KR20200068359A - 푸코실락토오스 검출용 바이오센서 및 이를 이용하여 푸코실락토오스의 정량 분석 방법 - Google Patents

푸코실락토오스 검출용 바이오센서 및 이를 이용하여 푸코실락토오스의 정량 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 푸코실락토오스 검출용 바이오센서 및 이를 이용하여 푸코실락토오스의 정량 분석 방법에 관한 것으로, 구체적으로 에너지 공여체와 에너지 수여체로 작용하는 형광 단백질들을 푸코실락토오스와 결합하는 단백질과 융합시킨 푸코실락토오스 바이오센서를 이용하여 세포 내부 또는 외부의 푸코실락토오스를 빠르게 정량하여 신규한 푸코실락토오스 발현 균주를 찾아낼 뿐만 아니라 모유와 같은 여러 다른 조건에서도 푸코실락토오스의 농도를 빠르게 정량할 수 있으므로 매우 유용한 기술이다.

Description

푸코실락토오스 검출용 바이오센서 및 이를 이용하여 푸코실락토오스의 정량 분석 방법{Biosensor for detecting fucosyllactose and detecting method of fucosyllactose using the same}
본 발명은 푸코실락토오스 검출용 바이오센서 및 이를 이용하여 푸코실락토오스의 정량 분석 방법에 관한 것으로, 구체적으로 eCFP-FBP-eYFP로 구성되는 세포 내부 또는 외부의 푸코실락토오스 정량을 위한 바이오센서에 관한 것으로서, 푸코실락토오스를 인식하는 푸코실락토오스 결합 단백질을 삽입함으로써 신호발생부인 형광단백질 사이의 거리 변화를 통해 FRET 변화(FRET Ratio)를 특징으로 하는 신규한 바이오센서에 관한 것이다.
해파리에서 유래한 GFP(green fluorescence protein)의 다양한 유전자 변이들인 CFP(cyan fluorescence protein)와 YFP(yellow fluorescence protein) 사이의 '형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)' 현상을 이용한 바이오센서로 세포 내 대사물질들을 정량적으로 측정한 연구는 1997년 Tsien 그룹에서 '칼모듈린 (calmodulin)'과 이와 상호 작용하는 'M13 펩타이드 (M13 peptide)'에 BFP와 GFP를 연결시킨 '카멜레온 (cameleon)'으로 명명한 융합단백질로 세포내 칼슘 (calcium) 농도를 측정하면서부터 본격적으로 시작되었다.
또한, 1997년 Hellinga 그룹에서는 리간드의 결합에 의해 구조가 바뀌는 미생물의 '세포막간 단백질들(periplasmic-binding proteins, PBPs)'의 일종인 말토오스 결합 단백질 (maltose binding protein, MBP)에 형광 염료를 결합하여 인공적인 조건(in vitro)에서 높은 감지 신호를 갖는 바이오센서를 구축하였으며, 최근까지도 다양한 종류의 단백질들에 적용한 사례가 보고 되어 있다.
이러한 연구들을 바탕으로 2002년 Frommer 그룹에서는 MBP의 양 말단에 CFP 와 YFP를 결합시킨 융합 단백질을 살아있는 효모에서 안정적으로 발현시키고, CFP와 YFP의 형광 강도의 차이를 비교하는 방법으로 살아있는 효모 내에서 맥아당 농도의 변화를 정량적으로 측정한 결과를 발표하였다. 그 후 세포막간 단백질인 '라이보오스 결합 단백질 (ribose-binding protein)'과 '글루코스 결합 단백질 (glucose-binding protein)'로 동일 한 연구를 수행하여 동물세포 내에서 각각의 당을 정량적으로 분석한 연구 결과를 발표했다. 뿐만 아니라 최근에는 세포내에 존재하는 다양한 물질들을 감지할 수 있는 형태의 바이오센서들이 개발되어지고 있는바, Champman 등은 최근에 보툴리눔(C. botulinum)의 신경독소 활성 (neurotoxin activity)을 측정할 수 있는 형광 바이오센서를 개발하여 발표하였고, Tojyo 등은 inositol 1,4,5-trisphosphate를 측정할 수 있는 바이오센서의 개발로 단일세포 수준에서 형광을 관찰하는 방법으로 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 발표한 바 있다.
