KR20040107476A - 신규 고감도 핵산 분석법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고감도 SNP 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 미량의 표적 DNA를 사용하여 다량의 SNPs를 신속하게 분석할 수 있는 SNP 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 발광 염료와 소광 물질을 함유하는 FRET 프로브를 사용하는 인베이더 방법에 의한 SNP 분석 방법에 있어서, FRET 프로브 중의 발광 염료로서, 유로퓸 또는 테르븀 등의 희토류 원소로 만든 희토류 형광 착체 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 SNP 분석 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정의 희토류 형광 착체 표식제와 특정의 형광 소광제 표식제의 조합물을 포함하는 형광 발광 제어용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 FRET 프로브 등의 고감도 표식 프로브에서 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하고, 소광 물질로서 형광 소광제 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 고감도 표식 프로브, 및 이를 함유하는 SNP 분석용 키트에 관한 것이다.
Description
통상적으로, 사람 게놈 DNA의 단일 뉴클레오티드 다형 분석법으로서, TaqManPCR 방법, MALDI-TOF/MS 방법, DNA 칩 방법, 인베이더(Invader) 방법, RCA(rolling circle amplification)를 사용하는 방법 등이 있다. 이들 방법은 자신만의 특징이 있으며, 각종 SNP 분석에 사용되고 있다.
TaqMan PCR 방법은 PCR 반응을 사용하는 SNP 분석법이고, 분석 단계 수가 적다는 이점을 지니고 있다[참조: T. Morris et al., J. Clin. Microbiol., 1996, 34, 2933., K. J. Livak et al., Genet. Anal., 1999, 14, 143]. 그러나, 이 방법은 1가지 종류의 SNP를 분석하기 위해 2가지 종류의 형광 표식 프로브가 필요하기 때문에, 표식 프로브 제작 비용이 높다는 단점이 있다.
MALDI-TOF/MS(Matris assisted laser desorption-time of flight/mass spectrometry) 방법은 하나의 SNP 분석에 대해 전혀 표식을 필요로 하지 않으면서 하나의 프라이머를 사용하는 이점을 지니고 있지만[참조: L, A. Haff et al., Genome Res., 1997, 7,378. P. Ross et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16, 1347], 표적 영역의 PCR 증폭, PCR 생성물의 정제, 프라이머 신장 반응, 프라이머 신장 반응 생성물의 정제, 질량 측정 샘플의 스폿팅, 질량 분석 등의 작동 단계 수가 너무 많다는 단점이 있다.
DNA 칩 방법은 다량의 SNPs를 한 번에 분석할 수 있다는 이점이 있다[참조: D. G. Wang et al., Science, 1998, 280, 1077., J. G. Hacia et al., Nat. Genet., 1999, 22, 164., P. N. Gilles et al., Nat. Biotechnol., 1999, 17, 365]. 이 방법은 DNA 칩 상에서 하이브리드화를 수행하기 전에 PCR이 필요하므로, 다량의 SNPs를 분석하기에 앞서, 다수의 PCRs을 수행해야만 하는 단점이 있다.
인베이더 방법은 소수의 SNP 분석 단계로 구성되고, PCR과 형광 표식 대립인자(allele) 특이적 올리고뉴클레오티드를 필요로 하지 않으며, 각 대립인자-특이적 올리고뉴클레오티드에 공통적인 플랩(flap)를 부가하는 것 만을 필요로 한다.
도 1은 인베이더 방법에 의한 단일 뉴클레오티드 다형 분석법의 개략을 다이아그램으로서 도시한 것이다. 이 방법은 도 1에 도시한 바와 같이 표적 DNA 중의 "N" 위치에 SNP인 뉴클레오티드가 존재하는지를 결정하는 방법이다. 이 때문에, 리포터(reporter) 프로브(1차 프로브), 인베이더 프로브(2차 프로브), 검출용 FRET 프로브, 및 형광 공명 에너지 이동 프로브(FRET 프로브)를 사용한다. 리포터 프로브는 표적 DNA의 SNP 위치의 5' 측면에서 상보적인 뉴클레오티드 서열을 함유하고, "플랩"으로 불리우는 뉴클레오티드 서열 영역을 추가로 함유한다. 이러한 플랩 영역의 뉴클레오티드 서열은 FRET 프로브의 3' 측면의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열이다. 또한, 인베이더 프로브는 표적 DNA의 3' 측면에서 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. SNP 위치(도 1에서 "N"으로 지시된 위치)에서 표적 DNA의 뉴클레오티드 "N"은 단일 뉴클레오티드 다형 부위의 뉴클레오티드이고, A, T, G 및 C 중의 어느 하나이다. 리포터 프로브의 뉴클레오티드 "N1"은 N과 정상적인 염기 쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드이고, 인베이더 프로브의 "N2"은 임의의 뉴클레오티드이다.
FRET 프로브는 3' 측면에 플랩 영역이 결합되는 일본쇄 영역을 함유하는 프로브이고, FRET 프로브의 5' 측면에서는 이의 전부 또는 일부가 이본쇄를 형성한다. 도 1에서 5' 측면의 전부가 이본쇄를 형성하는 것으로 도시되어 있긴 하지만, 전부가 이본쇄를 형성할 필요는 없다. 그러나, 본원에서는 도 1에 따라서 설명한다. 추가로, 발광 염료 "Ln" 및 소광 물질 "Q"가 FRET 프로브의 5' 측면에 결합된다. 소광 물질 "Q"가 발광 염료 "Ln"으로부터 일정 거리 내에 존재하는 경우에는, 발광 염료로부터의 발광이 소광되어, 발광을 관찰할 수 없다.
