KR20170122344A - 아크리딘계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체분자에 인터컬레이팅됨으로써 생체분자를 표지하는 것이 가능한 신규한 아크리딘계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생체분자에 인터컬레이팅됨으로써 생체분자를 표지하는 것이 가능한 신규한 아크리딘계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물에 관한 것이다.
형광성 염료는 DNA 및 RNA를 비롯한 핵산 및 핵산을 수반하는 다양한 생물학적 샘플의 검출에 사용되어 왔다. 이에 따라, 핵산에 특이적으로 결합 또는 인터컬레이션되어 우수한 형광성을 나타내는 복합체를 형성하는 형광성 핵산 염료에 대한 연구가 활발히 이루어져 왔다.
핵산에 특이적으로 결합 또는 인터컬레이션되는 염료는 순수 용액, 세포 추출물, 전기영동 겔, 마이크로어레이 칩, 생세포 또는 고정 세포, 사멸 세포 및 환경 샘플을 비롯한, 각종 매질 내 DNA 및 RNA의 존재 및 양을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이러한 형광 염료는 게놈 연구 및 의료 진단에 사용되는 기법으로서 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통한 핵산의 검출 등에 사용될 수 있다.
이 때, 일반적인 end-point PCR의 경우 샘플 핵산의 양에 비례한 정량적인 PCR이 불가능하기 때문에, 형광을 이용해 사이클마다 실시간으로 변화하는 형광값을 측정하여 정량적 분석이 가능하도록 한 실시간 정량적 PCR (real-time PCR 또는 qPCR)이 주로 사용되고 있다.
이러한 qPCR은 PCR 결과물로부터 형광 신호를 측정하여 정량적인 분석을 하게되는데, 형광 신호를 측정하기 위해 방식으로는 형광 프로브(probe)를 이용한 검출법과 인터컬레이팅 형광 염료를 이용한 검출법 등이 주로 알려져 있다.
형광 프로브를 이용한 검출법은 형광성 염료와 퀀처 염료의 복합체로 표지화된 프로브(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 기초로 한다. 형광성 염료와 퀀처 염료의 복합체로 표지화된 올리고뉴클레오티드가 표적 서열과 혼성화될 경우, 형광 염료가 복합체로부터 절단되어 방출됨에 따라 형광 신호를 발생시키게 된다.
상술한 형광 프로브를 이용한 검출법은 표적 서열에 대한 선택성과 특이성이 높다는 이점이 있으나, 설계가 복잡하고 다량으로 사용되기에 고가라는 단점이 존재한다.
인터컬레이팅 형광 염료를 이용한 검출법은 형광성 핵산 염료(dye) 또는 착색제(stain)로서 지칭되는 DNA-결합 형광성 염료에 기초한다. 형광성 핵산 염료는 비교적 간단한 분자로 구성되어 있어 설계 및 제조가 용이하여 상대적으로 저렴하다는 이점이 있다.
그러나, qPCR에 사용되기 위해서는 몇가지 기준들을 충족시켜야 하기 때문에 일반적으로 알려진 형광성 핵산 염료들이 모두 qPCR에 사용될 수 있는 것은 아니다.
예를 들어, qPCR에 사용되는 형광성 핵산 염료는 저장 및 PCR 중 충분한 안정성을 가져야 하며, PCR에 사용되는 완충액의 pH 범위에 대한 내성을 가져야 한다.
또한, 형광성 핵산 염료는 핵산이 존재하지 않을 경우, 형광 신호를 발생시키지 않거나 아주 미약한 형광 신호만을 발생시켜야 하며, 핵산이 존재할 경우 상대적으로 강한 형광 신호를 발생시켜야 한다.
종래 핵산의 표지에 가장 많이 사용되는 염료로는 브로민화 에티듐(ethidium bromide)이 있다.
[브로민화 에티듐]
브로민화 에티듐은 예를 들어 전기영동이 완료된 겔을 염색하기 위해 사용(사후-염색)되기도 하며, 전기영동 전 겔의 제조시 미리 첨가하여 전기영동과 함께 염색이 이루어지기 위해 사용(사전-염색)되기도 한다. 또한, 브로민화 에티듐은 400 nm 이하의 UV 광을 발생시키며, DNA와 결합할 시 약 620 nm의 발광 스펙트럼을 가지기 때문에 DNA의 존재 및 위치를 시각적으로 용이하게 확인할 수 있다는 이점이 있다.
위와 같은 브로민화 에티듐의 이점에도 불구하고 브로민화 에티듐은 돌연변이 원(mutagen) 및 발암물질(carcinogen)에 해당하기 때문에 사용시 상당한 주의를 요한다. 특히, 브로민화 에티듐은 DNA와 RNA의 합성을 방해함으로써 DNA 복제를 저해함에 따라 돌연변이를 유발할 수 있다는 연구 결과도 보고된 바 있다.
