염료 억제와 관련되었다. 따라서, 그러한 종래 염료의 농도는 통상 비-qPCR 용도에 대한 것보다 qPCR 용도에 대해서 훨씬 더 낮도록 되어 있다.
qPCR 용도에서의 그러한 염료 농도 저하는 예로서 qPCR용으로 가장 널리 이용되는 DNA 염료인 SYBR 그린 I의 하기 논의로부터 식별될 수 있는 바와 같이, 종점 형광 신호 강도의 측면에서의 희생을 초래한다. qPCR에 사용되는 SYBR 그린 I 의 농도는 제조자에 의해 제공되지 않는 바, 다른 염료와의 정확한 비교는 용이하거나 일상적이지 않다. 그러나, 염료의 농도는 비어 법칙에 따라 그것의 광학 밀도와 일차적인 관계가 있어, qPCR에 사용되는 SYBR 그린 I 용액 및 qPCR에 사용되는 또 다른 염료 용액의 광학 밀도 특성은, 각 농도를 적어도 정성적으로 비교하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, qPCR에 사용되는 SYBR 그린 I 용액에 대한 전형적인 광학 밀도는 0.025 내지 0.05이고, 한편 qPCR에 사용되는, 본원의 표 2의 염료 No. 19의 용액에 대한 광학 밀도는 전형적으로 약 0.04 내지 약 0.8, 또는 그 이상, 전형적으로는 약 0.1 내지 약 0.4이다. SYBR 그린 I 염료는, 염료 농도가 495 nm의 흡수 피크에서 0.025의 광학 밀도에 상응하는 0.5X에서, 동일한 흡수 피크에서 0.05의 광학 밀도에 상응하는 1X 농도로 증가할 때 유의적 억제 효과를 나타낸다. 도 8에 도시된 바와 같이, IX 농도의 SYBR 그린 I은 0.5X 농도의 SYBR 그린 I에 비해 더 높은 종점 형광 신호를 가지고, 한편 1X 염료 농도와 관련된 사이클 수, 즉 Ct 값은 지연된다. 이 지연된 Ct 값은 SYBR 그린 I이 보다 높은 염료 농도에서 PCR를 유의적으로 억제함을 가리킨다. 이량체 염료인 AOAO-12는, 염료 농도가 471 nm의 흡수 피크에서 0.1의 광학 밀도에 상응하는 1X 염료 농도에서, 동일한 흡수 피크에서 0.2의 광학 밀도에 상응하는 2X 염료 농도로 증가할 때 억제를 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다. AOAO-12가 PCR 억제를 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않기 때문에, 그것은 도 9에 도시된 바와 같이, 비교적 높은 농도로 사용될 수 있고, SYBR 그린 I보다 수배 더 높을 수 있는 형광 신호를 제공할 수 있다. 간략히, AOAO-12는 넓은 농도 범위에서 PCR 억제를 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않고, 이에 따라 증가된 형광 신호에 대해 보다 높은 농도로 사용될 수 있다.
보다 높은 염료 농도가 사용될 수 있도록 하는, 본원에 기재된 염료와 관련될 수 있는, PCR 억제의 상술된 실질적 결여는 도 1에 개략적으로 도시되어 있는 "요구형 방출" 기전에 의해 설명될 수 있을 것으로 사료된다. 즉, 용액 내 있을 때, 이량체 염료는 도 1에 도시된 바와 같이, 폐쇄 헤어핀 입체형태 및 개방 무작위 입체형태 간의 동적 평형 상태로 존재하는 것으로 사료된다. 일반적으로, 헤어핀 입체형태는 개방 무작위 입체형태보다 훨씬 더 안정하고, 우세하다. 염료의 헤어핀 입체형태의 독점성은 단량체 스펙트럼에 대한 이량체 스펙트럼의 실질적 편이를 나타내는 자외선/가시광선 스펙트럼에 의해 지지된다. 헤어핀 입체형태는 염료의 불활성 형태이고, 한편 개방 입체형태는 DNA 결합이 가능한 염료의 활성 형태이다. DNA이 존재할 때, 개방 입체형태의 염료는 DNA-결합 입체형태로 이동하고, 헤어핀 입체형태의 더 많은 염료는 개방 입체형태로 이동하며, 개방 입체형태의 염료는 매우 낮은 농도로 유지된다. 즉, 염료의 대부분은 비-DNA-결합 헤어핀 입체형태로 포착되고, 보다 많은 DNA 존재에 대한 반응으로 단지 개방 입체형태, 또는 DNA-결합 형태로 방출된다. 이 "요구형 방출" 기전은 PCR 공정 자체를 억제하지 않으면서 염료가 비교적 높은 농도에서 사용될 수 있도록 한다. 본원에 기재된 염료와 달리, SYBR 그린 I은 염료의 효과적인 농도를 낮추는 것을 도우며, 이에 따라 높은 농도-의존성 PCR 억제 효과를 나타내는 비-DNA-결합 입체형태를 가지지 않는다.
본원에 기재된 핵산 염색은 비교적 간단하고, 매우 통상적 기준에서, 예를 들어 수그램 내지 수십 그램으로 측정되는 양 등의 바람직한 규모로 제조될 수 있다. 이 핵산 염색은 DNA 증폭의 검출 및 비교적 통상적인 연구 용도를 위해 매우 보편적으로 사용될 수 있다. 예로서, 형광성 핵산 염료는 실질적으로 비-서열-선택적 방식으로, 또한 비교적 보편적인 방식으로 DNA의 존재 및 양을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
브릿지는 하기 나타낸 화학식(화학식 1)을 가질 수 있다.
화학식 1
Figure 112007074347589-pct00011
화학식 1에서, 치환기 L1 및 치환기 L2(이들은 각기 "L"로 간단히 칭해질 수 있음)의 각각의 치환기는 브릿지의 부분이다. L1은 Q1 염료 성분 및 Q2 염료 성분 중 하나의 염료 성분에 공유 결합되고, L2는 상기 하나의 염료 성분 이외의, Q1 염료 성분 및 Q2 중 염료 성분에 공유 결합된다. L1 및 L2는 각각 독립적으로 단일 결합을 포함하는 부분; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 탄소수 1 내지 약 12의 폴리메틸렌 단위; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴기이다. (CH2) 메틸렌 단위와 관련된 첨자, 즉 α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ 및 ι는 동일하거나 상이할 수 있고, 이는 각각 독립적으로 관련된 메틸렌 단위의 크기를 가리키고, 0 또는 1 내지 약 20의 정수, 또는 1 내지 약 12의 정수이다. 화학식 1의 중괄호 부분과 관련된 첨자, 즉 a, b, c, d, e, f, g, h 및 i는 동일하거나 상이할 수 있고, 이는 각각 독립적으로 그 화학식의 관련된 중괄호 부분의 크기를 가리키고, 0 또는 1 내지 약 20의 정수, 또는 1 내지 약 10의 정수, 또는 1 내지 약 5의 정수이다.
A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10은 동일하거나 상이할 수 있고, 이는 각각 독립적으로 핵산-결합-증진기(NABEG); N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 분지형 알킬; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 하나 이상의 포화된 5- 또는 6-원 환이다. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10은, 브릿지가 1 이하의 양 전하를 포함하거나 실질적으로 중성이도록 하며, 후자의 경우, 이들 성분은 각각 독립적으로 그 자체가 실제 중성인 것을 포함하는 실질적 중성을 나타낼 수 있다. NABEG는 높은 전기음성도의 하나 이상의 이종 원자 또는 S를 포함하는 하나 이상의 결합 연결기를 포함하는 부분; 및 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴기로부터 선택될 수 있다. 높은 전기음성도의 하나 이상의 이종 원자 또는 S를 포함하는 하나 이상의 결합 연결기를 포함하는 부분의 예에는 하나 이상의 아미드 결합, 우레탄 결합, 우레아 결합, 티오우레아 결합, 에테르 결합 또는 티오에테르 결합을 포함하는 부분들이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10 중 하나는 하기 나타낸 화학식(화학식 2)에 나타낸 바와 같이, 분지 B' 및 링커 L을 통해 Q3에 공유 결합된 분지화 단위일 수 있다.
화학식 2
Figure 112007074347589-pct00012
화학식 2에서, T는 치환된 탄소, 치환된 질소, 또는 O, N 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴일 수 있다. B'는 하기 나타낸 화학식(화학식 3)을 가진다.
화학식 3
Figure 112007074347589-pct00013
화학식 3의 -(CH2)α'는 화학식 2의 T에 공유 결합되고, 화학식 3의 A14는 화학식 2의 L3에 공유 결합된다. A11, A12, A13 및 A14은 각각 독립적으로 화학식 1의 A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10과 각기 연관되어 전술된 바와 같이, 중성이거나 실질적으로 중성인 핵산-결합-증진기(NABEG); N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 중성 분지형 알킬; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 하나 이상의 중성 포화된 5- 또는 6-원 환일 수 있다. (CH2) 메틸렌 단위와 관련된 첨자, 즉 α', β', γ' 및 δ'는 동일하거나 상이할 수 있고, 이는 각각 독립적으로 관련된 메틸렌 단위의 크기를 가리키고 0, 또는 1 내지 약 20의 정수이다. 화학식 3의 중괄호 부분과 관련된 첨자, 즉 a', b' 및 c'는 동일하거나 상이할 수 있고, 이는 각각 독립적으로 관련된 중괄호 부분의 크기를 가리키고, 0, 또는 1 내지 약 20의 정수이다.
화학식 2에서, L3은 독립적으로 화학식 1의 L 성분들과 각기 연관하여 전술된 바와 같이, 단일 결합을 포함하는 부분; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 탄소수 1 내지 약 12의 폴리메틸렌 단위; 또는 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴기일 수 있다. 수득된 분자는 삼량체 핵산 염색이다.
A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10 중 하나는 하기 나타낸 화학식(화학식 4)에 나와 있는 바와 같이, 분지 B' 및 링커 L3을 통해 반응기 Rr에 공유 결합된 분지화 단위일 수 있다.
화학식 4
Figure 112007074347589-pct00014
화학식 4에서, T, B' 및 L3은, L3이 Rr에 공유 결합되는 것을 제외하고는, 화학식 2 및 화학식 3과 연관하여 상기된 같이 정의된다. 수득된 분자는 상기 구조 3에 의해 나타낸 바와 같은 핵산 염색일 수 있다.
반응기 -Rr을 가지는 염료는, 적당한 작용기를 포함하거나 적당한 작용기를 포함하도록 유도체화된 매우 다양한 분자들 중 임의의 것을 표지화하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "반응기"는 "반응기" 또는 "작용기"를 가리키기 위해 사용될 수 있고, 용어 "작용기"는 "반응기" 또는 "작용기"를 가리키기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 그 중 어느 하나, 또는 양자 모두는 염료 상의 결합-형성기, 또는 표지화할 기질 분자 상의 결합-형성기를 가리킬 수 있다. 여기에서, 편의상, 단 비제한적으로, 염료 상의 결합-형성기는 일반적으로 반응기로 지칭되고, 기질 분자 상의 결합-형성기는 일반적으로 작용기로 지칭될 것이다. 단지 예로서, 반응기 또는 작용기 -Rr를 가지는 염료는 1 이하의 양 전하를 가질 수 있다.
일반적으로, 기질 분자로의 염료의 접합은 접합된 기질 분자에 염료의 핵산-검출 성질을 부여할 수 있다. 반응기 및 작용기는 전형적으로 각기 친전자성 및 친핵성이어서, 공유 결합을 형성할 수 있다. 한 대안예에 따라, 반응기는 자외선 광활성화 또는 열분해 시에 탄화수소 분자와 반응할 수 있는 광활성화가능한 기이다. 또 다른 대안예에 따라, 반응기는 디엘스-엘더(Diels-Alder) 반응을 통해 접합된 디엔과 반응할 수 있는 친디엔성 기이다. 또 다른 대안예에 따라, 반응기는 친디엔성 기와 반응할 수 있는 1,3-디엔이다. 또 다른 반응기/작용기 쌍은 슈타우딩거(Staudinger) 화학작용, 또는 아지도기와 말단 알킨 간의 반응(소위 클릭(Click) 화학작용)에 기초하여 선택될 수 있다. 단지 예로서, 유용한 반응기, 작용기 및 상응하는 연결기의 예가 하기 표 1에 열거되어 있다.
반응기, 작용기 및 공유 연결기의 예
친전자성기 친핵성 기 수득되는 공유 연결기
활성화된 에스테르* 아민/아닐린 카르복사미드
아크릴아미드 티올 티오에테르
아실 아지드** 아민/아닐린 카르복사미드
아실 할라이드 아민/아닐린 카르복사미드
아실 할라이드 알코올/페놀 에스테르
아실 니트릴 알코올/페놀 에스테르
아실 니트릴 아민/아닐린 카르복사미드
알데히드 아민/아닐린 이민
알데히드 또는 케톤 히드라진 히드라존
알데히드 또는 케톤 히드록시아민 옥심
알킬 할라이드 아민/아닐린 알킬 아민
알킬 할라이드 카르복실산 에스테르
알킬 할라이드 티올 티오에테르
알킬 할라이드 알코올/페놀 에스테르
알킬 술포네이트 티올 티오에테르
알킬 술포네이트 카르복실산 에스테르
알킬 술포네이트 알코올/페놀 에스테르
무수물 알코올/페놀 에스테르
무수물 아민/아닐린 카르복사미드
아릴 할라이드 티올 티오페놀
아릴 할라이드 아민 아릴 아민
아지리딘 티올 티오에테르
보로네이트 글리콜 보로네이트 에스테르
카르복실산 아민/아닐린 카르복사미드
카르복실산 알코올 에스테르
카르복실산 히드라진 히드라지드
카르보디이미드 카르복실산 N-아실우레아 또는 무수물
디아조알칸 카르복실산 에스테르
에폭시드 티올 티오에테르
할로아세트아미드 티올 티오에테르
할로트리아진 아민/아닐린 아미노트리아진
할로트리아진 알코올/페놀 트리아지닐 에테르
이미도 에스테르 아민/아닐린 아미딘
이소시아네이트 아민/아닐린 우레아
이소시아네이트 알코올/페놀 우레탄
이소티오시아네이트 아민/아닐린 티오우레아
말레이미드 티올 티오에테르
포스포르아미다이트 알코올 포스피트 에스테르
실릴 할라이드 알코올 실릴 에테르
술포네이트 에스테르 아민/아닐린 알킬 아민
술포네이트 에스테르 티올 티오에테르
술포네이트 에스테르 카르복실산 에스테르
술포네이트 에스테르 알코올 에테르
술포닐 할라이드 아민/아닐린 술폰아미드
술포닐 할라이드 페놀/알코올 술포네이트 에스테르
* 활성화된 에스테르는 당업계에서 이해되어지는 바와 같이, 일반적으로 화학식 -COΩ(식 중에서, Ω는 예를 들어 숙신이미딜옥시(-OC4H4O2), 술포숙신이미딜옥시(-OC4H3O2-SO3H) 또는 -1-옥시벤조트리아졸릴(-OC6H4N3)과 같은 양호한 이탈기; 활성화된 아릴 에스테르를 형성하기 위해 사용되는, 아릴옥시기, 또는 예를 들어 니트로, 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메틸 또는 이들의 조합과 같은 전자-흡인 치환기(들)에 의해 한 번 이상 치환된 아릴 옥시기; 또는 무수물 또는 혼합된 무수물 - OCORa 또는 - 0CNaNHRb(식 중에서, 동일하거나 상이할 수 있는 Ra 및 Rb는 독립적으로 C1-C6 알킬, C1-C6 퍼플루오로알킬 또는 C1-C6 알콕시; 또는 시클로헥실, 3-디메틸아미노프로필, 또는 N- 모르폴리노에틸임)을 형성하기 위해 카르보디이미드에 의해 활성화된 카르복실산임)을 가진다.