인베이더 방법에서는, 먼저, 표적 DNA에 리포터 프로브와 인베이더 프로브가 결합되고, 이때 리포터 프로브의 뉴클레오티드 "N1"과 표적 DNA의 뉴클레오티드 "N"의 염기 쌍 중간에 인베이더 프로브의 뉴클레오티드 "N2"가 인베이더(침입자) 처럼 삽입된다. 이러한 상황이 도 1의 최상단부에 도시되어 있다.
상기와 같은 3개의 뉴클레오티드가 서로 결합되는 상황 하에 특이적으로 작용하는 절단 효소(구조-특이적 5' 뉴클레아제)를 작용시키면, 이러한 절단 효소는 리포터 프로브를 뉴클레오티드 "N1"의 위치에서 절단시키고, 플랩 영역 만을 함유하는 단편을 형성시킨다. 이어서, 플랩 영역은 FRET 프로브의 3' 측면에 결합된다. 이 상황이 도 1의 중간부에 도시되어 있다. 이때, 뉴클레오티드 "N1"을 함유하는 플랩 영역의 선단부가 FRET 프로브의 이본쇄 부분의 중간에 삽입된다. 이러한 상황은 상기 언급된 인베이더 프로브의 상황과 유사하고, 절단 효소로 인해 특이적 절단 위치로 된다. 이어서, 이 절단 효소는 FRET 프로브의 5' 말단부가 플랩 영역에 의해 차단된 영역에서 절단시킨다.
절단된 FRET 프로브의 5' 측면에 발광 염료 "Ln"이 결합되고, 이러한 절단에의해 발광 염료 "Ln"이 소광 물질 "Q"로부터 분리된다. 그 결과, 발광 염료 "Ln"의 발광이 관찰될 수 있다. 이러한 상황은 도 1의 최하단부에 도시되어 있다. 발광 염료 "Ln"은 소광 물질 "Q"로부터 방출되고, 본래의 발광을 나타낸다.
리포터 프로브의 뉴클레오티드 "N1"이 표적 DNA의 뉴클레오티드 "N"과 정상적인 염기 쌍을 형성할 수 없는 경우에는, 인베이더와 같은 상황에 도달하지 못하므로, 절단 효소에 의한 절단이 야기되지 않는다. 따라서, 표적 DNA의 뉴클레오티드 "N"이 리포터 프로브의 뉴클레오티드 "N1"과 정상적인 염기 쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드인지의 여부는 발광으로써 판단할 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 인베이더 방법에서는, 표적 DNA를 표식시킬 필요가 없을 뿐만 아니라 리포터 프로브와 인베이더 프로브도 표식시킬 필요가 없으며, 표식화가 필요한 것은 FRET 프로브 뿐이다. 또한, FRET 프로브는 플랩 영역의 뉴클레오티드 서열과만 연관이 있으며, 플랩 영역의 뉴클레오티드 "N1"과는 특별한 연관이 없다. 따라서, FRET 프로브는 표적 DNA의 뉴클레오티드 서열에 의해 전부 영향을 받는 것은 아니고, 표적 DNA와 무관하게 임의로 결정된 플랩 영역의 뉴클레오티드에 기초하기 때문에, 대량 생산이 가능하여 프로브 생산 비용을 대폭 감소할 수 있다는 이점이 있다.
그러나, 종래의 방법의 측정 감도는 충분하지 않기 때문에, 하나의 SNP를 분석하기 위해서는 수십 나노그램의 게놈 DNA가 필요하므로, 다량의 SNPs를 분석하기 위해서는 다량의 게놈 DNAs가 필요하다는 단점이 있다.
발명의 개시
전술된 상황에 근거하면, 본 발명은 고감도 SNP 분석 방법을 제공하고, 미량의 표적 DNA로 다량의 SNPs를 신속하게 분석할 수 있는 SNP 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 고감도 발광 염료, 보다 상세하게는 고감도 발광 염료와 소광 물질을 포함하는 형광 발색 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 추가로, 본 발명은 뉴클레오티드 SNP 분석법에 있어서, 고감도 발색 염료와 소광 물질로 구성된 FRET 프로브 등의 고감도 표식 프로브 및 이러한 FRET 프로브를 사용한 시간 분해 형광 검정에 의한 최대 고감도 SNP 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 고감도 단일 뉴클레오티드 다형(single nucleotide polymorphism:SNP) 분석법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하고, 시간 분해 형광 검정(time-resolved fluorescence assay)에 기초하여 형광 발광을 측정하는 것을 특징으로 하는 고감도 SNP 분석 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정의 희토류 형광 착체 표식제와 특정의 형광 소광제(quencher) 표식제의 조합물을 포함하는 형광 발광 제어용 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 프로브 등의 고감도 표식 프로브에서, 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하고, 소광 물질로서 형광 소광제 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 고감도 표식 프로브, 및 이를 포함하는 SNP 분석용 키트에 관한 것이다.