이에 따라, 비유전독성을 나타내는 대체 형광 염료로서 SYBR green Ⅰ가 주로 사용되었으나, SYBR green Ⅰ는 PCR 공정에 대한 억제 효과가 있기 때문에 단순히 형광 염료의 농도를 증가시킨다 하여도 얻을 수 있는 최대 형광 신호의 강도가 제한된다는 한계가 있다.
이에 따라, SYBR green Ⅰ의 농도가 PCR 공정을 유의적으로 억제하기 시작하는 농도에 도달할 때까지는 SYBR green Ⅰ의 농도에 비례하여 형광 신호의 강도가 증가하나, 이후부터는 SYBR green Ⅰ의 농도의 추가적인 증가에 따라 DNA 증폭이 감소되며, 이에 따라 관찰되는 형광 신호의 강도가 감소하거나, 역치 사이클 수(threshold cycle)가 증가하게 된다.
또한, SYBR green Ⅰ은 알칼리 조건 하에서 화학적으로 불안정하기 때문에 완충액 내에서 수일 내 상당량이 분해된다는 문제가 보고되고 있다.
상술한 기술적 배경 하에서 본 발명은 인터컬레이팅 형광 염료를 이용한 qPCR에 사용하기 적합한 인터컬레이팅 형광 염료로서 아크리딘계 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 브로민화 에티듐과 달리 비-유전독성의 아크리딘계 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 역치 사이클 수를 증가시키지 않으면서 핵산 농도에 비례하여 형광 신호의 강도를 증가시킬 수 있는 아크리딘계 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
아울러, 본 발명은 상술한 아크리딘계 화합물을 포함하는 염료, 키트 및 조영제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 아크리딘(acridine)계 화합물이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
여기서,
R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR9), 알데하이드, 에스터(-COOR9), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-P 작용기로부터 선택될 수 있다.
여기서, L은 8 내지 150개의 비-수소 원자를 포함하는 링커며, P는 형광 신호를 발생시킬 수 있는 형광단이거나 화학식 1로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
형광 신호를 발생시킬 수 있는 형광단으로서, P는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택될 수 있다.
또한, R5 내지 R8은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR9), 알데하이드, 에스터(-COOR9), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염 및 폴리알킬렌 옥사이드로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, -L-P 작용기는 하기의 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
-L1-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L2-P
여기서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, A1 내지 A10은 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며, x1 내지 x9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며, y1 내지 y9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 아크리딘계 화합물을 포함하는 생체분자 표지용 염료가 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 아크리딘계 화합물을 포함하는 생체분자 표지용 키트가 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 아크리딘계 화합물을 포함하는 조영제 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 아크리딘계 화합물은 생체분자에 인터컬레이팅됨으로써 가시광선 영역에서 형광 신호를 나타낼 수 있으며, 비-유전독성을 나타내는 바, 이를 기반으로 본 발명에 따른 아크리딘계 화합물은 생체분자 표지용 염료, 생체분자 표지용 키트 및 조영제 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 상용화된 염료인 SYBR safe의 전기영동 결과를 나타낸 것이며, 도 1b 내지 도 1e는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 아크리딘계 화합물의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 수 있다.
또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 수 있다.
신규한 아크리딘계 화합물
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 아크리딘(acridine)계 화합물이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
여기서,
R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR9), 알데하이드, 에스터(-COOR9), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-P 작용기로부터 선택될 수 있다.
또한, R5 내지 R8은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR9), 알데하이드, 에스터(-COOR9), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염 및 폴리알킬렌 옥사이드로부터 선택될 수 있다.
Ra (여기서, a는 1 내지 8로부터 선택되는 정수)가 케톤기(-COR9) 또는 에스터기(-COOR9)일 때, R9는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬 및 치환 또는 비치환된 C1-C10 아미노알킬로부터 선택될 수 있다.
또한, Rb (여기서, b는 1 내지 9으로부터 선택되는 정수)가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 설폰산, 설폰산염, 케톤, 알데하이드, 카복실산, 카복실산염, 인산, 인산염, 아실클로라이드, 폴리알킬렌 옥사이드, 4차 암모늄염, 에스터 및 아마이드로부터 선택되는 적어도 하나로 치환될 수 있다.
Ra (여기서, a는 1 내지 9로부터 선택되는 정수)가 알케닐 또는 알키닐일 때, 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소가 직접적으로 결합되거나 알케닐의 sp2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소에 결합된 알킬의 sp3-혼성 탄소에 의해 간접적으로 결합된 형태일 수 있다.
본원에서 Ca-Cb 작용기는 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는 작용기를 의미한다. 예를 들어, Ca-Cb 알킬은 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 알킬 및 분쇄 알킬 등을 포함하는 포화 지방족기를 의미한다. 직쇄 또는 분쇄 알킬은 이의 주쇄에 10개 이하(예를 들어, C1-C10의 직쇄, C3-C10의 분쇄), 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 3개 이하의 탄소 원자를 가진다.
구체적으로, 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸일 수 있다.
