KR101073989B1

KR101073989B1 - Ｆｒｅｔ 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법

Info

Publication number: KR101073989B1
Application number: KR1020090036575A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 하재석; 송재준
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2011-10-17
Also published as: EP2426500A4; US20120083048A1; WO2010126272A2; EP2426500B1; EP2426500A2; CN102449485B; JP2012525582A; JP5710595B2; KR20100117877A; US9921215B2; CN102449485A; WO2010126272A3

Abstract

본 발명은 FRET (fluorescence resonance energy transfer; 형광공명에너지전이) 현상을 적용한 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 바이오센서를 구성하는 리간드 결합단백질(ligand-binding protein)이 특정한 임계온도 이상에서 가역적 구조풀림(unfolding temperature)이 나타나고, 이 구조풀림의 수준이 리간드의 농도에 따라 달라지는 현상을 이용하여, 상기 임계온도를 유지시키는 조건에서 바이오센서의 FRET을 측정하여 시료 중의 리간드를 간단히 검출하는 방법이다. 본 발명에 따른 방법은 리간드 결합단백질과 형광물질을 이용하는 다양한 종류의 FRET 바이오센서에 폭넓게 적용시킬 수 있다.

바이오센서(biosensor), FRET(fluorescence resonance energy transfer; 형광공명에너지전이), 리간드 결합단백질(ligand-binding protein), 세포막간 결합 단백질(periplasmic-binding protein), 형광단백질 (fluorescent protein)

Description

ＦＲＥＴ 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법{Method for Detecting Ligands Using Biosensor Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer}

본 발명은 FRET 현상을 적용한 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 바이오센서를 구성하는 리간드결합단백질이 특정한 임계온도 이상에서 가역적 구조풀림(unfolding temperature)이 나타나고, 이 구조풀림의 수준이 리간드의 농도에 따라 달라지는 현상을 이용하여 종래 보다 우수한 효율로 리간드(특히 당)를 검출함과 아울러 그 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

2002년 Stanford 대학교의 Frommer는 말토오스 측정용 FRET 바이오센서를 최초로 개발하였다 (Fehr et al., PNAS ., 99: 9846-9851, 2002). 그 후 유사한 형태의 리보오스(Lager et al., FEBS Lett ., 553: 85, 2003), 글루코스 (Fehr et al., J. Biol . Chem., 278: 19127-19133, 2003), 수크로스 (Ha et al., Appl . Environ . Microbiol., 73: 7408, 2007) 측정용 센서 등이 지속적으로 개발되어 왔다.

하지만 초기에 개발된 상기 바이오센서들은 매우 낮은 수준의 검출능력을 보이는바, 보다 정확한 측정수단으로 사용하기 위해서는 감도가 높은 센서를 개발해야 할 필요성이 대두되었다 (Fehr et al. Current Opinion in Plant Biology , 7: 345, 2004). 이러한 노력의 일환으로 본 발명자들은 대한민국등록특허 10-0739529 (2007. 7. 29)와 미국등록특허 US 7432353(2008.10. 7)에서는 바이오센서를 구성하고 있는 단백질 도메인들 사이의 링커 펩티드를 최적화시키는 방법으로 말토오스 측정용 FRET 바이오센서의 검출능력을 증가시킬 수 있다고 제시하였다. 또한, RIKEN 연구소의 Miyawaki는 형광단백질을 순환치환 (circular permutation) 시키는 방법으로 칼슘 측정용 FRET 바이오센서인 "Cameleon"의 검출능력을 크게 증가시켰으며 (Nagai et al., PNAS ., 101: 10554, 2004), Frommer는 QBP (glutamine-binding protein)에 형광단백질을 삽입융합(in-frame fusion)하는 방법 등으로 FRET 바이오센서의 검출능력을 증가시켜 왔다 (Deuschle et al., Protein Sci ., 14: 2304, 2006). 그러나 유전자 조작에 의한 FRET 바이오센서의 개량 방법은 수많은 시행착오와 적지않은 시간이 요구되며, 이미 기술적인 한계점에 도달해 있다는 점에서 보다 효율적이고 손쉬운 개선 방식이 요구되고 있다.

한편, 온도 변화에 따른 단백질 구조의 가역적 변화와 안정성 유지를 관찰하는 연구는 단백질의 3차원 구조가 규명된 이래, 단백질의 접힘 (folding) 과정을 예측하기 위한 연구와 맞물려 많은 연구자들의 주된 관심사가 되었으며, 대장균 유래의 PBP (periplasmic binding protein)들은 이러한 단백질 구조의 열역학적 변화를 관찰하는 좋은 모델이 되어왔다. 온도에 따른 ARBP (arabinose-binding protein)의 구조변화를 DSC (differential scanning calorimeter)를 이용하여 관찰한 보고에 의하면, 아라비노오스가 없는 조건에서는 53.5℃에서 가역적인 구조풀림 (unfolding)이 발생하였으며, 1 mM의 아라비노오스가 존재하는 경우에는 59℃에서 구조풀림이 관찰되었다 (Fukuda et al., J. Biol . Chem., 258: 13193. 1983). 또한 GGBP (glucose/galactose-binding protein)의 경우에도 글루코스의 유무에 따라 온도에 따른 구조풀림 현상이 50℃에서 63℃로 증가한다는 보고가 있었으며 (Piszczek et al., Biochem . J., 381: 97, 2004), MBP의 경우에도 말토오스가 존재하는 경우에는 pH에 따라 구조풀림이 발생하는 온도를 8~15℃까지 증가시킨다는 보고가 있었다 (Novokhatny et al., Protein Sci ., 6: 141, 1997).