도 1은 인베이더 방법을 사용한 SNP 분석법의 개략을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 FRET 프로브의 한 예의 개략을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 BPTA-Tb3+와 Dabcyl로 구성된 FRET 프로브를 사용한 경우를 예로 들어, 본 발명의 SNP 분석법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 형광 소광제 표식제 Dabcyl의 흡수 스펙트럼과, 본 발명의 희토류 형광 착체 표식제 BPTA-Tb3+의 형광 발광 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 4의 횡축은 파장(nm)이고, 좌측의 종축은 형광 강도를 나타내며, 우측의 종축은 흡수를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 방법에 있어서, 표적 DNA의 농도 변화를 수반하는 형광 강도 변화를 도시한 것이다. 도 5의 횡축은 표적 DNA의 농도(pM)이고, 종축은 형광 강도를 나타낸다.
통상적으로, 몇몇 희토류 형광 착체 표식제는, 리간드의 구조 또는 조성에 상당히 의존적이긴 하지만, 강한 형광 강도를 지니고 있기 때문에, 시간 분해 형광 검정에 사용되어 왔다. 그러나, 이들은 희토류 형광 착체 표식제의 강한 형광 강도의 이점을 취하고 있지만, 희토류 형광 착체 표식제와 형광 소광제 표식제의 조합물에 의한 발광의 제어는 개발하지 못하였다. 본 발명에서는, 특정의 희토류 형광 착체 표식제와 특정의 형광 소광제 표식제의 조합물에 의해 발광을 제어할 수 있다는 사실을 밝혀내었다.
달리 말하면, 본 발명은 발광 염료와 소광 물질을 함유하는 FRET 프로브를 사용하는 인베이더 방법에 있어서의 SNP 분석 방법, 또는 헤어핀 구조를 갖는 프로브를 사용하는 분자 비이콘(Molecular beacon) 방법에 있어서의 SNP 분석 방법 등에서, 고감도 표식 프로브의 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 SNP 분석 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 언급하면, 본 발명은 다음 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 리간드 중의 어느 하나를 포함하는 희토류 형광 착체 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 SNP 분석 방법에 관한 것이다. 추가로 상세하게 언급하면, 본 발명은 소광 물질로서 다음 화학식 7 내지 9로써 나타낸 형광 소광제 표식제 중의 어느 하나를 사용하는 것을 특징으로 하는 SNP 분석 방법에 관한 것이다. 추가로 상세하게 언급하면, 본 발명은 형광 검정법으로서 시간 분해 형광 검정법을 사용하는 것을 특징으로 하는 고감도 SNP 분석 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 특정의 희토류 형광 착체 표식제와 특정의 형광 소광제 표식제의 조합물을 포함하는 형광 발광 제어용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게 언급하면, 본 발명은 다음 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 리간드와 희토류 원소로 구성된 희토류 형광 착체 표식제 하나 이상과, 다음 화학식 7 내지 9로 구성된 형광 소광제 표식제 하나 이상을 포함하는 형광 발광 제어용 조성물에 관한 것이다:
상기식에서,
n은 1 내지 4의 정수를 나타내고,
R은 치환체 그룹을 갖는 알릴 그룹을 나타내고,
R'는 아미노 그룹, 하이드록실 그룹, 카복실 그룹, 설포네이트 그룹 또는 이소티오시아네이트 그룹을 나타내고,
m은 1 내지 4의 정수를 나타내고,
R1또는 R2중의 어느 하나는 담체 또는 핵산 상에 고정화하기 위한 링커 그룹을 나타내고, 다른 하나는 수소 원자 또는 알킬 그룹을 나타내며,
R3은 담체 또는 핵산 상에 고정화하기 위한 링커 그룹을 나타낸다.
또한, 본 발명은 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하고, 소광 물질로서 형광 소광제 표식제를 사용하는 FRET 프로브 등의 고감도 표식 프로브에 관한 것이고, 보다 상세하게는 발광 염료로서, 상기 언급된 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 리간드와 희토류 이온을 포함하는 희토류 형광 착체 표식제 하나 이상을 사용하고, 소광 물질로서, 상기 언급된 화학식 7 내지 9를 포함하는 형광 소광제 표식제 하나 이상을 사용하는 고감도 표식 프로브에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 상기 언급된 본 발명의 고감도 표식 프로브를 포함하는 SNP 분석용 조성물 또는 SNP 분석용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 도 1에서 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제 "Ln", 보다 상세하게는 상기 언급된 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 리간드와 희토류 이온을 포함하는 희토류 형광 착체 표식제를 사용하고, 소광 물질로서 형광 소광제 표식제 "Q", 보다 상세하게는 상기 언급된 화학식 7 내지 9를 포함하는 형광 소광제 표식제를 사용하는 것을 특징으로 한다.
도 2는 본 발명의 FRET 프로브의 한 예를 도시한 것이다. 이 예에서는, 희토류 형광 착체 표식제 "Ln"이 프로브의 5' 말단에 지시되어 있지만, 본 발명의 FRET 프로브는 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 FRET 프로브는 형광 소광제 표식제 "Q"가, 희토류 형광 착체 표식제 "Ln"에 의한 형광을 소광시키기에 충분한 거리 내에 위치하고, 희토류 형광 착체 표식제 "Ln" 또는 형광 소광제 표식제 "Q"가, 인베이더 상태로 절단 효소에 의해 절단되어 방출되는 위치에 위치하는 한은 어떠한 입체 배치일 수 있으며, 이러한 희토류 형광 착체 표식제 "Ln"과 형광 소광제 표식제 "Q"는 절단에 의해 격리되어 있고, 이들 간의 거리는 발광을 관찰하기에 충분히 크도록 유지되며, 도 2에 도시된 위치로 제한되지 않는다.