또한, 본원에서 알콕시는 -O-(알킬)기와 -O-(비치환된 사이클로알킬)기 둘 다를 의미하는 것으로, 하나 이상의 에터기 및 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분쇄 탄화 수소이다.
구체적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 1,2-다이메틸부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본원에서 할로겐은 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 요오도(-I)을 의미하며, 할로알킬은 상술한 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 예를 들어, 할로메틸은 메틸의 수소 중 적어도 하나가 할로겐으로 대체된 메틸(-CH2X, -CHX2 또는 -CX3)을 의미한다.
본원에서 아르알킬은 아릴이 알킬의 탄소에 치환된 형태의 작용기로서, -(CH2)nAr의 총칭이다. 아르알킬의 예로서, 벤질(-CH2C6H5) 또는 페네틸(-CH2CH2C6H5) 등이 있다.
본원에서 아릴은 달리 정의되지 않는 한, 단일 고리 또는 서로 접합 또는 공유결합으로 연결된 다중 고리(바람직하게는 1 내지 4개의 고리)를 포함하는 불포화 방향족성 고리를 의미한다. 아릴의 비제한적인 예로는 페닐, 바이페닐, o- 터페닐(terphenyl), m-터페닐, p-터페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴(anthryl), 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트레닐(phenanthrenyl), 2-페난트레닐, 3--페난트레닐, 4--페난트레닐, 9-페난트레닐, 1-피레닐, 2-피레닐 및 4-피레닐 등이 있다.
본원에서 헤테로 아릴은 상기에서 정의된 아릴 내 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황과 같은 비-탄소 원자로 치환된 작용기를 의미한다. 헤테로 아릴의 비제한적인 예로는, 퓨릴(furyl), 테트라하이드로퓨릴, 피로릴(phrrolyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 티에닐(thienyl), 테트라하이드로티에닐, 옥사졸릴(oxazolyl), 아이소옥사졸릴(isoxazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 아이소티아졸릴(isothiazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 피리딜(pyridyl), 피리다지일(pyridaziyl), 트리아지닐(triazinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 모르포리닐(morpholinyl), 티오모르포리닐(thiomorpholinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피페라이닐(piperainyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 인돌릴(indolyl), 인도리닐, 인돌리지닐, 인다졸릴(indazolyl), 퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 시놀리닐(cinnolinyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 퀴나졸리닐, 퀴녹사리닐, 프테리디닐(pteridinyl), 퀴누클리디닐(quinuclidinyl), 카바조일, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티지닐(phenothizinyl), 페녹사지닐, 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl) 및 벤조티아졸릴 등과 이들이 접합된 유사체들이 있다.
본원에서 탄화수소 고리(cycloalkyl) 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리(heterocycloalkyl)은 달리 정의되지 않는 한 각각 알킬 또는 헤테로 알킬의 고리형 구조로 이해될 수 있을 것이다.
탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐 및 사이클로헵틸 등이 있다. 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르포리닐, 3-모르포리닐, 테트라하이드로퓨란-2-일, 테트라하드로퓨란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 있다.
또한, 탄화수소 고리 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리는 여기에 탄화수소 고리, 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리, 아릴 또는 헤테로 아릴이 접합되거나 공유결합으로 연결된 형태를 가질 수 있다.
여기서, 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리머의 특성이 유지되는 한도 내에서 필요에 따라 추가적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 폴리머의 화학적 또는 생물학적 안정성을 증가 또는 감소시키기 위한 화학적 결합일 수 있다. 구체적인 예로서, 폴리알킬렌 옥사이드 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 하이드록시, 알킬 에터(메틸 에터, 에틸 에터, 프로필 에터 등), 카복실메틸 에터, 카복시에틸 에터, 벤질 에터, 다이벤질메틸렌 에터 또는 다이메틸아민으로 치환될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 폴리알킬렌 옥사이드는 메틸 에터로 종결되는 폴리알킬렌 옥사이드(mPEG)일 수 있으며, 여기서 mPEG는 -(CH2CH2O)nCH3의 화학식으로 표현되며, 에틸렌 글라이콜 반복 단위의 수에 해당하는 n의 크기에 따라 mPEG의 크기가 달라질 수 있다.
본 발명의 다양한 변형예에 따르면, 화학식 1으로 표시되는 구조를 가지는 아크리딘계 화합물은 하나의 -L-P 작용기를 가진다.
여기서, L은 화학식 1로 표시되는 구조와 형광 신호를 발생시킬 수 있는 형광단인 P를 연결하는 L은 8 내지 150개의 비-수소 원자를 포함하는 링커이다.
또한, P는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택되는 형광단이거나 화학식 1로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, -L-P 작용기는 하기의 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
-L1-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L2-P
여기서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며, A1 내지 A10은 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며, x1 내지 x9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며, y1 내지 y9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이다.