** 아실 아지드는 또한 이소시아네이트로 재정렬될 수 있다.
반응기는 아민, 티올 또는 알데히드와 반응하는 것일 수 있다. 반응기는 예를 들어 숙신이미딜 에스테르와 같은 아민-반응기, 또는 예를 들어 말레이미드, 할로아세트아미드 또는 메탄티오-술포네이트(MTS)와 같은 티올-반응기, 또는 예를 들어 아민, 아미녹시 또는 히드라지드와 같은 알데히드-반응기일 수 있다
반응성 염료는 매우 다양한 기질 분자들 중 임의의 것에 접합될 수 있다. 예를 들어, 적당한 기질은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 합텐, 약물, 마이크로입자, 합성 중합체, 천연 중합체, 생물학적 세포, 바이러스, 예를 들어 실리콘 웨이퍼의 표면, 폴리프로필렌 기질 또는 용기의 표면과 같은 고체 표면의 분자 등일 수 있다. 표지화될 표면은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 또는 핵산과 상호작용할 수 있는 분자일 수 있다. 예를 들어, DNA-결합 염료는 qPCR 용도를 위한 올리고뉴클레오티드-기재 프로브를 표지화하기 위해 사용되었다. 문헌[Shiguro, T., et al., Nucleic Acids Res. 24: 4992-7(1996)]을 참조할 수 있다.
동일하거나 상이할 수 있는, A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10은 독립적으로 높은 전기음성도의 하나 이상의 이종 원자 또는 S를 포함하는 하나 이상의 결합 연결기를 포함하는 부분; 및 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴기로부터 선택되는 NABEG일 수 있다. 높은 전기음성도의 하나 이상의 이종 원자 또는 S를 포함하는 하나 이상의 결합 연결기를 포함하는 부분의 예에는 하나 이상의 아미드 결합, 우레탄 결합, 우레아 결합, 티오우레아 결합, 에테르 결합 또는 티오에테르 결합을 포함하는 부분들이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10는 브릿지가 1 이하의 양 전하를 포함하거나 실질적으로 중성이도록 하며, 후자의 경우, 이들 성분은 각각 독립적으로 그 자체가 실제 중성인 것을 포함하는 실질적 중성을 나타낼 수 있다.
브릿지는 예를 들어 약 10 내지 약 100개의 비-수소 원자, 또는 이량체 염료에 대해서는 약 12 내지 약 60개의 비-수소 원자, 및 삼량체 염료에 대해서는 약 20 내지 약 100개의 비-수소 원자와 같이, 전술된 바와 같이 임의의 적당한 수의 비-수소 원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 브릿지는 이량체 염료에 대해서는 약 15 내지 약 40개의 비-수소 원자, 및 삼량체 염료에 대해서는 약 30 내지 약 70개의 비-수소 원자를 가질 수 있다.
단지 예로서, 브릿지는 하기 나타낸 화학식(화학식 5)를 가질 수 있다.
화학식 5
Figure 112007074347589-pct00015
그러한 한 경우에서, 예를 들어, 브릿지의 L1은 -(CH2)x-이고, 브릿지의 L2는 -(CH2)x-(식 중에서, x는 각각 독립적으로 1 내지 11(한계 수치 포함)로부터 선택되는 정수임)이고; 브릿지의 A1는 -C(=O)NH-이며; 브릿지의 a는 1이고; 브릿지의 A2는 -O-이며; 브릿지의 A3은 -O-이고; α는 2 내지 약 20(한계 수치 포함)으로부터 선택되는 정수일 수 있고; β 및 γ는 각각 독립적으로 2 또는 3일 수 있으며; b는 0, 또는 2 내지 약 20으로부터 선택되는 정수일 수 있고; c는 0 또는 1일 수 있으며; 브릿지의 d, e, f, g, h 및 i는 각각 0이고; 브릿지의 A10은 -NH(O=C)C-이다. 또한, 단지 예로서, 브릿지는 전술된 바와 같을 수 있고, 여기에서 c는 1이고, 또한 x는 5일 수 있으며; α 및 γ는 동일할 수 있고, 2 또는 3일 수 있으며; β는 2일 수 있고; b는 0, 1, 2 또는 3일 수 있다.
단량체 염료
독립적으로 이량체 및 삼량체 염료를 위해 사용되는 성분 단량체 염료 또는 작용성 분자, Q1, Q2 및 Q3은 각각 1) 형광성 핵산 염료; 2) 비형광성 핵산-결합 분자; 3) 형광성 비핵산 염료; 및 4) 비형광성 비핵산 염료로부터 선택된다. 일반적으로, DNA 결합 시의 Q1, Q2 및 Q3은 DNA의 부재 하에서의 분자내 이량체 형성 및 고형광성 DNA-염료 복합체의 형성을 도모하거나 확실히 하기 위한 방식으로 선택되어, 브릿지를 통해 공유 결합될 수 있다. 분자내 이량체 형성은 전술된 바와 같이, 이량체 염료의 유용한 헤어핀 입체형태를 제공하기에 충분할 수 있다. 그러한 이량체 염료는 예를 들어 낮은 배경 형광 및 낮은 PCR 억제와 같은 바람직한 성질을 가질 수 있다. 전술된 바와 같이, 본원에 기재된 이량체 염료를 비교적 높은 농도로 사용하여, 바람직한, 즉 강한 형광 신호를 발생시킬 수 있다.
분자내 이량체 형성은, 수용액 내 이량체 염료 또는 삼량체 염료의 흡수 스펙트럼을 역시 수용액 내 관련 단량체 염료 또는 염료들의 흡수 스펙트럼을 비교함으로써 확인될 수 있다. 임의의 분자내 이량체 형성 염료는 이량체 또는 삼량체 내 성분 단량체 염료의 스펙트럼이 관련 단량체 염료(들)의 스펙트럼 대비 유의적으로 편이되도록 할 수 있어야 한다. 이와 관련하여, 유의적 편이는 예로서 약 10 nm 이상일 수 있다. 예를 들어, 도 2에서, AOAO-7과 관련된 스펙트럼은 DMAO의 스펙트럼에 비해 유의적으로 편이된다.
분자내 이량체 형성이 H-이량체 형성일 때, 스펙트럼은 통상 유의적 청색 편이를 겪을 것이다. 이와 관련하여, 유의적 편이는 예로서 약 10 nm 이상일 수 있다. 분자내 다른 유형의 이량체 형성도 또한 가능하고, 또 다른 방향으로의 분광 편이, 성분 단량체 염료의 각각에 대해 분리된 방향으로의 분광 편이, 비유의적 분광 편이, 또는 분광 비-편이를 초래할 수 있다. 이와 관련하여, 비유의적 편이는 예로서 약 5 nm 이하일 수 있다. 일반적으로, 유의적 분광 편이가 관찰되지 않을 때, 기타 분석 기법을 이용하여 임의의 분자내 이량체의 형성을 확인할 수 있다. 그러한 분석 기법에는 예를 들어 핵 자기 공명(NMR) 분광법, 적외선 분광법 및 형광 분광법이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 헤어핀 구조를 초래하는 임의의 분자내 염료 응집이 일반적으로 바람직하다.
Q1, Q2 및 Q3의 각종 조합이 유용하거나 바람직할 수 있다. 단지 예로서, 이량체 염료는 도 10에 개략적으로 나와 있는 바와 같이, Q1 및 Q2의 5가지 상이한 조합을 통해 구성될 수 있다. 추가 예로서, 제조된 염료 및 관련된 중간체의 예가 하기 표 2에 열거되어 있다.
[표 2]
제조된 형광성 핵산 염료
Figure 112007074347589-pct00016
Figure 112007074347589-pct00017
Figure 112007074347589-pct00018
Figure 112007074347589-pct00019
Figure 112007074347589-pct00020
표 2에 나와 있는 구조들 중 많은 구조들이 하나 이상의 요오다이드 음이온(들)을 나타내나, 단지 예시적으로 클로라이드 음이온(들) 등의 본원에 기재된 것들과 같은 임의의 다른 적절한 음이온(들)을 나와 있는 요오다이드 음이온 대신에 사용할 수 있다.
본 발명의 이량체 염료는 형광성 핵산 염료 Q1 및 형광성 핵산 염료 Q2를 포함할 수 있고, 여기에서 Q1 및 Q2는 동일하거나 상이할 수 있다. Q1 및 Q2가 동일한 경우, 수득된 염료는 단지 예시로서의 표 2의 염료 No. 6-22, 24-26, 및 28-36 중 임의의 것과 같은 동종이량체이다. Q1 및 Q2가 유사한 흡수 및 방출 스펙트럼을 가지는 상이한 형광성 핵산 염료인 경우, 수득된 이량체는 단지 예시로서 표 2의 염료 No. 23와 같은 이종이량체이다. 그러한 이종이량체는 동종이량체와 작용적으로 유사하다. 어느 경우에서도, Q1 및 Q2는 모두 리포터 염료이어서, 도 10의 조합 A에 개략적으로 도시된 바와 같이, DNA 결합 시에 검출된 형광 신호에 기여한다. 대안적으로, 이종이량체 염료는 실질적으로 상이한 흡수 및 방출 스펙트럼을 가지는 2개의 상이한 형광성 핵산 염료를 포함할 수 있다. 이 경우에, 두 염료 중 단 하나만이 리포터 염료로 선택된다.
Q1 및 Q2는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 쌍을 형성할 수 있다. 이 경우에, 보다 짧은 파장을 가지는 염료는 형광 공여자 염료로 작용하고, 한편 보다 긴 파장을 가지는 염료는 어셉터 또는 리포터 염료로 작용한다. 효율적인 FRET가 일어나기 위해, 공여자 염료의 방출 스펙트럼 및 흡수는 충분히 중첩될 필요가 있다. FRET의 추가 논의가 문헌[Forster, Ann. Phys.(1948) 및 Stryer, et al., Proc . Natl . Acad. Sci .(1967)]에 제시되어 있다. FRET-기재 염료는 한 파장에서 여기되고, 실질적으로 보다 긴 파장에서 형광의 한 파장 및 재방출에서 여기되도록 한다.
실질적으로 상이한 스펙트럼의 Q1 및 Q2를 포함하는 이종이량체가 FRET-기재 염료가 아닌 경우, Q1 및 Q2가 동시에 양자 모두가 아닌 어느 하나가 리포터 염료로 선택될 수 있다. 다른 한 비-리포터 염료는 필요한 분자내 이량체 형성을 위한 상대로 작용하고, 이량체 염료를 위한 부가적 핵산 결합 능력을 제공한다. 한 리포터 염료인 형광성 핵산 염료 Q1, 및 한 비-리포터 염료인 비형광성 핵산-결합 분자 Q2를 가지는 이종이량체 염료의 한 예가 도 10의 조합 B에 개략적으로 도시되어 있다.
이종이량체 염료는 비형광성 핵산-결합 분자 Q1 및 형광성 비핵산 염료 Q2를 포함할 수 있다. 여기에서, Q2는 리포터 염료이고, 한편 Q1는 DNA 앵커링 염료 및 필요한 분자내 이량체 형성을 위한 쌍 형성 상대로 작용한다. 이 유형의 이종이량체를 위한 DNA 결합 방식이 도 10의 조합 C에 개략적으로 도시되어 있다.
이종이량체 염료는 형광성 핵산 염료 Q1 및 비형광성 비핵산 염료 Q2를 포함할 수 있다. 그러한 경우에, Q1는 리포터 염료이고, Q2는 필요한 분자내 이량체 형성을 위한 상대로 작용한다. 이 유형의 이종이량체를 위한 DNA 결합 방식이 도 10의 조합 D에 개략적으로 도시되어 있다.
이종이량체 염료는 형광성 핵산 염료 Q1 및 형광성 비핵산 염료 Q2를 포함할 수 있다. Q1 및 Q2가 유사한 흡수 및 방출 스펙트럼을 가지는 경우, Q1 및 Q2는 양자 모두 리포터 염료이나, Q1만이 핵산에 결합된다. 이 유형의 이종이량체를 위한 DNA 결합 방식이 도 10의 조합 E에 개략적으로 도시되어 있다. Q1 및 Q2가 FRET 쌍을 형성할 때, 보다 짧은 파장을 가지는 염료는 형광 공여자 염료로 작용하고, 한편 보다 긴 파장을 가지는 염료는 어셉터 또는 리포터 염료로 작용한다. Q1 및 Q2가 스펙트럼이 실질적으로 상이하고 FRET 쌍이 아닌 경우, Q1 및 Q2가 동시에 양자 모두가 아닌 어느 하나가 리포터 염료로 선택될 수 있다. 이 후자의 경우의 한 예는 도 12 및 13에 도시된 바와 같이, 각기 503 nm 및 523 nm(DNA)에서 흡수 피크 및 방출 피크를 가지는 AO, 및 각기 600 nm 및 ~620 nm에서 흡수 피크 및 방출 피크를 가지는 로자민 염료를 포함하는 이종이량체 AORO-7(표 2의 염료 No. 27)이다. 도 14는 i사이클러(iCycler) IQ 다중색 실시간 PCR 검출 시스템(바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재) 제조)에서의 채널 no. 3을 이용하여, 형광성 비-핵산 로자민 염료 성분을 리포터 염료로 선택할 때, AORO-7을 이용한 PCR 증폭 플롯을 나타낸다.
이량체 염료는 2개의 동일한 형광성 핵산 염료 및 2개의 상이한 형광성 핵산 염료로부터 선택되는 한 쌍의 단량체 염료를 포함할 수 있다.
삼량체 염료는 형광성 핵산 염료 Q1, 형광성 핵산 염료 Q2, 형광성 핵산 염료 Q3을 포함할 수 있고, 여기에서 Q1, Q2 및 Q3은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, Q1, Q2 및 Q3은 동일한 형광성 핵산 염료일 수 있다. 삼량체 염료는 형광성 핵산 염료 Q1, 형광성 핵산 염료 Q2 및 형광성 비핵산 염료 Q3을 포함할 수 있고, 여기에서 Q1 및 Q2는 DNA 앵커링 분자로 작용하고, Q3은 리포터 염료이다. 본 발명의 삼량체 염료는 비형광성 핵산-결합 분자 Q1, 비형광성 핵산-결합 분자 Q2 및 제3 형광성 비핵산 염료 Q3을 포함할 수 있고, 여기에서 Q1 및 Q2는 DNA 앵커링 분자로 작용하고, Q3은 리포터 염료이다.
형광성 핵산 염료, 비형광성 핵산-결합 분자, 형광성 비핵산 염료, 비형광성 비핵산 염료, 및 이들의 예가 하기 추가 기재되어 있다.
형광성 핵산 염료
염료를 구성하는데 적당한 단량체 형광성 핵산 염료의 예에는 아크리딘 염료, 비대칭 시아닌-기재 핵산 염색, 페난트리디늄 염료, 대칭 시아닌 핵산 염색, DAPI의 유도체, 및 호에스트(Hoechst) 염료의 유도체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. DAPI 및 호에스트 염료는 일반적으로 결합 형성을 위한 반응기를 가지지 않기 때문에 브릿지에 직접 부착될 수 없다. 이 맥락에서, 유도체는 예로서 반응기 부가 등에 의해, 결합 형성을 위해 충분히 개질된 DAPI 또는 호에스트 염료와 같은 염기 염료를 가리킨다.
아크리딘 염료
단지 예로서, 단량체 형광성 핵산 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 4)를 가지는 아크리딘 염료일 수 있다.
구조 4
Figure 112007074347589-pct00021
아크리딘 오렌지(AO)는 dsDNA를 그린 형광으로 염색하고 RNA를 적색 형광으로 염색하는 아크리딘 염료이다. 문헌[Traganos, et al., J. Histochem . Cytochem . 25(1), 46(1977)]을 참조할 수 있다. 일부 다른 아크리딘 염료와는 달리, AO는 높은 흡광 계수(>50,000) 및 긴 흡수 파장(λabs = 500 nm(DNA 결합))을 가진다. 그러나, 핵산에 대한 AO의 친화도는 매우 낮고, 염료는 핵산의 부재 하에서 유의적 고유 형광을 가진다. 이와 관련하여, 고유 형광 수준은 예를 들어 낮은 나노그램/mL 범위에서와 같은 낮은 수준에서의 핵산 검출, 또는 예를 들어 탈염색 단계 없이 겔 내 핵산 검출에 사용되는 것을 배제한다는 점에서 유의적일 수 있다. 결과적으로, AO 자체는 DNA 또는 RNA 정량화, 특히 실시간 qPCR과 같은 용도들과 관련된 고감도 DNA 검출에 특히 대해 유용성이 거의 없다.