그러나 초기에 개발된 상기 바이오센서들은 매우 미약한 수준의 감지력을 보이는 바, 보다 정확한 측정수단으로의 활용을 위해서는 그 감지 능력을 높이는 요구가 계속되어지고 있으며, 최근에는 이러한 단점을 보완하고자 하는 시도가 있었으며, 그 중 하나로 Miyawaki 그룹에서는 'cameleon'의 EYFP 유전자를 순환치환(circular permutation)하는 방법으로 FRET 감지신호를 증가시킬 수 있다는 연구결과를 2001년부터 2004년까지 계속적으로 발표되고 있다.
그러나 유전자 조작의 어려움과 탐색 공정의 단순함이 다른 유사한 종류의 바이오센서에 적용하기 쉽지 않다는 점에서 보다 효율적인 방식의 접근이 요구된다. 따라서 세포 내에서 특정 물질의 농도를 정량적으로 측정할 수 있는 바이오센서는 바이오센서의 감지능도 높아야 하고, 감지능을 높이는 개발 과정도 보편적 유전자 조작 방법을 사용하여 다른 유사한 종류의 바이오센서에도 적용이 가능한 개발 방법을 제공하는 것이 필요하다.
또한, 푸코실락토오스 생산 균주의 개량을 위해서는 푸코실락토오스의 농도를 고속탐색(high-throughput)으로 측정하는 것이 매우 중요하나, 푸코실락토오스의 농도를 분석하기 위한 방법으로는 HPLC를 통한 당분석법이 유일한 방법이다. 이 방법은 1개의 시료당 분석 시간이 30분 이상 소요되므로 균주개발이나 발효연구에서 발생하는 다수의 시료를 분석하는데 많은 시간이 소요된다. 따라서 대량의 시료를 빠르게 분석할 수 있는 분석방법의 개발이 필수적이며 현재의 기술로는 고속탐색(high-throughput)이 불가능하다.
(0001) 한국 등록 특허 KR 10-1073989
(0001) Marcus Fehr. et. al. (2002) PNAS 99: 9846-9851 (0002) Marcus. Fehr. et. al. (2004) Current Opinion in Plant Biology 7: 345-351
본 발명의 목적은 푸코실락토오스 검출능 및 농도 측정능이 개선된 바이오센서 및 농도 측정방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 공여 형광체 단백질(Fluorescence donor), 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP) 및 수용 형광체 단백질(Fluorescence acceptor)을 포함하는 푸코실락토오스(fucosyllactose) 검출용 FRET 센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 공여 형광체 단백질(Fluorescence donor), 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP) 및 수용 형광체 단백질(Fluorescence acceptor)을 포함하는 푸코실락토오스 검출용 FRET 센서를 푸코실락토오스를 포함하는 시료에 접촉시키는 단계; 및
상기 공여 형광체 단백질과 수용 형광체 단백질의 방사광 비율의 변화를 측정하여 푸코실락토오스의 농도를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 에너지 공여체와 에너지 수여체로 작용하는 형광 단백질들을 푸코실락토오스와 결합하는 단백질과 융합시킨 푸코실락토오스 바이오센서로서 세포 내부 또는 외부의 푸코실락토오스를 빠르게 정량하여 신규한 푸코실락토오스 발현 균주를 찾아낼 뿐만 아니라 모유와 같은 여러 다른 조건에서도 푸코실락토오스의 농도를 빠르게 정량할 수 있다.
도 1은 푸코실락토오스 바이오센서의 구성 및 작동원리를 나타낸 모식도이다.
도 2는 푸코실락토오스 바이오센서의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 3은 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP)로서 DC-SIGN을 이용한 바이오센서의 FRET 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP)로서 BoGT6a를 이용한 바이오센서의 FRET 변화를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서 "FRET"이란 서로 다른 발광 파장대의 두 형광물질 사이에서 발생하는 비방사성 (non-radiative) 에너지 전이현상으로, 여기(excitation)된 상태의 형광공여체의 여기 준위 에너지가 형광수용체로 전달되어 형광수용체로부터 발광 (emission)이 관찰되거나, 형광공여체의 형광감소(quenching)가 관찰되는 현상이다(Lakowicz,JR Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999)
본 발명에서 "형광공여체"란 FRET 현상에서 공여체로 작용하는 형광물질을 의미하고, "형광수여체"란 FRET 현상에서 수여체로 작용하는 형광물질을 의미한다.