본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해, 희토류 착체 표식제로서, 테르븀이온과 유기 리간드 N,N,N1,N1-[2,6-비스(3'-아미노메틸-1'-피라졸릴)-4-페닐피리딘]테트라키스(아세트산)(치환체 그룹 R이 페닐 그룹인 상기 언급된 화학식 2로써 나타낸 리간드, BPTA로서 약칭 후술됨)로 구성된 테르븀 착체 형광 표식제(BPTA-Tb3+로서 약칭 후술됨)를 사용하고, 형광 소광제 표식제로서 화학식 9의 화합물(Dabcyl로서 약칭 후술됨)를 사용하여 설명한다. BPTA 및 이의 N-하이드록시석시네이트이미드 모노에스테르(NHS-BPTA로서 약칭됨)의 합성은 본 발명자들에 의해 보고된 방법[참조: J. Yuan, G. Wang, K. Majima, K. Matsumoto, Anal. Chem., 2001, 73, 1869]에 따라서 수행하였다. BPTA-Tb3+의 화학 구조가 다음에 제시된다:
또한, DNA 올리고뉴클레오티드로서, 다음을 사용한다. 표적 DNA로서, 3'TGTGTCACAGGAGGGCGAGGAGGACTCGTGGGAGGAGGAGAAGG5'를 사용하고, 리포터 프로브로서 5' AACGAGGCGCACCCCTCCTCCTCTTCC3'를 사용하며, 인베이더 프로브로서, 5' ACACAGTGTCCTCCCGCTCCTCCTGAGCAC3'를 사용한다. 희토류 형광 착체 표식제 BPTA-Tb3+와 형광 소광제 표식제 Dabcyl을 고정화시킨 FRET 프로브로서, 다음을 사용한다:
이들 시약을 사용하여, 도 1에 도시된 인베이더 방법의 개략에 따라서 실험을 수행한다. 구체적인 방법의 개략이 도 3에 도시되어 있다. 도 3에서 표적 DNA의 밑줄친 부분은 SNPs를 검출할 위치를 지시한다.
Dabcyl의 흡수 스펙트럼과 BPTA-Tb3+의 형광 발광 스펙트럼을 측정한다. 그 결과가 도 4에 도시되어 있다. 도 4의 횡축은 파장(nm)이고, 좌측의 종축은 형광 강도를 나타내며, 우측의 종축은 흡수를 나타낸다. 도 4의 파선은 Dabcyl의 흡수 스펙트럼을 지시하고, 실선은 BPTA-Tb3+의 형광 발광 스펙트럼을 지시한다.
Dabcyl의 흡수 스펙트럼과 BPTA-Tb3+의 형광 발광 스펙트럼이 중복됨으로써, 이들이 서로 근접하게 되면, BPTA-Tb3+의 형광 발광이 Dabcyl에 의해 소광된다는 사실이 밝혀졌다. 이와는 반대로, 이들이 서로 떨어져 있으면, BPTA-Tb3+는 강한 형광을 방출할 수 있다. 달리 말하면, FRET 프로브에서는, Dabcyl과 BPTA-Tb3+이 근접한 거리 내에 있기 때문에, BPTA-Tb3+의 형광이 소광된다. 그러나, 도 3에 제시된 반응을 수반하여, BPTA-Tb3+표식된 뉴클레오티드 부분을 차례로 절단하면 BPTA-Tb3+가 Dabcyl로부터 격리됨으로써, BPTA-Tb3+의 형광은 반응이 진행됨에 따라 점차적으로 보다 강해진다. 이러한 형광을 시간 분해 형광 검정법으로 측정함으로써, 표적 DNA에서의 SNP를 분석할 수 있다.
이와는 반대로, 표적 DNA가 SNP를 갖지 않는 경우에는, 제1 프로브, 제2 프로브 및 표적 DNA의 하이브리드화 반응 후의 절단 반응이 일어나지 않으며, 플랩과 FRET 프로브의 하이브리드화 반응과, 이러한 반응 후의 절단 반응이 일어나지 않기 때문에, 비특이적 반응에 의한 소량의 형광 증가가 측정되긴 하지만, SNP가 존재하는 경우에 일어나는 BPTA-Tb3+의 상당한 형광 증가를 측정하지 못한다.
도 5에서는, 표적 DNA의 농도 변화를 수반하는 형광 강도 변화가 도시되어 있다. 도 5의 횡축은 표적 DNA의 농도(pM)이고, 종축은 형광 강도를 나타낸다. 표적 DNA의 농도가 0인 지점은 배경 형광 강도를 지시한다. 이 결과에 따르면, 배경 + 2SD(표준 편차)를 표준으로 한 경우에, 검출 감도는 약 0.008pM (8 x 10-15M)이다. 이는 유기 표식제를 사용하는 종래의 방법에 비해, 약 2 차수 정도 더 민감하다.