이에 본 발명자들은 종래 FRET 바이오센서의 리간드 농도 측정능 및 검출능을 향상시키고자 예의 노력한 결과, 가역적 구조풀림(unfolding) 현상이 나타나는 특정 임계온도에서 융합단백질로 구성된 바이오센서와 리간드를 접촉시키는 경우, 리간드를 검출하고 농도를 측정하는 능력이 획기적으로 개선됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 종래 FRET 바이오센서의 리간드 검출능 및 농도 측정능이 개선된 새로운 리간드의 검출 및 농도 측정방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형광공여체(fluorescence donor) 및 형광수여체(fluorescence acceptor)를 포함하는 신호발생부(signaling domain)와 상기 형광공여체 및 형광수여체를 연결하는 리간드 결합단백질을 포함하는 감지부(sensing domain)를 포함하는 FRET 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법에 있어서, 가역적 구조풀림(unfolding) 현상이 나타나며 리간드결합에 따른 FRET 비율(ratio)의 변화가 가장 큰 온도구간인 임계온도에서 리간드를 함유하는 시료와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 리간드의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 형광공여체 및 형광수여체를 포함하는 신호발생부와 상기 형광공여체 및 형광수여체를 연결하는 리간드 결합단백질을 포함하는 감지부를 포함하는 FRET 바이오센서를 이용한 리간드 농도의 측정방법을 제공한다:

(a) 가역적 구조풀림(unfolding) 나타나며 리간드가 상기 리간드 결합단백질에 결합함에 따른 FRET 비율의 변화가 가장 큰 온도구간인 임계온도에서, 상기 FRET 바이오센서를 리간드를 함유하는 시료와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 형광공여체와 형광수여체의 발광량 비율의 변화를 측정하여 리간드의 농도를 측정하는 단계.

본 발명은 종래 FRET 바이오센서의 리간드 검출능 및 농도 측정능을 향상시키는 새로운 리간드 농도 측정 및 검출방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 방법은, 바이오센서를 구성하고 있는 리간드 결합단백질이 특정한 임계온도 이상에서 가역적 구조풀림이 나타나고, 이 구조풀림의 수준이 리간드 농도에 따라 달라지는 현상에 기반하는 기술로서, 상기 임계 온도를 유지시키는 간편한 방법으로 FRET 바이오센서의 검출능력을 획기적으로 증가시킬 수 있고, 리간드 결합 단백질과 형광단백질을 이용한 모든 종류의 FRET 바이오센서에 폭넓게 적용시킬 수 있어 활용범위가 광범위하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 "FRET"이란 서로 다른 발광 파장대의 두 형광물질 사이에서 발생하 는 비방사성 (non-radiative) 에너지 전이현상으로, 여기(excitation)된 상태의 형광공여체의 여기 준위 에너지가 형광수용체로 전달되어 형광수용체로부터 발광 (emission)이 관찰되거나, 형광공여체의 형광감소(quenching)가 관찰되는 현상이다(Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy , 2 nd ed., New York:Plenum Press, 1999).

본원에서 "형광공여체"란 FRET 현상에서 공여체로 작용하는 형광물질을 의미하고, "형광수여체"란 FRET 현상에서 수여체로 작용하는 형광물질을 의미한다.

본원에서 "리간드 결합단백질(ligand-binding protein)"이란 리간드의 결합에 의하여 구조적 변화 (conformational change)를 일으키는 단백질들의 집합체를 의미하며, 대장균 유래의 세포막간 결합단백질 (periplasmic binding protein, PBP)을 포함한다 (de Wolf et al ., Pharmacol Rev ., 52:207, 2000).

본원에서 "리간드"란 리간드 결합단백질에 결합하여 구조적인 변화를 일으키는 분자로, 당, 아미노산, 단백질, 지질, 유기산, 금속 또는 금속이온, 산화물, 수산화물 또는 그 컨쥬게이트(conjugates), 무기 이온, 아민 또는 폴리아민 및 비타민 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 "시료"란, 관심있는 리간드를 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 세포, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 수집된 것임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 동식물은 인체를 포함한다.

본원에서 "임계온도"란, FRET 바이오센서의 리간드 결합단백질의 구조풀 림(unfolding)이 리간드의 존재 유·무에 의해 조절되어 FRET 바이오센서의 검출능 및 측정능이 향상되는 온도구간, 즉 리간드 결합단백질에 리간드의 결합 유무에 따른 FRET 비율(ratio)의 변화가 가장 큰 온도구간을 말한다. 본 발명의 실시예 3 및 4에서 확인되듯이 PBP로 구성된 FRET 바이오센서의 경우 49~54℃의 온도구간이 검출능 및 측정능이 향상되는 "임계온도"라 하겠다.

본 발명은 일 관점에서, 형광공여체 및 형광수여체를 포함하는 신호발생부와 상기 형광공여체 및 형광수여체를 연결하는 리간드 결합단백질을 포함하는 감지부를 포함하는 FRET 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법에 있어서, 가역적 구조풀림(unfolding)이 나타나며 리간드가 상기 리간드 결합단백질에 결합함에 따른 FRET 비율(ratio)의 변화가 가장 큰 온도구간인 임계온도에서 리간드를 함유하는 시료와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 리간드의 검출방법에 관한 것이다.

시료 중의 리간드의 검출은, 형광공여체 및 형광수여체의 발광량을 형광분석장비 등으로 측정함으로써 수행되며, 형광분석장비로는 필터방식 및 모노크롬 방식의 형광분광기 등을 이용할 수 있다. 이때, 시료 중 리간드가 존재하는 경우 상기 형광공여체와 형광수여체의 발광량 변화가 감지되는바, 이로써 리간드를 검출할 수 있게 된다.

본 발명은 다른 관점에서, 다음의 단계를 포함하는, 형광공여체 및 형광수여체를 포함하는 신호발생부와 상기 형광공여체 및 형광수여체를 연결하는 리간드 결합단백질을 포함하는 감지부를 포함하는 FRET 바이오센서를 이용한 리간드 농도의 측정방법에 관한 것이다:

(a) 가역적 구조풀림(unfolding)이 나타나며 리간드가 상기 리간드 결합단백질에 결합함에 따른 FRET 비율(ratio)의 변화가 가장 큰 온도구간인 임계온도에서, 상기 FRET 바이오센서를 리간드를 함유하는 시료와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 형광 공여체와 형광 수여체의 발광량 비율의 변화를 측정하여 리간드의 농도를 측정하는 단계.