아크리딘 염료는 환 구조 내 각종 위치들에 각종 치환기들 중 임의의 것을 포함할 수 있다, 치환기의 성질 및 그 치환 위치는 생산되는 염료의 분광 성질에 상당히 영향을 줄 수 있다. 일반적으로, 3- 및 6-위치의 전자-공여 치환기 및 9-위치의 전자-흡인 치환기는 전형적으로 염료의 흡수 및 방출 스펙트럼을 적색 편이시킨다. 전형적인 전자-공여기의 예에는 아미노기, 히드록실기, 알콕시기, 및 알킬머캅토기가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 전형적인 전자-흡인기의 예에는 시아노기, 퍼플루오로알킬기, 카르복사미도기, 술폰아미드기, 니트로기 및 할로겐기가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 코어 구조와 융합된 임의의 부가적 환 구조도 역시 생산되는 염료의 파장을 증가시킬 것이다.
이제 구조 4의 각종 부분들이 기재된다. 구조 4에서, 본원에 제공되거나 기재된 각종 기타 단량체 염료 구조들에서와 같이, 단지 예시적으로 R1와 같은, 첨자 뒤의 기호 "R"는 브릿지의 부분이 아닌 구조의 치환기를 가리키거나, 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있는 바, 이 경우, 그것은 구조의 치환기가 아니다. R1은 각각 독립적으로 H; 탄수소 1 내지 6의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR4; -SR5; -NR6R7; -CN; -NH(C=O)R8; -NHS(=O)2R9; 또는 -C(=0)NHR10일 수 있고; R1들 중 임의의 인접한 쌍은 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 추가로 포함하는 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 임의적으로 형성하고; R1들 중 하나는 전술된 바와 같은 -L-Rr이거나, R1들 중 하나는 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내고, 이 경우에 R1는 단지 예시적이고 실제로 단량체 염료의 치환기가 아니다. R1가 R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10 중 하나 이상을 포함하는 임의의 경우에, 그것들 중 임의의 적용가능한 하나는 독립적으로 H 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이며, 인접한 R6 및 R7 중 임의의 적용가능한 쌍의 경우, R6 및 R7은 각각 N 및 O로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 조합하여 형성할 수 있다.
전형적으로, R2는 H; 탄수소 1 내지 6의 알킬 또는 알케닐; 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴; 할로겐; -OR11; -SR12; -NHR13; -CN; 또는 -C(=O)NHR14이거나; 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낸다. R2가 R11, R12, R13 및 R14 중 하나 이상을 포함하는 임의의 경우에, 그것들 중 임의의 적용가능한 하나는 독립적으로 H 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이다.
전형적으로, R3은 H; 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이거나; 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낸다.
Ψ는 예를 들어 염료와 관련된 양 전하(들)의 밸런스를 맞추는 음이온과 같은 음이온이다. Ψ는 생물학적으로 상용적일 수 있다. 적당한 음이온의 예에는 할라이드, 술페이트, 포스페이트, 퍼클로레이드, 테트라플루오로보레이트 및 헥사플루오로포스페이트가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 단지 예로서, 음이온은 클로라이드 또는 요오다이드일 수 있다.
R1, R2 및 R3 중 단 하나만이 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내야 한다. 단지 예로서, R2 및 R3 중 하나는 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 브릿지는 본원에 기재된 임의의 염료와 같은 한 단량체 아크리딘 염료 및 또 다른 한 적당한 단량체 염료를 공유 결합시켜 이량체 염료를 형성하거나, 또는 2개의 적당한 다른 단량체 염료를 공유 결합시켜 삼량체 염료를 형성할 수 있다. 일반적으로, R1, R2 및 R3 중 단 하나만이 임의적으로 전술된 바와 같은 -L-Rr일 수 있다. 이량체 염료 또는 삼량체 염료는 단지 하나의 -L-Rr만을 포함할 수 있다.
단지 예로서, 단량체 아크리딘 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 5)를 가질 수 있다.
구조 5
Figure 112007074347589-pct00022
구조 5에서, 일반적으로, R1은 각각 독립적으로 H, 또는 C1-C2 알킬이고; R2 및 R3 중 하나는 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내며; 임의적으로, R2 및 R3 중 하나는 전술된 바와 같은 -L-Rr이고; R2가 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내지 않고 L-Rr가 아닐 때, R2는 H, -CH3, -NH2, - NHCH3, -CN 및 -C(=O)NH2로부터 선택되고; R3이 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내지 않고 L-Rr가 아닐 때, R3은 H 또는 -CH3로부터 선택되며; R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 또는 C1-C2 알킬이고; Ψ는 전술된 바와 같은 음이온이다. 단지 예로서, 인접한 R6 또는 R7 및 R1의 각 쌍의 경우, 독립적으로 R6 또는 R7 및 R1은 조합하여 5- 또는 6-원의 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있다.
한 예에서, 구조 5로 나타낸 단량체 아크리딘 염료는 R1가 각각 H이고; R2가 H이며; R3이 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내며; R6이 각각 -CH3이고; R7이 각각 -CH3이며; Ψ가 전술된 바와 같은 음이온이도록 하는 염료일 수 있다.
단지 예로서, 이량체 염료는 2개의 동일한, 구조 5의 단량체 아크리딘 염료 분자 및 화학식 5의 브릿지를 포함할 수 있다.
비대칭 시아닌 염료
단지 예로서, 단량체 형광성 핵산 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 6)를 가지는 비대칭 시아닌 염료일 수 있다.
구조 6
Figure 112007074347589-pct00023
비대칭 시아닌 염료의 일반 구조(상기 구조 6)는 치환된 벤즈아졸리움 환인 헤테로시클릭 환; 메탄 또는 폴리메틴 브릿지; 및 치환된 피리디늄 또는 퀴놀리늄 환인 헤테로시클릭 환을 포함한다. 구조 내 점선은 4차화되거나 되지 않을 수 있는 하나 이상의 질소(들)이 임의적으로 혼입되어 있는, 하나 이상의 융합된 방향족 환(들)을 형성하는데 필요한 원자를 나타낸다. 점선이 하나 이상의 질소 원자(들)을 포함하는 6-원 환을 나타내는 경우, 수득된 융합된 환은 아자-벤졸 환이라 불린다.
구조 6에서, 일반적으로, 벤즈아졸리움 환 상의 R1 및 R1'은 각각 독립적으로 H; 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR9; -SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; 또는 -C(=O)NHR15이다. 단지 예로서, R1 및 R1' 중 하나는 X 또는 벤즈아졸 질소에 대해 메타 위치인 치환기일 수 있고, 여기에서 치환기는 하기 추가 기재되는 하나 이상의 바람직한 성질을 부여한다. R1 또는 R1'가 R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 중 하나 이상을 포함하는 임의의 경우에서, 그것들 중 임의의 적용가능한 하나는 독립적으로 H; 또는 1 내지 2개 질소(들)이 임의적으로 혼입되어 있는, 탄소수 1 내지 12의 알킬, 또는 아릴이고; 임의의 적용가능한 R11 및 R12는 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 구조 6의 R1 및 R1' 중 하나는 염료에 하나 이상의 바람직한 성질을 부여하는 치환기일 수 있다. 그러한 한 바람직한 성질은 DNA 마이너 그루브-결합이다. 마이너 그루브-결합 분자는 전형적으로 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브에 부합하는 초승달 모양을 가지는 구조를 가진다. 천연 분자를 포함할 수 있는 DNA 마이너 그루브-결합 염료 분자 또는 비-염료 분자의 예에는 DAPI, 호에스트 염료, 디스타마이신 A, 네트로프신, 및 N-메틸피롤 및 N-메틸이미다졸의 폴리아미드 기재의 수많은 합성 마이너 그루브- 바인더들 중 임의의 것이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 참고 자료[바이오티움 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)의 카달로그, 2005-2006; Boger, et al., Ace. Chem . Res. 37, 61 (2004); 및 Dervan, P.B., Bioorg . & Med . Chem . 9, 2215 (2001)]를 참조할 수 있다. 마이너 그루브-바인더의 초승달 모양은 전형적으로, 치환 또는 비치환된 벤족사졸-2-일, 치환 또는 비치환된 벤즈이미다졸-2-일, 치환 또는 비치환된 벤조티아졸-2-일, 치환 또는 비치환된 이미다졸-2-일, 치환 또는 비치환된 옥사졸-2-일, 치환 또는 비치환된 티아졸-2-일, 치환 또는 비치환된 N-메틸피롤릴-2-아미노카르보닐, 치환 또는 비치환된 N-메틸피롤릴-3-카르복사미도, 치환 또는 비치환된 1-메틸이미다졸-2-카르복사미도, 치환 또는 비치환된 1-메틸이미다졸-4-아미노카르보닐, 치환 또는 비치환된 페닐, 치환 또는 비치환된 피리딜, 치환 또는 비치환된 피라지닐, 및 치환 또는 비치환된 트리아지닐이 포함되나, 이에 한정되지 않는 마이너 그루브-바인더 치환기를 가지는 5- 또는 6-원 환의 메타-치환에 의해 생성된다. DNA 염료는 미국 특허 출원 공보 제2004/0132046호에 기재된 것들과 같은 마이너 그루브-바인더 치환기에 의해 메타-치환될 수 있다.
R1 및 R1' 중 하나는 전술된 바와 같은 -L-Rr일 수 있다. R1 및 R1' 중 하나는 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다.
X가 O 및 S로부터 선택된다. 일반적으로, X가 S인 염료는 X가 O인 유사 염료보다 긴 흡수 및 방출 파장을 가진다.
R2는 메틸 또는 에틸이거나, 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다. 단지 예로서, R2는 메틸 또는 에틸일 수 있다.
첨자 n은 임의의 메틴 브릿지 내 수많은 이중 결합 단위들을 나타내고, 0, 1 및 2로부터 선택된다. 전형적으로, 보다 긴 메틴 브릿지를 가지는 염료는 보다 짧은 메틴 브릿지를 가지는 염료보다 긴 파장을 가질 것이다. 단지 예로서, n은 0 또는 1일 수 있다.
치환기 R3, R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 -CH3이다. 임의적으로, 이들 치환기의 임의의 인접한 쌍은 5- 또는 6-원 환을 형성할 수 있다. 단지 예로서, R3, R4 및 R5는 H일 수 있다.
일반적으로, 치환기 R6, R8 및 R8'은 각각 독립적으로 H; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR16; -SR16; -NR16R17; 할로겐, 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개 이종 원자(들)을 임의적으로 포함하는, 치환 또는 비치환된 아릴일 수 있다. R8 및 R8'은 조합하여, C1-C2 알킬, C1-C2 알콕시, C1-C2 알킬머캅토 또는 할로겐에 의해 독립적으로 1 내지 4회(들) 추가 치환될 수 있는, 융합된 방향족 환을 형성할 수 있다. R6, R8 및 R8' 중 임의의 것이 R16 및 R17 중 하나 이상을 포함하는 임의의 경우에서, 그것들 중 임의의 적용가능한 하나는 독립적으로 H; 또는 1 내지 2개 질소(들)이 임의적으로 혼입되어 있는, 탄소수 1 내지 12의 알킬, 또는 아릴이고; 임의의 적용가능한 R16 및 R17은 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있다.
R6은 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다. R6은 전술된 바와 같은 -L-Rr-일 수 있다.
R7은 H; 아릴, 및 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개 이종 원자(들)을 임의적으로 포함하는, 치환 또는 비치환된 아릴; 및 전술된 바와 같은 -L-Rr로부터 선택되거나; 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다.
Ψ는 본원에 전술된 바와 같은 음이온이다.
R1, R1', R6, R7 및 R8 중 단 하나만이 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내야 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 브릿지는 단량체 비대칭 시아닌 염료 및 또 다른 적당한 단량체 염료를 공유 결합시켜 이량체 염료를 형성하거나, 단량체 비대칭 시아닌 염료 및 다른 두 적당한 단량체 염료를 공유 결합시켜 삼량체 염료를 형성할 수 있다. 일반적으로, R1, R1', R6, R7 및 R8 중 단 하나만이 임의적으로 전술된 바와 같은 -L-Rr일 수 있다. 더욱 전형적으로는, 이량체 염료 또는 삼량체 염료가 단지 하나의 -L-Rr을 포함할 수 있다.
단지 예로서, 비대칭 시아닌 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 7)를 가질 수 있고, 여기에서 R1', R6, R7, R8 및 R8'은 각각 구조 6과 관련하여 전술된 바와 같다.
구조 7
Figure 112007074347589-pct00024
예로서, 구조 7로 표시되는 바와 같은 비대칭 시아닌 염료는, R1'가 H; 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR9; -SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; 또는 -C(=O)NHR15; 마이너 그루브 결합과 관련된 치환기; 또는 전술된 바와 같은 -L-Rr이거나; 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내도록 하는 염료일 수 있다. 또한, R1'이 R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 중 하나 이상을 포함하는 경우, 상기 R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 중 임의의 하나는 독립적으로 H 또는 1 내지 2개 질소(들)이 임의적으로 혼입되어 있는, 탄소수 1 내지 12의 알킬 또는 아릴이고; R1'이 R11 및 R12를 포함할 경우, R11 및 R12는 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 5- 또는 6-원의 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있다. X는 O 및 S로부터 선택될 수 있고, n은 0, 1 및 2로부터 선택될 수 있다. R6은 H; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR16; -SR16; -NR16R17; 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개 이종 원자(들)을 임의적으로 포함하는, 치환 또는 비치환된 아릴; 또는 전술된 바와 같은 -L-Rr일 수 있거나; 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다. R7은 H; 아릴, 및 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개 이종 원자(들)을 임의적으로 포함하는, 치환 또는 비치환된 아릴; 또는 전술된 바와 같은 -L-Rr이거나; 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다. R8은 H; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR16; -SR16; -NR16R17; 또는 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개 이종 원자(들)을 임의적으로 포함하는, 치환 또는 비치환된 아릴; 또는 전술된 바와 같은 -L-Rr일 수 있거나; 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다. R8'은 H;, N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 탄소수 1 내지 10(한계 수치 포함)의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR16; -SR16; -NR16R17; 또는 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개 이종 원자(들)을 임의적으로 포함하는, 치환 또는 비치환된 아릴일 수 있다. R8 및 R8'은 조합하여, C1-C2 알킬, C1-C2 알콕시, C1-C2 알킬머캅토 또는 할로겐에 의해 독립적으로 1 내지 4회(들)로 추가 치환될 수 있는 융합된 방향족 환을 형성할 수 있다. R16 및 R17 중 하나 이상을 포함하는 임의의 R6, R8 또는 R8'에 대해, 이들의 R16 및 R17 중 상기 임의의 하나는 독립적으로 H; 1 내지 2개 질소(들)이 임의적으로 혼입되어 있는, 탄소수 1 내지 12의 알킬 또는 아릴일 수 있다. R16 및 R17을 포함하는 임의의 R6, R8 또는 R8'에 대해, 이들의 R16 및 R17은 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있다. R1', R6, R7 및 R8 중 단 하나만이 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낸다. 일반적으로, R1', R6, R7 및 R8 중 단 하나만이 임의적으로 전술된 바와 같은 -L-Rr일 수 있다. Ψ는 전술된 바와 같은 음이온이다.
한 예에서, 비대칭 시아닌 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 8)(식 중에서, R7은 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타내고, Ψ는 전술된 바와 같은 음이온임)를 가진다.
구조 8
Figure 112007074347589-pct00025
단지 예로서, 이량체 염료는 2개의 동일한 구조 8의 단량체 비대칭 시아닌 염료 분자 및 화학식 5의 브릿지를 포함할 수 있다.
단지 예로서, 예를 들어 구조 1 의 것과 같은 형광성 핵산 염료에서, Q1 염료 성분은 예를 들어 구조 6-8 중 임의의 것과 같은 비대칭 시아닌 염료이고, Q2 염료 성분은 예를 들어 구조 6-8 중 임의의 것과 같은 비대칭 시아닌 염료이며, 예를 들어 화학식 1의 브릿지와 같은 브릿지의 a, b, c, d, e, f, g, h 및 i의 총합은 3 초과일 수 있고, 혹은 예를 들어 화학식 1의 브릿지와 같은 브릿지의 A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10 중 하나 이상은, 하나 이상의 아미드 결합, 우레탄 결합, 우레아 결합 또는 티오우레아 결합을 포함하는 하나 이상의 결합 연결기를 포함하는 부분; 또는 할로겐, N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의적으로 포함하는 아릴을 포함하는 NABEG일 수 있다.