상기 언급된 바와 같이, 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하고, 소광 물질로서 형광 소광제 표식제를 사용하는 본 발명의 방법이, 종래의 유기 형광 표식제를 사용하는 시스템과 비교해서 극도로 고감도이고, 반응 후의 형광 시그널 대 소음 비가 또한 크다. 이는 희토류 형광 착체 표식제의 형광 수명이 매우 길므로, 반응 후의 형광 시그널을 장시간 시간 분해 형광 검정법에 사용할 수 있어, 짧은 형광 수명을 지닌 배경 소음을 효율적으로 제거할 수 있기 때문이다. 종래의 유기 형광 염료로 구성된 FRET 프로브를 사용하는 경우, 예를 들면, 플루오레세인(fluorescein)과 Cy3으로 구성된 FRET 프로브를 사용하는 경우[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 8272]에는, 반응 후의 플루오레세인 형광 측정에 있어서, Cy3은 플루오레세인의 최대 형광 파장에서 강한 형광을 지니기 때문에, 큰 배경 소음을 산출시킨다. 그러나, 본 발명의 방법에서는, 시간 분해 형광 검정법을 사용할 수 있기 때문에, 형광 수명이 짧은 Cy3의 형광을 완전히 제거할 수 있고, 가장 민감한 측정을 수행할 수 있다. 또한, 희토류 형광 착체 표식제로서 유로퓸 형광 착체 표식제를 사용하거나 또는 형광 소광제 표식제로서 Cy5를 사용한 경우에도, 유사한 결과가 획득된다.
본 발명의 희토류 형광 착체 표식제는 희토류 원소의 착체로 구성되고, 희토류 원소로서는, 란타노이드 계열의 각종 원소가 열거될 수 있지만, 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 및 디스프로슘(Dy)이 바람직하다. 이들 희토류 원소는 0가 형태일 수 있지만, 이온 형태, 바람직하게는 3가 양이온 형태의 원소로부터 형성된 착체가 바람직하다.
본 발명의 희토류 형광 착체 표식제에 바람직한 리간드로는 상기 언급된 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 리간드가 있다. 상기 언급된 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 리간드 중의 치환체 그룹 R의 아릴 그룹은 페닐 그룹 및 나프틸 그룹 등의카보사이클릭 방향족 그룹, 또는 환 중에 1 내지 3개의 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자를 함유하는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 방향족 그룹일 수 있다. 이들 방향족 그룹은 모노사이클릭, 폴리사이클릭 또는 축합 사이클릭 시스템일 수 있다. 바람직한 아릴 그룹으로는 페닐 그룹, 티에닐 그룹 및 피리딜 그룹이 있다. 치환체 그룹 R의 아릴 그룹은 치환체 그룹을 가지며, 이러한 치환체 그룹으로서는, 아미노 그룹, 하이드록실 그룹, 카복실 그룹, 설포네이트 그룹 또는 이소티오시아네이트 그룹 등의 극성의 작용성 그룹이 바람직하다. 추가로, 이는 이들 작용성 그룹의 알킬 유도체 또는 할로겐화 유도체일 수 있다. 바람직한 치환체 그룹으로는 아미노 그룹, 카복실 그룹 및 이소티오시아네이트 그룹이 있다.
상기 언급된 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 리간드 중의 치환체 그룹 R'로는 아미노 그룹, 하이드록실 그룹, 카복실 그룹, 설포네이트 그룹 또는 이소티오시아네이트 그룹을 열거할 수 있지만, 이에 제한되지 않으며, 극성의 작용성 그룹이 바람직하다. 추가로, 이는 이들 작용성 그룹의 알킬 유도체 또는 할로겐화 유도체일 수 있다. 바람직한 치환체 그룹으로는 아미노 그룹, 카복실 그룹 및 이소티오시아네이트 그룹이 있다.
본 발명의 형광 소광제 표식제의 바람직한 예로는 상기 언급된 화학식 7 내지 9로써 나타낸 화합물이 있다.
화학식 7로써 나타낸 본 발명의 형광 소광제 표식제의 치환체 그룹 R1및 R2는 이들 중의 적어도 1개가 담체 또는 핵산 상에 고정화하기 위한 링커 그룹이라는것을 지시한다. 치환체 그룹 R1및 R2중의 하나가 링커 그룹이 아닌 경우에는, 그 하나가 수소 원자 또는 알킬 그룹, 바람직하게는 알킬 그룹을 나타낸다. 본 발명에서의 알킬 그룹은 탄소수 1 내지 20, 바람직하게는 탄소수 1 내지 10, 보다 바람직하게는 탄소수 1 내지 7의 직쇄 또는 측쇄 알킬 그룹이다. 바람직한 알킬 그룹으로는 메틸 그룹, 에틸 그룹 및 이소프로필 그룹이 있다. 또한, 담체 또는 핵산 상에 화학식 7 내지 9 중의 치환체 그룹 R1, R2및 R3을 고정화하기 위한 링커 그룹은, 담체 또는 핵산 상에 고정화하기에 적당한 크기를 지니고, 고정화하기 위한 반응성 그룹을 가지는 한은 어떠한 것일 수 있고, 이는 담체 또는 핵산의 종류에 따라서 임의로 선택할 수 있다. 이러한 링커 그룹에 대해서는, 탄소수 3 내지 30, 바람직하게는 탄소수 5 내지 20, 보다 바람직하게는 탄소수 5 내지 15의 선형 알킬렌 그룹에 의해 표적 담체 또는 핵산에 연결시키는데, 이러한 알킬렌 그룹의 탄소 원자 중의 1개 이상이 산소 원자, 질소 원자 또는 황 원자 등의 또 다른 원자에 의해 치환될 수 있거나, 또는 알킬렌 그룹의 탄소 원자, 질소 원자 또는 황 원자 중의 1개 이상이 옥소 그룹(=O), 할로겐, 하이드록실 그룹, 아미노 그룹 또는 알킬 그룹에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 사용된 변형 FRET 뉴클레오티드 프로브(변형 DNA 올리고뉴클레오티드)의 제조 방법은 그 자체가 널리 공지되어 있는 뉴클레오티드 프로브 제조 방법 중의 어떠한 것에 따라서도 수행할 수 있다. 예를 들어, 어떠한 올리고뉴클레오티드 합성도 자동화 DNA 합성기를 사용하여 포스포르아미다이트 방법에 의해 수행할 수 있다. 정제는 역상 HPLC에 의해 수행할 수 있다. 또한, 형광 소광제 표식제의 도입은 다음 화학식 10으로써 나타낸 Dabcyl-dT, 다음 화학식 11로써 나타낸 TAMRA-dT, 다음 화학식 12로써 나타낸 Cy3-dC, 또는 다음 화학식 13으로써 나타낸 Cy5-dC 등의 염료 유도체를 사용하는 통상의 방법에 따라서 수행할 수 있다:
상기식에서,
DMTO는 4-모노메톡시트리메틸 그룹을 나타내고,
iPr은 2-프로필 그룹을 나타낸다.
