CN108474021A

CN108474021A - 葡萄糖生物传感器及其用途

Info

Publication number: CN108474021A
Application number: CN201680069713.0A
Authority: CN
Inventors: H·W·赫林卡; M·J·阿勒特
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2016-09-02
Publication date: 2018-08-31
Also published as: US20240168032A1; US11156615B2; AU2016357091A1; EP3377643A4; EP3377643A1; US20220244266A1; WO2017087051A1; CA3005831A1; US20180328935A1

Abstract

本申请主题提供了葡萄糖生物传感器以及包括此类生物传感器的组合物、装置和方法。

Description

葡萄糖生物传感器及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年11月20日提交的美国临时申请号62/257,796和2015年11月20日提交的美国临时申请号62/257,784的优先权权益，将其各自的全部内容通过引用并入本文。

通过引用并入序列表

名称为“35327-516001WO_Sequence_Listing.txt”的文本文件的内容是在2016年9月2日创建的，其大小为587KB，将其通过引用以其全文特此并入。

技术领域

本发明涉及用于检测和确定葡萄糖和/或半乳糖浓度的组合物和方法。

背景技术

生物传感器是通过将生物大分子的精细分子识别特性与将配体结合关联至容易检测到的物理变化的信号转导机制相结合，可以用于测量复杂混合物中单一分子种类的存在的分析工具(Hall,Biosensors[生物传感器],Prentice-Hall[普伦蒂斯·霍尔出版社],恩格尔伍德克利夫斯,新泽西州；Scheller等人,Curr.Op.Biotech.[生物技术当前述评]12:35-40,2001)。理想地，生物传感器是无试剂的，并且与基于酶的测定或竞争性免疫测定相反，不会由于进行测量而改变组成(Hellinga和Marvin,Trends Biotech.[生物技术趋势]16:183-189,1998)。大多数生物传感器将天然存在的大分子(如酶或抗体)与讨论中的分子特有的合适物理信号的鉴定和特异于该系统的检测器的构建相组合(Meadows,Adv.Drug Deliv.Rev.[高级药物递送评论]21:177-189,1996)。最近，已经探索了分子工程技术来开发将大范围的结合特异性和亲和性与共同信号转导机制相结合的大分子，以构建通用检测系统用于许多不同的分析物(Hellinga和Marvin,Trends Biotech.[生物技术趋势]16:183-189,1998)。

大肠杆菌(Escherichia coli)周质结合蛋白是蛋白超家族的成员(细菌周质结合蛋白，bPBP)(Tam和Saier,Microbiol.Rev.[微生物学评论]57:320-346,1993)。这些蛋白质包括通过铰链区连接的两个结构域(Quiocho和Ledvina,Molec.Microbiol.[分子微生物学]20:17-25,1996)。配体结合位点位于两个结构域之间的界面处。蛋白质通常采用两种构象：无配体的开放形式和配体结合的闭合形式，它们在配体结合时经由铰链弯曲机构互相转换。通过将单个环境敏感的荧光团定位在经历与全局变化相呼应的局部构象变化的位置中，这种全局配体介导的构象变化已被用于将配体结合关联至荧光强度变化(Brune等人,Biochemistry[生物化学]33:8262-8271,1994；Gilardi等人,Prot.Eng.[蛋白质工程]10:479-486,1997；Gilardi等人,Anal.Chem.[分析化学]66:3840-3847,1994；Marvin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]94:4366-4371,1997；Marvin和Hellinga,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]120:7-11,1998；Tolosa等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]267:114-120,1999；Dattelbaum和Lakowicz,Anal.Biochem.[分析生物化学]291:89-95,2001；Marvin和Hellinga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:4955-4960,2001；Salins等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]294:19-26,2001)。

发明内容

本发明提供了改进的生物传感器，这些生物传感器快速、可靠且准确地检测和定量葡萄糖和/或半乳糖，相对于先前的系统具有显著的优势。本披露提供了用于配体的生物传感器，该生物传感器包括附接至报告基团的配体结合蛋白。配体可以是葡萄糖和/或半乳糖，并且配体结合蛋白包括结合葡萄糖和/或半乳糖的结构域。配体与配体结合蛋白的配体结合结构域的结合引起通过报告基团进行的信号传导的改变。在各种实施方式中，当配体与配体结合结构域结合时，生物传感器可以产生信号，当该配体离开该配体结合结构域时，不产生该信号(和/或不同于所产生的信号)。这些生物传感器具有广泛的用途，包括在临床、工业和环境背景中。

本文所描述的葡萄糖结合蛋白(生物传感器)的特征在于当与葡萄糖结合时具有一种构象形状，并且当与葡萄糖未结合时具有不同的构象形状，这种形状变化影响可检测标记(如荧光团)的信号。将蛋白质工程化为包括可检测标记(例如，荧光团)所共价附接的单个半胱氨酸。生物传感器是无试剂的，因为它们的监测机制既不需要另外的底物来产生信号，也不需要测量底物消耗或产物生成速率来确定葡萄糖浓度。

这些含荧光团的蛋白质构建体的优点之一是它们的高耐用性。构建体保留其结合葡萄糖，改变形状并因此检测分析物(葡萄糖)的能力：(a)即使当固定(直接地或间接地)在固体表面(如珠粒、平板或片)上时；(b)即使在干燥(并随后在生理缓冲溶液中重构)之后；(c)即使当遭受环境条件(例如，在储存和/或运输中可能遇到的条件)时；和(d)甚至当老化/存储延长的时间段(例如，数周、数月或甚至数年)时。因此，生物传感器不需要制冷或冷链用于分配，从而允许更大范围的适用性(如现场使用)并降低传感器产品的成本。

对于临床应用，可以使用微升体积(例如，10μl或更少)的体液(如血液)。此外，与传统的基于酶或基于抗体的测定系统相比，结果几乎是瞬间(例如，在30-60秒内)实现的。另外的优点是传感器始终且可靠地结合并检测复杂流体(如全血)中的分析物(葡萄糖)。因此，在临床环境中，不需要处理全血，从而减少了诊断程序的时间和成本。

在非临床情况下(例如商业环境工业如废水分析、食品或饮料生产、或生物反应器/发酵监测)，待分析的样品可以在取样时直接使用而无需进一步纯化或处理，从而类似地减少了测试的时间和费用。此外，因为未结合的材料(“污染物”)不会实质上影响精确、可靠的可检测测定信号的产生，所以在将测试样品与传感器接触之后，不需要洗涤固定的传感器以除去未结合的材料。

葡萄糖生物传感器产生二色比率信号，即该信号被定义为两个独立波长处的强度的商。这样的信号的优点是它提供了内部一致的参考。比率测量的自我校准性质消除了在每次测量之前执行机载(on-board)校准测试的必要性。

因此，与基于酶的生物传感器相比，无试剂的荧光响应性葡萄糖传感器具有许多优点，包括消除化学转化、消除底物需求和自我校准，这些共同导致快速响应时间、连续监测能力、简单的样品处理、由于简化的制造和分销过程导致的更低的成本。

配体结合蛋白

本申请主题的方面提供了包括结合葡萄糖和/或半乳糖的配体结合蛋白的生物传感器。结合葡萄糖和半乳糖两者的配体结合蛋白在本文中可以被称为“葡萄糖-半乳糖结合蛋白”(GGBP)。通常，天然的GGBP在室温下具有约10μM或更小的葡萄糖解离常数(KD)。然而，可以将GGBP选择、设计或工程化为检测不同(例如，更高或更低)水平的葡萄糖和/或半乳糖。配体结合蛋白可以包括天然存在的蛋白质或与天然存在的蛋白质相比被修饰的蛋白质。例如，与天然存在的蛋白质相比，配体结合蛋白可以包括一个或多个突变。在一些实施例中，天然存在的蛋白质是配体结合蛋白的天然存在的对应物(例如，配体结合蛋白是天然存在的对应物的突变体)。

突变多肽的“天然存在的对应物”是已经衍生出或可能衍生出突变多肽(例如，通过一个或多个突变)的天然产生的多肽。例如，天然存在的对应物是由生物体天然产生的内源多肽，其中该内源多肽通常不具有突变多肽中存在的一个或多个突变。为了方便和取决于上下文，本文中可以提及天然存在的对应物是出于比较的目的并且为了说明一个或多个突变、结合活性和/或结构特征的位置和/或存在。

如本文所使用的，“突变”是经修饰的多肽/蛋白质与天然存在的对应物的氨基酸序列之间的差异。具有突变的多肽可以被称为“突变体”。突变的非限制性实例包括插入、缺失和取代。然而，术语“突变”不包括(i)向多肽的N-末端或C-末端添加氨基酸，和(ii)多肽的信号肽的遗漏/缺失/置换(例如，被另一个信号肽或被甲硫氨酸置换)。

经由肽键将氨基酸添加到蛋白质的N-末端或C-末端在本文中可以被称为将氨基酸“融合”到蛋白质上。类似地，在其N-末端或C-末端与氨基酸(例如，另一种蛋白质、片段、标签或多肽部分)融合的外源蛋白可以被称为“融合蛋白”。所添加的氨基酸可以包括异源多肽(例如，多肽报告基团，如荧光蛋白)、促进多肽分离或修饰的部分、或促进多肽与底物或表面附接的部分。如本文所使用的，当提及融合蛋白的所添加的氨基酸(例如，“多肽”)时，“异源”表示该多肽不是其在融合蛋白中融合的蛋白质的天然部分。例如，与蛋白质融合的异源多肽(“所添加的氨基酸”)的序列由除衍生出该蛋白质的生物体以外的生物体编码，并不知道是由任何生物体天然编码，或由除编码蛋白质的内源形式的野生型基因以外的基因编码。

如本文所使用的，术语“信号肽”是指指导蛋白质转运的蛋白质的N-末端的短(例如，5-30个或10-60个氨基酸长)氨基酸段。在各种实施例中，信号肽在细胞对蛋白质进行翻译后修饰的过程中被切除。信号肽也可以被称为“靶向信号”、“前导序列”、“信号序列”、“转运肽”或“定位信号”。在对于本文所讨论的GGBP没有限定信号肽的情况下，信号肽可以任选地被认为是，例如，距离翻译的蛋白质的N-末端的前5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、5-15个、5-20个、5-25个、5-100个、10-15个、10-20个、10-25个、10-50个、10-100个、25-50个、25-75个、或25-100个氨基酸(与没有除去信号肽的蛋白质相比，例如，与天然存在的蛋白质相比)。

在一些实施例中，与天然存在的蛋白质相比，配体结合蛋白包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、1-10个、1-15个、1-20个、5-15个、5-20个、10-25个、10-50个、20-50个、25-75个、25-100个或更多个突变，同时保留至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％、或约100％的天然存在的蛋白质的活性。突变包括但不限于取代、插入和缺失。与天然存在的蛋白质相比，配体结合蛋白的非限制性实例可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、1-10个、1-15个、1-20个、5-15个、5-20个、10-25个、10-50个、20-50个、25-75个、25-100个或更多个取代突变，同时保留至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％、或约100％的天然存在的蛋白质的活性。在实施例中，配体结合蛋白的至少一个氨基酸已被半胱氨酸取代。可替代地或另外地，与天然存在的蛋白质相比，配体结合蛋白可以包括一个或多个除去半胱氨酸的突变，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个半胱氨酸取代或缺失。

可替代地，配体结合蛋白不是突变体。例如，报告基团与配体结合蛋白的N-末端或C-末端融合。

在各种实施例中，配体结合蛋白可以包括在与天然存在的蛋白质的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、或99.5％一致性的序列中的一段氨基酸(例如，配体结合蛋白的全长或包括至少约50个、100个、200个、250个、300个、或350个氨基酸的部分)。

在一些实施例中，突变是保守的，并且本申请主题包括许多仅有的突变为取代突变的配体结合蛋白。在非限制性实例中，与天然存在的蛋白质(例如，天然存在的对应物)相比，配体结合蛋白没有缺失或插入。可替代地，与天然存在的蛋白质相比，配体结合蛋白可以具有(i)少于约5个、4个、3个、2个、或1个插入的氨基酸，和/或(ii)少于约5个、4个、3个、2个、或1个缺失的氨基酸。

在各种实施例中，与配体结合蛋白比较的天然存在的蛋白质已衍生(例如，通过突变、融合或其他修饰)自原核配体结合蛋白(如细菌配体结合蛋白)。例如，原核配体结合蛋白是天然的(即，野生型)细菌蛋白的突变体、片段或变体。在各种实施例中，细菌配体结合蛋白来自嗜热、嗜温或嗜寒原核微生物(例如，嗜热、嗜温或嗜寒细菌)。

如果微生物能够在41℃与140℃之间(106。F与284。F之间)的温度下存活、生长和繁殖，则它是“嗜热的”。在各种实施例中，嗜热生物体具有在41℃与140℃之间的最佳生长温度，或至少约45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、或140℃的最佳生长温度。许多嗜热菌是古生菌。嗜热真细菌被认为是最早的细菌之一。嗜热菌发现于地球各种地热地区(如温泉和深海热液喷口)、以及腐烂的植物物质(如泥炭沼泽和堆肥)中。与其他类型的微生物不同，嗜热菌可以在热得多的温度下存活，而其他细菌如果暴露于相同的温度下会被伤害并且有时会被杀死。嗜热菌可以被分为三组：(1)专性嗜热菌；(2)兼性嗜热菌；和(3)超嗜热菌。专性嗜热菌(也称为极端嗜热菌)需要如此高的生长温度，而兼性嗜热菌(也称为中等嗜热菌)可以在高温下生长、但也可以在较低温度(例如低于50℃)下生长。超嗜热菌是特别极端的嗜热菌，对其而言最佳温度高于80℃。一些微生物可以在高于100℃的温度下在大的海洋深度中(在这里水因为高压而不会沸腾)生活。许多超嗜热菌也能够承受其他极端环境，如高的酸度或辐射水平。如果化合物(例如，蛋白质或生物传感器)能够在暴露于高于41℃的温度下存活，则它是“耐热的”。例如，在一些实施例中，当暴露于约45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、或140℃持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多分钟时，耐热生物传感器保持其功能，并且不会发生变性。在一些实施例中，耐热化合物在压力下在暴露于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、或140℃存活。

如果微生物能够在20℃与40℃之间(68。F与104。F之间)的温度下存活、生长和繁殖，则它是“嗜温的”。“嗜冷菌”(psychrophile或cryophile)是在低温下能够生长和繁殖的微生物。在各种实施例中，嗜冷菌能够在10℃或更低(例如，在-20℃与+10℃之间)的温度下生长和繁殖。