페난트리디늄 염료
단지 예로서, 단량체 형광성 핵산 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 9)를 가지는 페난트리디늄 유도체일 수 있다.
구조 9
Figure 112007074347589-pct00026
일반적으로, R1은 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있으나, 다른 구조에의 브릿지의 부착을 제공할 수 있거나, 각종 바람직한 파장들 중 임의의 파장을 가지는 염료를 제공하도록 구조를 변형시킬 수 있는 합성 기법과 같은 각종 기법들을 통해, 상기 구조 9의 많은 변형들이 가능하고 본원에서 구상되어지는 것으로 이해한다. Ψ는 전술된 바와 같은 음이온이다.
단지 예로서, 화학식 5의 브릿지와 구조 9의 2개의 단량체 페난트리디늄 염료 분자는 조합하여 이량체 염료를 형성할 수 있다.
단지 예로서, 단량체 형광성 핵산 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 10)를 가지는 잔텐 유도체일 수 있다.
구조 10
Figure 112007074347589-pct00027
특정 양이온 하전 잔텐 염료는 핵산에 결합하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, R1, R2, R1' 및 R2'가 메틸이고, R3, R3', R4, R4' 및 A가 H인 피로닌 Y는 DNA 겔 염색에 사용되어 온 공지된 형광 DNA 결합 염료이다. 문헌[Adkin, S., 및 Burmeister, M., Anal. Biochem. 240(1), 17(1996)]을 참조할 수 있다. 상기 구조 10에 나와 있는 일반 골격을 가지는 염료는 유사한 성질을 가지고 다른 형광 색상을 제공하는 것으로 예상된다. 예를 들어, 피로닌 Y는 548 nm에서 흡수 최대를 가지고, 565 nm에서 방출 최대를 가져, 적색 형광 색상을 제공한다.
단지 예로서, 일반적으로, R1, R2, R1' 및 R2'은 각각 독립적으로 H, 또는 N 및 O로부터 선택되는 1 내지 2개 이종 원자(들)가 임의적으로 혼입된 C1-C6(한계 수치 포함) 알킬일 수 있고, 또한 단지 예로서, 독립적으로 쌍 R1와 R2 및 쌍 R1'와 R2' 중 하나 이상은 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 하나의 이종 원자를 임의적으로 포함하는, 5- 또는 6-원 환을 형성할 수 있다. R1 및 R1'는 동일할 수 있고, R2 및 R2'도 동일할 수 있다.
R1, R2, R1' 및 R2' 중 하나는 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다. 임의적으로, R1, R2, R1' 및 R2' 중 하나는 전술된 바와 같은 -L-Rr이다.
단지 예로서, R3, R3', R4 및 R4'는 독립적으로 H 또는 C1-C3(한계 수치 포함) 알킬일 수 있다. R3, R3', R4 및 R4'는 동일할 수 있다. 독립적으로 쌍 R3과 R1, 쌍 R2와 R4, 쌍 R3'과 R1', 및 쌍 R4와 및 R2' 중 하나 이상은 조합하여, 포화 또는 불포화되고, 치환 또는 비치환된 5- 또는 6-원 환을 형성할 수 있다.
A는 C1-C3 알킬; 또는 -L-Rr(식 중에서, L 는 C1-C12 지방족 링커이고, Rr은 전술된 바와 같은 반응기임)이거나; 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낸다.
R1, R2, R1', R2' 및 A 중 단 하나만이 브릿지가 구조에 부착되는 위치를 나타낼 수 있다.
Ψ는 전술된 바와 같은 음이온이다.
구조 10의 2개의 단량체 잔텐 염료 분자는 화학식 5의 브릿지와 조합하여 이량체 염료를 형성할 수 있다.
단지 예시적으로 DAPI, DIPI, 호에스트 염료, LDS 751, 히드록시스틸바미딘, 스티릴 염료, 메로시아닌 염료, 시아닌 염료 또는 플루오로골드(FluoroGold)와 같은 다른 단량체 형광 핵산 염색이 사용하기에 적당하거나, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기에 적당하도록 유도체화될 수 있다. 문헌[Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 제9판]을 참조할 수 있다. 수많은 다른 단량체 핵산 염료들이 사용하기에 적당하거나, 본원에 기재된 바와 같이 사용하기에 적당하도록 유도체화될 수 있음을 이해될 것이다. 염료는 브릿지에 직접 접합되거나, 합성 지식을 이용하여 브릿지에 접합될 수 있도록 유도체화될 수 있다.
비형광성 핵산 염료
일반적으로, 비형광성 핵산-결합 분자는 비형광성이거나 매우 약한 형광성이어서, 형광성 핵산 염료로 유용할 수 없는 핵산-결합 분자이다. 비형광성 핵산-결합 분자에는 비형광성 핵산-결합 염료 및 무색 합성 또는 천연 핵산-결합 분자가 포함된다.
수많은 비형광성 염료들이 비색(colorimetric) 핵산 겔 염색으로 사용되어 왔다. 형광성 핵산 염색 에티듐 브로마이드에 비해, 이들 비형광성 염료는 통상 훨씬 더 낮은 검출 감도를 가지나, 예를 들어 인간에 의한 사용에 대한 독성 관점에서 더 안전한 것과 같이 사용에 더 안전한 것으로 간주된다. 비형광성 핵산-결합 염료의 예에는 나일 블루(Nile Blue), 크리스탈 바이올릿(Crystal Violet), 메틸렌 블루, 티오닌(Thionin), 메틸 그린, 베이직 블루(Basic Blue) 66, 베이직 레드(Basic Red) 29, 인돌린 블루(Indoline Blue), 사프라닌(Safranin) O, 재누스 그린(Janus Green) B, 피나시아놀(Pinacyanol), 및 스테인스-올(Stains-All)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Adkins, et al., Anal. Biochem . 240, 17(1996)]을 참조할 수 있다. 이들 염료 대부분은 알드리히 케미칼 컴퍼니 인코포레이티드(Aldrich Chemical Company, Inc.)(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 입수가능하다.
형광성 비핵산 염료
단량체 염료 Q1, Q2 및 Q3 중 하나는 형광성 비핵산 염료일 수 있다. 일반적으로, 정상적으로 형광성 핵산 염료로 간주되지 않는 모든 형광성 염료는 형광성 비핵산 염료로 간주된다. 본원에서 용어 "형광성 비핵산 염료"는 일반적으로 정상적으로 핵산 염료로 간주되지 않는 형광성 염료를 가리킨다. 예로서, 염료는 정상적으로 형광 마이너 그루브-바인더 또는 형광 인터칼레이터로 간주되지 않을 수 있다. 추가 예로서, 일부 형광성 비핵산 염료는 핵산과의 약한 상호작용을 나타낼 수 있으나, 이들 상호작용은 일반적으로 염료가 핵산 검출에 유용하도록 하기 위한 유의적 형광 분광 변화를 유발하기에 충분하지 않다.
각종 형광성 비핵산 염료들이 바이오티움 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)와 같은 각종 출처로부터 상업적으로 입수가능하다. 형광성 비핵산 염료의 예에는 플루오레신 염료, 술폰화 플루오레신 염료, 로다민 염료, 술폰화 로다민 염료, 시아닌 염료, 술폰화 시아닌 염료, 쿠마린 염료, 파이렌 염료, 옥사진 염료 및 보디파이(Bodipy) 염료(몰레큘러 프로브스 인코포레이티드)(미국 오레곤주 유겐 소재)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 한 적당한 형광성 비핵산 염료는 전술된 바와 같은 반응기 Rr을 포함할 수 있다. 한 적당한 형광성 비핵산 염료는 반응기 Rr을 포함하도록 유도될 수 있다. 한 적당한 반응성 염료는 브릿지 Rr를 통해 브릿지에 또한 브릿지로부터의 적당한 작용기에 공유 결합된다.
적당한 형광성 비핵산 염료의 선택은 쌍을 이루는 나머지 단량체 염료 또는 염료들에 의존한다. 일반적으로, 한 적당한 형광성 비핵산 염료는 쌍을 이루는 염료 또는 염료들과 분자내 이량체를 형성할 수 있어야 한다. 분자내 이량체 형성은 전형적으로 브릿지에 의해 단량체 염료가 쌍을 이루는 나머지 단량체 염료 또는 염료들에 공유 결합되기 전 및 후에 수성 매질 내 성분 단량체 염료들 중 하나 이상의 흡수 스펙트럼에 있어 유의적 변화에 의해 확인된다.
비형광성 비핵산 염료
일반적으로, 용어 "비형광성 비핵산 염료"는 형광성도 아니고 핵산-결합도 아닌 염료를 가리킨다. 그러한 염료는 일반적으로 FRET-기재 용도에서 형광 켄처로 사용된다. 예로서, 플루오로제닉(fluorogenic) 펩티다제 기질은, 형광 공여자 염료를 펩티드의 한 말단에 공유 결합시키고, 비형광성 비핵산 염료, 즉 켄처를 펩티드의 다른 한 말단에 공유 결합시켜, 공여자의 형광을 켄칭함으로써 구성되어 왔다. 효소에 의한 펩티드의 절단 시, 공여자 및 켄처가 분리되고, 이로써 형광 신호가 방출된다. 추가 예로서, 비형광성 비핵산 염료는 qPCR용 소위 태크맨(TaqMan) 프로브를 설계하기 위해 사용되고 있다. 태크맨 프로브는 표적 DNA 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드의 한 말단에 결합된 형광 공여자 염료, 및 올리고뉴클레오티드의 다른 한 말단에 결합되어 공여자 염료의 형광을 켄칭하는 켄처로 구성된다. 실시간 PCR 중, 표지화된 올리고뉴클레오티드는 표적 DNA에 결합되고, 이는 올리고뉴클레오티드가 효소에 의해 절단되도록 유발하고, 이로써 형광 신호가 발생된다.
비형광성 비핵산 염료는 주로 요구형 방출 DNA-결합 기전에 작용하는, 분자내 이량체 형성을 위한 쌍 형성 상대로서 사용될 수 있다. 비형광성 비핵산 염료는 그 염료와 그것이 DNA 결합 후 쌍을 이루게 되는 형광성 핵산-결합 염료 간의 최소한의 FRET를 확실히 하도록 선택되어야 한다. 일반적으로, FRET로 인한 형광성 핵산 염료의 형광 손실은 예를 들어 총 방출 형광의 약 70% 이하 등과 같이 최소이어야 한다. 비형광성 비핵산 염료의 선택은 형광성 핵산-결합 염료의 방출 스펙트럼 및 비형광성 염료의 흡수 스펙트럼의 평가에 기초할 수 있다. 이상적으로, 이들 스펙트럼은 상기 기재된 바와 같이 FRET로 인한 형광 신호 손실이 최소가 되도록 최소의 중합을 가져야 한다. FRET를 최소화하기 위한 또 다른 가능한 방법은, FRET의 효율이 성분 염료들 간의 분자간 분리의 역 6멱(inverse sixth power)에 의존하기 때문에, 상기 기재된 바와 같이 FRET로 인한 형광 신호 손실이 최소가 되도록 충분히 긴 브릿지를 사용하는 것이다.
유용할 수 있는, 상업적으로 입수가능한 비형광 켄처의 예에는 다브실(DABCYL)(플루카(Fluka)(스위스 부흐스 소재) 제조), 블랙홀 켄처(Black Hole Quencher)(BHQ)(바이오리서치 테크놀로지즈 인코포레이티드(Biosearch Technologies, Inc.)(미국 캘리포니아주 노바토 소재) 제조), 에클립스 다크 켄처(Eclipse Dark Quencher)(에포크 바이오사이언시스(Epoch Biosciences)(미국 워싱턴주 보쎌 소재), 아이오와 블랙(IOWA Black)(IWB)(인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies)(미국 일리노이즈주 스코키 소재) 제조), 및 QSY(몰레큘러 프로브즈 인코포레이티드(미국 오레곤주 유겐 소재) 제조)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
사용 방법
본원에 기재된 핵산 염료는 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 특히 유용할 수 있다. 형광성 핵산 염료를 통한 형광-기재 DNA 검출과 결부된 PCR을 이용하여, PCR 실행을 중단하거나 PCR 실행 동안 반응을 샘플링할 필요없이, PCR 공정의 생성물의 양을 결정할 수 있다. qPCR을 이용하여, DNA 샘플의 원래의 양을 정량화할 수 있을 뿐만 아니라, 서열 정보도 얻을 수 있다. qPCR의 감도 및 특이성으로 인해 질병의 진단 및 예후, 및 농업 및 과학수사에서의 종 확인을 포함한 수많은 실제 용도들에 있어 매우 유용하다.
qPCR에서의 염료의 사용은 PCR 반응에 적당한 염료 및 (예를 들어, 증폭 효소 또는 효소들, 표적 핵산 서열의 증폭에 충분한 프라이머 또는 프라이머들, 및 데옥시뉴클레오시드 삼인산염과 같은) 기타 성분들의 용액을 관 내 DNA 샘플을 포함하는 용액에 첨가하고, qPCR 기기 내 밀봉된 관에 두며, 검출된 형광 신호를 기록하는 단계를 포함할 수 있다. Ct 값, 즉 형광 신호가 임의 결정된 역치 값에 도달하기 위해 필요한 사이클 수를 기록할 수 있다. Ct 값은 DNA 샘플 복제수의 대수와 일차적인 관계가 있다. Ct 값 및 DNA 복제수의 대수의 표준 플롯을 이용하여, Ct 값에 기초하여, DNA 샘플의 DNA 복제수를 결정할 수 있다. 단지 예로서, 선택된 염료를 이용한 PCR 증폭 플롯이 도 8, 9, 11 및 14에 도시되어 있다.
형광성 핵산 염료의 다른 용도에는 용액 또는 겔 내 DNA 정량화, 생세포 또는 사멸 세포 내 핵산의 염색, 및 마이크로어레이에서의 핵산 검출이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 형광성 핵산 염료의 사용은 염료를, 임의적으로 임의의 부가적 시약(들)과 조합하여, 핵산 중합체를 포함하거나 포함하는 것으로 사료되는 샘플과 접촉시키는 단계; 염료-핵산 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 시간 동안 염료 및 샘플의 수득된 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및 염료-핵산 복합체의 형광 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
염료는 본원에서와 같은 적당한 용도를 위해 제조될 수 있다. 단지 예로서, 염료는 최종 염색 용액에 사용되는 농도의 약 100배 초과의 농도인 수혼화성 및 생물학적 상용성 유기 용매 또는 수성 용매를 이용하여 스톡 용액으로 제조될 수 있다. 염료 스톡 용액을 제조할 때 적당한 유기 용매와 조합되거나 단독으로 사용될 수 있는 적당한 수성 용매의 예에는 물, PBS 완충액 및 트리스 완충액이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 염료 스톡 용액을 제조하기 위해 적당한 유기 용매의 예에는 DMSO, DMF, 메탄올 또는 에탄올이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 이어서, 스톡 용액을 예를 들어 물 또는 생물학적 완충액과 같은 적당한 수성 용매를 이용하여 원하는 최종 염료 농도의 염색 용액으로 희석한다. 일반적으로, 염색 용액을 위한 특정 염료 농도는 분석 샘플의 성질 및 수행 분석의 성질에 의해 결정될 수 있다. 예로서, 일반적으로, 세포성 샘플과 관련하여 사용하기 위한 염색 용액은 약 1 nM 이상, 또는 약 100 μM 이하의 염료 농도를 가질 수 있다. 추가 예로서, 일반적으로, 전기영동 겔과 관련하여 사용하기 위한 염색 용액은 약 1 μM 이상, 또는 약 50 μM 이하의 염료 농도를 가질 수 있다.