상기 형광공여체 및 형광수여체의 발광량은 형광분석장비 등으로 측정되며, 리간드의 농도 변화가 발생하는 경우, 상기 두 형광공여체와 형광수여체의 발광량에 변화가 발생하는바, 이에 본 발명은 리간드의 농도 변화 측정을 위해 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서, FRET 바이오센서를 구성하는 융합단백질은 신호발생부로 형광공여체 및 형광수여체를 포함하고, 감지부로 리간드 결합단백질을 포함하는 형태로서, 상기 형광공여체와 형광수여체는 리간드 결합단백질의 양 말단에 결합될 수 있다. 이때, 형광공여체 또는 형광수여체는 하나 이상의 링커를 이용하여 상기 리간드 결합단백질에 연결될 수 있다.

상기 리간드 결합단백질은 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 사용된 MBP(maltose-binding protein), ALBP(allose-binding protein), ARBP(arabinose-binding protein) 및 GGBP(galactose/glucose-binding protein) 등 대장균 유래의 PBP인 것을 특징으로 할 수 있으나, 리간드의 결합에 의하여 구조적 변화(conformational change)를 일으키는 리간드 결합단백질이라면 이에 한정되지 않고 본 발명에 따른 방법 및 센서로 제공될 수 있음은 자명하다.

아울러, 상기 바이오센서의 신호발생부로 사용되는 형광공여체 및 형광수여체의 구성은, 형광공여체의 발광스펙트럼과 형광수여체의 흡광스펙트럼이 서로 중첩되어 FRET 또는 형광감소를 유발할 수 있는 것이라면 어느 것이든 무방하며, 이에 상기 형광공여체로서 다양한 파장의 형광단백질(fluorescent protein)들과 형광 안료(fluorescent dye), 생체발광 단백질(bioluminescent protein) 및 양자점(quantum dot) 등을 이용할 수 있으며, 상기 형광수여체로 상기 형광공여체와 파장이 상이한 형광단백질, 형광 안료 및 양자점 등을 사용할 수 있다. 또는 형광수여체로서 상기 형광공여체의 형광세기를 감소시키는 소광체(quencher)들과 금나노입자(Au-nano particle) 등을 사용할 수 있다. 다만, 이 중에서도 FRET 바이오센서를 구성하는 경우 형광공여체와 형광수여체의 흡광계수(extinction coefficient)와 양자효율(quantum efficiency), 광안정성(photostability)과 이용의 편의성 등을 고려하여 형광 단백질들인 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein)와 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein)를 사용함이 바람직하다.

본 발명에 따른 리간드의 검출 및 농도 측정방법은 형광의 광학적 특성인 "FRET"를 이용하며, 그 원리는 도 1에 나타나 있다. FRET은 일반적으로 형광공여체로부터 방출되는 파장이 형광수용체의 흡광스펙트럼과 겹치며, 광자(photon)의 출현 없이 발생하기 때문에 공명에너지전이라 하고, 이는 형광공여체와 형광수용체 사이의 장거리 쌍극자 상호작용에 의한 결과이다. FRET의 에너지전이 효율은 형광공여체의 발광스펙트럼과 형광수용체의 흡광스펙트럼이 겹치는 범위와 형광공여체의 양자효율, 형광공여체와 형광수용체의 전이쌍극자들 (transition dipoles)의 상 대적 방향(relative orientation), 그리고 형광공여체와 형광수용체 사이의 거리에 따라 달라진다. 따라서 FRET의 에너지전이 효율은 형광공여체와 형광수용체의 거리와 상대적 방향에 따라 다르게 나타나는데, Forster의 수식에 따르면 다음과 같이 표현된다.

E=R₀ ⁶/(R⁶ +R₀ ⁶) [수식 1]

상기의 수식에서 E는 FRET 효율을 나타내며, R은 형광공여체와 형광수용체 사이의 거리로서 형광 물질에 따라 차이는 있지만 통상 2-9 nm 이내로 정의된다. 또한 R₀는 FRET 효율이 50%가 되는 형광공여체와 형광수용체 사이의 거리를 말하며, 일반적으로 Forster distance 또는 Forster radius로 불려진다. R₀는 다음의 수식으로 표현된다.

R₀=0.211[k ² n ^-4 Q _D J(λ)]^1/6 (in Å) [수식 2]

상기의 수식에서 k ²는 방향계수 (orientation factor)로 통상 2/3로 계산하며, 형광공여체 발광과 형광수용체 흡광의 상대적 방향에 따라 0~4 범위의 값을 갖는다. n은 매질의 굴절율로 통상 25℃의 물은 ~1.334이며, Q _D 는 형광공여체의 양자효율이다. J(λ)는 형광공여체의 발광과 형광수용체의 흡광스펙트럼상의 겹침(overlap) 정도로 M^-1cm^-1nm⁴의 단위 값을 갖는다 (Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy , 2 nd ed., New York:Plenum Press, 1999; Patterson et al., Anal . Biochem . 284: 438, 2000; Patterson et al., J. of Cell Sci . 114: 837, 2001).

이에 상기에서 설명한 FRET의 원리를 이용하여 본 발명자들은 대한민국 등록특허 10-0739529호(2007. 7. 29)와 미국등록특허 US 7432353호(2008. 10. 7)에서 FRET의 형광공여체와 형광수용체로 작용하는 형광단백질들인 ECFP (enhanced cyan fluorescent protein)와 EYFP (enhanced cyan fluorescent protein)를 리간드 결합단백질인 PBP의 양 말단에 융합시켜 FRET 바이오센서를 구성하였고, 이를 이용하여 각 센서에 결합 가능한 리간드인 알로오스와 아라비노오스, 리보오스, 말토오스를 정량적으로 검출할 수 있음을 보인 바 있다.