在一些实施例中，微生物蛋白由细菌微生物、古生菌微生物、藻类微生物、原生动物微生物或真菌微生物产生。在非限制性实例中，微生物蛋白由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌产生。在各种实施例中，生物传感器包括经修饰的(例如，突变的、融合的和/或轭合的)周质结合蛋白或胞质结合蛋白。

在配体结合蛋白是(1)大肠杆菌(Escherichia coli/E.coli)葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)(例如，已经经由突变衍生自大肠杆菌GGBP)或(2)具有与大肠杆菌GGBP的氨基酸序列有至少95％、96％、97％、98％、或99％一致性的氨基酸序列的非限制性实例中，该配体结合蛋白包括除氨基酸Y10、D14、N15、F16、N91、K92、E93、S112、S115、E149、H152、D154、A155、R158、M182、W183、N211、D236、L255、N256、D257、P294、或V296的突变以外的突变，其中每个氨基酸位置按照在(SEQ ID NO:17)中进行编号。

在某些实施例中，配体结合蛋白不是衍生自(例如，通过突变、融合或其他修饰)大肠杆菌蛋白(例如ecGGBP)，并且不包括与ecGGBP的氨基酸序列一致的氨基酸序列。例如，配体结合蛋白的天然存在的对应物不是大肠杆菌GGBP(例如，配体结合蛋白不是大肠杆菌GGBP的突变体、包括大肠杆菌GGBP的融合蛋白、或大肠杆菌GGBP的其他变体)。在一些实施例中，配体结合蛋白的氨基酸序列与大肠杆菌GGBP蛋白具有少于约100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、或15％的一致性，该大肠杆菌GGBP蛋白具有如SEQ ID NO:1、16或17所示的序列中的氨基酸。

本申请主题的方面提供了具有改变配体结合蛋白与配体(例如，葡萄糖和/或半乳糖)的相互作用的突变的配体结合蛋白。例如，与天然存在的对应物相比，配体结合蛋白包括改变配体结合蛋白与配体的相互作用的突变。在一些实施例中，与天然存在的对应物相比，配体结合蛋白包括改变配体结合蛋白的氨基酸与水分子的相互作用的突变。

在一些实施例中，配体结合蛋白不包括信号肽。例如，信号肽(例如，存在于天然存在的对应物中的信号肽)可以被甲硫氨酸置换。

示例性实施方式涉及诸如葡萄糖或半乳糖等配体，其中配体结合蛋白包括GGBP。例如，GGBP可以包括微生物GGBP的突变体、微生物GGBP的片段、或包括微生物GGBP的融合蛋白。在实施例中，GGBP不是已经附接或添加异源多肽的突变体或片段。在一些实施例中，配体结合蛋白对葡萄糖和/或半乳糖具有在受试者体内的葡萄糖和/或半乳糖的浓度范围内的亲和力(KD)。在某些实施例中，配体结合蛋白对葡萄糖具有在约0.2mM至约100mM、约0.1mmol/L至约120mmol/L、或约4mmol/L至约33mmol/L范围内的亲和力(KD)。在各种实施例中，配体结合蛋白对半乳糖具有在约0.8mM至约100mM或约0.2mM至约400mM范围内的亲和力(KD)。生物传感器能够检测在例如低血糖、正常血糖、高血糖或高血糖-高渗范围内的葡萄糖。因此，与先前的葡萄糖传感器不同，比率无试剂葡萄糖生物传感器在少于10μl的样品体积中在延长的葡萄糖浓度范围(从低血糖、正常血糖、高血糖、以及高血糖-高渗范围)上产生精确测量。在一些实施例中，与天然存在的蛋白质(例如，微生物GGBP)相比，配体结合蛋白包括改变(例如，增加或减少)突变体与结合的葡萄糖的相互作用的突变，其中该相互作用是与葡萄糖的一部分，葡萄糖的该部分选自下组，该组由以下各项组成：1-羟基、2-羟基、3-羟基、4-羟基、6-羟基、吡喃糖环或其任何组合。在非限制性实例中，与未突变的配体结合蛋白(例如，微生物GGBP)相比，配体结合蛋白包括改变(例如，增加或减少)突变体对葡萄糖和/或半乳糖的亲和力和/或特异性的突变。在某些实施例中，配体结合蛋白包括改变在蛋白质与结合的葡萄糖和/或半乳糖之间的相互作用的突变、改变在配体结合蛋白的开放状态与闭合状态之间的平衡的突变、改变在配体结合蛋白与报告基团之间的相互作用(例如荧光轭合物，例如，与prodan衍生的荧光团(如Acrylodan或Badan)的羰基基团或萘环的相互作用)的突变、和/或影响改变配体结合位点几何学的间接相互作用的突变。在各种实施例中，突变不会降低、或可忽视地影响配体结合蛋白的热稳定性。在一些实施例中，突变将配体结合蛋白的热稳定性改变了小于约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或10℃。

本申请主题提供了GGBP，该GGBP是以下各项或是以下各项的突变体：埃希氏菌属(Escherichia)物种(例如，艾伯特埃希氏菌(E.albertii)、大肠杆菌(E.coli)、费格森埃希氏菌(E.fergusonii)、赫氏埃希氏菌(E.hermannii)、或伤口埃希氏菌(E.vulneris))GGBP；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)物种(例如，乙酰乙基热厌氧杆菌(T.acetoethylicus)、布氏热厌氧杆菌(T.brockii)、产乙醇热厌氧杆菌(T.ethanolicus)、意大利热厌氧杆菌(T.italicus)、凯伍热厌氧杆菌(T.kivui)、马瑞氏热厌氧杆菌(T.mathranii)、假产乙醇热厌氧杆菌(T.pseudethanolicus)、亲铁热厌氧杆菌(T.siderophilus)、产硫磺热厌氧杆菌(T.sulfurigignens)、亲硫热厌氧杆菌(T.sulfurophilus)、热粪生热厌氧杆菌(T.thermocopriae)、热硫化氢热厌氧杆菌(T.thermohydrosulfuricus)、热解糖热厌氧杆菌(T.thermosaccharolyticum)、尤氏热厌氧杆菌(T.uzonensis)、或魏氏热厌氧杆菌(T.wiegelii))GGBP；梭菌属(Clostridium)物种(例如，不同梭菌(C.absonum)、乙酸梭菌(C.aceticum)、减醋酸梭菌(C.acetireducens)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、酸性梭菌(C.acidisoli)、耐酸梭菌(C.aciditolerans)、酸化梭菌(C.acidurici)、耐氧梭菌(C.aerotolerans)、埃氏梭菌(C.aestuarii)、阿卡吉梭菌(C.akagii)、C.aldenense、阿氏梭菌(C.aldrichii)、藻状梭菌(C.algidicarni)、解藻木聚糖梭菌(C.algidixylanolyticum)、C.algifaecis、嗜寒冷梭菌(C.algoriphilum)、碱性纤维素梭菌(C.alkalicellulosi)、嗜氨基梭菌(C.aminophilum)、氨基戊酸梭菌(C.aminovalericum)、苦杏仁梭菌(C.amygdalinum)、淀粉分解梭菌(C.amylolyticum)、灌木梭菌(C.arbusti)、北极梭菌(C.arcticum)、阿根廷梭菌(C.argentinense)、C.asparagiforme、金黄丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)、自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)、巴氏梭菌(C.baratii)、巴克氏梭菌(C.barkeri)、巴勒特梭菌(C.bartlettii)、贝季尔林斯基梭菌(C.beijerinckii)、双酶杆菌(C.bifermentans)、鲍氏梭菌(C.bolteae)、博尼氏梭菌(C.bornimense)、肉毒梭菌(C.botulinum)、鲍曼氏梭菌(C.bowmanii)、布氏梭菌(C.bryantii)、酪酸梭菌(C.butyricum)、尸毒梭菌(C.cadaveris)、C.caenicola、C.caminithermale、食气梭菌(C.carboxidivorans)、肉梭菌(C.carnis)、卡文迪什梭菌(C.cavendishii)、隐藏梭菌(C.celatum)、C.celerecrescens、产纤维二糖梭菌(C.cellobioparum)、纤维素发酵梭菌(C.cellulofermentans)、解纤维素梭菌(C.cellulolyticum)、纤维素梭菌(C.cellulosi)、食纤维梭菌(C.cellulovorans)、C.chartatabidum、鸣疽梭菌(C.chauvoei)、C.chromiireducens、C.citroniae、C.clariflavum、梭形梭菌(C.clostridioforme)、球形梭菌(C.coccoides)、匙形梭菌(C.cochlearium)、C.colletant、C.colicanis、鹧鸪梭菌(C.colinum)、食胶原梭菌(C.collagenovorans)、柱形芽胞梭菌(C.cylindrosporum)、艰难梭菌(C.difficile)、C.diolis、双孢梭菌(C.disporicum)、德氏梭菌(C.drakei)、坚韧梭菌(C.durum)、酯化梭菌(C.estertheticum)、酯化梭菌酯化亚种(C.estertheticum estertheticum)、酯化梭菌拉勒米亚种(C.estertheticum laramiense)、谲诈梭菌(C.fallax)、费地浸麻梭菌(C.felsineum)、热梭菌(C.fervidum)、C.fimetarium、C.formicaceticum、C.frigidicarnis、恶寒梭菌(C.frigoris)、冈氏梭菌(C.ganghwense)、产气梭菌(C.gasigenes)、戈氏梭菌(C.ghonii)、乙二醇梭菌(C.glycolicum)、甘草梭菌(C.glycyrrhizinilyticum)、格氏梭菌(C.grantii)、溶血梭菌(C.haemolyticum)、嗜盐梭菌(C.halophilum)、矛形梭菌(C.hastiforme)、海瑟薇梭菌(C.hathewayi)、食草梭菌(C.herbivorans)、希拉诺梭菌(C.hiranonis)、溶组织梭菌(C.histolyticum)、C.homopropionicum、华癸梭菌(C.huakuii)、亨氏梭菌(C.hungatei)、产氢梭菌(C.hydrogeniformans)、羟基苯甲酸梭菌(C.hydroxybenzoicum)、C.hylemonae、幼稚梭菌(C.jejuense)、吲哚梭菌(C.indolis)、无害梭菌(C.innocuum)、肠梭菌(C.intestinale)、不规则梭菌(C.irregulare)、板蓝根梭菌(C.isatidis)、约氏梭菌(C.josui)、克鲁佛梭菌(C.kluyveri)、乳酸发酵梭菌(C.lactatifermentans)、C.lacusfryxellense、拉勒米梭菌(C.laramiense)、拉瓦氏梭菌(C.lavalense)、缓徐瘤梭菌(C.lentocellum)、缓腐梭菌(C.lentoputrescens)、柔嫩梭菌(C.leptum)、泥渣梭菌(C.limosum)、海滨梭菌(C.litorale)、象牙海岸梭菌(C.lituseburense)、扬氏梭菌(C.ljungdahlii)、洛氏梭菌(C.lortetii)、伦登梭菌(C.lundense)、大梭菌(C.magnum)、恶名梭菌(C.malenominatum)、芒氏梭菌(C.mangenotii)、马犹姆贝梭菌(C.mayombei)、食甲氧基苯甲酸梭菌(C.methoxybenzovorans)、甲基戊糖梭菌(C.methylpentosum)、新丙酸梭菌(C.neopropionicum)、系结梭菌(C.nexile)、硝基酚梭菌(C.nitrophenolicum)、诺维氏梭菌(C.novyi)、海洋梭菌(C.oceanicum)、C.orbiscindens、乳清酸梭菌(C.oroticum)、草酸梭菌(C.oxalicum)、溶纸梭菌(C.papyrosolvens)、奇异梭菌(C.paradoxum)、副产气荚膜梭菌(C.paraperfringens)、副腐化梭菌(C.paraputrificum)、牧场梭菌(C.pascui)、巴斯德氏梭菌(C.pasteurianum)、食缩氨酸梭菌(C.peptidivorans)、多年生梭菌(C.perenne)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、芬氏梭菌(C.pfennigii)、植物发酵梭菌(C.phytofermentans)、毛发状梭菌(C.piliforme)、解多糖梭菌(C.polysaccharolyticum)、包氏梭菌(C.populeti)、丙酸梭菌(C.propionicum)、蛋白溶解梭菌(C.proteoclasticum)、解朊梭菌(C.proteolyticum)、嗜冷梭菌(C.psychrophilum)、略紫色梭菌(C.puniceum)、解嘌呤环梭菌(C.purinilyticum)、腐化梭菌(C.putrefaciens)、腐败梭菌(C.putrificum)、橡树梭菌(C.quercicolum)、奎宁梭菌(C.quinii)、多枝梭菌(C.ramosum)、直肠梭菌(C.rectum)、玫瑰色梭菌(C.roseum)、糖化丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)、糖化梭菌(C.saccharogumia)、解糖梭菌(C.saccharolyticum)、糖化过丁酸丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、撒丁岛梭菌(C.sardiniense)、平底锅形梭菌(C.sartagoforme)、粪味梭菌(C.scatologenes)、西尔玛赫梭菌(C.schirmacherense)、C.scindens、败血梭菌(C.septicum)、索氏梭菌(C.sordellii)、楔样梭菌(C.sphenoides)、螺状梭菌(C.spiroforme)、产芽胞梭菌(C.sporogenes)、球孢梭菌(C.sporosphaeroides)、粪堆梭菌(C.stercorarium)、C.stercorarium leptospartum、粪堆梭菌粪堆亚种(C.stercorarium stercorarium)、粪堆梭菌热乳亚种(C.stercorarium thermolacticum)、斯蒂克兰德梭菌(C.sticklandii)、C.straminisolvens、偏端梭菌(C.subterminale)、C.sufflavum、产硫梭菌(C.sulfidigenes)、共生梭菌(C.symbiosum)、C.tagluense、C.tepidiprofundi、白蚁梭菌(C.termitidis)、第三梭菌(C.tertium)、破伤风梭菌(C.tetani)、破伤风形梭菌(Clostridium tetanomorphum)、C.thermaceticum、C.thermautotrophicum、嗜热碱梭菌(C.thermoalcaliphilum)、嗜热丁酸梭菌(C.thermobutyricum)、热纤梭菌(C.thermocellum)、高温堆肥梭菌(C.thermocopriae)、嗜热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)、热乳梭菌(C.thermolacticum)、热棕榈梭菌(C.thermopalmarium)、C.thermopapyrolyticum、嗜热化糖梭菌(C.thermosaccharolyticum)、热产琥珀酸梭菌(C.thermosuccinogenes)、热产硫磺梭菌(C.thermosulfurigenes)、减硫代硫酸盐梭菌(C.thiosulfatireducens)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、C.uliginosum、C.ultunense、绒毛梭菌(C.villosum)、奋森梭菌(C.vincentii)、绿色梭菌(C.viride)、解木聚糖梭菌(C.xylanolyticum)、或食木聚糖梭菌(C.xylanovorans))GGBP；沙门氏菌属(Salmonella)物种[例如，乍得沙门氏菌(S.bongori)、肠道沙门氏菌(S.enterica)、肠道沙门氏菌肠道亚种(S.entericasubspecies enterica)、肠道沙门氏菌萨拉姆亚种(S.enterica subspeciessalamae)、肠道沙门氏菌亚利桑那亚种(S.enterica subspecies arizonae)、肠道沙门氏菌双相亚利桑那亚种(S.enterica subspecies diarizonae)、肠道沙门氏菌豪顿亚种(S.enterica subspecies houtenae)、肠道沙门氏菌印度亚种(S.enterica subspeciesindica)、或肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清变型(S.enterica subspecies entericaserovar Typhimurium)(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)]GGBP；热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)物种(例如，解糖热解纤维素菌(C.saccharolyticus)、C.acetigenus、贝氏热解纤维素菌(C.bescii)、长白热解纤维素菌(C.changbaiensis)、热水热解纤维素菌(C.hydrothermalis)、热液热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorhydrother)、克里斯热解纤维素菌(C.kristjanssonii)、克罗诺基热解纤维素菌(C.kronotskyensis)、C.lactoaceticus、欧文斯热解纤维素菌(C.owensensis)、或黑曜石热解纤维素菌(C.obsidiansis))GGBP；类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种(例如，P.agarexedens、P.agaridevorans、解藻朊类芽孢杆菌(P.alginolyticus)、碱土类芽孢杆菌(P.alkaliterrae)、蜂房类芽孢杆菌(P.alvei)、解淀粉类芽孢杆菌(P.amylolyticus)、厌氧类芽孢杆菌(P.anaericanus)、南极类芽孢杆菌(P.antarcticus)、阿萨姆类芽孢杆菌(P.assamensis)、偶氮还原类芽孢杆菌(P.azoreducens)、固氮类芽孢杆菌(P.azotofixans)、巴西诺类芽孢杆菌(P.barcinonensis)、北极类芽孢杆菌(P.borealis)、巴西类芽孢杆菌(P.brasilensis)、甘蓝类芽孢杆菌(P.brassicae)、坎皮纳斯类芽孢杆菌(P.campinasensis)、P.chinjuensis、嗜几丁质类芽孢杆菌(P.chitinolyticus)、软骨酸类芽孢杆菌(P.chondroitinus)、灰色类芽孢杆菌(P.cineris)、库氏类芽孢杆菌(P.cookii)、P.curdlanolyticus、P.daejeonensis、树状类芽孢杆菌(P.dendritiformis)、坚韧类芽孢杆菌(P.durum)、爱媛类芽孢杆菌(P.ehimensis)、埃吉类芽孢杆菌(P.elgii)、P.favisporus、解葡聚糖类芽孢杆菌(P.glucanolyticus)、解聚糖类芽孢杆菌(P.glycanilyticus)、戈登类芽孢杆菌(P.gordonae)、禾谷类芽孢杆菌(P.graminis)、食谷类类芽孢杆菌(P.granivorans)、程谷类芽孢杆菌(P.hodogayensis)、伊利诺伊类芽孢杆菌(P.illinoisensis)、贾米拉类芽孢杆菌(P.jamilae)、哥本类芽孢杆菌(P.kobensis)、P.koleovorans、韩国类芽孢杆菌(P.koreensis)、胶冻样类芽孢杆菌(P.kribbensis)、乳酸类芽孢杆菌(P.lactis)、幼虫类芽孢杆菌(P.larvae)、灿烂类芽孢杆菌(P.lautus)、缓死类芽孢杆菌(P.lentimorbus)、浸麻类芽孢杆菌(P.macerans)、马阔里类芽孢杆菌(P.macquariensis)、马赛类芽孢杆菌(P.massiliensis)、门德利类芽孢杆菌(P.mendelii)、本部类芽孢杆菌(P.motobuensis)、食萘球类芽孢杆菌(P.naphthalenovorans)、嗜线虫类芽孢杆菌(P.nematophilus)、臭味类芽孢杆菌(P.odorifer)、饲料类芽孢杆菌(P.pabuli)、皮尔瑞俄类芽孢杆菌(P.peoriae)、海枣类芽孢杆菌(P.phoenicis)、叶球形类芽孢杆菌(P.phyllosphaerae)、多黏类芽孢杆菌(P.polymyxa)、金龟子类芽孢杆菌(P.popilliae)、尘埃类芽孢杆菌(P.pulvifaciens)、根际类芽孢杆菌(P.rhizosphaerae)、血类芽孢杆菌(P.sanguinis)、P.stellifer、土地类芽孢杆菌(P.terrae)、溶硫胺类芽孢杆菌(P.thiaminolyticus)、蒂莫内类芽孢杆菌(P.timonensis)、P.tylopili、图列茨类芽孢杆菌(P.turicensis)、强壮类芽孢杆菌(P.validus)、涡流类芽孢杆菌(P.vortex)、伤口类芽孢杆菌(P.vulneris)、温尼类芽孢杆菌(P.wynnii)、解木聚糖类芽孢杆菌(P.xylanilyticus))GGBP；丁酸弧菌属(Butyrivibrio)物种(例如，分裂蛋白丁酸弧菌(B.proteoclasticus)、穗状丁酸弧菌(B.crossotus)、溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)、或亨氏丁酸弧菌(B.hungatei))GGBP；罗氏菌属(Roseburia)物种(例如，肠罗氏菌(R.intestinalis)、粪罗氏菌(R.faecis)、人罗氏菌(R.hominis)、或食菊粉罗氏菌(R.inulinivorans))GGBP；粪杆菌属(Faecalibacterium)物种(例如，普拉粪杆菌(F.prausnitzii))GGBP；丹毒丝菌属(Erysipelothrix)物种(例如，红斑丹毒丝菌(E.rhusiopathiae)、E.inopinata、或扁桃体丹毒丝菌(E.tonsillarum))GGBP；或真杆菌属(Eubacterium)物种(例如，直肠真杆菌(E.rectale)、嗜氨基酸真杆菌(E.acidaminophilum)、缠结真杆菌(E.nodatum)、氧化还原真杆菌(E.oxidoreducens)、或E.foedans))GGBP。