또한, P는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택되거나 본원에 개시되지 않은 다른 구조의 형광단 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 아크리딘계 화합물은 전하를 가질 수 있으며, 이에 따라 아크리딘계 화합물은 카운터 이온을 더 포함하는 구조를 가질 수 있다. 카운터 이온은 유기 또는 무기 음이온으로서 아크리딘계 화합물의 용해도 및 안정성 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 아크리딘계 화합물의 카운터 이온의 예로서, 포스포릭산 육플루오라이드 이온, 할로겐 이온, 포스포릭산 이온, 과염소산 이온, 과요오드산 이온, 안티몬 육플루오라이드 이온, 주석산 육플루오라이드 이온, 플루오로보릭산 이온 및 사플루오르 이온 등과 같은 무기산 음이온과 티오시안산 이온, 벤젠설폰산 이온, 나프탈렌설폰산 이온, p-톨루엔설폰산 이온, 알킬설폰산 이온, 벤젠카르복실산 이온, 알킬카르복실산 이온, 삼할로알킬카르복실산 이온, 알킬설폰산 이온, 트라이할로알킬설폰산 이온, 및 니코틴산 이온 등과 같은 유기산 이온이 있다. 또한, 비스페닐디톨, 티오비스페놀 킬레이트 및 비스디올-α-디켄톤 등과 같은 금속 화합물 이온, 소듐 및 포타슘 등과 같은 금속 이온과 4차 암모늄 염도 카운터 이온으로서 선택될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 아크리딘계 화합물은 다음과 같다.
[화합물 1]
[화합물 2]
[화합물 3]
[화합물 4]
[화합물 5]
[화합물 6]
[화합물 7]
[화합물 8]
[화합물 9]
[화합물 10]
[화합물 11]
[화합물 12]
[화합물 13]
[화합물 14]
[화합물 15]
본 발명의 다양한 실시예에 따른 아크리딘계 화합물의 타겟이 되는 생체분자는 단일사슬 RNA, 이중사슬 RNA, 단일사슬 DNA 및 이중사슬 DNA로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 아크리딘계 화합물은 핵산 내 인터컬레이션될 수 있다.
생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 아크리딘계 화합물로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물이 제공될 수 있다.
또한, 필요에 따라, 생체분자 표지용 키트는 타겟 생체분자인 핵산 내 인터컬레이션을 위한 효소, 용매(완충액 등) 및 기타 시약 등을 더 포함할 수 있다.
여기서 용매로는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 다이클로로메탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴로부터 선택되는 유기 용매 또는 물 등이 사용될 수 있으며, 용매의 종류에 따라 시아닌계 화합물에 다양한 작용기를 도입함으로써 용해도를 조절하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체분자 표지용 염료 내에서 이량체 및/또는 삼량체 형태의 아크리딘계 화합물들은 분자간 상호작용에 의해 서로 응집된 상태로 존재할 수 있다.
이 때, 이량체 및/또는 삼량체 형태의 아크리딘계 화합물은 응집된 상태에서는 형광 신호를 발생시키지 않는다. 반면, 생체분자(예를 들어, 핵산)가 존재할 경우, 응집된 상태로 존재하는 이량체 및/또는 삼량체 형태의 아크리딘계 화합물들은 서로 분리되어 핵산 내 인터컬레이션됨에 따라 형광 신호를 발생시킬 수 있다.
즉, 인터컬레이션 가능한 생체분자의 존재 여부가 본 발명의 일 실시예에 따른 생체분자 표지용 염료의 소광자(quencher)로서 역할하게 된다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체분자 표지용 키트는 생체분자인 핵산을 크기별로 분리한 후 생체분자 표지용 염료 내 아크리딘계 화합물이 핵산 내 인터컬레이션됨에 따라 핵산을 표지하도록 구성된 전기영동 키트로 제공될 수 있다.
상기 지지 매트릭스는 알지네이트, 콜라겐, 펩타이드, 피브린, 히알루론산, 아가로즈, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리바이닐알코올, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트, 젤라틴, 매트리젤(matrigel), 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 라텍스 및 세파로즈로부터 선택되는 적어도 하나로 제조될 수 있으며, 비드 또는 멤브레인 형태일 수 있다.
또한, 상기 실시예에 따른 조영제 조성물은 경구 또는 비경구 방식으로 투여되기 위해 본 발명의 다양한 실시예에 따른 아크리딘계 화합물 외에 약학적으로 허용하는 담체를 더 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체의 구체적인 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등이 있다.
이하에서는 상술한 생체분자 표지용 염료 또는 생체분자 표지용 키트를 이용한 생체분자의 표지 방법에 대하여 설명하도록 한다.
생체분자 표지용 염료를 이용한 생체분자의 표지 방법
본 발명의 다양한 실시예에 따른 아크리딘계 화합물로 생체분자를 표지하는 방법으로는 표지된 고체 또는 반고체 상태의 생체분자의 형광을 측정하는 표지 방법이 가능한 모든 생체분자의 표지에 적용될 수 있다.