상기 FRET 바이오센서는 ECFP-PBP-EYFP가 하나의 폴리펩티드로 구성되어 거대한 융합단백질로 발현되는바, PBP들의 대략적인 크기가 3×4×6.5 nm (Spurlino et al., J. Biol. Chem., 266: 5202, 1991)인 것을 고려할 때 ECFP와 EYFP 사이의 거리가 대략 5~6 nm정도에 위치하게 되므로 FRET의 발생이 가능한 거리가 된다. 따라서, 436 nm로 ECFP를 여기 시키면 ECFP의 여기 준위 에너지가 EYFP로 전달되어 ECFP와 EYFP의 발광을 동시에 관찰할 수 있다 (도 1참조). 상기 FRET 바이오센서의 리간드 결합부위에 당이 결합하게 되면 PBP의 양 말단에 융합된 ECFP와 EYFP의 거리와 상대적 방향이 변하게 되고, 결과적으로 FRET 효율의 차이가 발생하기 때문에 두 형광단백질들의 발광량 비율이 달라지게 된다. 따라서 두 형광단백질의 발광량 변화를 측정하는 원리로 리간드의 감지가 가능한데, 발광량 비율의 변화는 당 농도에 비례하므로 정량적인 당 농도의 측정이 가능하다.

뿐만 아니라, 상기의 [수학식 2]의 계산에 따르면 ECFP와 EYFP는 대략 5 nm정도의 R₀값을 가지므로 (Patterson et al., Anal . Biochem ., 284: 438, 2000) ECFP와 EYFP 사이의 거리가 대략 5-6 nm정도라고 가정한다면, 거리 또는 상대적 방향의 작은 변화가 FRET 효율에는 큰 차이를 만들어 낼 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 리간드와 결합 이전과 결합에 의한 FRET 효율의 차이를 극대화할 수 있다면 바이오센서의 검출능력이 크게 향상될 것으로 예상하였다. 이에 본 발명에서는 검출능력을 극대화하기 위하여 연구한 결과, 대장균 유래의 PBP들이 온도 상승에 따른 가역적인 구조풀림 현상을 보이며, 이러한 현상은 리간드가 존재하게 되면 보다높은 온도에서 구조풀림 현상이 관찰된다는 연구결과에 착안하여 종래 FRET 원리를 이용한 방법에 비하여 리간드 검출능력이 증가된 리간드의 검출 및 농도 측정방법을 제공하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 온도 변화에 따른 FRET 바이오센서들의 형광분석을 통하여 45~65℃의 온도 범위에서 리간드 유무에 따른 바이오센서의 형광 비율이 크게 달라지는 것을 확인하였는바, 보다 자세하게는 49℃~54℃의 온도범위에서 센서의 검출 능력인 △ratio값이 증가하는 것을 확인하여 “임계온도” 구간이 존재함을 확인 하였다(도 2 ~ 도 5). 아울러, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면, 본 발명의 임계온도가 결합단백질의 종류에 따른 안정성 수준 및 반응액의 조성에 따라 다양한 범위로 변화될 수 있음을 이해할 것이다. 즉, 저온성 또는 호열성 미생물 유래의 리간드 결합단백질 또는 이의 기질특이성을 개량한 결합단백질을 이용한 바이오센서는 본 발명의 임계온도 범위(49℃~54℃)보다 높거나 낮은 온도범위에서 보다 향상된 검출 능력을 보유할 수도 있다. 특히 단백질의 구조적 견고성(rigidity)에 영향을 미치는 물질 즉 산(acid), 염기(base), 환원제(reducing agent), 변성제(denaturant, chaotropic agent), 안정제(stabilizer), 계면활성제(surfactant), 유화제(emulsifier), 또는 불활성화제(detergent)의 유무에 따라서 임계온도 범위를 조절하는 것이 가능함은 본 발명에서 기대하는 통상의 지식범위에 속한다.

본 발명의 다른 실시예에서는, FRET 바이오센서들의 검출능력이 25℃에서 측정한 경우보다 임계온도를 유지한 상태에서는 최소 2.5배에서 최대 12배 정도 증가하는 것을 확인하였으며(도 6 ~ 도 9), 각 센서들의 기질에 대한 특이성 또한, 미국등록특허 US 7432353호에서 제시한 결과보다 향상되는 것을 확인할 수 있었다 (도 12, 도 13).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. FRET 바이오센서의 제조

1-1: FRET 바이오센서를 위한 융합단백질 제조를 위한 발현 벡터의 구축

먼저 다음 구조식 Ⅰ로 표시되는 단백질을 함유하는 바이오센서를 제공하기 위하여 다음과 같이 발현 벡터를 구축하였다:

[구조식 Ⅰ]

여기서, 리간드결합단백질인 PBP는 ALBP, ARBP, MBP 및 GGBP로 구성된 군에서 선택되고; L₁ 및 L₂는 각각 FP₁의 C-말단과 PBP의 N-말단 사이, PBP의 C-말단과 FP₂의 N-말단 사이를 연결하는 2개의 아미노산으로 구성된 링커 펩티드이며; FP₁과 FP₂는 FRET의 형광공여체와 형광수여체로 각각 ECFP와 EYFP로 구성된다.

본 발명에서 사용된 알로오스와 아라비노오스, 말토오스를 정량적으로 측정할 수 있는 FRET 바이오센서들은 본 발명 출원인들에 의해 선 출원된 한국등록특허 10-0739529호 및 미국등록특허 US 7432353호에서 제시된 센서들과 동일하며, 상세하게는 다음의 방법에 의하여 구축하였다.

먼저 말토오스를 정량적으로 측정하기 위한 말토오스 바이오센서인 CMY-BII의 발현벡터는 다음의 방법에 의하여 구축하였다.