在各种实施例中，生物传感器包括GGBP，该GGBP是以下各项或是以下各项的突变体：大肠杆菌GGBP(ecGGBP；SEQ ID NO:1)；热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosaccharolyticum)GGBP(ttGGBP；SEQ ID NO:2)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)GGBP(stGGBP；SEQ ID NO:3)；热水热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorhydrothermalis)GGBP(chyGGBP；SEQ ID NO:4)；黑曜石热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor obsidiansis)GGBP(cobGGBP；SEQ ID NO:5)；类芽孢杆菌属物种GGBP(pspGGBP；SEQ ID NO:6)；解糖梭菌(Clostridium saccharolyticum)GGBP(csaGGBP；SEQ ID NO:7)；自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)GGBP(cauGGBP；SEQ ID NO:12)；扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)GGBP(cljGGBP；SEQ ID NO:11)；分裂蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)GGBP(bprGGBP；SEQ ID NO:8)；肠罗氏菌(Roseburia intestinalis)GGBP(rinGGBP_A；SEQ ID NO:9或者rinGGBP_B；SEQ ID NO:13)；普拉粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)GGBP(fprGGBP；SEQ ID NO:10)；红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)GGBP(erhGGBP；SEQ ID NO:14)；或直肠真杆菌(Eubacterium rectale)GGBP(ereGGBP；SEQ ID NO:15)。在一些实施例中，GGBP包括与以下各项的氨基酸序列具有在75％与10％之间的一致性(例如，在25％与50％之间的一致性)的氨基酸序列：ecGGBP(SEQ ID NO:1或17)；ttGGBP(SEQ ID NO:2或18)；stGGBP(SEQ ID NO:3或19)；chyGGBP(SEQ ID NO:4或20)；pspGGBP(SEQ ID NO:6或22)；csaGGBP(SEQ ID NO:7或23)；bprGGBP(SEQ ID NO:8或24)；rinGGBP_A(SEQ ID NO:9或25)；rinGGBP_B(SEQ IDNO:13或29)；fprGGBP(SEQ ID NO:10或26)；cljGGBP(SEQ ID NO:11或27)；cauGGBP(SEQ ID NO:12或28)；erhGGBP(SEQ ID NO:14或30)；和/或ereGGBP(SEQ ID NO:15或31)。

本申请主题的方面包括GGBP，该GGBP是表1中所列出的蛋白质或是表1中所列出的蛋白质的突变体，例如，表1中的编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138的蛋白质。

关于所限定的多肽，高于或低于本文中所提供的那些的％一致性数字将涵盖各种实施例。因此，在可适用的情况下，根据最小％一致性数字，多肽可以包括与参考SEQ ID NO或与多个参考SEQ ID NO中的每一个具有至少60％、65％、70％、75％、76％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％一致性的氨基酸序列。在可适用的情况下，根据与参考序列的最大％一致性，多肽可以包括与参考SEQ ID NO或与多个参考SEQ IDNO中的每一个具有小于75％、70％、65％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、或15％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，多肽包括在与参考SEQ ID NO或与多个参考SEQ ID NO中的每一个优选具有至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、或30％且小于约75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、或30％一致性的序列中的氨基酸。本文所披露的参考蛋白质和氨基酸序列的非限制性实例包括：

(i)来自大肠杆菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ecGGBP；基因组，NC_002695；蛋白质，WP_032329053，SEQ ID NO:1)；

(ii)来自热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ttGGBP；基因组，NC_014410；蛋白质，YP_003852930.1，SEQ IDNO:2)；

(iii)来自鼠伤寒沙门氏菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(stGGBP；基因组，NC_003197；蛋白质，WP_001036943，SEQ ID NO:3)；

(iv)来自热水热解纤维素菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(chyGGBP；基因组，NC_014652；蛋白质标识符，YP_003991244.1，SEQ ID NO:4)；

(v)来自黑曜石热解纤维素菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(cobGGBP；基因组，NC_014392；蛋白质，YP_003839461.1，SEQ ID NO:5)；

(vi)来自类芽孢杆菌属物种的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(pspGGBP；基因组，NC_013406；蛋白质，YP_003243743.1，SEQ ID NO:6)；

(vii)来自解糖梭菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(csaGGBP；基因组，NC_014376；蛋白质，YP_003822565.1，SEQ ID NO:7)；

(viii)来自分裂蛋白丁酸弧菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(bprGGBP；基因组，NC_014387；蛋白质，YP_003830205.1，SEQ ID NO:8)；

(ix)来自肠罗氏菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(rinGGBP_A；基因组，NC_021012；蛋白质，YP_007778116.1，SEQ ID NO:9)；

(x)来自普拉粪杆菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(fprGGBP；基因组，NC_021020；蛋白质，YP_007799070.1，SEQ ID NO:10)；

(xi)来自扬氏梭菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(cljGGBP；基因组，NC_014328；蛋白质，CLJU_c08950，SEQ ID NO:11)；

(xii)来自自产乙醇梭菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(cauGGBP；基因组，NC_022592；蛋白质，CAETHG_2989，SEQ ID NO:12)；

(xiii)来自肠罗氏菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(rinGGBP_B；基因组，NC_021012；蛋白质，YP_007778124.1，SEQ ID NO:13)；

(xiv)来自红斑丹毒丝菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(erhGGBP；基因组，NC_015601；蛋白质，YP_004561181.1，SEQ ID NO:14)；以及

(xv)来自直肠真杆菌的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ereGGBP；基因组，NC_012781；蛋白质，YP_002936409.1，SEQ ID NO:15)。

本文所披露的GGBP可以任选地与包括一段氨基酸的基序融合(例如，在其N-末端和/或C-末端)，该基序促进分离或其他操作，例如轭合至部分或固定于基底(如塑料)、纤维素产品(如纸)、聚合物、金属、贵金属、半导体或量子点(例如，荧光量子点)上。这样一段氨基酸的非限制性实例具有序列：GGSHHHHHH(SEQ ID NO:104)。该基序对于改变或影响配体结合活性或信号转导不是必需的，并且也不认为会改变或影响配体结合活性或信号转导。例如，SEQ ID NO:32-103中的每一个(和本文所披露的实验中使用的其他蛋白质的非限制性实例)都包括该基序(SEQ ID NO:104)。可替代地或另外地，可以将配体结合蛋白与异源多肽或“所添加的氨基酸”融合，所述异源多肽或“所添加的氨基酸”有助于将其附接至表面，如装置的表面。

在一些实施例中，与多肽的天然存在的对应物相比，多肽包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个半胱氨酸取代或缺失(即，已除去1个、2个、3个、4个、5个或更多个天然半胱氨酸)，例如，与多肽的天然存在的对应物相比，1个、2个、3个、4个、5个或更多个半胱氨酸至丙氨酸的取代。在一些实施例中，与多肽的天然对应物相比，该多肽的全部半胱氨酸已经被缺失和/或被取代。

在实施例中，与蛋白质的天然存在的对应物相比，该蛋白质的氨基酸序列包括不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、或25个突变。在一些实施例中，少于25个、20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、或2个的突变是1个、2个、3个、4个、或5个、或不超过1个、2个、3个、4个、或5个氨基酸的缺失或插入。在一些实施例中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个突变是取代突变。在某些实施例中，与蛋白质的天然存在的对应物相比，对该蛋白质进行的每个突变都是取代突变。在各种实施例中，与蛋白质的天然存在的对应物相比，对该蛋白质进行的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个或全部突变是保守取代突变。

在各种实施例中，与多肽的天然对应物相比，除了(任选地)除去信号肽和/或在其N-末端或C-末端融合化合物(如另一种多肽)以外，该多肽不具有任何插入或缺失。

包括主要互补表面(Primary Complementary Surface，PCS)的配体结合蛋白

以下BLAST参数用于鉴定GGBP的序列同系物：(1)预期阈值为10.0；(2)空位成本是存在:11(Existence:11)和延伸:1(Extension:1)；(3)所使用的矩阵是BLOSUM62；(4)低复杂度区域的过滤器是“开”。这样的比对可以使用ProteinHunter程序生成。ProteinHunter软件包总是用以下命令来执行BLAST搜索