본 발명에서 "시료"란, 관심있는 푸코실락토오스를 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 세포, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 수집된 것임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 동식물은 인체를 포함한다.
본 발명은 공여 형광체 단백질(Fluorescence donor), 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP) 및 수용 형광체 단백질(Fluorescence acceptor)을 포함하는 푸코실락토오스(fucosyllactose) 검출용 FRET 센서에 관한 것이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광체 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광체 단백질 (mGFP), 증강된 녹색 형광체, 단백질 (eGFP), 적색 형광체 단백질 (RFP), 변형된 적색 형광체 단백질 (mRFP), 증강된 적색 형광체 단백질(eRFP), 청색 형광체 단백질 (BFP), 변형된 청색 형광체 단백질 (mBFP), 증강된 청색 형광체 단백질 (eBFP), 황색 형광체 단백질 (YFP), 변형된 황색 형광체 단백질 (mYFP), 증강된 황색 형광체 단백질 (eYFP), 남색 형광체 단백질 (CFP), 변형된 남색 형광체 단백질 (mCFP), 증강된 남색 형광체 단백질 (eCFP), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 푸코실락토오스 결합 단백질은 DC-SIGN(Dendritic Cell Specific Intracellular adhesion molecule-3-grabbing Non integrin, CD209) 또는 BoGT6a(Bacteroides ovatus glycotransferase)인 것이며, 상기 DC-SIGN 단백질은 서열번호 7로 표기되고, 상기 BoGT6a 단백질은 서열번호 8로 표기되는 것이다.
또한, 본 발명은 공여 형광체 단백질(Fluorescence donor), 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP) 및 수용 형광체 단백질(Fluorescence acceptor)을 포함하는 푸코실락토오스 검출용 FRET 센서를 푸코실락토오스를 포함하는 시료에 접촉시키는 단계; 및
상기 공여 형광체 단백질과 수용 형광체 단백질의 방사광 비율의 변화를 측정하여 푸코실락토오스의 농도를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 푸코실락토오스 결합 단백질은 DC-SIGN(Dendritic Cell Specific Intracellular adhesion molecule-3-grabbing Non integrin, CD209) 또는 BoGT6a(Bacteroides ovatus glycotransferase)인 것이며, 상기 DC-SIGN 단백질은 서열번호 7로 표기되고, 상기 BoGT6a 단백질은 서열번호 8로 표기되는 것이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 공여 형광체 단백질과 수용 형광체 단백질의 방사광 비율은 하기 수학식 1에 개시된 바와 같이 계산하고 도 3 또는 도 4와 같이 공여 형광체 단백질과 수용 형광체 단백질의 방사광 비율(FRET Ratio)에 따라 푸코실락토오스의 농도를 측정할 수 있으므로 푸코실락토오스를 정량할 수 있다. FBP로서 DC-SIGN를 이용한 경우 푸코실락토오스의 농도가 10- 2uM에서 102uM까지 FRET Ratio가 변화되는 것을 측정할 수 있으며, FRET Ratio는 10- 2uM의 푸코실락토오스 농도에서 0.84의 측정값을 갖고 102uM 농도까지 푸코실락토오스의 양을 증가시켰을 때 FRET ratio가 0.78까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
또한, FBP로서 BoGT6a를 이용한 경우 푸코실락토오스의 농도가 10-2uM에서 102uM에서 FRET 변화되는 것을 측정할 수 있으며, FRET Ratio는 10- 2uM 농도에서 0.80의 측정값을 갖고 102uM 농도까지 푸코실락토오스의 양을 증가시켰을 때 0.91까지 증가하는 것을 확인할 수 있으므로(도 4). 이를 통해 표준곡선이 구할 수 있으며, 측정된 FRET Ratio을 이용하여 용액 내 푸코실락토오스의 농도를 구할 수 있다.