종래의 형광 염료 대신 아크리딘계 화합물을 사용함으로써, 고감도로 화학적으로 안정적이고 조작성이 뛰어난 표지 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 타겟 생체분자에 아크리딘계 화합물을 인터컬레이션시켜 생체분자를 표지하하는 방법 등이 구현될 수 있다.
아울러, 아크리딘계 화합물로 표지한 생체분자를 전기영동을 통해 동정하는 방법이 구현될 수도 있다.
DNA 마이크로어레이법
DNA 마이크로어레이법은 표지해야 할 표적 핵산에 염료를 반응(즉, 아크리딘계 화합물이 표적 핵산 내 인터컬레이션)시켜 표지하는데, 이 때 표적 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 가지는 단일사슬의 프로브 핵산을 준비하고, 단일사슬로 변성시킨 표적 핵산과 프로브 핵산을 기판 위에서 혼성화한 후, 형광 염료가 표적 핵산 내로 인터컬레이션되도록 함으로써 형광 신호를 발생시킬 수 있다.
본 표지 방법에서 기판에 고정하는 프로브 핵산으로는, 유전자의 발현을 조사하는 경우, cDNA 등의 cDNA의 라이브러리, 게놈의 라이브러리 또는 모든 게놈을 주형(鑄型)으로 하여 PCR법에 의해 증폭하여 조제한 것을 사용할 수 있다.
또한, 유전자의 변이 등을 조사하는 경우, 표준이 되는 이미 알려진 서열을 근거로 하여, 변이 등에 대응하는 여러가지 올리고뉴클레오티드를 합성한 것을 사용할 수 있다.
프로브 핵산을 기판 위에 고정하는 것은, 핵산의 종류나 기판의 종류에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, DNA의 전하를 이용하여, 폴리리신 등의 양이온으로 표면처리한 기판에 정전결합시키는 방법을 이용할 수도 있다.
PCR 법
PCR법은, 표지해야 할 표적 핵산의 염기서열에 상보적인 프로브를 염료로 표지하고, 표적 핵산의 증폭에 앞서 혹은 증폭시킨 후에 표적 핵산과 프로브를 반응시켜, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
구체적으로는 표적 핵산의 신장반응은 효소(DNA 중합효소, RNA 중합효소)에 의해 이루어지며, 이 때 표적 핵산과 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머가 형성한 이중사슬 핵산서열을 효소가 인식하여, 이 인식한 위치로부터 신장반응이 이루어지고, 목적으로 하는 유전자 영역만을 증폭시킨다.
효소가 합성을 할 때, 뉴클레오티드(dNTP, NTP)를 원료로 하여 합성반응이 이루어진다.
이 때 통상의 뉴클레오티드(dNTP, NTP)에 염료를 가지는 뉴클레오티드를 임의의 비율로 혼합하면, 그 비율의 염료가 도입된 핵산을 합성할 수 있다.
또한, PCR에 의해 임의의 비율로 아미노기를 가지는 뉴클레오티드를 도입한 후에 표지용 염료를 결합하여, 표지용 염료가 도입된 핵산을 합성할 수도 있다.
효소가 합성을 할 때 뉴클레오티드를 원료로 합성반응이 이루어지는데, 이 때의 뉴클레오티드의 3'의 OH를 H로 바꾼 것을 사용한 경우, 더 이상 핵산의 신장반응이 이루어지지 않고, 그 시점에서 반응이 종료한다.
이 뉴클레오티드, ddNTP (dideoxy nucleotide triphospate)는 터미네이터라고 불린다.
통상의 뉴클레오티드에 터미네이터를 섞어 핵산을 합성하면, 일정한 확율로 터미네이터가 도입되어 반응이 종료하기 때문에, 여러가지 길이의 핵산이 합성된다.
이것을 겔 전기영동에 의해 크기 분리하면, 길이의 순번마다 DNA가 늘어서게 된다. 여기서, 터미네이터의 각 염기의 종류마다 다른 표지용 염료로 표지해두면, 합성반응의 종점(3' 말단)에는 각 염기에 의존한 경향이 관찰되어, 터미네이터에 표지한 표지용 염료를 기점으로 형광정보를 읽어냄으로써, 그 표적 핵산의 염기서열 정보를 얻을 수 있다.
또한, 터미네이터 대신에 미리 표지용 염료로 표지한 프라이머를 사용하여 표적 핵산과 혼성화할 수도 있다.
또한, 프로브로서 PNA(펩티드 핵산)를 사용할 수도 있다. PNA는 핵산의 기본 골격 구조인 오탄당·인산골격을, 글리신을 단위로 하는 폴리아미드 골격으로 치환한 것으로, 핵산과 많이 닮은 3차원 구조를 가지고, 상보적인 염기서열을 가지는 핵산에 대하여 매우 특이적이며 강력하게 결합한다. 이를 통해, ISH (in-situ hybridization)법 등 기존의 DNA 해석방법 뿐만 아니라, 텔로미어(telomere, 말단소립) PNA 프로브에 응용함으로써, 텔로미어 연구의 시약으로서 사용할 수도 있다.