“blastall-p blastp-m 8-b 50000-d％s-i<INPUT FILE>-o<OUTPUT FILE>”

其中，对于给定的计算，<INPUT FILE>和<OUTPUT FILE>分别指定输入文件和输出文件。用由程序固有设置的默认参数，该命令执行蛋白质序列的BLAST比对程序。BLAST程序版本是2.2.24。

如下所讨论，使用BLAST鉴定的GGBP的序列同系物可以使用ClustalW与ecGGBP比对以鉴定与ecGGBP共享PCS的同系物。

本申请主题的方面提供了与本文所披露的GGBP共享PCS的配体结合蛋白。在实施例中，PCS包括用于鉴定葡萄糖-半乳糖结合蛋白的至少约5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸位置。例如，ecGGBP的PCS可以包括位置14、16、91、152、154、158、183、211、236、和256，其中每个位置按照在SEQ ID NO:17中计数。在各种实施例中，如果蛋白质的氨基酸序列具有以下各项，那么该蛋白质与ecGGBP共享PCS：

(i)在与ecGGBP的位置14比对的位置处的D或N；

(ii)在与ecGGBP的位置16比对的位置处的F、Y或W；

(iii)在与ecGGBP的位置91比对的位置处的N或D；

(iv)在与ecGGBP的位置152比对的位置处的H、N或Q；

(v)在与ecGGBP的位置154比对的位置处的D或N；

(vi)在与ecGGBP的位置158比对的位置处的R；

(vii)在与ecGGBP的位置183比对的位置处的W、F或Y；

(viii)在与ecGGBP的位置211比对的位置处的N或D；

(ix)在与ecGGBP的位置236比对的位置处的D或N；以及

(x)在与ecGGBP的位置256比对的位置处的N或D，

其中在ecGGBP(SEQ ID NO:17)与蛋白质之间的比对是使用ClustalW比对程序构建的。

ProteinHunter软件包总是用以下命令来执行多重序列比对

“clustalw–infile＝<INPUT FILE>-outfile＝<OUTPUTFILE>-align–quiet”

该命令对蛋白质序列执行CLUSTALW多序列比对程序。没有改变程序的比对行为的用户指定的参数设置°CLUSTALW程序版本是2.1。

为了方便和取决于上下文，与ecGGBP的规定位置比对的位置在本文中可以被称为与规定的位置“对应(equivalent)”。

示例性配体结合蛋白

本文所提供的各种生物传感器包括葡萄糖-半乳糖结合蛋白，如与其天然存在的对应物相比具有改变的氨基酸序列的葡萄糖-半乳糖结合蛋白。在实施例中，此类蛋白质与报告基团轭合。ecGGBP是关于葡萄糖-半乳糖结合蛋白的非限制性参考蛋白。在图3中提供了ecGGBP与其他多肽的比对。

在各种实施例中，本披露的多肽包括

(a)如下氨基酸，其与ecGGBP优选具有(i)至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、或30％，且(ii)小于约75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、或35％一致性；

(b)在一段至少5个、10个或20个氨基酸内的半胱氨酸取代(与其天然存在的对应物相比)(例如，色氨酸至半胱氨酸的取代)，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置183的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％一致性；

(c)一段至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、或30个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置14的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％一致性；

(d)在以下序列中的一段氨基酸

a.IYKX₁DDX₂FM(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是Y、F、Q或K；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是N或T)(SEQ ID NO:182)，

b.YKX₁DDX₂FM(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是Y、F、Q或K；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是N或T)(SEQ ID NO:183)，

c.YKX₁DDX₂F(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是Y、F、Q或K；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是N或T)(SEQ ID NO:184)，

d.KX₁DDX₂F(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是Y、F、Q或K；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是N或T)(SEQ ID NO:185)，

e.YKXDD(其中X是任何氨基酸，或其中X是Y、F、Q或K)(SEQ ID NO:186)，

f.KXDD(其中X是任何氨基酸，或其中X是Y、F、Q或K)(SEQ ID NO:187)，

g.DDXF(其中X是任何氨基酸，或其中X是N或T)(SEQ ID NO:188)，

h.DX₁FMX₂X₃VR(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是N或T；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是S、T、G；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是V、G、E或L)(SEQ ID NO:189)，

i.DX₁FMX₂X₃V(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是N或T；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是S、T、G；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是V、G、E或L)(SEQ ID NO:190)，

j.DXFM(其中X是任何氨基酸，或其中X是N或T)(SEQ ID NO:191)，

k.IYKX₁DNX₂FM(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是Y、F、Q或K；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是N或T)(SEQ ID NO:192)，

l.YKX₁DNX₂FM(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是Y、F、Q或K；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是N或T)(SEQ ID NO:193)，

m.YKX₁DNX₂F(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是Y、F、Q或K；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是N或T)(SEQ ID NO:194)，

n.KX₁DNX₂F(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是Y、F、Q或K；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是N或T)(SEQ ID NO:195)，

o.YKXDN(其中X是任何氨基酸，或其中X是Y、F、Q或K)(SEQ ID NO:196)，

p.KXDN(其中X是任何氨基酸，或其中X是Y、F、Q或K)(SEQ ID NO:197)，

q.DNXF(其中X是任何氨基酸，或其中X是N或T)(SEQ ID NO:198)，

r.NX₁FMX₂X₃VR(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是N或T；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是S、T、G；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是V、G、E或L)(SEQ ID NO:199)，

s.NX₁FMX₂X₃V(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是N或T；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是S、T、G；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是V、G、E或L)(SEQ ID NO:200)，

t.NXFM(其中X是任何氨基酸，或其中X是N或T)(SEQ ID NO:201)；

(e)在以下序列中的一段氨基酸

g.DDXF(其中X是任何氨基酸，或其中X是N或T)(SEQ ID NO:188)，

j.DXFM(其中X是任何氨基酸，或其中X是N或T)(SEQ ID NO:191)，

q.DNXF(其中X是任何氨基酸，或其中X是N或T)(SEQ ID NO:198)，

s.NX₁FMX₂X₃V(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是N或T；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是S、T、G；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是V、G、E或L)(SEQ ID NO:200)，或

t.NXFM(其中X是任何氨基酸，或其中X是N或T)(SEQ ID NO:201)，

该段氨基酸是在多肽的N-末端的约50个、45个、40个、35个、20个、或15个氨基酸内，包括或不包括其天然对应物的信号肽(在本文中也被称为前导肽)的氨基酸；

(f)一段至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、或30个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置91的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％一致性；

(g)具有以下序列的一段氨基酸

a.PVVFFNKEP(SEQ ID NO:202)，

b.PVVFXNKEP(其中X是任何氨基酸，或其中X是F、L、V或I)(SEQ ID NO:203)，

c.PVVFFNXEP(其中X是任何氨基酸，或其中X是K、R、E或G)(SEQ ID NO:204)，

d.PVVFX₁NX₂EP(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是F、L、V或I；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是K、R、E或G)(SEQ ID NO:205)，

e.VVFX₁NX₂EP(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是F、L、V或I；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是K、R、E或G)(SEQ ID NO:206)，

f.VFX₁NX₂EP(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是F、L、V或I；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是K、R、E或G)(SEQ ID NO:207)，

g.PVVFX₁NX₂E(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是F、L、V或I；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是K、R、E或G)(SEQ ID NO:208)，

h.PVVFXN(其中X是任何氨基酸，或其中X是F、L、V或I)(SEQ ID NO:209)，

i.PX₁VFX₂N(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是V、I、L或T；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是F、L、V或I)(SEQ ID NO:210)，

j.PVX₁FX₂N(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是V、I、L或T；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是F、L、V或I)(SEQ ID NO:211)，

k.FX₁NX₂EP(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是F、L、V或I；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是K、R、E或G)(SEQ ID NO:212)，或

l.FX₁NX₂E(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是F、L、V或I；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是K、R、E或G)(SEQ ID NO:213)；

(h)一段至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、或30个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置150、155、或160的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％一致性；

(i)具有以下序列的一段氨基酸

a.PGHPDAEART(SEQ ID NO:214)，

b.PGHX₁DAX₂X₃RT(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是P、Q、V、I或E；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是E、I、K或Q；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ IDNO:215)，

c.GHX₁DAX₂X₃RT(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是P、Q、V、I或E；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是E、I、K或Q；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ IDNO:216)，

d.HX₁DAX₂X₃RT(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是P、Q、V、I或E；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是E、I、K或Q；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ IDNO:217)，

e.DAX₁X₂RT(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是E、I、K或Q；并且其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ ID NO:218)，

f.PGHX₁DAX₂X₃R(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是P、Q、V、I或E；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是E、I、K或Q；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ IDNO:219)，

g.PGHXDA(其中X是任何氨基酸，或其中X是P、Q、V、I或E)(SEQ ID NO:220)，

h.PGHXD(其中X是任何氨基酸，或其中X是P、Q、V、I或E)(SEQ ID NO:221)，

i.PGNPDAEART(SEQ ID NO:222)，

j.PGNX₁DAX₂X₃RT(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是P、Q、V、I或E；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是E、I、K或Q；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ IDNO:223)，

k.GNX₁DAX₂X₃RT(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是P、Q、V、I或E；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是E、I、K或Q；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ IDNO:224)，

l.NX₁DAX₂X₃RT(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是P、Q、V、I或E；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是E、I、K或Q；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ IDNO:225)，

m.PGNX₁DAX₂X₃R(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是P、Q、V、I或E；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是E、I、K或Q；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A、L、V、K、Q或Y)(SEQ IDNO:226)，

n.PGNXDA(其中X是任何氨基酸，或其中X是P、Q、V、I或E)(SEQ ID NO:227)，或

o.PGNXD(其中X是任何氨基酸，或其中X是P、Q、V、I或E)(SEQ ID NO:228)；

(j)一段至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、或30个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置183的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％一致性；

(k)具有以下序列的一段氨基酸

a.DTAMWD(SEQ ID NO:229)，

b.DTAMCD(SEQ ID NO:230)，

c.DTAMW(SEQ ID NO:231)，

d.DTAMC(SEQ ID NO:232)，

e.TAMWD(SEQ ID NO:233)，

f.TAMCD(SEQ ID NO:234)，

g.AX₁WX₂X₃(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是M或N；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是D或N；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是T或R)(SEQ ID NO:235)，或

h.AX₁CX₂X₃(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是M或N；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是D或N；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是T或R)(SEQ ID NO:236)；

(l)一段至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、或30个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置210的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％一致性；

(m)具有以下序列的一段氨基酸

a.IEVVIANND(SEQ ID NO:237)，

b.EVVIANND(SEQ ID NO:238)，

c.IEVVIANN(SEQ ID NO:239)，

d.EVVIANN(SEQ ID NO:240)，

e.IEX₁VX₂X₃NND(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是V、A、L或C；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是I、F或L；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A或C)(SEQ ID NO:241)，

f.IEX₁VX₂X₃NN(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是V、A、L或C；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是I、F或L；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A或C)(SEQ ID NO:242)，

g.EX₁VX₂X₃NND(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是V、A、L或C；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是I、F或L；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A或C)(SEQ ID NO:243)，或

h.EX₁VX₂X₃NN(其中X₁是任何氨基酸，或其中X₁是V、A、L或C；其中X₂是任何氨基酸，或其中X₂是I、F或L；并且其中X₃是任何氨基酸，或其中X₃是A或C)(SEQ ID NO:244)；

(n)一段至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、或30个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置235或240的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％一致性；

(o)具有以下序列的一段氨基酸

a.PVFGVDA(SEQ ID NO:245)，

b.VFGVDA(SEQ ID NO:246)，

c.PVFGVD(SEQ ID NO:247)，

d.FGVDA(SEQ ID NO:248)，

e.PVXGVDA(其中X是任何氨基酸或其中X是F、V或I)(SEQ ID NO:249)，

f.VXGVDA(其中X是任何氨基酸或其中X是F、V或I)(SEQ ID NO:250)，

g.PVXGVD(其中X是任何氨基酸或其中X是F、V或I)(SEQ ID NO:251)，或

h.VXGVD(其中X是任何氨基酸或其中X是F、V或I)(SEQ ID NO:252)；

(p)一段至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、或30个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置255或260的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％一致性；

(q)具有序列GTVLNDA(SEQ ID NO:253)、GTVLND(SEQ ID NO:254)、GTVLN(SEQ IDNO:255)、或TVLND(SEQ ID NO:256)的一段氨基酸；

(r)与ecGGBP相比不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或15个缺失的或插入的氨基酸，与其天然对应物相比不包括添加到多肽的N-末端或C-末端的所添加的氨基酸，并且包括或不包括多肽的天然对应物的信号肽；

(s)至少8个、9个、10个、或11个α-螺旋，或恰好8个、9个、10个、或11个α-螺旋；和/或

(t)至少9个、10个、11个、或12个β-折叠，或恰好9个、10个、11个、或12个β-折叠。

在实施例中，上述特征(c)-(q)中的两个或更多个或每一个以上文所列出的顺序出现在多肽中，这是因为从N-末端到C-末端观察或读取多肽的氨基酸序列(其间具有另外的特征和/或氨基酸序列)。例如，多肽可以具有N-末端，接着是特征(c)、(d)、或(e)，接着是特征(f)或(g)，接着是特征(h)或(i)，接着是特征(j)或(k)，接着是特征(l)或(m)，接着是特征(n)或(o)，接着是特征(p)或(q)，接着是C-末端。

如本文所使用的，当提及从N-末端到C-末端读取的氨基酸中特征的顺序时，在氨基酸序列中第二特征出现在第一特征之后时，第一特征“接着是”第二特征。单词“接着是(followed by)”不要求第二特征紧跟在第一特征之后或接近第一特征。例如，N-末端接着是C-末端。

上文所列出的特征不是限制性的，并且可以与本文所披露的任何其他相关特征(包括下文列出的那些特征)组合。

在一些实施例中，多肽具有以下序列：

其中每个

Z单独地是任何氨基酸或不存在，

X单独地是任何氨基酸，

！单独地是I或V，

$单独地是L或M，

％单独地是F或Y，并且

#单独地是N、D、Q或E。

在非限制性实例中，葡萄糖-半乳糖结合多肽包括通过柔性铰链连接的N-末端结构域和C-末端结构域，其中配体结合位点(配体结合结构域)位于N-末端结构域与C末端结构域之间的裂隙中。