본 발명은 도 1에 나타낸 바와 같이, CFP-FBP-YFP(도 2 모식도 참고)로 구성되는 세포 내·외부의 푸코실락토오스 정량을 위한 바이오센서에 관한 것으로서, 푸코실락토오스 인식부위인 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP)에 푸코실락토오스가 결합하면 푸코실락토오스의 결합에 의해 FBP의 구조가 바뀌면서 양 말단에 결합한 CFP와 YFP의 거리(distance)와 배향(orientation)이 바뀌는 구조적 변화(conformational change)가 일어나게 되고, 이로 인해 발생하는 FRET의 정도 차이로 발생하는 형광을 비교 측정함에 있다. FRET이 발생하기 위한 조건으로는 에너지 공여체(donor)의 방사광(emission) 스펙트럼과 수여체(acceptor)의 흡수광(absorbtion) 스펙트럼이 서로 중첩되어야 하며, 공여체와 수여체의 전위쌍극자 상호배향(transition dipole orientation)이 평행이 되어야 유리하다. 상기의 바이오센서는 푸코실락토오스의 결합으로 FBP의 구조 변화를 유발하며, 결과적으로 FBP의 양 말단에 위치한 CFP와 YFP의 거리와 전위 쌍극자 상호배향을 변화시켜 FRET의 조건을 변화시킴으로 인해 발생하는 CFP와 YFP의 형광차이를 비교 분석하는 방법으로 세포 내·외부의 푸코실락토오스를 정량적으로 분석한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 푸코실락토오스 검출용 바이오센서의 제작 방법
도 2로 표시되는 His-eCFP-FBP-eYFP로 구성되는 융합 단백질을 발현시키기 위한 발현벡터를 구축하기 위해 하기 표 1에 기재된 DNA 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하여 클로닝을 수행하였다.
구체적으로, eCFP와 eYFP가 들어있는 유전자는 Wolf Frommer에게 제공받은 FLIPRbs 발현벡터를 주형으로 하였고, 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 하였다. eCFP와 eYFP 사이에 삽입되는 푸코실락토오스 결합 단백질인 DC-SIGN과 BoGT6a의 아미노산 서열은 표 2에 기재된 서열과 같고, 이 서열을 대장균에서의 발현을 위해 DNA 염기서열 최적화 과정을 통해 Solid-phase oligonucleotide synthesis 법을 통해 DNA로 합성하였다. 합성된 DC-SIGN 염기서열은 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머를 이용해 PCR로 증폭시켰고, BoGT6a는 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭시켰다.
주형인 서열번호 1과 서열번호 2로 증폭된 유전자와 서로 중첩되게 제작된 서열번호 3과 서열번호 4로 증폭된 DC-SIGN의 유전자를 SLIC(Sequence and Ligase Independent Cloning) 방법으로 클로닝 하였고 마찬가지로 서열번호 1과 서열번호 2로 증폭된 유전자와 서로 중첩되게 제작된 서열번호 5와 서열번호 6으로 증폭된 BoGT6a의 유전자를 SLIC 방법으로 클로닝하여 각각 eCFP와 eYFP 사이에 DC-SIGN 또는 BoGT6a가 융합된 DNA 염기서열을 얻을 수 있었다.
이름 서열번호 서열
FLIPRbs
Forward primer		 1 5‘-GGCGCCGGTACCGGTGGAATG-3’
FLIPRbs
Reverse primer		 2 5’-GCCTCCGGTACCACCCTTGTACAG-3’
DC-SIGN
Forward primer		 3 5‘-GGTGGTACCGGAGGCTGTCATCCATGCCCGTGGGAATGG-3’
DC-SIGN
Reverse primer		 4 5‘-ACCGGTACCGGCGCCGCAGCTTGCCGCGGATTTTTTACAAATCCA-3’
BoGT6a
Forward primer		 5 5‘-GGTGGTACCGGAGGCATGCGGATCGGCATCCTGTATATCTGTACTGGG-3’
BoGT6a
Reverse primer		 6 5‘-ACCGGTACCGGCGCCGTTTTTACGTCTCAGCAACTCGTGTCCTCCGTACTG-3’
이름 서열번호 서열
DC-SIGN 7 CHPCPWEWTFFQGNCYFMSNSQRNWHDSITACKEVGAQLVVIKSAEEQNFLQLQSSRSNRFTWMGLSDLNQEGTWQWVDGSPLLPSFKQYWNRGEPNNVGEEDCAEFSGNGWNDDKCNLAKFWICKKSAASC
BoGT6a 8 MRIGILYICTGKYDIFWKDFYLSAERYFMQDQSFIIEYYVFTDSPKLYDEENNKHIHRIKQKNLGWPDNTLKRFHIFLRIKEQLERETDYLFFFNANLLFTSPIGKEILPPSDSNGLLGTMHPGFYNKPNSEFTYERRDASTAYIPEGEGRYYYAGGLSGGCTKAYLKLCTTICSWVDRDATNHIIPIWHDESLINKYFLDNPPAITLSPAYLYPEGWLLPFEPIILIRDKNKPQYGGHELLRRKN
실시예 2 : 바이오센서 단백질의 형광분석
상기 실시예 1에서 제작된 eCFP-FBP-eYFP로 구성된 바이오센서 단백질의 형광 스펙트럼 분석은 형광분광장비인 Synergy H1(Biotek)을 사용하여 측정하였으며, CFP의 입사광(excitation)을 433nm로 하였을 때 측정되는 475nm의 방사광(emission)값과 FRET에 의해 여기(excited)된 YFP의 방사광인 528nm의 비율을 하기 수학식 1에 의해 계산하여 FRET 변화를 측정하였다.