표지에는 예를 들어, 이중사슬 DNA를, DNA의 염기서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가지며 표지용 염료로 표지된 PNA와 접촉시켜 혼성화하고, 그 혼합물을 가열하여 단일사슬 DNA를 생성하며, 혼합물을 천천히 실온까지 냉각하여 PNA-DNA 복합체를 조제하고, 그 형광을 측정함으로써 진행할 수 있다.
상기 예에서는 표적 핵산을 PCR법에 의해 증폭시켜 생성물의 형광을 측정하는 방법에 대하여 설명하였지만, 이 방법에서는 전기영동으로 생성물의 크기를 확인하고, 그 후 형광 강도를 측정함으로써 증폭생성물의 양을 조사할 필요가 있다.
이를 위해, 형광 염료의 에너지 트랜스퍼를 이용하고, PCR법의 생성물에 혼성화시킴으로써 형광이 발생하도록 고안된 프로브를 사용하여, 실시간으로 생성물의 양을 측정할 수도 있다.
예를 들어, 도너와 억셉터를 표지한 DNA를 사용할 수 있다. 구체적인 표지 방법으로는 특정 서열의 핵산의 존재를 확인하는 분자비콘법이나 TaqMan-PCR법이나 사이클링 프로브(cycling probe)법 등을 들 수 있다.
기타 표지 방법
또한, 본 발명의 표지용 염료를 이용하여, 세포 내 신호 전달(signaling) 현상을 관찰할 수도 있다. 내부 신호 전달 또는 이에 따른 세포의 반응에는 다양한 효소 등이 관여하고 있다. 대표적인 신호 전달 현상에서는 특수한 단백질 인산화효소(protein kinase)가 활성화되며, 이에 따라 단백질의 인산화가 유도되어 신호 전달의 개시되는 것으로 알려져 있다.
뉴클레오티드(예를 들어, ATP 또는 ADP)의 결합과 가수분해는 이들의 활성에 중대한 역할을 하고 있으며, 뉴클레오티드 유도체에 표지용 염료를 도입함으로써, 세포 내 신호 전달 현상을 고감도로 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명의 표지용 염료를 RNA 간섭작용(RNAi)을 이용한 유전자 발현 현상의 관찰에 이용할 수도 있다.
RNAi는 이중사슬 RNA (dsRNA)를 세포에 도입함으로써, 표적 유전자의 mRNA를 분해하여 발현을 억제하는 것으로서, 설계된 dsRNA를 표지용 염료로 표지함으로써 RNAi 현상을 관찰하는 것이 가능하다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로서 본 발명이 제한되어서는 아니된다.
제조예
제조예
1. 화합물 1의 합성
(1) 중간체 1 및 중간체 2의 합성
1L 3구 반응기에 proflavin (5.8 g, 0.0277 mol), di-tert-butyldicarbonate (12 g, 0.0554 mol), 아세톤 (500 mL)을 넣고 환류 하에 24시간 동안 교반한 후 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 1을 수득하였다(4.4 g, 0.0142 mol, 51%).
500 mL 1구 반응기에 60% NaH (0.63 g, 0.0156 mol)와 dimethylformamide (150 mL)를 넣고 상온에서 10분 동안 교반하였다. 반응기에 중간체 1 (4.4 g, 0.0142 mol)을 넣고 상온에서 20분 동안 교반하였다. 반응기에 ethyl 6-bromohexanoate (3.17 g, 0.0142 mol)을 넣고 상온에서 2시간 교반한 후 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 2를 수득하였다(5.9 g, 0.0130 mol, 92%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.48 (s, 1H), 7.73-7.81 (m, 3H), 7.30-7.33 (m, 1H), 7.18-7.19 (m, 1H), 6.96-6.99 (m, 1H), 4.07 (q, J=7.2Hz, 2H), 2.24 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.56-1.65 (m, 6H), 1.44 (s, 9H), 1.25-1.39 (m, 2H), 1.20 (t, J=7.2H, 3H)
(2) 중간체 3 및 중간체 4의 합성
250mL 1구 반응기에 중간체 2 (5.9 g, 0.0130 mol)와 dimethylforamide (70 mL)를 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. 반응기에 60% NaH (1.3 g, 0.0326 mol)을 넣고 상온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응기에 iodomethane (20 g, 0.130 mol)을 넣고 상온에서 12시간 교반한 후 농축 및 컬럼 정제하여 중간체 3을 수득하였다(5 g, 0.00804 mol, 62%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 9.06 (s, 1H), 8.10 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.99 (d, J=9.6Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.45 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.16 (d, J=9.6Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 4.40 (s, 3H), 4.05 (q, J=6.8Hz, 2H), 3.86 (t, J=6.8Hz, 2H), 3.39 (s, 6H), 2.25 (t, J=6.4Hz, 2H), 1.60-1.62 (m, 4H), 1.49 (s, 9H), 1.34-1.36 (m, 2H), 1.18 (t, J=6.4Hz, 3H)