在一些实施例中，葡萄糖-半乳糖结合多肽从N-末端至C-末端包括第一β-折叠(β1)，接着是第一α-螺旋(α1)，接着是第二β-折叠(β2)，接着是第二α-螺旋(α2)，接着是第三β-折叠(β3)，接着是第三α-螺旋(α3)，接着是第四β-折叠(β4)，接着是第四α-螺旋(α4)，接着是第五β-折叠(β5)，接着是第一结构域间铰链区段(h1)，接着是第五α-螺旋(α5)，接着是第六β-折叠(β6)，接着是第六α-螺旋(α6)，接着是第七β-折叠(β7)，接着是第七α-螺旋(α7)，接着是第八β-折叠(β8)，接着是第八α-螺旋(α8)，接着是第九β-折叠(β9)，接着是第九α-螺旋(α9)，接着是第十β-折叠(β10)，接着是第二结构域间铰链区段(h2)，接着是第十α-螺旋(α10)，接着是第三结构域间铰链区段(h3)，接着是第十一β-折叠(β11)。在一些实施例中，多肽包括(i)1个、2个或3个在β1与α1之间的氨基酸取代；(ii)1个、2个或3个在β2与α2之间的氨基酸取代；(iii)1个、2个或3个在β3与α3之间的氨基酸取代；(iv)1个、2个或3个在β4与α4之间的氨基酸取代；(v)1个、2个或3个在β6中的氨基酸取代；(vi)1个、2个或3个在α6中的氨基酸取代；(vii)1个、2个或3个在β7与α7之间的氨基酸取代；(viii)1个、2个或3个在α8中的氨基酸取代；和/或(ix)1个、2个或3个在β9与α9之间的氨基酸取代。在一些实施例中，这些取代是保守取代。在各种实施例中，多肽包括在β7、α7或在β7与α7之间的半胱氨酸取代。

葡萄糖-半乳糖结合多肽可以进一步包括1个、2个或更多个Ca²⁺结合位点。

在各种实施例中，葡萄糖-半乳糖结合多肽的主链与ecGGBP、ttGGBP、stGGBP、chyGGBP、cobGGBP、pspGGBP、csaGGBP、bprGGBP、rinGGBP_A、rinGGBP_B、fprGGBP、cljGGBP、cauGGBP、erhGGBP、ereGGBP、和/或chyGGBP之间的C_α均方根偏差(RMSD)是例如，在约或之间，或小于约或在一些实施例中，葡萄糖-半乳糖结合多肽的N-末端结构域(即，结合结构域铰链的N-末端侧的蛋白质部分)主链与ecGGBP、ttGGBP、stGGBP、chyGGBP、cobGGBP、和/或pspGGBP的相应结构域之间的C_αRMSD是例如，在约或之间，或小于约或在某些实施例中，葡萄糖-半乳糖结合多肽的C-末端结构域(即，结合结构域铰链的C-末端侧的蛋白质部分)主链与ecGGBP、ttGGBP、stGGBP、chyGGBP、cobGGBP、pspGGBP、csaGGBP、bprGGBP、rinGGBP_A、rinGGBP_B、fprGGBP、cljGGBP、cauGGBP、erhGGBP、ereGGBP、和/或chyGGBP的相应结构域之间的C_αRMSD是例如，在约或之间，或小于约或在Chothia和Lesk(1986)The EMBO Journal[欧洲分子生物学学会杂志]，5(4):823-826(将其全部内容通过引用并入本文)中讨论了与同源蛋白之间的序列和结构差异有关的非限制性考虑。

在本文所提供的生物传感器中有用的葡萄糖-半乳糖结合多肽的非限制性实例包括ecGGBP、ttGGBP、stGGBP、chyGGBP、cobGGBP、pspGGBP、csaGGBP、bprGGBP、rinGGBP_A、rinGGBP_B、fprGGBP、cljGGBP、cauGGBP、erhGGBP、ereGGBP、和chyGGBP。在实施例中，生物传感器包括与其天然存在的对应物相比具有氨基酸取代的经修饰的ecGGBP、ttGGBP、stGGBP、chyGGBP、cobGGBP、pspGGBP、csaGGBP、bprGGBP、rinGGBP_A、rinGGBP_B、fprGGBP、cljGGBP、cauGGBP、erhGGBP、ereGGBP、或chyGGBP多肽，这样使得该多肽在以下位置处具有半胱氨酸：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、或383、或其1个、2个、3个、4个或5个的任何组合，其中该位置对应本文对于ecGGBP、ttGGBP、stGGBP、chyGGBP、cobGGBP、pspGGBP、csaGGBP、bprGGBP、rinGGBP_A、rinGGBP_B、fprGGBP、cljGGBP、cauGGBP、erhGGBP、ereGGBP、或chyGGBP所披露的SEQ ID NO。在实施例中，半胱氨酸与报告基团轭合。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的ecGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的ecGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：Y10X、D14X、N15X、F16X、P70X、N91X、K92X、S112X、S115X、E149X、H152X、P153X、D154X、A155X、R158X、M182X、W183X、N211X、D212X、D236X、L238X、D257X、P294X、和V296X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在不包括信号肽的ecGGBP(SEQID NO:17)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的ecGGBP包括以下取代中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或11个：Y10A、Y10C、D14C、D14A、D14Q、D14N、D14S、D14T、D14E、D14H、D14L、D14Y、D14F、F16L、F16A、F16C、N91C、N91A、K92A、K92C、E149C、E149K、E149Q、E149S、H152C、H152A、H152F、H152Q、H152N、D154C、D154A、D154N、A155C、A155S、A155H、A155L、A155F、A155Y、A155N、A155K、A155M、A155W、A155Q、R158C、R158A、R158K、M182C、M182W、W183C、N211C、N211F、N211W、N211K、N211Q、N211S、N211H、N211M、N211C、D212C、L238C、D236C、D236A、D236N、N256A、N256D、D257C、P294C、和V293C。

在各种实施例中，生物传感器包括经修饰的ttGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的ttGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：Y11X、D15X、T16X、F17X、G20X、N42X、V67X、R69X、R91X、E92X、A111X、Q148X、H151X、Q152X、A154X、N181X、W182X、D183X、D211X、T237X、T240X、L257X、N258X、D259X、A260X、和K300X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的ttGGBP(SEQ ID NO:18)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的ttGGBP包括以下取代中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或11个：Y11C、D15A、D15E、D15N、D15C、T16S、T16N、T16C、F17C、G20A、G20C、N42C、V67C、R69P、R69C、R91K、E92C、A111C、Q148S、Q148K、Q148E、Q148C、H151Q、H151N、H151F、H151C、Q152P、Q152C、A154S、A154N、A154M、A154F、A154C、N181C、W182C、D183C、D211A、D211C、T237C、T240A、L257C、N258D、N258S、N258A、N258C、D259C、A260N、A260Q、A260R、A260K、A260W、A260F、A260Y、A260S、A260C、和K300C。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的stGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的stGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：Y11X、Y13X、D15X、N16X、F17X、P71X、N92X、K93X、P113X、S116X、E150X、H153X、P154X、D155X、A156X、R159X、M183X、W184X、N211X、N212X、D213X、A214X、D237X、L239X、D258X、P295X、和V297X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的stGGBP(SEQ ID NO:19)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的stGGBP包括以下突变中的1个、2个或3个：Y13C、F17C、和W184C。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的chyGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的chyGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：F12X、D14X、T15X、F16X、R68X、N89X、R90X、A110X、S113X、E147X、H150X、Q151X、D152X、A153X、R156X、M180X、W181X、N207X、N208X、D209X、D210X、D237X、T239X、D258X、V296X、和Y298X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的chyGGBP(SEQ ID NO:20)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的chyGGBP包括以下突变中的1个、2个或3个：F12C、F16C、C39A、W181C、和C206A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的cobGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的cobGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：F12X、D14X、T15X、F16X、C39X、R68X、N89X、R90X、A110X、S113X、E147X、H150X、Q151X、D152X、A153X、R156X、C173X、M180X、W181X、C206X、N207X、N208X、D209X、D210X、D237X、T239X、D258X、P297X、和Q299X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的cobGGBP(SEQ ID NO:21)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的cobGGBP包括以下突变中的1个、2个或3个：F12C、F16C、C39A、C173A、W181C、和C206A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的pspGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的pspGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：F9X、D11X、T12X、F13X、R65X、N86X、R87X、A107X、S110X、E144X、H147X、Q148X、D149X、A150X、R153X、M177X、W178X、N204X、N205X、D206X、D207X、D234X、T236X、255X、A294X、和K296X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的pspGGBP(SEQ ID NO:22)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的pspGGBP包括以下突变中的1个、2个或3个：F9C、F13C、和W178C。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的csaGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的csaGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：Y14X、D16X、F18X、C62X、I72X、C82X、N93X、R94X、C113A、S118X、A121X、E152X、N155X、E156X、D157X、S158X、R161X、N185X、W186X、C211X、D241X、L243X、D262X、D290X、I292X、I297X、F299X、Q301X、和T302X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的csaGGBP(SEQ ID NO:23)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的csaGGBP包括以下突变中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、或8个：Y14C、F18C、C62A、C82A、C113A、W186C、和C211A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的bprGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的bprGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：C8X、K12X、D14X、N15X、F16X、S72X、N93X、R94X、C112X、C116X、A118X、S121X、A153X、N156X、I157X、D158X、A159X、C179X、N186X、W187X、C211X、N212X、N213X、D214X、A215X、D241X、D243X、K251X、C289X、D290X、和V292X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的bprGGBP(SEQ ID NO:24)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的bprGGBP包括以下突变中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、或9个：C8A、K12C、F16C、C112A、C116A、C179A、W187C、C211A、和C289A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的rinGGBP_A。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的rinGGBP_A可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：C6X、F10X、D12X、N13X、F14X、S70X、N91X、R92X、C114X、A116X、Q118X、D151X、N154X、V155X、D156X、A157X、R160X、C177X、N184X、W185X、C210X、N211X、N212X、D213X、A214X、D240X、L242X、L250X、C288X、D289X、和V291X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的rinGGBP_A(SEQ ID NO:25)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的rinGGBP_A包括以下突变中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、或8个：C6A、F10C、F14C、C114A、C177A、W185C、C210A、和C288A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的rinGGBP_B。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的rinGGBP_B可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：Q13X、D15X、T16X、F17X、C66X、C70A、R76X、N97X、R98X、A118X、S121X、E155X、H158X、Q159X、D160X、A161X、R164X、N188X、W189X、N215X、N216X、D217X、D218X、D244X、T246X、D265X、P301X、A303X、和C306X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的rinGGBP_B(SEQ ID NO:29)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的rinGGBP_B包括以下突变中的1个、2个、3个、4个、5个、或6个：Q13C、F17C、C66A、C70A、W189C、和C306A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的fprGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的fprGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：C8A、F12X、D14X、N15X、F16X、T69X、N90X、R91X、C105X、C106X、A113X、S116X、C143X、D146X、N149X、I150X、D151X、A152X、R155X、N179X、W180X、C205A、N206X、N207X、D208X、A209X、D235X、L237X、N243X、D284X、和V286X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的fprGGBP(SEQ ID NO:26)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的fprGGBP包括以下突变中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、或7个：C8A、F12C、F16C、C105A、C106A、C143A、W180C、和C205A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的cljGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的cljGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：F11X、N13X、T14X、W15X、V67X、C77X、N88X、R89X、A109X、S112X、E142X、N145X、Q146X、D147X、A148X、R151X、M175X、W176X、C198X、N201X、N202X、D203X、D204X、D231X、T233X、D252X、D291X、和K294X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的cljGGBP(SEQ ID NO:27)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的cljGGBP包括以下突变中的1个、2个、3个、4个、或5个：F11C、W15C、C77A、W176C、和C198A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的cauGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的cauGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：F12X、N14X、T15X、W16X、V68X、C78X、N89X、R90X、A110X、S113X、E143X、N146X、Q147X、D148X、A149X、R152X、M176X、W177X、C199X、N203X、N204X、D205X、D206X、D233X、T235X、D254X、D293X、和K295X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的cauGGBP(SEQ ID NO:28)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的cauGGBP包括以下突变中的1个、2个、3个、4个、或5个：F12C、W16C、C78A、W177C、和C199A。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的erhGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的erhGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：F13X、D15X、N16X、F17X、P76X、N97X、R98X、A119X、S122X、D153X、N156X、V157X、D158X、A159X、R162X、M187X、W188X、N214X、N215X、D216X、G217X、D243X、I245X、D264X、E312X、和V314X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的erhGGBP(SEQ IDNO:30)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的erhGGBP包括以下突变中的1个、2个或3个：F13C、F17C、和W188C。

在实施例中，生物传感器包括经修饰的ereGGBP。在非限制性实例中，与其天然存在的对应物相比，经修饰的ereGGBP可以包括以下取代中的一个或多个、或任何组合：Q13X、D15X、T16X、F17X、C29X、C65X、C69X、R75X、N96X、R97、A117X、S120X、E154X、H157X、Q158X、D159X、A160X、R163X、C183X、N187X、W188X、N214X、N215X、D216X、A217X、D243X、T245X、D264X、P301X、和E303X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在信号肽被甲硫氨酸置换的ereGGBP(SEQ ID NO:31)中进行计数。在一些实施例中，经修饰的ereGGBP包括以下突变中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、或8个：C10A、Q13C、F17C、C29A、C65A、C69A、C183A、和W188C。

在各种实施例中，突变葡萄糖-半乳糖结合多肽的葡萄糖和/或半乳糖，与其天然存在的对应物相比，解离常数相差至少约1μM、5μM、10μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、75μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、或100mM(增加或减少)。

本文所提供的生物传感器和配体结合蛋白在大范围的物理条件(例如，压力、温度、盐度、渗透压和pH条件)下是稳健且有用的。例如，本文所提供的生物传感器和配体结合蛋白可以在干燥或暴露于高温后存活相当长的时间段。在一些实施例中，生物传感器在暴露于约40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、或125℃、或40℃-125℃的温度约1、2、3、4、5、6、15、30、60、120、180、240、或360分钟之后，维持至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或更多的其信号转导活性。在某些实施例中，生物传感器在水性溶液中进行1、2、3、4、或5次冻融循环之后，维持至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或更多的其信号转导活性。在各种实施例中，生物传感器以干燥形式在20℃至37℃之间的温度下储存约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、或1-24个月之后，维持至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或更多的其信号转导活性。在一些实施例中，生物传感器的最佳功能温度是在41℃与122℃之间、在20℃与40℃之间、或小于约10℃(例如，在-20℃与+10℃之间)。可以例如在具有或不具有避免光暴露的保护的情况下储存本文所提供的装置、组合物和生物传感器。在一些实施例中，在黑暗中(例如，具有避免光的保护的情况下)储存装置、组合物和生物传感器。