서열번호 1: 5'-gatcggatccatggtgagcaagggcgag-3'

서열번호 2: 5'-gatcaagcttgtacagctcgtccatgc-3'

서열번호 3: 5'-gatcatatggtgagcaagggcgag-3'

서열번호 4: 5'-tttaccttcttcgattttcattcgcgacttgtacagctcgtccatgcc-3'

서열번호 5: 5'-atgaaaatcgaagaaggtaaac-3'

서열번호 6 : 5'-gatcggatcccgagctcgaattagtctg-3'

우선 EYFP의 유전자는 pEYFP-N1 벡터(Clontech, Palo Alto, CA)를 주형으로 하고 각각 BamHI과 HindIII 절단 염기서열이 도입된 서열번호 1 과 2 의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 EYFP 유전자는 BamHI과 HindIII 제한효소로 절단한 후 발현벡터인 pET-21a((Novagen, Madison, WI)의 제한효소 인지부위에 삽입하여 EYFP의 C 말단에 6×His-tag이 발현될 수 있는 벡터인 pEYFP-III를 구성하였다. ECFP 유전자는 pECFP 벡터(Clontech, Palo Alto, CA)를 주형으로 하고 NdeI의 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 3과, MBP의 N말단 염기서열이 중첩되게 제작한 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 마찬가지로 MBP의 유전자는 pMALc2x(NEB, Beverly, MA, USA)를 주형으로 하고 서열번호 5와, BamHI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 6의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 증폭된 각각의 ECFP와 MBP의 유전자는 서로 중첩되게 제작된 프라이머에 의해 중복신장 중합효소 연쇄반응(overlap-extension PCR)이 가능하기 때문에 서열번호 3과 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 반응액에 동일한 양의 ECFP와 MBP 유전자를 첨가한 후 PCR을 수행하여 ECFP-MBP 형태의 합성유전자를 얻을 수 있었다. 상기 증폭된 합성유전자는 NdeI과 BamHI 제한효소로 절단하였고, MBP-EYFP의 발현벡터인 pEYFP-III의 제한효소 인지부위에 부위에 클로닝하는 방법 으로 발현벡터인 pECMY-BII 벡터를 구축하였으며, 상기와 같은 방법으로 구성된 말토오스 측정용 FRET 바이오센서를 CMY-BII라 명명하였다.

또한, 알로오스 측정용 바이오센서인 CalsBY-QV의 발현벡터를 구축하기 위한 ECFP 유전자의 증폭은 염기서열 3 및 7의 프라이머를 사용하였으며, ALBP 유전자는 대장균 MG1655에서 추출한 염색체 유전자(chromosomal DNA)를 주형으로 하여 서열번호 8과 9의 프라이머를 사용하여 증폭하였다.

서열번호 7: 5'-gacagcatattcggcggccattacttgcttgtacagctcgtccatgc-3'

서열번호 8: 5'-atggccgccgaatatgctgt-3'

서열번호 9: 5'-cgcggatcccgattgagtgaccaggatt-3'

증폭된 ECFP 및 ALBP의 유전자는 서열번호 3과 9의 프라이머를 이용하여 ECFP-ALBP의 합성유전자로 증폭하였다. 상기의 ECFP-ALBP 유전자는 NdeI, BamHI 제한효소 인지부위를 이용하여 pECMY-BII 발현벡터로 부터 ECFP-MBP 유전자를 제거하고 삽입하는 방법으로 알로오스 측정용 바이오센서의 발현을 위한 pECalsBY-QV벡터를 구축하였다.

마찬가지로, 아라비노오스 측정용 바이오센서인 CaraFY-PR의 발현벡터를 구축하기 위한 ECFP 유전자의 증폭은 염기서열 3과 10의 프라이머를 사용하였으며, ARBP의 유전자는 대장균 MG1655에서 추출한 염색체 유전자를 주형으로 하여 서열번호 11와 12의 프라이머를 사용하여 증폭하였다.

서열번호 10: 5'-ccgagcttcaggttctccatcctaggcttgtacagctcgtccatgc-3'

서열번호 11: 5'-atggagaacctgaagctcg-3'

서열번호 12: 5'-cgcggatcccgacttaccgcctaaacctt-3'

증폭된 ECFP와 ARBP의 유전자는 서열번호 3과 12의 프라이머를 이용하여 ECFP-ARBP의 합성유전자로 증폭하였고, pECMY-BII 발현벡터의 ECFP-MBP 유전자 위치에 삽입하는 방법으로 pECaraFY-PR를 구축하였다.

또한 본 발명에서 사용된 글루코스 측정용 바이오센서인 CmglBY-SS의 발현벡터는 아래의 방법으로 구축하였다.

서열번호 13: 5'-caccaatgcgagtatcagccatcgaagacttgtacagctcgtccatgcc-3'

서열번호 14: 5'-atggctgatactcgcattggtg-3'

서열번호 15: 5'-cgcggatcccgatttcttgctgaattcagc-3'

우선 ECFP 유전자는 pECFP벡터를 주형으로 하고 서열번호 3과, GGBP의 N말단 염기서열이 중첩되게 제작한 서열번호 13의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 마찬가지로 GGBP의 유전자는 대장균 MG1655에서 추출한 염색체 유전자를 주형으로 하고 서열번호 14와, BamHI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 15의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기에서 증폭한 ECFP와 GGBP 유전자를 반응액에 함께 첨가한 후, 서열번호 3과 서열번호 15의 프라이머로 PCR을 수행하여 ECFP-GGBP의 합성유전자를 얻을 수 있었다. 상기 증폭된 ECFP-GGBP 합성유전자는 NdeI과 BamHI 제한효소로 절단하였고, 상기 pECMYB-II의 NdeI과 BamHI 제한효소 인지부위를 이용하여 ECFP-MBP유전자를 제거하고 삽입하는 방법으로 pECmglBY-SS 벡터를 구축하였으며, 상기와 같은 방법으로 구성된 글루코스 측정용 FRET 바이오센서를 CmglBY-SS라 명명하였다.