추가로, 희토류 형광 착체 표식제의 도입은, 예를 들어, 5' 말단에서 아미노변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 화학식 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로써 나타낸 리간드 중의 어느 하나와 희토류 이온으로 구성된 형광 착체 표식제와 반응시킴으로써 수행할 수 있고, 정제는 역상 HPLC, 전기영동, 또는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 고감도 표식 프로브는 SNP 분석에 사용되는 표식 프로브로서, 본 발명의 희토류 형광 착체 표식제와 형광 소광제 표식제를 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 고감도 표식 프로브의 예로는 인베이더 방법에 있어서의 FRET 프로브, 분자 비이콘 방법에 있어서의 헤어핀 구조의 프로브, 또는 TaqMan PCR 방법에 있어서의 TaqMan 프로브가 있지만, 이에 제한되지 않는다.
첨언하면, JP-A-2002-063960 및 JP-A-2003-061958 명세서에 기재된 모든 내용이 본 명세서에 혼입되어 있다.
본 발명은 다음 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 설명될 것이지만, 본 발명이 이들 실시예로 제한되지는 않는다.
실시예 1(테르븀 형광 표식제 BPTA-Tb3+의 제조)
테르븀 형광 표식제 BPTA-Tb3+은 테르븀 이온과 유기 리간드 BPTA로 구성된 착체이고, BPTA와 이의 N-하이드록시석시네이트이미드 모노에스테르(NHS-BPTA로 약칭됨)은 본 발명자들에 의해 보고된 방법[참조: J. Yuan, G. Wang, K. Majima, K.Matsumoto, Anal. Chem., 2001, 73, 1869]에 따라서 제조하였다.
실시예 2(DNA 올리고뉴클레오티드의 제조)
도 3에 도시된 모든 올리고뉴클레오티드는 자동화 DNA 합성기를 사용하여 포스포르아미다이트 방법에 의해 합성하였다. 정제는 역상 HPLC에 의해 수행하였다. 표적 DNA의 밑줄친 뉴클레오티드는 SNP 부위를 지시한다.
FRET 프로브의 제조는 먼저, 5' 아미노 그룹과 Dabcyl로 변형시킨 DNA 올리고뉴클레오티드를 자동화 DNA 합성기에 의해 합성하고, NHS-BPTA-Tb3+를 사용하여 5' 아미노 그룹을 추가로 표식시킴으로써 수행하였다.
실시예 3(SNP 검정)
표적 DNA의 SNP 검정은 종래의 방법[예를 들면, 문헌(Nature Biotechnology, 1999, 17, 292 and Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 8272)에 기재된 방법]에 따라서 수행하였다. 이의 원리가 도 3에 제시되어 있다. 달리 말하면, 리포터 프로브(1차 프로브), 인베이더 프로브(2차 프로브), 표적 DNA 및 FRET 프로브를 함유하는 용액에, 절단 효소로서 플랩 엔도뉴클레아제 1 효소를 가하고, 63℃에서 4시간 동안 항온 배양한 후, 시간 분해 형광 검정을 수행하였다.
측정 장치는 ARVO 1420(Wallac)이다. 측정 조건은 다음과 같다: 지연 시간(delay time)은 0.4 밀리초(millisecond)이고, 윈도우 시간(window time)은 0.4 밀리초이며, 순환 시간은 1.0 밀리초이고, 여기 파장은 320nm이며, 측정 파장은 545nm이다.
실시예 4분자 비이콘 방법에 대한 BPTA의 응용(1)
분자 비이콘 방법을 사용하여 하이브리드화 시그널을 검출하는데 BPTA를 응용하기 위해, 다음 실험을 수행하였다:
검출하고자 하는 표적 서열로서, 5'-GCTGGAGGGATGATACTTTGCA-3' 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성한다.
분자 비이콘으로서 사용된 프로브에 대해서는, 5' 말단에 (CH2)6의 스페이서를 통하여 BPTA를 결합시키고, 3' 말단에 소광제로서 DABCYL (4-(디메틸아미노)아조벤젠-4'-설포닐) 그룹을 결합시킨 5'-CCAAGCGCAAAGTATCATCCCTCCAGGCTTGG-3' 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 이러한 서열 중의 5' 말단측과 3' 말단측의 6개 뉴클레오티드 잔기는 상보적이고, 이들 서열 사이의 서열이 상보적인 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하지 않는 경우에는, 스템(stem) 구조가 형성되고, BPTA와 DABCYL은 분자 중에 근접하게 존재하고, BPTA가 여기되는 파장 범위의 빛은 DABCYL 그룹에 의해 흡수되어, BPTA 유도된 형광이 결과적으로 감소되도록 프로브를 고안한다.