염료를 이용한 핵산의 염색 방법은 수행되는 분석의 성질에 의해 결정될 수 있다. 예비고정되거나 고정되지 않을 수 있는 세포성 또는 조직 샘플 내 핵산을 염색함에 있어, 샘플은 통상 수분 내지 2시간 동안 염색 용액 내 인큐베이션되어, 염료가 세포막을 통과하여 핵산과 조합되도록 한다. 일부 경우들에서, 핵산은 정제된 핵산 또는 조 세포 추출물을 포함하는 용액의 형태로 존재할 수 있다. 그러한 경우들에서, 일반적으로, 핵산 용액으로의 염료 스톡 용액의 첨가는 즉시적으로 검출 가능한 형광 신호를 초래하여야 하며, 이 신호의 강도는 핵산의 양에 비례한다. 예로서, DNA 적정 곡선이 도 7에 도시되어 있다. DNA의 양과 형광 강도 간의 실질적으로 일차적인 관계가 DNA의 정량화를 위해 사용될 수 있거나, 세포 추출물이 사용될 경우에는 세포 수 평가를 위해 사용될 수 있다. 특정 예들에서, 핵산은 예를 들어 블롯(blot) 또는 겔과 같은 불활성 매트릭스에 함침되거나, 예들 들어 마이크로어레이 칩 또는 임의의 다른 고체 표면과 같은 고체 표면에 부착될 수 있다. 그러한 경우들에서, 일반적으로, 염색은 염색 용액을 핵산-포함 매트릭스의 표면, 또는 마이크로어레이 칩의 표면 또는 다른 고체 표면에 도포하고, 염료-핵산 복합체가 형성하도록 하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션함으로써 수행된다.
형광성 핵산-염료 복합체는 그것의 방출 또는 여기를 통해 검출될 수 있다. 예로서, 형광성 핵산-염료 복합체는 그 복합체의 흡수 최대 파장 또는 그 부근의 파장을 가지는 광에 의해 여기될 수 있거나, 전형적으로는 여기된다. 추가 예로서, 핵산-염료 복합체는 겔 가시화 용도에 사용되는 조명기들 대부분에 있어 이용가능한 여기 광의 통상의 공급원인, 300 nm 내지 400 nm의 파장을 가지는 UV 광에 의해 여기될 수 있다. 예로서, 형광 신호는 예를 들어 플레이트 리더, 현미경, 플루오로미터, 양자 카운터 및 유세포분류기와 같은 각종 기기들을 통해 검출될 수 있다. 추가 예로서, 형광 신호는 예를 들어 시각적 조사 또는 사진 기록과 같은 시각적 방법에 의해 만들어질 수 있다.
합성
염료의 합성은 단량체 염료 성분의 합성, 브릿지의 합성, 및 브릿지로의 단량체 염료 성분의 접합의 측면에서 기재될 것이다. 단량체 염료, 및 작용기 또는 반응기를 포함하는 단량체 염료의 합성이 이제 기재된다.
단량체 염료 및 작용성 분자의 합성
적당한 단량체 염료, 및 작용기 또는 반응기를 포함하는 단량체 염료들은 공지된 절차 또는 임의의 적당한 절차에 의해, 또는 적당하거나 바람직한 코어 구조를 이미 가지는 상업적으로 입수가능한 물질을 변형시킴으로써, 스크래치로부터 제조될 수 있다. 많은 단량체 아크리딘 염료는 상업적으로 입수가능한 아크리딘 염료로부터 제조될 수 있다. 합성을 위한 적당한 출발 물질로 작용할 수 있는 상업적으로 입수가능한 아크리딘 염료의 수가지 예들이 하기 나와 있다.
다른 아크리딘 코어 구조는 공지된 절차 또는 임의의 적당한 절차에 따라 제조될 수 있다. 문헌[Albert, A., The acridines : their preparation, physical, chemical, and biological properties and uses, Edward Arnold Ltd., London; Eldho, et al ., Synth . Commun. 29, 4007(1999); 및 Joseph, et al ., Bioconjugate Chem. 15, 1230 (2004)]을 참조할 수 있다. 하기 반응 1에 개략적으로 도시된 바와 같이, 아크리딘 코어 구조는 루이스 산의 존재 하에 적당한 디페닐아민을 적당한 카르복실산 또는 카르복실산 등가물과 축합시킴으로써 형성될 수 있다.
반응 1
Figure 112007074347589-pct00029
반응 1에서, R', R" 및 R'"은 이하 추가 기재되는 바와 같은 적당한 치환기이다. 디페닐아민 출발 물질은 상업적으로 입수가능하거나, 공지된 방법 또는 임의의 적당한 방법을 이용하여 적당한 아릴 할라이드 및 적당한 아릴아민으로부터 합성될 수 있다. 문헌[Yang, et al., J. Organomet . Chem. 576, 125(1999); Hartwig, et al., J. Org . Chem . 64, 5575(1999); 및 Wolfe, et al., J. Org . Chem . 65, 1158 (2000)]을 참조할 수 있다.
치환기의 성질 및 치환기가 부착된 위치는 염료의 분광 성질에 상당한 영향을 줄 수 있다. 일반적으로, 2-, 3-, 6- 및 7-위치의 전자-공여기는 염료의 흡수 및 방출 파장을 증가시킬 것이다. 전형적인 전자-공여기는 예로서 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, 히드록실기, 알콕시기, 티올기 또는 알킬티오기일 수 있다. 더욱 전형적인 전자-공여기는 예로서 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기 또는 알콕시기일 수 있다. 일반적으로, 9-위치의 전자-흡인기는 염료의 흡수 및 방출 파장을 증가시킬 수 있다. 전형적인 전자-흡인기는 예로서 시아노기, 퍼플루오로알킬기, 아미노카르보닐기, 알킬아미노카르보닐기, 알킬카르보닐기, 알데히드기, 알콕시카르보닐기, 아미노술포네이토기, 알킬아미노술포네이토기 또는 할라이드기일 수 있다. 더욱 전형적인 전자-흡인기는 시아노기, 퍼플루오로알킬기 또는 할라이드기일 수 있다.
일반적으로, 일단 아크리딘 코어 구조가 구성되면, 10-질소가, 전형적으로 부가적 반응기, 또는 반응기로 전환될 수 있는 작용기를 포함하는 할로알킬기로 알킬화된다. 부가적 반응기는 브릿지에 아크리딘 염료를 접합시키는 작용을 한다. 적당한 반응기를 갖는 단량체 아크리딘 오렌지 염료를 제조하는 수가지 방식들이 하기 반응식 1에 개략적으로 도시되어 있다:
Figure 112007074347589-pct00030
10-알킬화된 아크리딘의 9-위치는 시아노기로 용이하게 치환될 수 있고, 이 는 하기 반응식 2에 개략적으로 도시되어 있는 바와 같이 추가로 카르복사미드기로 가수분해될 수 있다.
Figure 112007074347589-pct00031
반응성 단량체 비대칭 시아닌 염료의 제조 방법이 문헌[Carreon, et al., Org. Lett. 6(4), 517 (2004)]에 기재되었다. 그러한 염료는 하기 나타낸 화학식의 구조(구조 11)를 가질 수 있다.
구조 11
Figure 112007074347589-pct00032
미국 특허 제5,863,753호는 퀴놀리늄 또는 피리디늄 질소에 대해 오르토에 치환기를 가지는 염료들을 포함한 일련의 반응성 비대칭 시아닌 염료들의 제조를 개시하고 있다. 퀴놀리늄 또는 피리디늄 질소에 대해 오르토에 있는 상기와 같은 치환기, 특히 시클릭 치환기는 미국 특허 제5,436,134호에 따르면, 비대칭 시아닌 염료에 요망되는 성질을 부여한다고 한다. 이들 고리 치환된 비대칭 시아닌 염료는 통상 SYBR 염료로 일컬어진다. 문헌[Zipper, et al., Nucleic Acids Res. 32(12), e1O3 (2004)]을 참조할 수 있다. 반응성 SYBR 염료들 중 일부는 몰레큘러 프로브즈 인코포레이티드(미국 오레곤주 유겐 소재)로부터 상업적으로 입수가능하나, 이들 염료의 정확한 구조는 알려져 있지 않다. 문헌[Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 제9판]을 참조할 수 있다.
미국 특허 출원 공보 제2004/0132046호는 마이너 그루브-결합능을 가지는 단량체 비대칭 시아닌 염료의 제조 방법을 개시하고 있다. 일반적으로, 이들 염료는 염료의 벤즈아졸릴환 상에 부가적 벤즈아졸릴 치환기를 가짐으로 인해 초승달-형상의 구조를 가진다. 적당한 반응기를 가지는 유사한 단량체 염료가 하기 반응식 3에 개략적으로 도시되어 있는 바와 같이, 예를 들어 유사한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
Figure 112007074347589-pct00033
반응성 페난트리디늄 염료는 하기 반응식 4에 개략적으로 도시되어 있는 바와 같이 상업적으로 입수가능한 3,8-디아미노-6-페닐페난트리딘으로부터 제조될 수 있다.
Figure 112007074347589-pct00034
단지 예로서, 표 2의 염료 No. 35는 상기 반응식 4에 도시된 반응기를 가지는 페난트리디늄 중간체를 이용하여 제조될 수 있다.
9-위치에 반응기를 가지는 피로닌 유도체의 제조는, 하기 반응식 5에 개략적 으로 도시되어 있는 바와 같이 2 당량의 m-아미노페놀 유도체를 1 당량의 디카르복실산 무수물과 축합시킴으로써 수행될 수 있다.
Figure 112007074347589-pct00035
많은 단량체 비형광성 핵산-결합 염료들이 텍스타일 및 잉크 산업에 사용되는 공지 안료이고, 상업적으로 입수가능하다. 이들 염료의 제조에 대한 참고자료는 문헌에서 찾아볼 수 있다. 많은 적당한 반응성 단량체 형광성 비핵산 염료 및 비형광성 비핵산 염료는 상업적으로 입수가능하거나, 공지된 방법을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다.
브릿지의 합성
브릿지는 통상, 단량체 염료가 종종 상업적으로 입수가능한 이- 또는 삼-작용기에 커플링될 때 형성된다. 일반적으로, 브릿지의 말단 부분은 단량체 염료 자체로부터 비롯되고, 한편 브릿지의 중간 부분은 이- 또는 삼-작용성 분자는 상업적 출처로부터 입수가능하다. 일부 경우들에서, 브릿지의 예를 들어 약 90% 이하와 같은 상당 부분이 단량체 염료에 예비-접착된 후, 최종적으로 이량체 또는 삼량체 염료에 어셈블리될 수 있다. 일부 다른 경우들에서, 대부분의 브릿지들은 단량체 염료가 부착되기 전에 별도로 제조될 수 있다. 이종이량체 합성의 경우, 모노-보호 이-작용성 링커 기는 통상 먼저 제1 단량체 염료에 부착된 후, 탈보호되고, 그 후 제2 단량체 염료에 커플링된다. 이종삼량체 염료는 유사한 단계별 보호-탈보호 전략을 이용하여 합성될 수 있다.
브릿지에 대한 단량체 염료의 접합
일반적으로, 이량체 및 삼량체 염료는 동종이량체 중 일부를 위한 1-단계 커플링 반응, 또는 다중 브릿지 요소 A를 포함하는 동종이량체들 중 일부, 또는 이종이량체 및 삼량체를 위한 다단계 반응에서, 적당한 반응기를 가지는 단량체 염료를 이- 또는 삼-작용성 링커에 접합시킴으로써 어셈블리될 수 있다. 선택된 동종이량체 및 이종이량체로의 합성 경로의 예가 하기 반응식 6에 개략적으로 도시되어 있다.
Figure 112007074347589-pct00036
동종삼량체 염료의 제조의 한 예가 하기 반응식 7에 개략적으로 도시되어 있다.
Figure 112007074347589-pct00037
반응기를 가지는 이량체 염료의 제조 방법의 예가 하기 반응식 8에 개략적으로 도시되어 있다.
Figure 112007074347589-pct00038
실시예 1: 10-(3- 요오도프로필 ) 아크리딘 오렌지, 요오다이드의 제조
1 당량의 1,3-디요오도프로판을 10 mL의 클로로벤젠 중 5 g의 아크리딘 오렌지(알드리히)의 현탁액에 첨가하였다. 수득된 혼합물을 하룻밤 동안 90-100℃에서 교반하였다. 고온 반응 혼합물을 ~200 mL의 EtOAc에 주입하였다. 오렌지 석출물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에 건조시켜, ~8 g을 수득하였다.
실시예 2: 10-(5- 카르복시펜틸 ) 아크리딘 오렌지 클로라이드 염의 제조
1,3-디요오도프로판을 에틸 6-브로모헥산산으로 대체한 것을 제외하고는 실시예 1의 절차를 이용하여, 10-(5-에톡시카르보닐펜틸)아크리딘 브로마이드를 제조하였다. 조 생성물(5 g)을 ~100 mL의 메탄올, 및 30 mL의 H2O에 용해된 3 당량의 NaOH에 현탁시켰다. 현탁액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 메탄올을 증발에 의해 제거하였고, 잔존 수용액을 농축 HCl로 산성화하였다. 약 50 mL의 포화 NaCl을 첨가하여, 생성물을 석출시켰다. 생성물을 여과에 의해 수집한 후, 45℃에서 24시간 동안 진공 하에 건조시켰다.
실시예 3: DMAO (표 2의 염료 No. 1)의 제조
10-(3-요오도프로필)아크리딘 오렌지, 요오다이드(100 mg)을 밀봉관 내 메탄올 중 20 mL의 2 M 디메틸아민에 현탁시킨 후, 60℃에서 하룻밤 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 50 mL의 EtOAc에 주입하였다. 석출물을 원심분리에 의해 수집한 후, 40℃에서 24시간 동안 진공 하에 건조시켰다.
실시예 4: TMAO (표 2의 염료 No. 2)의 제조
CH3OH(2 mL) 중 DMAO(표 2의 염료 No. 1)(11 mg, 0.023 mmol) 및 CH3I (0.5 mL)의 혼합물을 4일 동안 온화하게 환류시켰다. 오렌지색 생성물(10 mg)을 흡인 여과에 의해 수집하였다.
실시예 5: PMAO (표 2의 염료 No. 5)의 제조
CH3OH(10 mL) 중 10-(3-요오도프로필)아크리딘 오렌지 요오다이드 염(100 mg, 0.18 mmol) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-1,3-프로판디아민(0.3 mL, 1.8 mmol)의 혼합물을 하룻밤 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 석출물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 석출물을 CH3OH(5 mL)에 재현탁시키고, 하룻밤 동안 환류시켰으며, 흡인 여과에 의해 수집하였다. 그것을 진공 하에 일정한 중량이 되도록 건조시켜, 암적색 고체(14 mg)를 수득하였다.
실시예 6: AOAO -2Q(표 2의 염료 No. 9 )의 제조
DMF(1.5 mL) 중 10-(3-요오도프로필)아크리딘 오렌지 요오다이드 염(81 mg, 0.15 mmol) 및 PMAO(100 mg, 0.15 mmol)의 혼합물을 130℃에서 7시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, CH3OH(15 mL)를 첨가하였고, 현탁액을 1시간 동안 가열 환류시켰다. 흡인 여과에 의해 생성물을 암적색 고체(83.1 mg)로서 수득하였다.
실시예 7: AOAO -2(표 2의 염료 No. 7)의 제조
Et3N(0.15 mL, 1.05 mmol) 및 TSTU(320 mg, 1.05 mmol)을 실온에서 DMF(5 mL) 내 10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드 염(438 mg, 1.03 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 후, Et3N(0.1 mL) 및 3,3'-디아미노-N-메틸디프로필아민(50 mg, 0.344 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반한 후, EtOAc(20 mL)를 첨가하여 생성물을 석출시켰다. 조 생성물을 DMF에 재용해시키고, EtOAc를 이용하여 다시 석출시켰다. 고체(250 mg)를 원심분리에 의해 분리시켰다.
실시예 8: AOAO -3(표 2의 염료 No. 8)
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지(432 mg, 1.03 mmol) 및 에틸렌디아민(25 mg, 0.42 mmol)으로부터 AOAO-2를 합성하기 위해 동일 절차를 이용함으로써 염료(393 mg)를 제조하였다.
실시예 9: 10-(8- 브로모옥틸 ) 아크리딘 오렌지 브로마이드의 제조
클로로벤젠(15 mL) 중 아크리딘 오렌지(2 g, 7.53 mmol) 및 1,8-디브로모악탄(12 mL, 67.8 mmol)의 혼합물을 110℃에서 하룻밤 동안 가열하였다. EtOAc(50 mL)를 첨가하고, 현탁액을 1시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 흡인 여과에 의해 생성물을 오렌지색 고체(3.56 g)로서 수득하였다.