1-2: FRET 바이오센서의 제조, 순수분리

실시예 1-1에서 구축한 pECalsBY-QV, pECaraFY-PR, pECMY-BII 및 pECmglBY-SS가 각각 JM109(DE3)에 형질 전환된 대장균들을 50 μg/ml의 ampicillin이 첨가된 LB 배지　(1% bacto-trypton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 진탕 배양하였다.

상기에서 배양시킨 대장균들은 50 μg/ml의 ampicillin이 첨가된 1 L의 LB 배지에 1%되게 접종하여 37℃에서 약 2 시간 정도 배양시켰으며, O.D. 600 nm에서의 흡광도가 0.5에 도달한 시점에 IPTG (isopropyl β-d-thiogalactopyranoside)를 0.5 mM 되게 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 단백질들의 발현을 유도하였다.

배양을 마친 균주들은 6000 rpm의 속도로 원심분리기 (Supra22K, Hanil, Korea)를 이용하여 회수하였고, 20 mM 인산염 완충액 (pH 7.5)에 현탁시켜 초음파 분쇄기로 세포막을 파괴시켰다. 용해된 균주들은 다시 고속 원심분리기로 15000 rpm에서 침전물을 제거하였고, 상층액만을 0.2 μm filter로 여과하여 이후의 정제과정에 사용하였다.

단백질의 정제는 FRET 바이오센서들의 C-말단에 발현된 6×His-tag을 이용하여 FPLC (fast-performance liquid chromatography)에 연결된 친화성 크로마토그래피 컬럼 HisTrap^TM HP (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 이용하여 1차로 수행 하였고, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 HiTrap^TM Q HP (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 이용하여 2차 정제를 하였다. 정제를 마친 FRET 센서들은 20% 글리세롤이 포함된 PBS 완충액 (pH 7.4)에 10 mg/ml의 농도로 농축하여 -70℃에서 보관하면서 하기의 실시예에서 사용하였다.

실시예 2. FRET 바이오센서의 형광 분석방법

FRET 바이오센서의 형광은 각 센서 단백질들을 0.5 ml의 PBS 완충액 (pH 7.4)에 0.5 μM의 농도로 동일하게 조절한 조건에서 형광분석장비인 Cary Eclipse (Varian Inc., Mulgrave, Australia)를 사용하여 측정하였으며, 436 nm로 여기 시켜 발생되는 발광 스펙트럼을 450 nm에서 600 nm까지 스캔하여 확인하였다. 또한 FRET 효율을 나타내는 지표로는 480 nm에서의 ECFP 발광과 FRET에 의해 발생되는 EYFP의 530 nm에서의 발광량 (emission intensity)의 비율을 아래의 수식 3에 대입한 값인 FRET ratio로 정의했다.

ratio = ( 530nm / 480nm ) [수식 3]

ratio : EYFP와 ECFP의 발광량 비율.

530 nm : FRET에 의해 측정되어 지는 EYFP의 발광량.

480 nm : 여기광을 436 nm로 하였을 때 측정되는 ECFP의 발광량.

또한 FRET 바이오센서의 검출능력을 정의하는 △ratio는 아래의 수식 4에 따라 결정하였다.

△ratio = ratio_max - ratio_min [수식 4]

△ratio : 리간드의 유무에 따른 ratio의 최대 차이.

ratio_max : 리간드가 존재하는 조건에서 측정되는 ratio의 비율.

ratio_min : 리간드가 없는 조건에서 측정되는 ratio의 비율.

FRET 바이오센서들의 리간드에 대한 적정곡선은 리간드의 농도를 1 nM~10 mM까지 증가시키면서 측정한 ratio 변화를 Sigmaplot 10.0 (Systat software Inc., USA)의 Hill equation, 4-parameter 방식을 적용하여 S자 형태의 곡선 (Sigmoidal curve)으로 표현하였으며, 각 센서들에 대한 리간드의 해리상수 (dissociation constant)인 K _d는 S자 형태의 곡선에서 △ratio가 1/2 값을 나타내는 리간드의 농도로 정하였다. 또한 각 센서들을 이용하여 정량적으로 측정 가능한 리간드의 농도범위는 △ratio값이 10%에서 90% 포화된 범위 이내의 리간드 농도로 정의하였다.

실시예 3. FRET 바이오센서의 온도 변화에 따른 형광분석

온도 변화에 따른 FRET 바이오센서들의 형광분석은 각 센서들을 0.5 ml의 PBS 완충액 (pH 7.4)에 0.5 μM의 농도로 조절하여 리간드가 없는 조건과 포화농도인 1 mM의 리간드가 첨가된 조건에서의 FRET ratio를 측정하여 비교 분석하였다. FRET 바이오센서 0.5 ml에 첨가하는 리간드의 부피는 센서의 과도한 희석을 방지하기 위하여 전체부피의 1/100에 해당하는 5 μl로 제한하였다. 온도 변화는 10~65℃ 구간까지 5℃ 간격으로 측정하였으며, ratio의 변화가 심한 구간인 45~60℃ 사이에서는 1℃ 간격으로 온도를 변화시키며 측정하였다. 모든 실험군은 수분 증발을 방 지하기 위해 마개가 닫힌 형광 큐벳 (cuvette)에 들어있는 상태로 실험을 수행하였으며, 큐벳은 온도조절 장치가 연결된 펠티어 소자 (peltier device)에 위치시킨 상태에서 측정 온도에 도달하고 나서 3분이 경과한 후에 형광을 측정하였다.

그 결과, 도 2 내지 5에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1-2에서 정제한 FRET 바이오센서들의 리간드 유무에 따른 FRET ratio의 변화가 가장 큰 임계온도는, 말토오스 센서는 54℃ (도 2)로 글루코스 센서는 50℃ (도 3), 알로오스와 아라비노오스 센서는 49℃ (도 4, 도 5)로 약간의 차이가 있었으며, 임계온도 ±１℃에서는 FRET ratio의 변화가 크지 않아 안정된 결과를 보이는 것으로 확인되었다.