또한, 비-표적 올리고뉴클레오티드로서, 서열 5'-CCATGGTGTCTGTTTAAGGTTGCT-3'을 사용하였다.
반응은 2mM MgCl2과 0.6μM TbCl3를 함유하는 15mM 트리스-HCl(pH 7.0) 완충 용액 50㎕ 중에, 0.2μM의 상기 언급된 분자 비이콘과 0.6μM의 표적 서열(또는 비-표적)을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 실온에서 5분 동안 수행하였다. 반응 후, 하이브리드화 시그널로서의 BPTA 유도된 형광은, WALLAC 제작의 ARVO™ SX 1420 멀티라벨 카운더(Multilabel Counter)를 사용하여 측정하였다. 또한, 표적 서열(또는 비-표적)의 올리고뉴클레오티드를 부가하지 않은 반응 용액을 반응의 블랭크(blank)로서 사용하였다.
그 결과가 표 1에 제시되어 있다. 표적 서열을 사용하는 경우, 비-표적 서열을 사용하는 경우에 비해 유의적으로 더 높은 시그널이 수득되었다.
| 서열 | 형광 강도 |
| 표적 서열 | 803,760 |
| 비-표적 서열 | 95,728 |
실시예 5분자 비이콘 방법에 대한 BPTA의 응용(2)
실시예 4에 사용된 DABCYL의 소광 능력을 응용함으로서, BPTA로 표식된 올리고 DNA를 사용하여, DNA의 단일 뉴클레오티드 차이를 검출하였다.
본 실시예에서는, 표적 DNAs로서, 표 II에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 4 종류의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
| 표적 서열 | 뉴클레오티드 서열 |
| A | 5'-CCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3' |
| B | 5'-CCATGGTGTCTGTTTCAGGTTGCT-3' |
| C | 5'-CCATGGTGTCTGTTTAAGGTTGCT-3' |
| D | 5'-CCATGGTGTCTGTTTTAGGTTGCT-3' |
이들 올리고뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 16번째 뉴클레오티드에 대해서만 서열이 상이하고, 나머지 서열에 대해서는 동일하도록 고안되었다. BPTA 표식 프로브로서, 5' 말단에 (CH2)6의 스페이서를 통하여 BPTA를 결합시킨, 5'-AGCAACCTCAAACAGACACCATGG-3' 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 이 서열은 표 II의 표적 서열 A에 완전히 상보적이다. 따라서, 적당한 조건 하에, 1개의 뉴클레오티드 미스매치(mismatch)가 존재하는 표적 서열 B 내지 D에 비해, 표적 서열 A와 특이적인 하이브리드화를 수행하는 것이 가능하다.
한편, 5'-GGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3' 서열을 갖고, 3' 말단에 DABCYL을 결합시킨 올리고뉴클레오티드(소광용 올리고뉴클레오티드)를 제조하였다. 이러한 서열은 상기 언급된 BPTA 표식 프로브의 5' 말단으로부터 1번째 내지 20번째 뉴클레오티드 서열과 상보적이고, 하이브리드화 가능하기 때문에, 자유 BPTA 표식 프로브로부터 유도된 형광을 소광시킬 것으로 예상된다. 이러한 이유 때문에, 표적 서열 A(완전히 상보적인 서열)와 B 내지 D(단일 뉴클레오티드 차이가 있는 서열) 간의 시그널 형광 강도 차이로써 단일 뉴클레오티드 차이를 식별할 수 있다
반응은 2mM MgCl2과 3μM TbCl3를 함유하는 15mM 트리스-HCl(pH 7.0) 완충 용액 50㎕ 중에, 1μM의 상기 언급된 BPTA 표식 프로브, 표적 서열을 갖는 2.0μM의 올리고뉴클레오티드, 및 2μM의 소광용 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 실온에서 30분 동안 수행하였다. 반응 후, 하이브리드화 시그널로서의 BPTA 유도된 형광은, WALLAC 제작의 ARVO™ SX 1420 멀티라벨 카운더를 사용하여 측정하였다. 또한, 표적 서열(또는 비-표적)의 올리고뉴클레오티드를 부가하지 않은 반응 용액을반응의 블랭크로서 사용하였다.
그 결과가 표 III에 제시되어 있다.
| 표적 서열 | 형광 강도 |
| A | 5,526,292 |
| B | 344,573 |
| C | 432,303 |
| D | 496,235 |
그 결과, 완전히 상보적인 서열에 대한 시그널은 단일 뉴클레오티드 차이가 있는 서열에 대한 시그널에 비해 유의적으로 높았다. 달리 말하면, 뉴클레오티드 서열 중의 단일 뉴클레오티드 차이는 식별할 수 있었다.
본 발명은 희토류 형광 착체 표식제와 형광 소광제 표식제로 구성된 FRET 프로브를 사용하는, 시간 분해 형광 검정에 기초한 고감도 뉴클레오티드 SNP 분석법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라서, 표적 DNA 농도 0.008pM(8 x 10-15M)에서 분석이 가능해지고, 극소량의 표적 DNA로 다량의 SNPs을 분석하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명의 방법에 따라서, 형광 수명이 짧은 배경 소음이 효과적으로 제거될 수 있기 때문에, 반응 후의 형광 시그널/소음 비가 크고, 분석 정밀도가 현격하게 개선될 수 있다.