실시예 10: AOAO -5(표 2의 염료 No. 11)의 제조
DMF(5 mL) 중 10-(8-브로모악틸)아크리딘 오렌지 브로마이드(0.5 g, 0.94 mmol) 및 아크리딘 오렌지(0.3 g, 11.2 mmol)의 혼합물을 130℃에서 하룻밤 동안 가열하였다. EtOAc를 첨가하여 생성물을 석출시켰다. DMF 및 EtOAc로부터 반복 석출하여, 생성물을 암적색 고체(214 mg)로서 수득하였다.
실시예 11: AOAO -7(표 2의 염료 No. 13)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드 염(121 mg, 0.29 mmol) 및 1,5-디아미노-펜탄 디히드로클로라이드(20 mg, 0.12 mmol)로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용하여, 염료(30 mg)를 합성하였다.
실시예 12: AOAO -8(표 2의 염료 No. 15)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드 염(241 mg, 0.58 mmol) 및 피페라진(20 mg, 0.23 mmol)으로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(182 mg)를 합성하였다.
실시예 13: AOAO -11(표 2의 염료 No. 18)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드 염(180 mg, 0.43 mmol) 및 1,8-디아미노-옥탄(25 mg, 0.17 mmol)으로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(112 mg)를 합성하였다.
실시예 14: AOAO -12(표 2의 염료 No. 19)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드 염(147 mg, 0.35 mmol) 및 2,2'-옥시비스(에틸-아민) 디히드로클로라이드(25 mg, 0.14 mmol)으로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(76 mg)를 합성하였다.
실시예 15: AOAO -13(표 2의 염료 No. 20)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드 염(96 mg, 0.23 mmol) 및 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(20 mg, 0.09 mmol)으로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(64 mg)를 합성하였다.
실시예 16: 1,3-디-((2-(N-t- Boc -아미노)에틸) 아미노카르보닐 ) 벤젠(하기 나타낸 염료 No. 101)의 제조
Figure 112007074347589-pct00039
Et3N(0.4 mL, 2.71 mmol) 및 TSTU(820 mg, 2.71 mmol)을 실온에서 DMF(2 mL) 중 이소프탈산(220 mg, 1.32 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, Et3N(1 mL) 및 모노-tBoc-에틸렌디아민(460 mg, 2.86 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반한 후, 1 N HCl(100 mL) 및 EtOAc(50 mL) 간에 분획화하였다. 수성층을 EtOAc(50 mL)으로 추출하였고, 조합된 유기층을 1 N HCl(2×50 mL), H2O(50 mL) 및 포화 NaCl(50 mL)로 세정하였고, 무수 Na2SO4로 건조하였다. 조 생성물을 EtOAc/헥산(9:1)을 용리액으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 무색 고체 생성물(356 mg)을 수득하였다.
실시예 17: 1,3-디-((2- 아미노에틸 ) 아미노카르보닐 )벤젠, 트리플루오로 -아세트산 염(하기 나타낸 염료 No . 102)의 제조
Figure 112007074347589-pct00040
1,3-디-((2-(N-t-Boc-아미노)에틸)아미노카르보닐) 벤젠(356 mg, 0.79 mmol)을 0℃에서 TFA (5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 용액을 진공 하에 농축 건조시켰다. 무색 잔류물을 CH3OH(2 mL)에 용해시키고, Et2O(30 mL)에 적가하였다. 석출물을 원심분리에 의해 수집하였고, 일정 중량이 되도록 진공 하에 건조시켜, 고체 생성물 (425 mg)을 수득하였다.
실시예 18: AOAO -9(표 2의 염료 No. 16)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드 염(109 mg, 0.26 mmol) 및 1,3-디((2-아미노에틸)아미노카르보닐)벤젠, 트리플루오로아세트산 염(50 mg, 0.1 mmol)으로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(55 mg)를 합성하였다.
실시예 19: 1,3-디((5-(N-t- Boc -아미노) 펜틸 ) 아미노카르보닐 ) 벤젠(하기 나타낸 염료 No. 103)의 제조
Figure 112007074347589-pct00041
이소프탈산(254 mg, 1.53 mmol) 및 모노-tBoc 카다베린(640 mg, 3.15 mmol)으로부터 1,3-디-((2-(N-t-Boc-아미노)에틸)아미노카르보닐)벤젠을 제조하기 위한 절차에 따라 염료(555 mg)를 제조하였다.
실시예 20: 1,3-디-((5- 아미노펜틸 ) 아미노카르보닐 )벤젠, 트리플루오로 - 아세 트산 염(하기 나타낸 염료 No. 104)의 제조
Figure 112007074347589-pct00042
염료 No. 102 (555 mg, 1.04 mmol)를 위한 절차에 따라 염료(560 mg)를 제조하였다.
실시예 21: AOAO -10(표 2의 염료 No. 17)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드(95 mg, 0.23 mmol) 및 염료 No. 104 (50 mg, 0.09 mmol)으로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(22 mg)를 제조하였다.
실시예 22: AOAO -14(표 2의 염료 No. 21)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드(166 mg, 0.40 mmol) 및 디아미도-dPEG-디아민(퀀타 바이오디자인(미국 오하이오주 포웰 소재)) 제조)(100 mg, 0.15 mmol)으로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(150 mg)를 제조하였다.
실시예 23: 10-((((3-(N- Boc -아미노)프로필)-N,N-디메틸)암모늄)프로필) 아 크리딘, 디요오다이드(하기 나타낸 염료 No. 105)의 제조
Figure 112007074347589-pct00043
CH3OH(50 mL) 중 10-(3-요오도프로필)아크리딘 오렌지 요오다이드(500 mg, 0.89 mmol) 및 3-(N-t-Boc-아미노)프로필-N,N-디메틸아민(1.8 g, 8.9 mmol)의 혼합물을 하룻밤 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 석출물을 흡인 여과에 의해 수집하였고, 일정 농도가 되도록 건조시켜, 염료 No. 105을 오렌지색 고체(292 mg)로서 수득하였다.
실시예 24: 10-((((3-암모늄)프로필)-N,N-디메틸)암모늄) 프로필 아크리딘 , 트리플루오로아세테이트 염(하기 나타낸 염료 No. 106)의 제조
Figure 112007074347589-pct00044
염료 No. 105 (50 mg, 0.06 mmol)을 0℃에서 TFA (2 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 용액을 진공 하에 농축 건조시켰고, 잔류물을 CH3OH(3 mL)에 용해시켰다. 용액을 Et2O(30 mL)에 적가하였고, 석출물을 원심분리에 의해 수집하였으며, 일정 중량이 되도록 진공 하에 건조시켜, 염료 No. 106을 오렌지색 고체(28 mg)로서 수득하였다.
실시예 25: AOAO -4(표 2의 염료 No. 10)의 제조
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드 염(31 mg, 0.075 mmol) 및 염료 No. 106(28 mg, 0.036 mmol)으로부터 AOAO-2를 제조하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(23 mg)를 제조하였다.
실시예 26: 10-(6-(N- 프탈로알리미도 ) 헥실 ) 아크리딘 오렌지 브로마이드 염(하기 나타낸 염료 No. 107)의 제조
Figure 112007074347589-pct00045
클로로벤젠(20 mL) 중 아크리딘 오렌지(2 g, 7.54 mmol) 및 N-(6-브로모헥실)프탈이미드(4.7 g, 15.1 mmol)의 혼합물을 110℃에서 2일 동안 가열하였다. EtOAc(50 mL)를 첨가하였고, 현탁액을 1시간 동안 가열 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 생성물 염료 No. 107을 흡인 여과에 의해 오렌지색 고체(3.76 g)로서 수집하였다.
실시예 27: 10-(5-((5- 카르복시펜틸 ) 아미노카르보닐 ) 펜틸 ) 아크리딘 오렌지, 요오다이드( 하기 나타낸 염료 No. 108)의 제조
Figure 112007074347589-pct00046
Et3N(40 μL, 0.28 mmol) 및 TSTU(81 mg, 0.27 mmol)를 DMF(3 mL) 중 10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드(107 mg, 0.258 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, Et3N(0.2 mL) 및 H2O (1 mL) 중 6-아미노헥산산(67 mg, 0.51 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에 서 1시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 H2O로 적정하여, 염료 No. 108을 오렌지색 고체(125 mg)로서 수득하였다.
실시예 28: 9- 시아노 -10-(5- 카르복시펜틸 ) 아크리딘 오렌지 클로라이드(하기 나타낸 염료 No. 109)의 제조
Figure 112007074347589-pct00047
DMF(3 mL) 내 10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지(0.15 g, 0.361 mmol) 및 시안화나트륨 (35 mg, 0.722 mmol)의 혼합물을 2일 동안 개방 공기 내 실온에서 교반하였다. CH3CN (10 mL)을 첨가하고, 수득된 현탁액을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 암청색 석출물을 원심분리에 의해 수집하였고, 일정 중량이 되도록 진공 하에 건조시켜, 염료 No. 109 (130 mg)을 수득하였다.
실시예 29: AOAO -12R(표 2의 염료 No. 22)의 제조
실온에서 Et3N(32 μL, 0.23 mmol) 및 TSTU(68 mg, 0.227 mmol)를 DMF(2 mL) 중 염료 No. 109(98.3 mg, 0.223 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, Et3N(100 μL) 및 2,2'-옥시비스-(에틸아민) 디히드로클로라이드(16 mg, 0.09 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2일 동안 실온에서 교반 하였다. 용액을 약 1 mL로 농축하였고, EtOAc(2 mL)를 첨가하였다 석출물을 원심분리에 의해 수집하였다. 생성물을 DMF에 재용해시키고, EtOAc로 다시 석출하여, 염료 No. 22를 암청색 고체(54.4 mg)로서 수득하였다.
실시예 30: 9- 아미노카르보닐 -10-(5- 카르복시펜틸 ) 아크리딘 (하기 나타낸 염료 No. 110)의 제조
Figure 112007074347589-pct00048
75% H2SO4 (1 mL)의 염료 No. 109 (30 mg, 0.068 mmol)의 용액을 60℃에서 2일 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 Et2O(10 mL)에 첨가하였다. 석출물을 원심분리에 의해 수집하였고, CH3OH(1.5 mL)에 재용해시켰다. EtOAc(10 mL)를 첨가하였고, 고체 석출물을 원심분리에 의해 수집하였고, 일정 중량이 되도록 진공 하에 건조시켜, 염료 No. 110을 암분홍색 고체(20.4 mg)로서 수득하였다.
실시예 31: (하기 나타낸) N- 카르복시펜틸 티아졸 오렌지의 제조
Figure 112007074347589-pct00049
공개된 절차(Carreon, et al ., Org . Let . 6(4), 517 (2004))를 이용하여 염료를 제조하였다.
실시예 32: TOTO-3(표 2의 염료 No. 14)의 제조
N-카르복시펜틸 티아졸 오렌지(460 mg, 1.04 mmol) 및 에틸렌 디아민(25 mg, 0.42 mmol)으로부터 AOAO-2를 합성하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(354 mg)를 제조하였다.
실시예 33: 10-(5-((2-(N-t- Boc -아미노)에틸) 아미노카르보닐 ) 펜틸 ) 아크리딘 오렌지 클로라이드 염(하기 나타낸 염료 No. 111)의 제조
Figure 112007074347589-pct00050
Et3N(106μL, 0.76 mmol) 및 TSTU(230 mg, 0.76 mmol)을 DMF(3 mL) 중 10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드(302 mg, 0.73 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. Et3N(350 μL) 및 모노 t-BOC-에틸렌디아민(150 mg, 0.92 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 CH3CN (2 mL)에 용해시키고, EtOAc(20 mL)를 첨가하여 석출시켰다. 석출물을 원심분리에 의해 수집하였고, 일정 농도가 되도록 건조시켜, 염료 No. 111을 오렌지색 고체(365 mg)를 수득하였다.
실시예 34: 10-(5-((2- 암모늄메틸 ) 아미노카르보닐 ) 펜틸 ) 아크리딘 오렌지, 트리플루오로아세테이트( 하기 나타낸 염료 No. 112)의 제조
Figure 112007074347589-pct00051
5℃에서 염료 No. 111(347 mg, 622 mmol)을 1 회분으로 트리플루오로아세트산(3 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 5℃에서 1시간 동안 교반하였고, 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 CH3OH(3 mL)에 용해시키고, Et2O(50 mL)에 적가하였다. 석출물을 원심분리에 의해 수집하여, 염료 No. 112를 오렌지색 고체(297 mg)로서 수득하였다.
실시예 35: AOTO -3(표 2의 염료 No. 23)의 제조
Et3N(20 μL, 0.142 mmol) 및 TSTU(42.2 mg, 0.142 mmol)를 DMF(1 mL) 중 N-카르복시펜틸티아졸 오렌지(62 mg, 0.142 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, Et3N(70 μL) 및 염료 No. 112(50 mg, 0.095 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 DMF(1 mL)에 재용해시키고, EtOAc(2 mL)를 첨가하였다. 석출물을 원심분리에 의해 수집하였다. DMF 및 EtOAc로부터 반복 석출하여, 생성물을 오렌지-적색 고체(50.4 mg)를 수득하였다.
실시예 36: TOTO-12(표 2의 염료 No. 24)의 제조
N-카르복시펜틸티아졸 오렌지(94.5 mg, 0.2145 mmol) 및 2,2'-옥시비스(에틸아민) 디히드로클로라이드(15 mg, 0.085 mmol)로부터 AOAO-2를 합성하기 위한 절차 를 이용함으로써 염료(19.4 mg)를 제조하였다.
실시예 37: TO(3)TO(3)-12(표 2의 염료 No. 25)의 제조
N-카르복시펜틸 타졸 블루(Carreon, et al ., Org . Let . 6(4), 517 (2004); 및 Benson, et al ., Nucleic Acid Res . 21(24), 5727(1993))(99 mg, 0.212 mmol) 및 2,2'-옥시비스(에틸아민) 디히드로클로라이드(15 mg, 0.085 mmol)로부터 AOAO-2를 합성하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(32.6 mg)를 제조하였다.
실시예 38: TO(3)TO(3)-2(표 2의 염료 No. 26)의 제조
N-카르복시펜틸 티아졸 블루 (76 mg, 0.173 mmol) 및 3,3'-디아미노-N-메틸디-프로필아민(10 mg, 0.069 mmol)로부터 AOAO-2를 합성하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(28.4 mg)를 제조하였다.
실시예 39: 10-(5-((5-(N-t- Boc -아미노) 펜틸 ) 아미노카르보닐 ) 펜틸 )- 아크리딘 오렌지 클로라이드(하기 나타낸 염료 No. 113)의 제조
Figure 112007074347589-pct00052
10-(5-카르복시펜틸)아크리딘 오렌지 클로라이드(200 mg, 0.483 mmol) 및 모노 t-BOC-카다베린(130 mg, 0.628 mmol)로부터 염료 No. 111을 합성하기 위한 절차를 이용함으로써 염료(280 mg)를 제조하였다.
실시예 40: 10-(5-((5- 암모늄펜틸 ) 아미노카르보닐 ) 펜틸 ) 아크리딘 오렌지, 트리플루오로아세테이트( 하기 나타낸 염료 No. 114)의 제조
Figure 112007074347589-pct00053
염료 No. 113 (280 mg, 0.467 mmol)로부터 염료 No. 112를 합성하기 위한 절차를 이용함으로써 염료 No. 114(234 mg)를 제조하였다.
실시예 41: AORO -7(표 2의 염료 No. 27)의 제조
화합물 No. 114(35 mg, O.O61 mmol) 및 로자민 염료(바이오티움 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 헤이워드 소재))(40 mg, 0.063 mmol)로부터 AOTO-3을 합성하기 위한 절차를 이용함으로써 화합물 (29 mg)를 제조하였다.