또한 상기 임계온도에서의 리간드에 대한 각 FRET 바이오센서들의 적정곡선을 분석한 결과, 도 6 내지 9에 나타난 바와 같이, 말토오스 센서는 1.22 (도 6)로, 글루코스는 센서는 1.6 (도 7), 알로오스 센서는 -0.62 (도 8), 아라비노오스 센서는 0.72 (도 9)의 △ratio값을 보이는 것으로 확인되었다.

상기에서 측정된 각 FRET 바이오센서들의 △ratio값을 기존에 25℃에서 측정한 수치와 비교하게 되면, 말토오스 센서는 7배 (도 6), 글루코스는 센서는 12배 (도 7), 알로오스 센서는 3배 (도 8), 아라비노오스 센서는 2.5배 (도 9) 이상 △ratio값이 증가된 수치이며, 이 결과는 특정 임계온도를 유지한 상태에서 다양한 종류의 FRET 바이오센서의 검출능력이 크게 개선될 수 있다는 본 출원인들의 주장을 직접적으로 확인시켜 주는 결과이다.

상기의 결과들은 아래의 표 1과 같이 정리할 수 있다.

[표 1] FRET 바이오센서의 특성 분석 결과

	임계온도 (℃)	△ratio	K _d (μM)	측정 농도 범위 (μM)
CalsBY-QV (알로오스 센서)	49	-0.62	8.4 ± 0.5	1 ~ 65
CaraFY-PR (아라비노오스 센서)	49	0.72	67.0 ± 4	9 ~ 500
CmglBY-SS (글루코스 센서)	50	1.6	9.2 ± 0.5	2 ~ 60
CMY-BII (말토오스 센서)	54	1.22	25.6 ± 2	3 ~ 200

한편, 각 FRET 바이오센서로 측정 가능한 리간드의 농도범위는 생리적 (physiological)으로 유의미한 농도범위로 확인되었는바, 예를 들면 혈당 농도를 측정하는데 중요한 혈액의 글루코스의 농도는 70 ~ 200 mg/dl로, 이는 대략 400 ~ 1100 μM에 해당한다. 따라서 글루코스 센서를 이용하여 혈당 농도를 측정하는 경우에는 혈액을 센서 부피의 1/100되게 첨가하기 때문에 4 ~ 11 μM의 농도 범위에 해당하게 되며, 상기의 농도범위는 글루코스 센서의 K _d 값이 9.2 ± 0.5 μM이기 때문에 가장 정확하게 측정할 수 있는 농도 구간이 된다.

실시예 4. FRET 바이오센서의 리간드에 대한 특이성 분석

FRET 바이오센서들의 다양한 리간드에 대한 특이성 분석은 19 종의 단당류와 다당류, 및 당알콜 등 다양한 종류의 당류들을 대상으로 측정하였다.

측정 방법은 정제된 FRET 바이오센서들을 0.5 ml의 PBS 완충액 (pH 7.4)에 0.5 μM의 농도로 조절하여 각 리간드의 농도를 100 μM과 1 mM, 10 mM 등이 되도록 첨가하고, 큐벳을 감싼 펠티어 소자가 상기 실시예 3에서 구한 각 임계온도에 도달한 시점에서 3분이 경과한 후에 형광을 측정하였다.

그 결과, 도 10 및 12에 나타난 바와 같이, 말토오스와 알로오스 측정용 FRET 바이오센서는 다른 종류의 당들과는 특이적인 결합을 하지 않는 것으로 확인되었다. 또한 25℃에서 측정한, 본 발명 출원인들에 의해 선 출원된 미국등록특허 US 7432353호의 결과와 비교해 보면 알로오스 FRET 바이오센서는 고농도의 리보오스에 대한 특이성이 감소됨을 확인할 수 있었다.

한편 아라비노오스와 글루코스 FRET 센서는 기존의 연구 결과들과 마찬가지로 갈락토스에 매우 친화력이 높은 것으로 확인 되었고 (Vyas et al., J. Biol. Chem. 266, 5226-5237, 1991; Fehr et al., J. Biol . Chem. 278, 19127-19133, 2003), 특히 글루코스 센서의 경우에는 갈락토스 이외에도 고농도로 존재하는 다수의 당류들과 낮은 수준의 친화력이 있는 것으로 확인되었다 (도 11). 하지만 혈액에 존재하는 당류들은 글루코스를 제외하고는 미량으로 존재하기 때문에 글루코스 센서를 혈당 측정용으로 사용하더라도 여타 당류들에 의한 오차가 크지 않을 것으로 판단되며, 최근의 연구에 의하면 갈락토스에 대한 친화력이 크게 감소된 GGBP가 보고된 바 있기 때문에 (Sakaguchi-Mikami et al., Biotechnol. Lett. 30: 1453-1460, 2008), 글루코스 측정용 FRET 바이오센서의 특이성을 개선할 수 있는 여지도 충분히 있다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 상온 (25℃)과 임계온도에서 리간드의 유무에 따른 FRET 바이오센서의 구조 변화와 FRET 효율의 변화, 그로 인한 형광단백질들의 발광량 차이를 나타낸 모식도이다.

도 2는 온도에 의한 말토오스 FRET 바이오센서의 ratio 값과 Δratio의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 온도에 의한 글루코스 FRET 바이오센서의 ratio 값과 Δratio의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 온도에 의한 알로오스 FRET 바이오센서의 ratio 값과 Δratio의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 온도에 의한 아라비노오스 FRET 바이오센서의 ratio 값과 Δratio의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 25℃와 Δratio 값이 가장 큰 임계온도인 54℃에서 리간드의 농도별로 측정한 말토오스 FRET 바이오센서의 적정곡선이고, 상단부의 스펙트럼은 25℃와 54℃에서 각각 측정한 말토오스 FRET 바이오센서의 형광 스펙트럼이다.

도 7은 25℃와 Δratio 값이 가장 큰 임계온도인 50℃에서 리간드의 농도별로 측정한 글루코스 FRET 바이오센서의 적정곡선이고, 상단부의 스펙트럼은 25℃와 50℃에서 각각 측정한 글루코스 FRET 바이오센서의 형광 스펙트럼이다.