그 결과, FBP로서 DC-SIGN를 이용한 경우 푸코실락토오스의 농도가 10- 2uM에서 102uM까지 FRET Ratio가 변화되는 것을 측정할 수 있다(도 3). 이 FRET Ratio는 10-2uM의 푸코실락토오스 농도에서 0.84의 측정값을 갖고 102uM 농도까지 푸코실락토오스의 양을 증가시켰을 때 FRET ratio가 0.78까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, FBP로서 BoGT6a를 이용한 경우 푸코실락토오스의 농도가 10-2uM에서 102uM에서 FRET 변화되는 것을 측정할 수 있다(도 4). 이 FRET Ratio는 10- 2uM 농도에서 0.80의 측정값을 갖고 102uM 농도까지 푸코실락토오스의 양을 증가시켰을 때 0.91까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 표준곡선이 구해진다면, 측정된 FRET Ratio을 이용하여 용액 내 푸코실락토오스의 농도를 정량할 수 있다.
[수학식 1]
Figure pat00001
FRET: YFP와 CFP의 방사광 비율
528nm: FRET에 의해 측정되어지는 YFP의 방사광 값
475nm: 입사광을 433nm로 하였을 때 측정되는 CFP의 방사광 값
<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Biosensor for detecting fucosyllactose and detecting method of fucosyllactose using the same <130> PN1811-489 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLIPRbs Forward primer <400> 1 ggcgccggta ccggtggaat g 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLIPRbs Reverse primer <400> 2 gcctccggta ccacccttgt acag 24 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-SIGN Forward primer <400> 3 ggtggtaccg gaggctgtca tccatgcccg tgggaatgg 39 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-SIGN Reverse primer <400> 4 accggtaccg gcgccgcagc ttgccgcgga ttttttacaa atcca 45 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BoGT6a Forward primer <400> 5 ggtggtaccg gaggcatgcg gatcggcatc ctgtatatct gtactggg 48 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BoGT6a Reverse primer <400> 6 accggtaccg gcgccgtttt tacgtctcag caactcgtgt cctccgtact g 51 <210> 7 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-SIGN <400> 7 Cys His Pro Cys Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr 1 5 10 15 Phe Met Ser Asn Ser Gln Arg Asn Trp His Asp Ser Ile Thr Ala Cys 20 25 30 Lys Glu Val Gly Ala Gln Leu Val Val Ile Lys Ser Ala Glu Glu Gln 35 40 45 Asn Phe Leu Gln Leu Gln Ser Ser Arg Ser Asn Arg Phe Thr Trp Met 50 55 60 Gly Leu Ser Asp Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly 65 70 75 80 Ser Pro Leu Leu Pro Ser Phe Lys Gln Tyr Trp Asn Arg Gly Glu Pro 85 90 95 Asn Asn Val Gly Glu Glu Asp Cys Ala Glu Phe Ser Gly Asn Gly Trp 100 105 110 Asn Asp Asp Lys Cys Asn Leu Ala Lys Phe Trp Ile Cys Lys Lys Ser 115 120 125 Ala Ala Ser Cys 130 <210> 8 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoGT6a <400> 8 Met Arg Ile Gly Ile Leu Tyr Ile Cys Thr Gly Lys Tyr Asp Ile Phe 1 5 10 15 Trp Lys Asp Phe Tyr Leu Ser Ala Glu Arg Tyr Phe Met Gln Asp Gln 20 25 30 Ser Phe Ile Ile Glu Tyr Tyr Val Phe Thr Asp Ser Pro Lys Leu Tyr 35 40 45 Asp Glu Glu Asn Asn Lys His Ile His Arg Ile Lys Gln Lys Asn Leu 50 55 60 Gly Trp Pro Asp Asn Thr Leu Lys Arg Phe His Ile Phe Leu Arg Ile 65 70 75 80 Lys Glu