실시예 42: DMAO 및 AOAO -7의 흡광도 및 형광
DMAO 및 AOAO-7의, 도 2 및 도 3에 도시된 흡광도 스펙트럼, 및 도 4에 도시된 형광 방출 스펙트럼을 PBS 완충액 내, DNA의 부재 하, 또는 DNA의 존재 하(2 mg/ml의 연어 정자 DNA)에 분리하여 측정하였다. 495 nm에서 광학 밀도 0.05를 제공하도록 모든 염료 농도들을 조정하였다. 스펙트럼을 흡광도 플롯에서 1로 정규화하였다. DMAO 대비, AOAO-7는 흡광도에 있어 471 nm에서 보다 짧은 새 파장 피크를 나타내고, 이는 AOAO-7 내 2개의 아크리딘 단량체의 응집을 나타낸다. DNA에 결합 시, AOAO-7 및 DMAO의 흡광도는 유리 염료 대비, 각기 5 nm- 및 10 nm-적색 편이를 나타냈다. 유리 AOAO-7의 형광은 DMAO의 형광보다 약 5배 더 낮다. AOAO-7의 보다 낮은 배경 형광은 실시간 qPCR에서 유리하다. AOAO-7의 아크리딘 단량체 당 형광은 DMAO의 형광에 근접하고, 이는 AOAO-7의 2개의 단량체는 DNA에 결합 시 더 이상 서로 켄칭하지 않았고, 양자 간의 링커가 양성자 수율에 음성적 영향을 나타내지 않았음을 가리킨다.
실시예 43: TOTO-1 및 TOTO-3의 흡광도 스펙트럼
실시예 42와 관련하여 기재된 방식과 유사한 방식으로, TOTO-1 및 TOTO-3의 흡광도 스펙트럼을, PBS 완충액 내, 도 5에 도시된 바와 같이 DNA의 부재 하에, 또는 도 6에 도시된 바와 같이 2 mg/ml의 연어 정자 DNA의 존재 하에 측정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 유리 염료의 스펙트럼은 중성이거나 실질적으로 양 전하가 없는 브릿지를 가지는 TOTO-3은 분자내 H-이량체, 즉 헤어핀 구조를 형성하는 한편, 다중 양 전하를 가지는 TOTO-1은 보다 적은 분광 편이를 가짐을 가리킨다. 도 6에 도시된 바와 같이, DNA의 존재 하에서의 TOTO-1 및 TOTO-3 양자 모두의 흡수 스펙트럼은 대략 동일한 위치로 편이하고, 이는 TOTO-3 이량체의 헤어핀 구조가 DNA 결합 시에 개방되고, TOTO-1 및 TOTO-3 양자 모두가 유사한 유형의 DNA-염료 복합체를 형성함을 가리킨다.
실시예 44: 상이한 양의 DNA에 대한 AOAO -12의 형광
0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 및 10 μg/ml 최종 농도의 연어 정자 DNA의 존재 하에서의 200 mL의 PBS 내 0.1 μM AOAO-12, 또는 단일 가닥 20량체 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 마이크로티터 플레이트 리더(스펙트라맥스(SpectraMax), 몰레큘러 디바이시스 코포레이션(Molecular Devices Corporation)(미국 캘리포니아주 서니베일 소재) 제조))에서 측정하였다. 도 7에 도시된 바와 같이 형광을 DNA 농도에 대해 플롯팅하였다. 형광이 2.0 μg/ml까지 DNA에 대해 일차적으로 반응하였음(삽입도)을 알 수 있다. DNA의 보다 높은 농도에서, 반응은 비일차적으로 되었다. AOAO-12은 단일 가닥 DNA에 결합될 때보다 이중 가닥 DNA에 결합될 때 더 강하게 형광을 나타낸다.
실시예 45: qPCR 에서의 AOAO -12 및 SYBR 그린 I의 신호 강도 비교
본 실시예는 qPCR에서의 형광 신호 강도에서 SYBR 그린 I 대비 AOAO-12의 우수한 성질을 입증한다. 모든 실시간 증폭을, 10 mM 트리스 (pH 8.0), 50 mM KCl, 3.5 mM MgC12, 2 mM의 각 dNTP, 및 1 단위의 앰플리태크(AmpliTaq) DNA 중합효소 (ABI, 미국 캘리포니아주 포스터시티 소재) 및 각종 농도의 형광 모니터링 염료를 포함하는 20 μL 반응 용액에서 수행하였다. pTOPO 플라스미드 내 ATPB 단편(서열 번호 1)을 0.5 μM 전방 프라이머 5'-GAGGTCTTCACAGGTCATA-S'(서열 번호 2), 0.5 μM 역방 프라이머 5'-CTCTTCAGCCAGCTTATC-3'(서열 번호 3)을 이용하여 증폭시켰다. 열 섭생법을 95℃에서 1분간, 및 그에 이어 95℃에서 15-초간, 55℃에서 15-초간, 및 72℃에서 15-초간의 50회 사이클로 설정하였다. 55℃ 단계에서 형광을 측정하였다. 기존 보고서(Nath, K., et al ., Effects of ethidium bromide and SYBR Green I on different polymerase chain reaction systems, J. Biochem Biophys Methods 42, 15 (2000))와 일관되게, SYBR 그린 I은 도 8에 도시된 바와 같이 PCR 반응에 대한 억제를 나타냈고, 이 때 Ct는 보다 높은 SYBR 그린 I 농도에서 지연되었다. SYBR 그린 I 농도 대비, 보다 높은 농도의 AOAO-12를, 억제를 나타내지 않으 면서 반응에 부가할 수 있었다. 결과적으로, AOAO-12에 있어 최종 형광 강도는 수배 더 높을 수 있었고, 이는 더욱 감도있는 검출을 가능하게 한다. 대안적으로, AOAO-12에서는 감도가 덜한 광학 장치를 열 사이클링 플루오로미터에 사용할 수 있었고, 이에 기기의 비용이 적어진다.
실시예 46: 게놈 인간 DNA의 적정
(1) 상이한 전방 및 역방 프라이머 세트(5'-ACTGGTAAGACCATCACC-3'(서열 번호 9) 및 5'-GCAATGAAATTTGTTGAA-3'(서열 번호 10))를 사용하였고, (2) 인간 DNA의 일련의 10-배 희석물들이 주형으로 작용하였음을 제외하고는, SYBR 그린 I(495 nm에서의 최종 흡수 피크는 0.025의 광학 밀도에 상응함, 즉 A495 = 0.025) 또는 AOAO-12(최종 A495 = 0.1)을 이용하여, 실시예 45에서 나와 있는 조건과 유사한 조건 하에서, 인간 게놈 DNA로부터의 USB 단편의 증폭을 수행하였다. 도 8은 SYBR 그린 I 또는 AOAO-12를 이용하여 인간 DNA의 105개 복사체에서 출발하여 10개 복사체로 도달하는 반응들의 증폭 플롯을 도시한다. 삽입도는 Ct 값이 양 염료에서 모니터링된 출발 복제수의 대수와 역 상관됨을 보여준다. AOAO-12는 신호 강도에 있어 SYBR 그린 I보다 명백히 우수하다.
실시예 47: qPCR 에서의 TO, TOTO-1 및 TOTO12
본 실시예는 qPCR에서의 TO (티아졸 오렌지, 비대칭 시아닌 염료) 또는 TOTO-1 대비 TOTO-12의 향상된 성질을 입증한다. TO, TOTO-1 및 TOTO-12를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5에서와 같이, 모든 실시간 증폭을 수행하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, TOTO-1은 PCR 반응을 완전히 억제하였으나, TOTO-12는 qPCR에서 TO 대비 향상된 Ct 및 향상된 형광 강도를 제공하였다. TOTO-12 이량체 염료는 TO 및 TOTO-1 염료의 각각보다 우수하다.
실시예 48: AOR0 -7의 흡광도 및 형광
도 12에 도시된 바와 같이, 실시예 42와 관련하여 기재된 방식과 유사한 방식으로, PBS 완충액 내, AOR0-7의 흡광도 스펙트럼이 단독으로, 또는 2 μg/ml의 연어 정자 DNA의 존재 하에 얻어졌다. DNA에 결합된 AOR0-7의 방출 스펙트럼이 도 13에 도시되어 있다. 이종이량체 염료 AOR0-7은 단량체 AO 염료 및 형광성 비핵산 로자민 RO 염료를 포함한다. 각각 AO 및 RO 부분에 의한 2개의 방출 피크를 기록하였다. 490 nm에 설정된 여기 및 530 nm에 수집된 방출, 즉 Ex490/Em530을 가지는 채널 1, 또는 Ex580/Em630을 가지는 채널 3, 단 매주 채널 2(Ex520/Em570)(데이터 미기재)에서의 AOR0-7을 이용하여, 바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재)의 Chromo4에서 qPCR을 기록할 수 있었다. 형광 공명 에너지 전이(FRET) 효과가 경미하므로, 단량체 염료 성분, AO 또는 RO가 리포터 염료로서 선택될 수 있다.
실시예 49: qPCR 에서의 이종이량체 염료 AOR0 -7
본 실시예는 qPCR에서의 AORO-7의 유용성을 입증한다. 최종 용액 내 600 nm에서 0.025의 광학 밀도를 가지는 AORO-7을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 5에서와 같이, 실시간 증폭을 수행하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, AORO-7은 qPCR 반응 과정을 모니터링하고, 증폭산물의 용융 곡선(삽입도)을 검출하기 위해 효과적으 로 사용될 수 있다. 바이오-래드 라보라토리즈(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재) 제조의 i사이클 IQ 다중색 실시간 PCR 검출 시스템에서의 채널 3(Ex580/Em630)에 이 qPCR을 모니터링한 결과로서, 바람직한 파장의 거의 임의의 염료가 본원에 개시된 방법에 의해 qPCR에서 DNA 리포터 염료로 조정될 수 있고, 이에 따라 qPCR 모니터링을 위한 분광 용도가 넓어지게 된다는 예가 제공된다. 현재, 대부분의 태크맨 프로브는 SYBR 그린 I의 동일한 채널을 차지하는 FAM 또는 VIC을 사용한다. qPCR에서 태크맨 프로브와 같은 서열-특이적-프로브, 및 AORO-7과 같은 상이한 파장의 서열-비-특이적 염료를 사용하는 것이 유리할 것이며, 여기에서 프로브는 서열 특이성을 제공하고, 염료는 용융점과 같은 증폭산물의 기타 매개변수를 제공한다.
실시예 50: AOAO -12를 이용하여 모니터링된 용융 피크
SYBR 그린 I은, 증폭산물의 융점이 qPCR 증폭 후에 검출될 수 있다는 점에서 유리한 것으로 보고되었다. 융점은 증폭산물의 크기 및 GC 함량의 함수인 바, 증폭산물에 관한 중요한 정보를 제공한다. 태크맨 반응으로부터는 융점을 수집할 수 없었다. 4가지 증폭산물들, 즉 HMBS(서열 번호 4), RPL4(서열 번호 5), SDHA(서열 번호 6) 및 TBP(서열 번호 7)로부터의 용융 곡선을, AOAO-12(패널 A) 또는 SYBR 그린(패널 B)의 존재 하에 증폭된 반응으로부터 측정하였고, 이는 도 15에 제시되어 있다. AOAO-12로 수집된 용융 피크는 SYBR 그린 I로 수집된 용융 피크와 밀접한 상관관계가 있었다. AOAO-12가 높은 친화도로, 다만 SYBR 그린 I보다 덜 단단히 DNA에 결합하기 때문에, AOAO-12로부터의 융점은 SYBR 그린 I로부터의 융점보다 약 2 도 더 낮다. AOAO-12의 보다 높은 농도를 실시간 PCR 반응에 사용할 수 있는 바, 용융 피크는 현저 더 높다. 데이터는 AOAO-12의 상대적 유용성을 입증한다.
SYBR 그린 I을 이용한 qPCR 반응은 프라이머-이량체를 형성하는 경향이 있고, 이 경향은 SYBR 그린 I의 농도와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다. SYBR 그린 I은 매우 단단히 DNA에 결합하여, 태크(Taq) DNA 중합효소의 성능을 간섭하는 것으로 간주되었다. AOAO-12는 DNA에 대한 친화도가 보다 낮아, 그러한 간섭이 경감될 것이다. AOAO-12의 이 성질은, SYBR 그린 I의 존재 하에서의 HMBS 증폭 반응이 정외(extra) 프라이머 이량체 피크를 가지고, 한편 AOAO-12의 존재 하에서의 동일한 증폭은 단지 단일의 간결하고 특이적인 피크를 나타낸다는 점에서, 도 15로부터 명백하다.
실시예 51: AOAO 염료의 안정성
단량체 AO를 포함하는 이량체 염료의 안정성을 입증하였다. 구체적으로, AOAO-12를 PCR 생성물과 함께 PCR 반응 완충액 내에 유지시켰다. 혼합물을 40분 동안 96℃로 가열하였다. 가열 과정 중, 혼합물을 60℃로 저하시켜, 형광을 간략히 모니터하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, AOAO-12는 실질적으로 형광의 손실 없이 40분 동안 96℃에서 안정하다. 데이터는 1 N PCR에서의 AOAO-12의 강건성을 입증한다.
실시예 52: TOTO-13(표 2의 염료 No. 29)의 제조
N-카르복시펜틸 티아졸 오렌지(102 mg, 0.23 mmol)(실시예 31) 및 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(23 mg, 0.1 mole)으로부터 AOAO-2(표 2의 염료 No. 7) 을 합성하기 위한 절차를 사용하여 염료(102 mg)를 제조하였다.
실시예 53: N-(5- 카르복시펜틸 )-4-(4-(디메틸아미노) 스티릴 ) 피리디늄 브로마이드의 제조
에탄올(100 mL) 중 4-N,N-디메틸아미노벤즈알데히드(3 g, 20 mmol), N-(5-카르복시-펜틸)피콜리늄 브로마이드(5.6 g, 20 mmol) 및 피페리딘 (2 mL)의 혼합물을 하룻밤 동안 60 ℃에서 가열하였다. 혼합물을 진공 하에 증발 건조시켰다. 잔류물을 메탄올에 재용해시킨 후, 에테르로 석출하여, 생성물(6.7 g)을 수득하였다.
실시예 54: STST -19(표 2의 염료 No. 31)의 제조
N-(5-카르복시펜틸)-4-(4-(디메틸아미노)스티릴)피리디늄 브로마이드(실시예 53)(200 mg, 0.5 mmol) 및 2,2'-옥시비스(에틸아민) 디히드로클로라이드(36 mg, 0.2 mmol)으로부터 AOAO-2(실시예 7)을 제조하기 위한 절차를 사용하여 염료(85 mg)를 제조하였다.
실시예 55: STST -27(표 2의 염료 No. 30)의 제조
N-(5-카르복시펜틸)-4-(4-(디메틸아미노)스티릴)피리디늄 브로마이드(실시예 53)(200 mg, 0.5 mmol) 및 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(44 mg, 0.2 mmol)으로부터 AOAO-2(실시예 7)을 제조하기 위한 절차를 사용하여 염료(81.8 mg)를 제조하였다.
이량체 염료 또는 삼량체 염료와 같은 유용한 염료가 본원에 기재되었다. 그러한 염료는 예를 들어 비교적 낮은 배경 형광, 비교적 낮은 PCR 억제, 양호한 형광 신호 강도 및 양호한 안정성과 같은 수많은 바람직한 성질들 중 임의의 성질을 가질 수 있다. 일반적으로, 1 이하의 양 전하를 가지는 염료는 들어 또 다른 분자의 표지화에서의 사용, 및 핵산의 존재 또는 부재의 검출에서의 사용과 같은 수많은 용도들 중 임의의 용도를 가질 수 있다. 또한, 일반적으로, 실질적으로 중성인 상기와 같은 염료는 예를 들어 PCR 공정에서의 사용, 또는 핵산의 존재 또는 부재의 검출에서의 사용, 또는 정량적 실시간 PCR에서의 사용과 같은 수많은 용도들 중 임의의 용도를 가진다.