도 8은 25℃와 Δratio 값이 가장 큰 임계온도인 49℃에서 리간드의 농도별로 측정한 알로오스 FRET 바이오센서의 적정곡선이고, 상단부의 스펙트럼은 25℃와 49℃에서 각각 측정한 알로오스 FRET 바이오센서의 형광 스펙트럼이다.

도 9는 25℃와 Δratio 값이 가장 큰 임계온도인 49℃에서 리간드의 농도별로 측정한 아라비노오스 FRET 바이오센서의 적정곡선이다. 삽입 그림은 25℃와 49℃에서 각각 측정한 아라비노오스 FRET 바이오센서의 형광 스펙트럼이다.

도 10은 다양한 종류의 당류들을 대상으로 말토오스 FRET 바이오센서의 특이성을 조사한 그래프이다.

도 11은 다양한 종류의 당류들을 대상으로 글루코스 FRET 바이오센서의 특이성을 조사한 그래프이다.

도 12는 다양한 종류의 당류들을 대상으로 알로오스 FRET 바이오센서의 특이성을 조사한 그래프이다.

도 13은 다양한 종류의 당류들을 대상으로 아라비노오스 FRET 바이오센서의 특이성을 조사한 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Detecting Ligands Using Biosensor Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer <130> P08-B0219 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gatcggatcc atggtgagca agggcgag 28 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gatcaagctt gtacagctcg tccatgc 27 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 gatcatatgg tgagcaaggg cgag 24 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 tttaccttct tcgattttca ttcgcgactt gtacagctcg tccatgcc 48 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 atgaaaatcg aagaaggtaa ac 22 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 gatcggatcc cgagctcgaa ttagtctg 28 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 7 gacagcatat tcggcggcca ttacttgctt gtacagctcg tccatgc 47 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 8 atggccgccg aatatgctgt 20 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 9 cgcggatccc gattgagtga ccaggatt 28 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 ccgagcttca ggttctccat cctaggcttg tacagctcgt ccatgc 46 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 atggagaacc tgaagctcg 19 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 cgcggatccc gacttaccgc ctaaacctt 29 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 13 caccaatgcg agtatcagcc atcgaagact tgtacagctc gtccatgcc 49 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 14 atggctgata ctcgcattgg tg 22 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 15 cgcggatccc gatttcttgc tgaattcagc 30

Claims

형광공여체(fluorescence donor) 및 형광수여체(fluorescence acceptor)를 포함하는 신호발생부(signaling domain)와 상기 형광공여체 및 형광수여체를 연결하는 리간드 결합단백질을 포함하는 감지부(sensing domain)를 포함하는 FRET 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법에 있어서, 가역적 구조풀림(unfolding)이 나타나며 리간드가 상기 리간드 결합단백질에 결합함에 따른 FRET 비율(ratio)의 변화가 가장 큰 온도구간인 임계온도에서, 리간드를 함유하는 시료를 상기 FRET 바이오 센서와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 리간드의 검출방법.
다음의 단계를 포함하는, 형광공여체 및 형광수여체를 포함하는 신호발생부와 상기 형광공여체 및 형광수여체를 연결하는 리간드 결합단백질을 포함하는 감지부를 포함하는 FRET 바이오센서를 이용한 리간드 농도의 측정방법:

(a) 가역적 구조풀림(unfolding)이 나타나며 리간드가 상기 리간드 결합단백질에 결합함에 따른 FRET 비율(ratio)의 변화가 가장 큰 온도구간인 임계온도에서, 리간드를 함유하는 시료를 상기 FRET 바이오센서와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 형광 공여체와 형광 수여체의 발광량 비율의 변화를 측정하여 리간드의 농도를 측정하는 단계.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 임계온도에 변화를 가하기 위하여 산(acid), 염기(base), 환원제(reducing agent), 변성제(denaturant, chaotropic agent), 안정제(stabilizer), 계면활성제(surfactant), 유화제(emulsifier) 및 불활성화제(detergent) 중 어느 하나 이상을 첨가한 다음, 변화된 임계온도에서 리간드와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 임계온도에 변화를 가하기 위하여 상기 리간드 결합단백질이 저온성 또는 호열성 미생물 유래의 PBP(periplasmic-binding protein) 또는 이의 기질특이성을 개량한 PBP인 FRET 바이오센서를 이용하여 변화된 임계온도에서 리간드와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드는 당, 아미노산, 단백질, 지질, 유기산, 금속 또는 금속이온, 산화물, 수산화물 또는 그 컨쥬게이트(conjugates), 무기 이온, 아민 또는 폴리아민 및 비타민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 형광공여체는 형광단백질(fluorescent protein), 형광 안료(fluorescent dye), 생체발광 단백질(bioluminescent protein) 및 양자점(quantum dot)으로 구성된 군에서 선택되고; 상기 형광수여체는 상기 형광공여체와 파장이 상이한 형광단백질, 형광 안료 및 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 형광공여체는 형광단백질(fluorescent protein), 형광 안료(fluorescent dye), 생체발광 단백질(bioluminescent protein) 및 양자점(quantum dot)으로 구성된 군에서 선택되고; 상기 형광수여체는 상기 형광 공여체의 형광세기를 감소시키는 소광체(quencher) 또는 금나노입자(Au-nano particle)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 형광공여체 또는 형광수여체는 하나 이상의 링커를 통하여 상기 리간드 결합단백질에 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드 결합단백질이 PBP인 경우, 상기 임계온도는 49~54℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드 결합단백질이 MBP(maltose-binding protein)인 경우 상기 임계온도는 약 54℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드 결합단백질이 GGBP(galactose/glucose binding protein)인 경우 상기 임계온도는 약 50℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드 결합단백질이 ALBP(allose-binding protein) 또는 ARBP(arabinose-binding protein)인 경우 상기 임계온도는 약 49℃인 것을 특징으로 하는 방법.