报告基团附接

本申请主题的方面提供了包括一个或多个报告基团的生物传感器，所述报告基团与配体结合蛋白附接，其中配体与配体结合蛋白的配体结合结构域的结合引起通过报告基团进行的信号传导的改变。在各种实施例中，报告基团与配体结合蛋白的内部空间位点(endosteric site)、变构位点、或外周空间位点(peristeric site)附接。在实施例中，报告基团共价或非共价附接至配体结合蛋白。

为了方便和取决于上下文，报告基团可以通过该报告基团的未附接形式的名称来提及，而不管该报告基团是否附接至配体结合蛋白。例如，当处于未轭合形式时称为“化合物A”的化合物当处于与配体结合蛋白附接的形式时在本文中可以被称为“化合物A”。在具体的实例中，术语“Acrylodan”用于指未反应/未轭合的Acrylodan、以及与配体结合蛋白轭合的Acrylodan。

在某些实施例中，生物传感器包括与配体结合蛋白轭合的报告基团，并且该报告基团与蛋白质的氨基酸轭合，当配体与该蛋白质结合时该氨基酸与该配体相距至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或在一些实施例中，报告基团与α-螺旋或β-折叠内的蛋白质的氨基酸轭合。在一些实施例中，报告基团与如下氨基酸轭合，该氨基酸(i)不在α-螺旋或β-折叠内，但是在蛋白质氨基酸序列的位于α-螺旋或β-折叠内的氨基酸的约10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、或1个氨基酸内。在一些实施例中，报告基团与在蛋白质的两个结构域之间的结构域间铰链氨基酸区域中的氨基酸轭合。在一些实施例中，报告基团与如下氨基酸轭合，该氨基酸在蛋白质的(i)α-螺旋与β-折叠之间；(ii)两个α-螺旋之间；或(iii)两个β-折叠之间的结构域间铰链氨基酸区域中。在一些实施例中，报告基团与在多肽(例如，与多肽的天然存在的对应物相比，不包括N-末端融合蛋白)的位置1-25、25-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-350、275-300、275-325、300-325、300-350、300-383、或350-383(包含端值)之间的氨基酸(例如，半胱氨酸，如与天然对应的多肽相比通过取代添加的半胱氨酸)轭合。

通过用与荧光团附接(“内部空间”附接位点)的半胱氨酸置换已知形成配体接触的残基，可以容易地设计在蛋白质与报告基团之间的直接信号传导关系。另外，间接信号传导关系可以通过两种方式建立。第一种依赖于对配体复合物结构进行的视觉检查，并且鉴定位于结合位点附近但不直接与配体相互作用并且可能参与构象变化的残基。通常，这样的“外周空间”位点位于与结合的配体形成直接接触的残基附近。在bPBP的情况下，此类残基位于形成配体结合位点的结构域间裂隙的周界。在形成闭合状态时，这些外周空间位点的环境发生显著变化。这些是靠近配体结合口袋/结构域的位置的实例。第二种最普遍的方法鉴定蛋白质结构中的位点，这些位点位于蛋白质的任何位置，包括与配体结合位点相距一定距离的位置(即，位于配体结合口袋/结构域的远端)，并且经历与配体结合相呼应的局部构象变化。如果开放状态和闭合状态的结构是已知的，则可以使用分析与配体结合伴随的构象变化的计算方法来鉴定此类“变构”位点(Marvin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]),94:4366-4371,1997)。可替代地，一旦在一个bPBP中鉴定了变构位点，就可以引用模型和结构同源论证来鉴定仅表征了一种状态的其他bPBP中的此类位点(Marvin和Hellinga,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]120:7-11,1998)。这种广义的构象分析还可以鉴定通过视觉检查鉴定和分类的外周空间位点和内部空间位点。

在非限制性实施方式中，报告基团经由生物素-抗生物素蛋白相互作用附接至所述配体结合蛋白。报告基团可以例如与生物素轭合，并且配体结合蛋白与抗生物素蛋白轭合。在一个实例中，抗生物素蛋白结合四种生物素分子，其中每种生物素分子单独与报告基团轭合。可替代地，报告基团与抗生物素蛋白轭合，并且配体结合蛋白与生物素轭合。例如，抗生物素蛋白结合四种生物素分子，其中每种生物素分子单独与配体结合蛋白轭合。

如本文所使用的，“轭合”意指共价附接。一种化合物可以直接与另一种化合物轭合，或例如经由接头间接轭合。

在一些实施例中，报告基团直接附接至所述配体结合蛋白。在各种实施例中，报告基团与配体结合蛋白的氨基酸附接，当配体与该配体结合蛋白结合时该氨基酸与该配体相距至少约2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或在某些实施例中，报告基团与具有如下位置的氨基酸轭合，该位置在配体结合蛋白的位置1-25、25-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、或275-300内，其中位置1是配体结合蛋白的N-末端氨基酸。在非限制性实例中，报告基团与配体结合蛋白的氨基酸轭合，该氨基酸(a)在配体结合蛋白的α-螺旋或β-折叠内；(b)不在α-螺旋内；(c)不在β-折叠内；(d)在α-螺旋或β-折叠内的氨基酸的约5个或10个氨基酸内；(e)在将配体结合蛋白的两个结构域连接的一段连续氨基酸内；(f)在将α-螺旋和β-折叠连接的一段连续氨基酸内；(g)在将两个α-螺旋连接的一段连续氨基酸内；或(h)在将两个β-折叠连接的一段连续氨基酸内。在一些实施例中，报告基团直接附接至配体结合蛋白的N-末端或C-末端。

报告基团可以经由各种接头或键与配体结合蛋白轭合，这些接头或键包括(但不限于)二硫键、酯键、硫酯键、酰胺键或已经通过点击反应形成的键。在一些实施例中，点击反应是以下物质之间的反应：(a)叠氮化物和炔烃；(b)在Cu(I)存在下的叠氮化物和炔烃；(c)叠氮化物和应变环辛炔；(d)叠氮化物和二苄基环辛炔、二氟辛炔或二芳基氮杂环辛炔酮；(e)二芳基应变环辛炔和1,3-硝酮；(f)叠氮化物、四嗪、或四唑和应变烯烃；(g)叠氮化物、四嗪、或三唑和氧杂降冰片二烯、环辛烯或反式环烯烃；(h)四唑和烯烃；或(i)具有被紫外线活化的氨基或苯乙烯基基团的四唑、和烯烃。这些示例性点击化学反应具有高特异性、有效的动力学，并且在生理条件下在体内发生。参见，例如，Baskin等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]104(2007):16793；Oneto等人Actabiomaterilia[生物材料学报](2014)；Neves等人Bioconjugate chemistry[生物轭合化学]24(2013):934；Koo等人Angewandte Chemie[应用化学]51(2012):11836；Rossin等人Angewandte Chemie[应用化学]49(2010):3375，以及2016年8月4日公开的美国专利申请公开号20160220686，将其中的每一个的全部内容通过引用并入本文。关于各种点击化学反应及其方法学的综述，参见例如Nwe K和Brechbiel M W,2009Cancer Biotherapy andRadiopharmaceuticals[癌症生物疗法和放射性药物],24(3):289-302；Kolb H C等人,2001Angew.Chem.Int.Ed.[德国应用化学国际版]40:2004-2021。将上述参考文献中的每一篇的全部内容通过引用并入本文。

如本文所使用的，术语“接头”是指如在桥中那样将一个分子或序列附接至另一个分子或序列的分子或序列(如氨基酸序列)。“连接”意指通过共价键、或非共价键、或其他键如范德华力附接或结合。在一些实施例中，接头包括由用于将一个分子附接至另一个的反应产生的化学结构。

在本申请主题的各种实施方式中，报告基团与配体结合蛋白的半胱氨酸轭合。半胱氨酸可以存在于配体结合蛋白的天然对应物或形式上，或通过取代突变添加至配体结合蛋白。在一些实施例中，半胱氨酸位于所述配体结合蛋白的N-末端或C-末端。

非限制性实例涉及报告基团与配体结合蛋白的伯胺的轭合。在某些实施例中，伯胺存在于所述配体结合蛋白的赖氨酸中。赖氨酸可以存在于配体结合蛋白的天然对应物或形式上，或通过取代突变添加至配体结合蛋白。在各种实施例中，赖氨酸位于配体结合蛋白的N-末端或C-末端。

本申请主题的方面提供了其中的报告基团经由接头与配体结合蛋白附接的生物传感器。在一些实施例中，接头包括长度小于约30、20、15或的有机化合物。间隔基的非限制性实例包括O、S、NH、PH和烷基间隔基。

如本文所使用的，“烷基”是指饱和或不饱和脂肪族基团的基团，包括直链烷基、烯基或炔基基团；支链烷基、烯基或炔基基团；环烷基、环烯基或环炔基(脂环族)基团；烷基取代的环烷基、环烯基或环炔基基团；以及环烷基取代的烷基、烯基或炔基基团。除非另外指明，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链是C₁-C₃₀，对于支链是C₃-C₃₀)、更优选20个或更少的碳原子、更优选12个或更少的碳原子、以及最优选8个或更少的碳原子。同样，优选的环烷基在其环结构中具有3-10个碳原子，并且更优选地在该环结构中具有5个、6个或7个碳。上面所提供的范围包括最小值和最大值之间的所有值。术语“烷基”包括“未经取代的烷基”和“经取代的烷基”两者，其中的后者是指具有一个或多个取代基的烷基部分，所述取代基置换在烃主链的一个或多个碳上的氢。此类取代基包括但不限于卤素、羟基、羰基(如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基、或芳香族或杂芳香族部分。除非碳的数目另有说明，如本文所使用的“低级烷基”意指如上文所定义的但其主链结构中具有从1个至10个碳、更优选从1个至6个碳原子的烷基。同样，“低级烯基”和“低级炔基”具有相似的链长。优选的烷基基团是低级烷基。烷基基团还可以在碳主链内含有一个或多个杂原子。优选地，掺入碳主链中的杂原子是氧、氮、硫及其组合。在某些实施例中，烷基基团含有在1个与4个之间的杂原子。

在一些实施例中，接头包括通过涉及反应性基团(如马来酰亚胺基团)的化学反应形成的键。可替代地或另外地，接头包括一段氨基酸。在非限制性实例中，接头包括聚甘氨酸接头。在实施例中，聚甘氨酸接头包括2个、3个、4个、5个或更多个甘氨酸。任选地，聚甘氨酸接头进一步包括丝氨酸。

在各种实施方式中，报告基团经由共价键附接至接头，并且接头经由共价键附接至配体结合蛋白。在实施例中，在接头与报告基团之间的共价键和/或在接头与配体结合蛋白之间的共价键是二硫键、酯键、硫酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键或已经通过点击反应形成的键。点击反应的非限制性实例包括在以下物质之间的反应：叠氮化物和炔烃；在Cu(I)存在下的叠氮化物和炔烃；叠氮化物和应变环辛炔；叠氮化物和二苄基环辛炔、二氟辛炔或二芳基氮杂环辛炔酮；二芳基应变环辛炔和1,3-硝酮；叠氮化物、四嗪、或四唑和应变烯烃；叠氮化物、四嗪、或三唑和氧杂降冰片二烯、环辛烯或反式环烯烃；四唑和烯烃；或具有被紫外线活化的氨基或苯乙烯基基团的四唑、和烯烃。

报告基团

各种类型的报告基团可以用于本申请主题的实施例中。例如，报告基团可以包括产生荧光信号的荧光团。包括荧光团的生物传感器在本文中可以被称为荧光响应性传感器(FRS)。

优选地，配体与FRS的结合导致来自报告基团的信号中比率ΔR的变化。比率信号(R_1,2)被定义为在两个独立的波长λ₁和λ₂处测量的两个强度I_λ1和I_λ2的商，并且可以根据以下等式进行计算：

R_1,2＝I_λ1/I_λ2

在一些实施例中，强度在记录的发射光谱中的波长范围上被积分。在一些实施例中，强度在中心在400-800nm之间(例如，对于λ₁在420nm与520nm之间)、以及在400-800nm之间(例如，对于λ₂在500nm与600nm之间)的10-nm、15-nm、20-nm、25-nm、30-nm、35-nm、40-nm、45-nm、50-nm、75-nm、100-nm、10-40-nm、10-50-nm、20-50-nm、或10-100-nm区域上被积分。在一些实施例中，通过带通滤波器记录强度。带通滤波器的非限制性实例是10-nm、15-nm、20-nm、25-nm、30-nm、35-nm、40-nm、45-nm、50-nm、75-nm、100-nm、10-40-nm、10-50-nm、20-50-nm、或10-100-nm带通滤波器，中心在400-800nm之间(例如在452nm处)(对于λ₁)、以及在400-800nm处(例如在528nm处)(λ₂)。

本申请主题的方面提供了FRS，这些FRS的发射光谱响应于配体结合而改变(例如，发射光谱形状改变)。在各种实施例中，FRS发射光谱的两个选定波长处的强度比率在配体结合时发生变化。在一些实施例中，在荧光团内原子的位置相对于彼此改变时(例如，由于结合的原子相对于彼此的旋转或键的角度的变化)，荧光团的发射波长和/或强度改变。在非限制性实例中，当(i)荧光团的一部分与荧光团的另一部分相比围绕键轴旋转时和/或(ii)当在所述荧光团的两个原子之间键的角度改变时，荧光团的发射波长和/或强度改变。在非限制性实例中，荧光团是衍生自prodan的荧光团(例如，Acrylodan或Badan)，并且配体的结合改变二甲氨基基团、萘环和/或羰基相对于配体结合蛋白和/或相对于彼此的取向。在非限制性实例中，荧光团上偶极的偏振度响应于配体结合而改变。在各种实施例中，当原子与所述荧光团静电相互作用时，荧光团的发射波长和/或强度改变。例如，当正电荷或负电荷源在荧光团的约1、2、3、4、5或内改变其相对于荧光团的距离时，荧光团的发射波长和/或强度改变。在一些实施例中，荧光团在配体与配体结合蛋白的配体结合结构域结合时表现出蓝移(hypsochromicity)或红移(bathochromicity)。在某些实施例中，荧光团具有如下发射波长，该发射波长包括约550纳米(nm)、575nm、600nm、625nm、650nm、或550-650nm的波长。