수많은 유용한 이량체 및 삼량체 염료들이 기재되었다. 예로서, 분자에 핵산-검출 능력을 부여하기 위한, 또 다른 분자와의 공유 접합 또는 그 분자의 표지화에 적당한 염료; 핵산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 검출하기에 적당한 염료; 및 샘플이 표적 핵산을 포함하는 경우, 핵산 증폭에 적당한 공정을 겪는 샘플과 같은 샘플 내 핵산 형성 또는 그것의 결여를 검출하기에 적당한 염료가 기재되었다. 전술된 염료들 중 임의의 염료의 제조 방법, 및 전술된 염료들 중 임의의 염료의 사용 방법이 또한 기재되었다. 본원에 기재된 조성물의 임의의 사용 방법이 또한 본원에서 구상된다. 유용한 용도를 가지는 본원에 개시된 조성물을 포함하는 임의의 키트와 같이, 본 발명의 적당한 염료, 및 샘플이 표적 핵산을 포함하는 경우, 샘플 내 표적 핵산의 증폭에 충분한 적당한 조성물을 포함하는 샘플 내 핵산 형성 또는 그것의 결여를 결정하기에 적당한 키트가 본원에서 구상된다.
본원의 설명에 관한 각종 변형, 공정 및 수많은 구조는 명세서를 검토할 때 당업자에게 자명할 것이다. 각종 참고문, 공보, 미국 또는 기타 국가의 가출원 및 비가출원, 및/또는 미국 또는 기타 국가의 특허가 본원에서 확인되었으며, 이들의 각 내용은 전체적으로 본원에 참고로 인용되다. 각종 측면 및 특성이 이해, 판단, 이론, 기저 간주 및/또는 연구 또는 가설적 예와 관련하여 설명되거나 기재되었을 수 있으나, 임의의 그러한 이해, 판단, 이론, 기저 간주 및/또는 연구 또는 가설적 예는 구속적이지 않다. 각종 측면 및 특성이 본원의 각종 실시양태 및 실시예와 관련하여 기재되었으나, 그것들 중 어느 것도 첨부된 특허청구범위의 전 범주에 대해 제한적이지 않음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Mao, Fei Leung, Wai-Yee Xin, Xing <120> DIMERIC AND TRIMERIC NUCLEIC ACID DYES, AND ASSOCIATED SYSTEMS AND METHODS <130> BIOT.001WO0 <150> US 60/663,613 <151> 2005-03-17 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 164 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aggtcttcac aggtcatatg gggaagctgg tacccctgaa ggagaccatc aaaggattcc 60 agcagatttt ggcaggtgaa tatgaccatc tcccagaaca ggccttctat atggtgggac 120 ccattgaaga agctgtggca aaagctgata agctggctga agag 164 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaggtcttca caggtcata 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctcttcagcc agcttatc 18 <210> 4 <211> 249 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtctagacgg ctcagatagc atacaagaga ccatgcaggc taccatccat gtccctgccc 60 agcatgaaga tggccctgag gatgacccac agttggtagg catcactgct cgtaacattc 120 cacgagggcc ccagttggct gcccagaact tgggcatcag cctggccaac ttgttgctga 180 gcaaaggagc caaaaacatc ctggatgttg cacggcagct taacgatgcc cattaactgg 240 tttgtgggg 249 <210> 5 <211> 231 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ccatgcacaa gatgattaat acagatctta gcagaatctt gaaaagccca gagatccaaa 60 gagcccttcg agcaccacgc aagaagatcc atcgcagagt cctaaagaag aacccactga 120 aaaacttgag aatcatgttg aagctaaacc catatgcaaa gaccatgcgc cggaacacca 180 ttcttcgcca ggccaggaat cacaagctcc gggtggataa ggcagctgct g 231 <210> 6 <211> 139 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gattgatgag tacgattact ccaagcccat ccaggggcaa cagaagaagc cctttgagga 60 gcactggagg aagcacaccc tgtcctttgt ggacgttggc actgggaagg tcactctgga 120 atatagaccc gtaatcgac 139 <210> 7 <211> 229 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agcaagaaaa tatgctagag ttgtacagaa gttgggtttt ccagctaagt tcttggactt 60 caagattcag aatatggtgg ggagctgtga tgtgaagttt cctataaggt tagaaggcct 120 tgtgctcacc caccaacaat ttagtagtta tgagccagag ttatttcctg gtttaatcta 180 cagaatgatc aaacccagaa ttgttctcct tatttttgtt tctggaaaa 229 <210> 8 <211> 140 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gagcccagtg acactatcga gaacgtcaaa gcaaagatcc aagacaagga aggcattcct 60 cctgaccagc agaggttgat ctttgccgga aagcagctgg aagatgggcg caccctgtct 120 gactacaaca tccagaaaga 140 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcaatgaaat ttgttgaa 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gcaatgaaat ttgttgaa 18

Claims (50)

  1. 하기 화학식을 갖는 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00054
    Q1은 형광성 핵산 염료 성분이고;
    Q2는 형광성 핵산 염료 성분이고;
    Q1 및 Q2는 동일하거나 상이할 수 있으며,
    (ⅰ) Q1 및 Q2 각각은 독립적으로 화학식Ⅰ의 페난트리디늄 염료이거나:
    Figure 112013074805776-pct00106
    (화학식 Ⅰ)
    R1은 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내고; Ψ은 음이온이거나; 또는
    (ⅱ) Q1 및 Q2 각각은 독립적으로 비대칭 시아닌 염료이며, Q1 및 Q2 염료 성분 각각은 화학식 Ⅱ의 구조를 갖거나:
    Figure 112013074805776-pct00107
    (화학식 Ⅱ)
    화학식 Ⅱ의 R1'은 H; 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 탄소를 갖는 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR9; -SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; -C(=O)NHR15; 또는 마이너 그루브 결합(minor groove binding)과 관련된 치환기이거나; 또는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내고;
    화학식 Ⅱ의 R1'가 R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 중 하나 이상을 포함하는 경우, 상기 R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 중 하나는 독립적으로
    ⅰ) H 또는
    ⅱ) 아릴 또는
    ⅲ) 0, 1 또는 2개의 질소(들)을 혼입하고 있는, 탄소수 1 내지 12의 알킬이며;
    화학식 Ⅱ의 R1'가 R11 및 R12를 포함하는 경우, R11 및 R12는 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 이종 원자들을 포함하는, 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있으며;
    화학식 Ⅱ의 X는 O 및 S로부터 선택되고;
    화학식 Ⅱ의 n은 0, 1 및 2로부터 선택되며;
    화학식 Ⅱ의 R6은 H; N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 이종 원자들을 포함하는, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR16; -SR16; -NR16R17; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개 이종 원자(들)을 포함하는 치환된 아릴; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개 이종 원자(들)을 포함하는 비치환된 아릴; 또는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내고;
    화학식 Ⅱ의 R7은 H; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자 및 0 또는 1개 아릴기를 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2, 또는 3개의 이종 원자(들)을 포함하는 치환된 아릴; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2, 또는 3개의 이종 원자(들)을 포함하는 비치환된 아릴; 또는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내며;
    화학식 Ⅱ의 R8 및 R8'은 조합하여, C1-C2 알킬, C1-C2 알콕시, C1-C2 알킬머캅토 또는 할로겐에 의해 독립적으로 1, 2, 3 또는 4회 추가 치환될 수 있는, 융합된 방향족 환을 형성하며;
    R16 및 R17 각각은 독립적으로
    ⅰ) H 또는
    ⅱ) 아릴 또는
    ⅲ) 0, 1, 또는 2개 질소(들)을 혼입하고 있는, 탄소수 1 내지 12의 알킬이거나; 또는
    R16 및 R17은 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 이종 원자(들)을 포함하는, 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있으며;
    화학식 Ⅱ의 R1', R6 및 R7 중 단 하나만은 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내고; 그리고
    화학식 Ⅱ의 Ψ은 음이온이거나; 또는
    (ⅲ) Q1 및 Q2의 각각은 독립적으로 화학식 Ⅲ의 아크리딘 염료이고:
    Figure 112013074805776-pct00108
    (화학식 Ⅲ)
    화학식 Ⅲ의 R1은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C2 알킬이고;
    화학식 Ⅲ의 R2 및 R3 중 하나는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내며;
    R2가 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내는 경우, R3은 H 또는 -CH3이고;
    R3이 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내는 경우, R2는 H, -CH3, -NH2, -NHCH3, -CN 및 -C(=O)NH2로부터 선택되며;
    화학식 Ⅲ의 R6은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C2알킬이고;
    화학식 Ⅲ의 R7은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C2 알킬이며;
    인접한 (R6 및 R1) 또는 (R7 및 R1)의 각 쌍의 경우, 독립적으로 (R6 및 R1) 또는 (R7 및 R1)은 조합하여 5- 또는 6-원의 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있고;
    화학식 Ⅲ의 Ψ는 음이온이며;
    브릿지는 8 내지 150개의 비-수소 원자를 포함하는 지방족 링커이며; 상기 링커는 1 이하의 양 전하를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 브릿지는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00109
    식 중에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단일 결합을 포함하는 부분; N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 이종 원자(들)을 포함하는, 탄소수 1 내지 12의 폴리메틸렌 단위; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이종 원자(들)을 포함하는 아릴이고;
    A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 및 A10는 각각 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이종 원자(들)을 포함하는 분지형 알킬; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이종 원자(들)을 포함하는, 하나 이상의 포화된 5- 또는 6-원 환이며;
    α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ 및 ι는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이고;
    a, b, c, d, e, f, g, h 및 i는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
  3. 제2항에 있어서, 브릿지는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00110
    식 중에서, x는 각각 독립적으로 1 내지 11로부터 선택되는 정수이고; α는 2 내지 20으로부터 선택되는 정수이며; β 및 γ는 각각 독립적으로 2 또는 3이고; b는 0 또는 1 내지 20의 정수이고; c는 0 또는 1이다.
  4. 제1항에 있어서, Q1 및 Q2 각각은 화학식 Ⅰ의 페난트리디늄 염료인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00111
    (화학식 Ⅰ)
    R1은 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내고;
    Ψ은 음이온이고; 그리고
    브릿지는 하기 화학식을 가지며:
    Figure 112013074805776-pct00112
    식 중에서, x는 각각 독립적으로 1 내지 11로부터 선택되는 정수이고; α는 2 내지 20으로부터 선택되는 정수이며; β 및 γ는 각각 독립적으로 2 또는 3이고; b는 0 또는 1 내지 20의 정수이고; c는 0 또는 1이다.
  5. 제4항에 있어서, x는 5이고; α 및 γ는 동일하며 2 또는 3이고; β는 2이며; b는 0, 1, 2 또는 3인 것인 화합물.
  6. 제4항에 있어서, 화합물은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00113
    식 중에서, Ψ은 I- 또는 Cl-이다.
  7. 제1항에 있어서, Q1 및 Q2 각각은 비대칭 시아닌 염료이고, Q1 및 Q2 염료 성분 각각은 독립적으로 화학식 Ⅱ의 구조를 갖는 것인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00057
    (화학식 Ⅱ)
    식 중에서, 화학식 Ⅱ의 R1'는 H; 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR9; -SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; -C(=O)NHR15; 또는 마이너 그루브 결합과 관련된 치환기이거나; 또는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내고;
    화학식 Ⅱ의 R1'가 R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 중 하나 이상을 포함하는 경우, 상기 R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 중 하나는 독립적으로
    ⅰ) H 또는
    ⅱ) 아릴 또는
    ⅲ) 0, 1, 또는 2개 질소(들)을 혼입하고 있는, 탄소수 1 내지 12의 알킬이며;
    화학식 Ⅱ의 R1'가 R11 및 R12를 포함하는 경우, R11 및 R12는 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 이종 원자들을 포함하는, 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있으며;
    화학식 Ⅱ의 X는 O 및 S로부터 선택되고;
    화학식 Ⅱ의 n은 0, 1 및 2로부터 선택되며;
    화학식 Ⅱ의 R6은 H; N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 또는 1 초과의 이종 원자(들)을 포함하는, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 할로겐; -OR16; -SR16; -NR16R17; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 이종 원자(들)을 포함하는 치환된 아릴; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 이종 원자(들)을 포함하는 비치환된 아릴; 또는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내고;
    화학식 Ⅱ의 R7은 H; N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자 및 0 또는 1개의 아릴기를 포함하는, 탄소수 1 내지 10의 알킬 또는 알케닐; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개 이종 원자(들)을 포함하는 치환된 아릴; 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 0, 1, 2 또는 3개의 이종 원자(들)을 포함하는 비치환된 아릴; 또는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내며;
    화학식 Ⅱ의 R8 및 R8'은 조합하여, C1-C2 알킬, C1-C2 알콕시, C1-C2 알킬머캅토 또는 할로겐에 의해 독립적으로 1, 2, 3, 또는 4회 추가 치환될 수 있는, 융합된 방향족 환을 형성하며;
    R16 및 R17 각각은 독립적으로
    ⅰ) H 또는
    ⅱ) 아릴 또는
    ⅲ) 0, 1 또는 2개 질소(들)을 혼입하고 있는, 탄소수 1 내지 12개의 알킬이거나; 또는
    R16 및 R17은 조합하여, N 및 O로부터 선택되는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 이종 원자(들)을 포함하는, 5- 또는 6-원 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있으며;
    화학식 Ⅱ의 R1', R6 및 R7 중 단 하나만은 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내고;
    화학식 Ⅱ의 Ψ은 음이온이며;
    상기 브릿지는 하기 화학식을 가지며:
    Figure 112013074805776-pct00114
    식 중에서, x는 각각 독립적으로 1 내지 11로부터 선택되는 정수이고; α는 2 내지 20으로부터 선택되는 정수이며; β 및 γ는 각각 독립적으로 2 또는 3이고; b는 0 또는 1 내지 20의 정수이고; c는 0 또는 1이다.
  8. 제7항에 있어서, Q1 및 Q2 각각은 하기 화학식의 구조를 갖는 것인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00058
    식 중에서, R7은 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타낸다.
  9. 제7항에 있어서, 화합물은 하기 구조를 갖는 것인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00115
  10. 제1항에 있어서, Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 화학식 Ⅲ의 아크리딘 염료인 것인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00116
    식 중에서, 화학식 Ⅲ의 R1은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C2 알킬이고;
    화학식 Ⅲ의 R2 및 R3 중 하나는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내며;
    R2가 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내는 경우, R3은 H 또는 -CH3이고;
    R3이 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내는 경우, R2는 H, -CH3, -NH2, -NHCH3, -CN 및 -C(=O)NH2로부터 선택되며;
    화학식 Ⅲ의 R6은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C2 알킬이고;
    화학식 Ⅲ의 R7은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C2 알킬이며;
    인접한 (R6 및 R1) 또는 (R7 및 R1)의 각 쌍의 경우, 독립적으로 (R6 및 R1) 또는 (R7 및 R1)은 조합하여 5- 또는 6-원의 포화 또는 불포화된 환을 형성할 수 있고;
    화학식 Ⅲ의 Ψ는 음이온이며;
    브릿지는 하기 화학식을 가지며:
    Figure 112013074805776-pct00117
    식 중에서, x는 각각 독립적으로 1 내지 11로부터 선택되는 정수이고; α는 2 내지 20으로부터 선택되는 정수이며; β 및 γ는 각각 독립적으로 2 또는 3이고; b는 0 또는 1 내지 20의 정수이고; c는 0 또는 1이다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 R1은 각각 H이고; R2는 H이며; R3는 브릿지가 Q1 또는 Q2에 부착되는 위치를 나타내며; R6는 각각 -CH3이고; 그리고 R7는 각각 -CH3인 것인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 것인 화합물:
    Figure 112013074805776-pct00118
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Ψ는 I- 또는 Cl-인 것인 화합물.
  14. 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 키트로서, 상기 키트는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물; 또는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물 및 완충액; 및 상기 키트의 사용에 관한 설명서를 포함하는 키트.
  15. 샘플 내 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물에 상기 핵산을 노출시켜, 핵산이 샘플 내 존재할 경우, 화합물과 핵산의 복합체가 형성되는 단계; 및 상기 복합체와 결합한 형광 또는 그것의 부재를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 핵산 증폭 반응을 수행하는 방법으로서,
    표적 핵산, 상기 표적을 증폭시키기 위해 필요한 시약, 및 제1항 내지 제12항 중 어느 항의 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 반응 혼합물을 증폭된 표적 핵산의 형성에 적합한 조건 하에서 중합 반응 시키는 단계;
    상기 반응 혼합물을 빛으로 조명하는 단계; 및
    상기 반응 혼합물로부터 형광 방출을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 방출은 증폭된 표적 핵산의 존재의 인식인 것인 방법.
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