<110> Matsumoto, Kazuko
<120> A New Method for Nucleotid Analisys
<130> JA924409
<150> JP2002-063960
<151> 2002-03-08
<150> JP2003-061958
<151> 2003-03-07
<160> 10
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target DNA
<400> 1
ggaagaggag gagggtgctc aggaggagcg ggaggacact gtgt 44
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primary Probe
<400> 2
aacgaggcgc acccctcctc ctcttcc 27
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Secondary Probe
<400> 3
acacagtgtc ctcccgctcc tcctgagcac 30
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FRET Probe
<400> 4
tcttgtctcg gtttttccga gacaagagtg cgcctcgtt 39
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gctggaggga tgatactttg ca 22
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Molecular Beacon
<400> 6
ccaagcgcaa agtatcatcc ctccaggctt gg 32
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target DNA
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ccatggtgtc tgtttgaggt tgct 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ccatggtgtc tgtttcaggt tgct 24
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<220>
<223> Target DNA
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ccatggtgtc tgtttaaggt tgct 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target DNA
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ccatggtgtc tgttttaggt tgct 24
Claims (14)
- 발광 염료와 소광 물질을 함유하는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 프로브를 사용하는 인베이더(Invader) 방법에 의한 SNP 분석 방법에 있어서, FRET 프로브 중의 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 희토류 형광 착체 표식제가, 리간드로서 다음 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 리간드 중의 어느 하나를 포함하는 방법:화학식 1화학식 2화학식 3화학식 4화학식 5화학식 6상기식에서,n은 1 내지 4의 정수를 나타내고,R은 치환체 그룹을 갖는 알릴 그룹을 나타내고,R'는 아미노 그룹, 하이드록실 그룹, 카복실 그룹, 설포네이트 그룹 또는 이소티오시아네이트 그룹을 나타낸다.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 희토류 형광 착체 표식제 중의 희토류 원소가 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 또는 디스프로슘(Dy)인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, FRET 프로브 중의 소광 물질이 형광 소광제 표식제인 방법.
- 제4항에 있어서, 형광 소광제 표식제가 다음 화학식 7 내지 9로써 나타낸 물질인 방법:화학식 7화학식 8화학식 9상기식에서,m은 1 내지 4의 정수를 나타내고,R1또는 R2중의 어느 하나는 담체 또는 핵산 상에 고정화하기 위한 링커 그룹을 나타내고, 다른 하나는 수소 원자 또는 알킬 그룹을 나타내며,R3은 담체 또는 핵산 상에 고정화하기 위한 링커 그룹을 나타낸다.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 형광 발광을 시간 분해 형광 검정법(time-resolved fluorescence assay)에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 SNP 분석 방법.
- 리간드로서 다음 화학식 1 내지 6으로써 나타낸 1개 이상의 리간드를 함유하는 희토류 형광 착체 표식제 하나 이상으로 구성된 희토류 형광 착체 표식제와, 다음 화학식 7 내지 9로써 나타낸 물질 하나 이상으로 구성된 형광 소광제 표식제의조합물을 포함하는 형광 발광 제어용 조성물:화학식 1화학식 2화학식 3화학식 4화학식 5화학식 6화학식 7화학식 8화학식 9상기식에서,n은 1 내지 4의 정수를 나타내고,R은 치환체 그룹을 갖는 알릴 그룹을 나타내고,R'는 아미노 그룹, 하이드록실 그룹, 카복실 그룹, 설포네이트 그룹 또는 이소티오시아네이트 그룹을 나타내고,m은 1 내지 4의 정수를 나타내고,R1또는 R2중의 어느 하나는 담체 또는 핵산 상에 고정화하기 위한 링커 그룹을 나타내고, 다른 하나는 수소 원자 또는 알킬 그룹을 나타내며,R3은 담체 또는 핵산 상에 고정화하기 위한 링커 그룹을 나타낸다.
- 제7항에 있어서, 희토류 형광 착체 표식제 중의 희토류 원소가 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 또는 디스프로슘(Dy)인 형광 발광 제어용 조성물.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 발광 염료와 소광 물질을 함유하는 FRET 프로브를 사용하는 인베이더 방법에 의한 SNP 분석 방법에 있어서의 형광 발광 제어용 조성물이, FRET 프로브 중의 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 SNP 분석 방법에 사용하기 위한 형광 발광 제어용 조성물.
- 발광 염료와 소광 물질을 함유하는 SNP 분석용 고감도 표식 프로브에 있어서, 발광 염료로서 희토류 형광 착체 표식제를 사용하고, 소광 물질로서 형광 소광제 표식제를 사용하는 것을 특징으로 하는 고감도 표식 프로브.
- 제10항에 있어서, 희토류 형광 착체 표식제와 형광 소광제 표식제가 제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따라서 기재된 희토류 형광 착체 표식제와 형광 소광제 표식제의 조합물을 포함하는 고감도 표식 프로브.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, FRET 프로브인 고감도 표식 프로브.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 분자 비이콘(beacon) 프로브인 고감도 표식 프로브.
- 제10항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 고감도 표식 프로브를 포함하는 SNP 분석용 키트.
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Families Citing this family (12)
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-
2004
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101034741B1 (ko) * | 2010-12-01 | 2011-05-17 | 함성민 | 펑크 대비용 런플랫 타이어 |
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