在一些实施例中，信号包括在单一波长处或在波长范围内记录的荧光团的发射强度。信号的变化可能是单一波长或波长范围的移位。在一些实施例中，波长的移位是至少约1nm、至少约2nm、至少约3nm、至少约4nm、至少约5nm、至少约6nm、至少约7nm、至少约8nm、至少约9nm、至少约10nm、至少约11nm、至少约12nm、至少约13nm、至少约14nm、至少约15nm、至少约16nm、至少约17nm、至少约18nm、至少约19nm、至少约20nm、至少约25nm、至少约30nm、至少约35nm、至少约40nm、至少约45nm、至少约50nm、至少约55nm、至少约60nm、至少约65nm、至少约70nm、至少约75nm、至少约80nm、至少约85nm、至少约90nm、至少约95nm、至少约100nm、至少约105nm、至少约110nm、至少约115nm、至少约120nm、至少约125nm、或至少约130nm。在一些实施例中，波长的移位是约1nm至约20nm、约2nm至约20nm、约3nm至约20nm、约4nm至约20nm、约5nm至约20nm、约1nm至约19nm、约1nm至约18nm、约1nm至约17nm、1nm至约16nm、约1nm至约15nm、约1nm至约14nm、约1nm至约13nm、约1nm至约12nm、约1nm至约11nm、或约1nm至约10nm。在一些实施例中，波长的移位是约1nm至约20nm。在一些实施例中，波长的移位是约1nm至约130nm。

在某些实施例中，信号包括在两个不同波长处或波长范围内记录的发射强度的比率或商，即比率信号。例如，如图1A-C所示，配体结合可以通过测量蓝色与绿色发射强度的比率来确定。信号的变化可以是在一个波长处的发射强度减小，且在另一波长处的发射强度没有变化。信号的变化可以是在一个波长处的发射强度增大，且在另一波长处的发射强度没有变化。信号的变化可以是在一个波长处的发射强度增大，且在另一波长处的发射强度增大。信号的变化可以是在一个波长处的发射强度减小，且在另一波长处的发射强度减小。信号的变化可以是在一个波长处的发射强度增大，且在另一波长处的发射强度减小。在一些实施例中，在两个不同波长处或波长范围内记录的发射强度比率的变化可以是至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.4倍、至少约1.6倍、至少约1.8倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约14倍、至少约16倍、至少约18倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍、或至少约100倍。在一些实施例中，在两个不同波长处或波长范围内记录的发射强度比率的变化可以是至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的减小，或者是5％-25％、25％-50％、25％-75％、50％-75％、50％-90％、或75％-99％的减小或其倒数的减小。

信号的变化可以是两个不同波长或波长范围的比率的变化。信号的变化可以是两个不同波长或波长范围的移位。在一些实施例中，一个波长移位。在一些实施例中，两个波长都移位。在一些实施例中，波长的移位是至少约1nm、至少约2nm、至少约3nm、至少约4nm、至少约5nm、至少约6nm、至少约7nm、至少约8nm、至少约9nm、至少约10nm、至少约11nm、至少约12nm、至少约13nm、至少约14nm、至少约15nm、至少约16nm、至少约17nm、至少约18nm、至少约19nm、至少约20nm、至少约25nm、至少约30nm、至少约35nm、至少约40nm、至少约45nm、至少约50nm、至少约55nm、至少约60nm、至少约65nm、至少约70nm、至少约75nm、至少约80nm、至少约85nm、至少约90nm、至少约95nm、至少约100nm、至少约105nm、至少约110nm、至少约115nm、至少约120nm、至少约125nm、或至少约130nm。在一些实施例中，波长的移位是约1nm至约20nm、约2nm至约20nm、约3nm至约20nm、约4nm至约20nm、约5nm至约20nm、约1nm至约19nm、约1nm至约18nm、约1nm至约17nm、1nm至约16nm、约1nm至约15nm、约1nm至约14nm、约1nm至约13nm、约1nm至约12nm、约1nm至约11nm、或约1nm至约10nm。在一些实施例中，波长的移位是约1nm至约20nm。在一些实施例中，波长的移位是约1nm至约130nm。

荧光团可以包括例如分子量小于约2000道尔顿(Da)的荧光蛋白或有机化合物。可商购的荧光团的非限制性实例包括例如5-碘乙酰胺基荧光素(5IAF)或6-碘乙酰胺基荧光素(6IAF)、罗丹明、俄勒冈绿(Oregon Green)、曙红、德克萨斯红(Texas Red)、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫代碳菁、份菁、Badan、Acrylodan、IAEDANS、包括3-氰基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素-3-甲酸、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素、或7-氨基-4-甲基香豆素、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、DRAQ5、DRAQ7或CyTRAK橙(CyTRAK Orange)、瀑布蓝(cascadeblue)、尼罗红(Nile red)、尼罗蓝(Nile blue)、甲酚紫、噁嗪170、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、金胺、结晶紫、孔雀石绿、卟吩、酞菁、胆红素、芘、N,N'-二甲基-N-(碘乙酰基)-N'-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)乙二胺(NBD)、N-((2-(碘乙酰氧基)乙基)N-甲基-1)氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBDE)、Acrylodan、JPW4039、JPW4042、JPW4045、俄勒冈绿(OregonGreen)、太平洋蓝(Pacific Blue)、CPM、N,N'-二甲基-N-(碘乙酰基)-N'-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)乙二胺(IANBD)、7-二乙基氨基-3-(4'-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基香豆素(CPM)、BODIPY 499、BODIPY 507/545、BODIPY 499/508、Alexa 432、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Cy5、或1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐(PyMPO马来酰亚胺)(PyMPO)。在各种实施例中，报告基团在与本文所披露的多肽轭合之前是硫醇反应性的。在实施例中，报告基团经由二硫键与本文所披露的多肽连接。可商购的荧光团的其他非限制性实例包括荧光蛋白，例如蓝色荧光蛋白(BFP)、TagBFP、mTagBFP2、石青蓝(Azurite)、增强型蓝色荧光蛋白2(EBFP2)、mKalama1、Sirius、天蓝色(Sapphire)、T-天蓝色(T-Sapphire)、青色荧光蛋白(CFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、蔚蓝(Cerulean)、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-青色(Midoriishi-Cyan)、TagCFP、mTFP1、AmCyan1、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、翠绿色(Emerald)、Superfolder GFP、AcGFP1、ZsGreen1、单体阿扎米绿(MonomericAzami Green)、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、柠檬色(Citrine)、Venus、超级黄色荧光蛋白2(SYFP2)、TagYFP、ZsYellow1、mBanana、橙色荧光蛋白(OFP)、单体Kusabira-橙色(Monomeric Kusabira-Orange，mKO)、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2、红色荧光蛋白(RFP)、DsRed-Express、DsRed-Express2、DsRed2、AsRed2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、HcRed1、E2-Crimson、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、或iRFP。

在一些实施例中，荧光团包括呫吨、呫吨衍生物、花菁、花菁衍生物、方酸菁、方酸菁衍生物、萘、萘衍生物、香豆素、香豆素衍生物、噁二唑、噁二唑衍生物、蒽、蒽衍生物、氟化硼络合二吡咯甲川(boradiazaindacine，BODIPY)家族荧光团、芘、芘衍生物、吖啶、吖啶衍生物、芳基次甲基、芳基次甲基衍生物、四吡咯或四吡咯衍生物。例如，荧光团可以包括呫吨衍生物，该呫吨衍生物包括荧光素或荧光素衍生物、罗丹明、俄勒冈绿、曙红或德克萨斯红。荧光素衍生物的非限制性实例包括5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯荧光素、6-四氯荧光素或异硫氰酸酯。在一些实施例中，荧光团包括花菁衍生物，该花菁衍生物包括吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫代碳菁或份菁。在某些实施例中，荧光团包括方酸菁衍生物，该方酸菁衍生物包括环取代的方酸菁。在各种实施例中，荧光团包括萘衍生物，该萘衍生物包括丹磺酰或prodan萘衍生物。在非限制性实例中，荧光团包括prodan或其衍生物。在某些实施例中，荧光团包括Badan、Acrylodan或N-(碘乙酰胺基乙基)-1-萘胺-5-磺酸(IAEDANS)。在一些实施例中，荧光团包括香豆素衍生物，如3-氰基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素-3-甲酸、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素(DiFMU)、或7-氨基-4-甲基香豆素。在各种实施例中，荧光团包括噁二唑衍生物，如吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑或苯并噁二唑。在某些实施例中，荧光团包括蒽衍生物，该蒽衍生物包括蒽醌(如DRAQ5、DRAQ7、或CyTRAK橙)。在各种实施例中，荧光团包括芘衍生物，该芘衍生物包括瀑布蓝。在非限制性实例中，荧光团包括噁嗪衍生物，如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫或噁嗪170。在一些实施例中，荧光团包括吖啶衍生物，如原黄素、吖啶橙或吖啶黄。在某些实施例中，荧光团包括芳基次甲基衍生物，如金胺、结晶紫或孔雀石绿。在各种实施例中，荧光团包括四吡咯衍生物，该四吡咯衍生物包括卟吩、酞菁或胆红素。

本申请主题的方面涉及可以容易地附接至本文所披露的配体结合蛋白(例如，在半胱氨酸残基处)的荧光团的用途。例如，荧光团可以在附接至配体结合蛋白之前包括巯基基团，该基团与配体结合蛋白的部分反应以将荧光团附接至配体结合蛋白。在一些实施例中，荧光团在附接至配体结合蛋白之前包括硫醇基团。例如，荧光团在附接至所述配体结合蛋白之前是硫醇反应性的。可以使用硫醇反应容易地附接至配体结合蛋白的荧光团的非限制性实例包括荧光素、芘、NBD、NBDE、Acrylodan(6-丙烯酰基-2-二甲氨基萘)、Badan(6-溴-乙酰基-2-二甲氨基萘)、JPW4039、JPW4042或JPW4045。

在某些实施例中，荧光团包括基于Prodan的荧光团的衍生物，如Acrylodan或Badan。基于Prodan的荧光团Acrylodan和Badan的激发和发射特性可以通过操纵荧光环系统同时保留二甲氨基供体基团和可扭转的羰基受体而改变(Klymchenko 2013Progress inMolecular Biology and Translational Science[分子生物学和转化科学进展],35-58)。用三环蒽(Lu 2006J.Org.Chem.[有机化学杂志],71,9651-9657)、芴(Kucherak2010J.Phys.Chem.Lett.[物理与化学通讯杂志],1,616-620)、芘(Niko 2013Chem.Eur.J.[欧洲化学杂志],19,9760-9765)、或苯乙烯(Benedetti 2012J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志],134,12418-12421)核心置换双环萘显著地红移激发和发射特性，并且在后两种情况下，通过改善其激发峰值消光系数来提高亮度。上面引用的参考文献中的每一篇(以及本文提到的所有其他参考文献，包括核酸和氨基酸序列登录号参考的内容)的全部内容通过引用并入本文。prodan类似物的非限制性实例包括2-氰基-6-二己基氨基蒽和2-丙酰基-6-二己基氨基蒽、以及包括以下结构的荧光团：

在一些实施例中，荧光团包括荧光蛋白。当与激发辐射接触时发出蓝色、青色、绿色、黄色、橙色、红色、远红外或近红外辐射的荧光蛋白在本领域中是已知的，并且作为蛋白质是可商购的，并且经由编码荧光蛋白的载体表达。荧光蛋白的非限制性实例包括蓝色荧光蛋白(BFP)、TagBFP、mTagBFP2、石青蓝、增强型蓝色荧光蛋白2(EBFP2)、mKalama1、Sirius、天蓝色、T-天蓝色、青色荧光蛋白(CFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、蔚蓝、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-青色、TagCFP、mTFP1、AmCyan1、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、翠绿色、Superfolder GFP、AcGFP1、ZsGreen1、单体阿扎米绿、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、柠檬色、Venus、超级黄色荧光蛋白2(SYFP2)、TagYFP、ZsYellow1、mBanana、橙色荧光蛋白(OFP)、单体Kusabira-橙色(mKO)、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2、红色荧光蛋白(RFP)、DsRed-Express、DsRed-Express2、DsRed2、AsRed2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、HcRed1、E2-Crimson、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、或iRFP。

在一些实施例中，荧光团包括量子点(Medintz等人2005)(Sapsford,Berti和Medintz 2006Angew Chem Int Ed Engl[应用化学英文国际版],45,4562-89；Resch-Genger等人2008Nat Methods[自然方法],5,763-75)。在一些实施例中，轭合蛋白的发射特性通过固定在金属纳米颗粒上或附近而增强(Zeng等人2014Chem Soc Rev[化学学会评论],43,3426-52；Shen等人2015Nanoscale[纳米级],7,20132-41)。

在各种实施例中，当配体与配体结合蛋白结合时，生物传感器的峰值发射波长和/或发射强度改变。在一些实施例中，当配体与配体结合蛋白结合时，生物传感器展现出双色信号传导改变。在各种实施例中，当生物传感器与配体结合时，生物传感器的峰值发射波长移位至少约5、10、15、20、30、40、50nm、或约5-50nm。在某些实施例中，当生物传感器与配体结合时，生物传感器的发射强度增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、或300％。在各种实施例中，当配体与配体结合蛋白结合时，由所述报告基团产生的信号持续至少1纳秒(ns)、5ns、10ns、25ns、50ns、75ns、100ns、200ns、300ns、400ns、500ns、600ns、700ns、800ns、900ns、0.001毫秒(ms)、0.01ms、0.1ms、1ms、5ms、10ms、20ms、25ms、50ms、100ms、或500ms。

使用本文所提供的生物传感器的示例性方法

本申请主题的方面提供了测定样品中的配体的方法。该方法可以包括使样品与本文所披露的生物传感器在使得如果所述样品中存在配体则生物传感器的配体结合蛋白与配体结合的条件下接触。该方法还包括检测(i)信号是否由生物传感器的报告基团产生；和/或(ii)由生物传感器的报告基团产生的信号。在非限制性实例中，生物传感器的报告基团是荧光的，并且该方法进一步包括使报告基团与具有如下波长的电磁辐射接触，该波长包括在报告基团的激发波长带内的波长。

在各种实施例中，该方法进一步包括(i)将当生物传感器与样品接触时由生物传感器的报告基团产生的信号与由含有已知量的配体的对照样品产生的信号进行比较；和(ii)基于该比较检测所述样品中配体的存在或不存在。可替代地或另外地，该方法进一步包括(i)将当生物传感器与样品接触时由生物传感器的报告基团产生的信号与由含有已知量的配体的一系列对照样品产生的信号进行比较；和(ii)基于该比较确定样品中配体的量。在一些实施例中，该系列对照样品包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个对照样品，并且其中每个对照样品包括不同量的配体。可替代地或另外地，该方法进一步包括确定样品中配体的浓度，其中确定样品中配体的浓度包括将信号与标准双曲线配体结合曲线进行比较以确定测试样品中配体的浓度，其中通过测量当生物传感器与含有已知浓度的配体的对照样品接触时由生物传感器的报告基团产生的信号来制备标准双曲线配体结合曲线。在各种实施例中，该方法包括(i)测量由报告基团产生的信号的比率变化(ΔR)和/或强度变化(ΔI)。在一些实施例中，该方法包括定量存在于所述样品中的配体的水平。