100mL 1구 반응기에 화합물 3 (5 g, 0.00804 mol)과 dichloromethane (50 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. 반응기에 trifluoroacetic acid (5 mL)를 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 농축 후 반응기에 dimethylformamide (50 mL)를 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. 반응기에 60% NaH (1 g, 0.0242 mol)을 넣고 상온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응기에 iodomethane (6 mL, 0.0808 mol)을 넣고 상온에서 12시간 동안 교반한 후 농축 및 컬럼정제하여 중간체 4를 수득하였다(1 g, 0.00186 mol, 23%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 8.56 (s, 1H), 7.79-7.83 (m, 2H), 6.96-7.01 (m, 2H), 6.60 (s, 2H), 4.26 (s, 3H), 4.10 (q, J=7.2Hz, 2H), 3.58 (t, J=7.2Hz, 2H), 3.29 (s, 6H), 3.28 (s, 3H), 2.32 (t, J=7.2Hz, 2H), 1.64-1.71 (m, 4H), 1.38-1.46 (m, 2H), 1.23 (t, J=7.2Hz, 3H)
(3) 중간체 5 및 화합물 1의 합성
100mL 1구 반응기에 중간체 4 (1.9 g, 0.00354 mol)와 methanol (40 mL)을 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. NaOH (0.425 g, 0.0106 mol)를 물 (12 mL)에 녹여 반응기에 넣어준 뒤 상온에서 2시간 동안 교반한 후 농축하고, 이어서 반응기에 물 (20 mL)을 넣고 진한 염산을 사용하여 pH 3~4로 맞췄다. 생성된 고체는 여과하여 진공 건조하여 중간체 5를 수득하였다(1.6 g, 0.00315 mol, 89%).
25mL 1구 반응기에 중간체 5 (507 mg, 1 mmol), dimethylforamamide (5 mL)를 넣고 상온에서 5분 동안 교반하였다. 반응기에 TSTU (301 mg, 1 mmol), triethylamine (140 uL, 1 mmol)을 넣고 상온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 반응기에 triethylamine (140 uL, 1 mmol), 2,2'-oxybisethylamine (36 mg, 0.340 mmol)을 넣고 상온에서 3일 동안 교반하였다. 이어서, ethylacetate (40 mL)에 반응액을 부어 고체를 석출시킨 후, 석출된 고체를 여과 및 컬럼정제하여 화합물 1을 수득하였다 (170 mg, 0.157 mmol, 15%).
1H-NMR (400 MHz, MeOD) d 8.38 (s, 2H), 7.71 (d, J=9.6Hz, 2H), 7.64 (d, J=9.2Hz, 2H), 7.11 (dd, J=9.2 and 2.0Hz, 2H), 6.92 (dd, J=9.2 and 2.0Hz, 2H), 6.52 (d, J=1.6Hz, 2H), 6.44 (s, 2H), 3.95 (s, 6H), 3.52 (t, J=7.2Hz, 4H), 3.36 (t, J=7.2Hz, 4H), 3.24-3.27 (m, 22H), 2.27 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.70-1.78 (m, 8H), 1.49-1.53 (m, 4H)
제조예
2. 화합물 2 내지 화합물 4의 합성
중간체 5로부터 화합물 1을 합성하는 예에서 2,2'-옥시비스에틸아민 대신 각각 4,7,10-트리옥사-1,13-트라이데칸다이아민, 1,2-비스(2-아미노에톡시)에탄, 1,13-다이아미노-3,6,9-트리옥사운데칸을 사용하여 화합물 2, 화합물 3 및 화합물 4를 합성하였다.
실험예
실험예 1. 아크리딘계 화합물의 핵산 표지 실험
제조예에 따라 제조된 화합물 1 내지 화합물 4와 시판 중인 염료인 SYBR safe의 핵산 표지 특성을 비교하기 위해, 1% 아가로즈 겔 (40ml 1X TAE 버퍼 + 0.4 g 아가로즈)에 각각 4 μL씩 혼합하여 9개의 아가로즈 겔을 준비하였다.
[SYBR safe]
준비된 9개의 아가로즈 겔을 1X TAE 버퍼에 완전히 잠기게 넣은 후 5개의 웰에 10 μL, 5 μL, 2.5 μL, 1 μL, 0.5 μL의 DNA 샘플을 각각 로딩하였다. 전기 영동은 100V의 전원에서 30분 동안 수행되었다. 상기 전기영동 결과는 도 1a 내지 도 1e에 나타내었다.
여기서, 도 1b 내지 도 1e는 각각 본 발명의 제조예에 따라 합성된 화합물 1 내지 화합물 4의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다.