Gln Leu Glu Arg Glu Thr Asp Tyr Leu Phe Phe Phe Asn Ala 85 90 95 Asn Leu Leu Phe Thr Ser Pro Ile Gly Lys Glu Ile Leu Pro Pro Ser 100 105 110 Asp Ser Asn Gly Leu Leu Gly Thr Met His Pro Gly Phe Tyr Asn Lys 115 120 125 Pro Asn Ser Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Asp Ala Ser Thr Ala Tyr 130 135 140 Ile Pro Glu Gly Glu Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Gly Gly Leu Ser Gly 145 150 155 160 Gly Cys Thr Lys Ala Tyr Leu Lys Leu Cys Thr Thr Ile Cys Ser Trp 165 170 175 Val Asp Arg Asp Ala Thr Asn His Ile Ile Pro Ile Trp His Asp Glu 180 185 190 Ser Leu Ile Asn Lys Tyr Phe Leu Asp Asn Pro Pro Ala Ile Thr Leu 195 200 205 Ser Pro Ala Tyr Leu Tyr Pro Glu Gly Trp Leu Leu Pro Phe Glu Pro 210 215 220 Ile Ile Leu Ile Arg Asp Lys Asn Lys Pro Gln Tyr Gly Gly His Glu 225 230 235 240 Leu Leu Arg Arg Lys Asn 245

Claims (7)

  1. 공여 형광체 단백질(Fluorescence donor), 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP) 및 수용 형광체 단백질(Fluorescence acceptor)을 포함하는 푸코실락토오스(fucosyllactose) 검출용 FRET 센서.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 형광 단백질은 녹색 형광체 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광체 단백질 (mGFP), 증강된 녹색 형광체, 단백질 (eGFP), 적색 형광체 단백질 (RFP), 변형된 적색 형광체 단백질 (mRFP), 증강된 적색 형광체 단백질(eRFP), 청색 형광체 단백질 (BFP), 변형된 청색 형광체 단백질 (mBFP), 증강된 청색 형광체 단백질 (eBFP), 황색 형광체 단백질 (YFP), 변형된 황색 형광체 단백질 (mYFP), 증강된 황색 형광체 단백질 (eYFP), 남색 형광체 단백질 (CFP), 변형된 남색 형광체 단백질 (mCFP), 증강된 남색 형광체 단백질 (eCFP), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 푸코실락토오스 검출용 FRET 센서.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 푸코실락토오스 결합 단백질은 DC-SIGN(Dendritic Cell Specific Intracellular adhesion molecule-3-grabbing Non integrin, CD209) 또는 BoGT6a(Bacteroides ovatus glycotransferase)인 것인 푸코실락토오스 검출용 FRET 센서.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 DC-SIGN 단백질은 서열번호 7로 표기되고, 상기 BoGT6a 단백질은 서열번호 8로 표기되는 것인 푸코실락토오스 검출용 FRET 센서.
  5. 공여 형광체 단백질(Fluorescence donor), 푸코실락토오스 결합 단백질(Fucosyllactose Binding Protein, FBP) 및 수용 형광체 단백질(Fluorescence acceptor)을 포함하는 푸코실락토오스 검출용 FRET 센서를 푸코실락토오스를 포함하는 시료에 접촉시키는 단계; 및
    상기 공여 형광체 단백질과 수용 형광체 단백질의 방사광 비율(FRET Ratio)의 변화를 측정하여 푸코실락토오스의 농도를 측정하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 푸코실락토오스 결합 단백질은 DC-SIGN(Dendritic Cell Specific Intracellular adhesion molecule-3-grabbing Non integrin, CD209) 또는 BoGT6a(Bacteroides ovatus glycotransferase)인 것인 푸코실락토오스의 농도를 측정하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 DC-SIGN 단백질은 서열번호 7로 표기되고, 상기 BoGT6a 단백질은 서열번호 8로 표기되는 것인 푸코실락토오스의 농도를 측정하는 방법.
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KR101073989B1 (ko) 2009-04-27 2011-10-17 한국생명공학연구원 Ｆｒｅｔ 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법

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