도 1a 내지 도 1e를 참조하면, SYBR safe에 비해 본 발명의 다양한 실시예에 따른 아크리딘계 화합물을 염료로서 사용할 경우, background signal이 균일한 것을 확인할 수 있으며, 전반적인 밴드의 밝기가 SYBR safe보다 밝아 표지 결과의 판독성을 향상시킨 것을 확인할 수 있다.
또한, SYBR safe의 경우, UV를 0.5초 간 조사했음에도 불구하고 전반적인 밴드의 밝기가 어두운 반면, 도 1b, 도 1d 및 도 1e를 참조하면, SYBR safe보다 짧은 시간 동안 UV를 조사하였음에도 불구하고 더 밝은 밴드가 관찰된 것을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 하기의 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 아크리딘(acridine)계 화합물:
[화학식 1]
여기서,
R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR9), 알데하이드, 에스터(-COOR9), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 폴리알킬렌 옥사이드 및 -L-P 작용기로부터 선택되되,
L은 8 내지 150개의 비-수소 원자를 포함하는 링커며,
P는 형광 신호를 발생시킬 수 있는 형광단이거나 화학식 1로 표시되는 구조를 가지며,
R5 내지 R8은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-COR9), 알데하이드, 에스터(-COOR9), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염 및 폴리알킬렌 옥사이드로부터 선택되며,
화학식 1로 표시되는 구조는 하나의 -L-P 작용기를 가진다.
- 제1항에 있어서,
Ra (여기서, a는 1 내지 8로부터 선택되는 정수)가 케톤기(-COR9) 또는 에스터기(-COOR9)일 때, R9는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C2-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬 및 치환 또는 비치환된 C1-C10 아미노알킬로부터 선택되는,
아크리딘계 화합물.
- 제1항에 있어서,
Rb (여기서, b는 1 내지 9으로부터 선택되는 정수)가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 설폰산, 설폰산염, 케톤, 알데하이드, 카복실산, 카복실산염, 인산, 인산염, 아실클로라이드, 폴리알킬렌 옥사이드, 4차 암모늄염, 에스터 및 아마이드로부터 선택되는 적어도 하나로 치환되는,
아크리딘계 화합물.
- 제1항에 있어서,
P는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택되는,
아크리딘계 화합물.
- 제1항에 있어서,
[화학식 2]
-L1-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L2-P
여기서,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 C1-C12 폴리메틸렌 단위이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 아릴이며,
A1 내지 A10은 각각 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 사슬형 알킬 또는 분지형 알킬이거나 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 5원자 고리 또는 6원자 고리이며,
x1 내지 x9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며,
y1 내지 y9는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 20의 정수이며,
P는 페난트리디움(phenanthridium), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridine)으로부터 선택된다.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 아크리딘계 화합물을 포함하는 생체분자 표지용 염료.
- 제6항에 있어서,
상기 생체분자는 단일사슬 RNA, 이중사슬 RNA, 단일사슬 DNA 및 이중사슬 DNA로부터 선택되는 적어도 하나의 핵산인,
생체분자 표지용 염료.
- 제7항에 있어서,
상기 아크리딘계 화합물은 상기 핵산 내 인터컬레이션되는,
생체분자 표지용 염료.
- 제6항에 따른 생체분자 표지영 염료를 포함하는 생체분자 표지용 키트.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 아크리딘계 화합물을 포함하는 조영제 조성물.
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| KR1020160050993A KR102608609B1 (ko) | 2016-04-26 | 2016-04-26 | 아크리딘계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102608609B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LU102310B1 (en) * | 2020-12-17 | 2022-06-17 | Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh | Inhibition of virus protease |
| WO2022129210A3 (en) * | 2020-12-15 | 2022-07-28 | Helmholtz Zentrum Muenchen - Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Inhibition of virus protease |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101333434B1 (ko) * | 2005-03-17 | 2013-11-26 | 알레로직 바이오사이언시스 코포레이션 | 이량체 및 삼량체 핵산 염료, 그리고 관련 시스템 및 방법 |
| US8877437B1 (en) * | 2009-12-23 | 2014-11-04 | Biotium, Inc. | Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection |
-
2016
- 2016-04-26 KR KR1020160050993A patent/KR102608609B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101333434B1 (ko) * | 2005-03-17 | 2013-11-26 | 알레로직 바이오사이언시스 코포레이션 | 이량체 및 삼량체 핵산 염료, 그리고 관련 시스템 및 방법 |
| US8877437B1 (en) * | 2009-12-23 | 2014-11-04 | Biotium, Inc. | Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biopolymers, (1969), Vol. 8, pp. 595-608 * |
| Biopolymers, (1972), Vol. 11, pp. 2537-2561 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022129210A3 (en) * | 2020-12-15 | 2022-07-28 | Helmholtz Zentrum Muenchen - Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Inhibition of virus protease |
| LU102310B1 (en) * | 2020-12-17 | 2022-06-17 | Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh | Inhibition of virus protease |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102608609B1 (ko) | 2023-12-04 |
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