在各种实施例中，配体包括葡萄糖和/或半乳糖，并且所述配体结合蛋白包括葡萄糖-半乳糖结合蛋白。

本申请主题的方面还提供了测定样品中多种配体的方法，其中所述多种配体包括第一配体和第二配体。这样的方法可以包括，使样品与(i)本文所提供的第一配体的第一生物传感器和(ii)所述第二配体的第二生物传感器在使得如果在所述样品中存在所述第一配体则所述第一生物传感器的配体结合蛋白与所述第一配体结合的条件下接触，和检测(i)由所述第一生物传感器的报告基团产生的信号、或(ii)信号是否由所述第一生物传感器的报告基团产生。在一些实施例中，第二生物传感器也是本文所提供的生物传感器，并且使第二生物传感器与第二配体在使得如果第二配体存在于样品中则第二生物传感器的配体结合蛋白结合第二配体的条件下接触。该方法可以进一步包括检测(i)由第二生物传感器的报告基团产生的信号、或(ii)信号是否由第二生物传感器的报告基团产生。

在一些实施例中，由所述第一生物传感器的报告基团产生的信号不同于由所述第二生物传感器的报告基团产生的信号。在非限制性实例中，所述第一生物传感器的报告基团和所述第二生物传感器的报告基团各自是荧光的，并且第一生物传感器的报告基团的峰值发射波长大于或小于第二生物传感器的报告基团的峰值发射波长至少约10、25、50、75、或100nm。

可以用作第二生物传感器的生物传感器的非限制性实例包括具有配体结合蛋白的生物传感器，这些配体结合蛋白包括：GGBP(例如，大肠杆菌GGBP)或其衍生物或突变体；(ii)大肠杆菌阿拉伯糖结合蛋白(例如，大肠杆菌阿拉伯糖结合蛋白)或其衍生物或突变体；(iii)二肽结合蛋白(例如，大肠杆菌二肽结合蛋白)或其衍生物或突变体；(iv)组氨酸结合蛋白(例如，大肠杆菌组氨酸结合蛋白)或其衍生物或突变体；(v)核糖结合蛋白(例如，大肠杆菌核糖结合蛋白)或其衍生物或突变体；(vi)硫酸盐结合蛋白(例如，大肠杆菌硫酸盐结合蛋白)或其衍生物或突变体；(vii)麦芽糖结合蛋白(例如，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)或其衍生物或突变体；(viii)谷氨酰胺结合蛋白(例如，大肠杆菌谷氨酰胺结合蛋白)或其衍生物或突变体；(ix)谷氨酸盐/天冬氨酸盐结合蛋白(例如，大肠杆菌谷氨酸盐/天冬氨酸盐结合蛋白)或其衍生物或突变体；(x)磷酸盐结合蛋白(例如，大肠杆菌磷酸盐结合蛋白)或其衍生物或突变体；或(xi)铁结合蛋白[例如，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza/H.influenzae)铁结合蛋白]或其衍生物或突变体。例如，第二生物传感器包括：大肠杆菌GGBP，其具有Y10C、Y10A、D14A、D14Q、D14N、D14S、D14T、D14E、D14H、D14L、D14Y、D14F、N15C、F16L、F16A、F16Y、K92A、N91A、E93C、S112A、S115A、E149C、E149K、E149Q、E149S、H152A、H152F、H152Q、H152N、H152C、D154A、D154N、A155S、A155H、A155L、A155F、A155Y、A155N、A155K、A155M、A155W、A155Q、R158A、R158K、M182W、W183C、W183A、N211F、N211W、N211K、N211Q、N211S、N211H、N211M、D236A、D236N、L255C、N256A、N256D、D257C、P294C、或V296C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个、5个或更多个)，其中每个氨基酸位置按照在(SEQ ID NO:17)中进行编号；(ii)大肠杆菌阿拉伯糖结合蛋白，其具有D257C、F23C、K301C、L253C、或L298C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个或5个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；(iii)大肠杆菌二肽结合蛋白，其具有D450C、K394C、R141C、S111C、T44C、或W315C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个、5个或6个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；(iv)大肠杆菌组氨酸结合蛋白，其具有E167C、K229C、V163C、Y230C、F231C、Y88C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个、5个或6个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；(v)大肠杆菌核糖结合蛋白，其具有T135C、D165C、E192C、A234C、L236C、或L265C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个、5个或6个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；(vi)大肠杆菌硫酸盐结合蛋白，其具有L65C、N70C、Q294C、R134C、W290C、或Y67C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个、5个或6个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；(vii)大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，其具有D95C、F92C、E163C、G174C、I329C、或S233C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个、5个或6个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；(viii)大肠杆菌谷氨酰胺结合蛋白，其具有N160C、F221C、K219C、L162C、W220C、Y163C、或Y86C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个、5个或更多个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；(ix)大肠杆菌谷氨酸盐/天冬氨酸盐结合蛋白，其具有A207C、A210C、E119C、F126C、F131C、F270C、G211C、K268C、Q123C、或T129C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个、5个或更多个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；(x)大肠杆菌磷酸盐结合蛋白，其具有A225C、N223C、N226C、S164C、或S39C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个、4个或5个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)；或(xi)流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza/H.influenzae)铁结合蛋白，其具有E203C、K202C、K85C、或V287C突变(例如，包括这些突变中的1个、2个、3个或4个)(参见例如美国专利申请公开号2004/0118681，将其全部内容通过引用并入本文)。在各种实施例中，怀疑样品包括葡萄糖或半乳糖。

bPBP结构、基因和配体结合的参考文献和PDB^a文件

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各种类型的样品可以用于本文所提供的方法中。在非限制性实例中，样品可以包括反应产物、缓冲液和/或溶剂。在一些实施例中，溶剂是水性溶剂。在一些实施例中，溶剂包括非极性溶剂、极性非质子溶剂和/或极性质子溶剂。例如，样品可以包括水、液氨、液态二氧化硫、磺酰氯、磺酰氯氟、磷酰氯、四氧化二氮、三氯化锑、五氟化溴、氟化氢、二甲亚砜、己烷、苯、甲苯、1,4-二噁烷、氯仿、二乙醚、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、甲酸、正丁醇、异丙醇、硝基甲烷、乙醇、甲醇和/或乙酸。

在实施例中，样品包括牛顿液体、剪切增稠液体、剪切变稀液体、触变液体、震凝液体或宾汉塑性体。在一些实施方式中，样品的动态黏度为至少约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或2帕斯卡·秒(Pa·s)，或小于约2、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5Pa·s；和/或运动黏度为至少约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或2厘沲(cSt)，或小于约2、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5cSt。

在各种实施例中，样品包括生物样品。样品可以包括例如临床样品(即，例如通过或在医生、护士、助理工作人员或医师的请求或监督或指导下，在临床或兽医环境中采集的样品)和/或生理样品(从生物体(例如，哺乳动物，如人)采集的样品)。在某些实施例中，生物样品包括皮肤表面或黏膜表面或已经从皮肤表面或黏膜表面提供或获得。在一些实施例中，生物样品包括生物流体。生物流体的非限制性实例包括汗液、泪液、血液、血清、血浆、间质液、羊水、痰、洗胃液、皮肤油、乳、粪便物、呕吐物、胆汁、唾液、尿液、黏液、精液、淋巴液、脊髓液、滑液、细胞裂解液、毒液、血淋巴和从植物获得的流体(如在植物的木质部细胞或韧皮部筛管元件中运输的流体(例如树液))。

本申请主题还提供了用于测量在包括培养的细胞或组织的液体溶液或悬浮液或组合物中或这样的溶液或悬浮液的上清液中(例如，培养细胞群体的条件培养基的样品或生长培养基的样品)的配体水平的生物传感器、方法、组合物和装置。在一些实施例中，样品在培养物内(例如，插入生物反应器中)或由培养基、培养物或反应提供(例如，在生物反应器中)。例如，样品可以在发酵器内(如来自发酵反应(例如，正在进行的发酵)中的培养物或培养物上清液)或从其提供。因此，可以在细胞培养期间(例如，连续地在或从反应或培养物中)在感兴趣的时间点或在一系列时间点测定配体的水平。生物反应器包括支持生物活性环境的装置或系统。例如，生物反应器可以包括在其中进行化学过程的容器，该化学过程涉及生物体或来自此类生物体的生化活性物质。这样的过程可以是需氧或厌氧的。在生物反应器中生长的生物体可以例如浸没或悬浮在液体培养基中或者可以附着到固体培养基的表面。浸没的培养物可以是悬浮的或固定的。悬浮生物反应器可以使用更多种类的生物体，因为不需要特殊的附接表面，并且可以比固定的培养物以大得多的规模运行。然而，在连续操作的过程中，生物体将与流出物一起从反应器中除去。固定是描述各种各样的细胞或颗粒附接或包埋的通用术语。它可以应用于基本上所有类型的生物催化，包括酶、细胞器和细胞(例如动物细胞、植物细胞、真菌细胞和细菌细胞)。固定可用于连续操作过程，因为生物体不会与反应器流出物一起被除去，但由于细胞仅存在于容器表面上而在规模上受到限制。生物反应器也可以是指在细胞培养的背景下意在使细胞或组织生长的装置或系统。询问和/或监测此类样品中的葡萄糖水平允许评价细胞生长状态或由细胞产生分泌产物以通知培养物的收获或补料或其他修改。

本申请主题的方面涉及使用本文所提供的方法和生物传感器来检测污染。

在一些实施例中，样品包括环境样品。取决于上下文，存在生物样品也可能是环境样品或可能是在环境样品内的情况。在某些实施例中，环境样品包括从生物组合物如骨、指/趾甲、毛发、壳或软骨获得的溶质。在各种实施例中，环境样品包括从环境物质和/或环境表面获得的溶质。例如，溶质可以使用水性溶液或非水性溶液从环境物质和/或环境表面溶解/获得。在一些实施例中，水性溶液可以任选地包括非水性溶剂(例如，与水性溶剂混合)。环境物质的非限制性实例包括岩石、土壤、黏土、沙子、陨石、小行星、灰尘、塑料、金属、矿物、化石、沉积物和木材。环境表面的非限制性实例包括以下各项的表面：运载工具，例如民用运载工具(例如，卫星、自行车、火箭、汽车、卡车、摩托车、游艇、公共汽车或飞机)或军用运载工具(例如，坦克、装甲运兵车、运输卡车、吉普车、移动式火炮单元、移动式防空单元、扫雷舰、防地雷伏击保护(MRAP)车辆、轻型战术全地形车、高机动多功能轮型载具、移动式多管火箭发射系统、两栖登陆车辆、船舶、气垫船、潜艇、运输飞机、战斗机、直升机、火箭或无人驾驶飞行器)；无人驾驶飞机；机器人；建筑；家具；或除人以外的生物体。在一些实施例中，样品包括环境流体。环境流体的非限制性实例包括海水、井水、饮用井水、挖掘用于石油开采或勘探的井底部的水、融化冰水、池塘水、水族馆水、池水、湖水、泥浆、溪流水、河水、小溪水、废水、处理过的废水、水库水、雨水和地下水。在一些实施例中，废水包括污水、化粪池水、农业径流、来自化学品或石油泄漏已经或怀疑已经发生(例如，石油泄漏到海洋环境中)的区域的水、来自辐射泄漏已经或怀疑已经发生的区域的水(例如，来自核反应堆的冷却剂)、建筑物管道内的水、研究设施内部或排出的水、和/或生产设施(如工厂)内部或排出的水。

在某些实施例中，样品包括食品或饮料添加剂和/或食品或饮料组合物。在一些实施例中，食品或饮料组合物包括发酵组合物。在各种实施例中，样品包括从食品组合物获得的流体。可替代地或另外地，样品可以包括从食品组合物溶解的溶质。在一些实例中，溶质用或已经用水性或非水性溶液从食品组合物中溶解。在各种实施方式中，水性溶液可以任选地包括非水性溶剂。在某些实施例中，样品包括处于半固体或液体形式的食品组合物。此类组合物的非限制性实例包括酸奶、汤、冰淇淋、肉汤、浓汤、奶昔、冰沙、糊状物、调味品、调味汁、及其任何组合。在一些实施方式中，样品是食品工程过程(例如，从食品设计、储存、运输或生产过程获得，或从旨在用于加工、运输或储存食品的设备获得)。食品组合物可以包括例如植物或从植物分离的组合物、和/或动物或从动物分离的组合物。在各种实施例中，样品包括饮料组合物。饮料组合物的非限制性实例包括软饮料、喷泉饮料、水、咖啡、茶、奶、基于乳制品的饮料、基于大豆的饮料(例如，豆奶)、基于杏仁的饮料(例如，杏仁奶)、蔬菜汁、水果汁、水果汁风味饮料、能量饮料、运动和健身饮料、酒精产品、以及包括其任何组合的饮料。包括水的饮料组合物的非限制性实例包括纯化水(例如，过滤水、蒸馏水、或通过反渗透纯化的水)、风味水、矿物质水、泉水、苏打水、奎宁水、及其任何组合。在各种实施例中，样品包括酒精。此类样品的非限制性实例包括包含啤酒、麦芽糖饮料、利口酒、葡萄酒、烈酒及其任何组合的样品，或从啤酒、麦芽糖饮料、利口酒、葡萄酒、烈酒及其任何组合获得/提供的样品。

在一些实施例中，样品包括营养组合物或补充剂组合物。在某些实施方式中，营养组合物或补充剂组合物包括ω-3脂肪酸、维生素、矿物质、蛋白质粉或膳食补充剂。

在某些实施例中，生物传感器被植入受试者的体内。例如，可以将生物传感器植入受试者的血管、静脉、眼睛、天然或人工胰腺、消化道、胃、肠、食道或皮肤(例如，皮肤内或皮肤下)。在各种实施例中，生物传感器被配置在隐形眼镜内或隐形眼镜的表面上。在一些实施例中，生物传感器被配置成植入皮肤内或植入皮肤下。在非限制性实例中，用光极和/或微珠将生物传感器植入受试者中。在某些实施例中，生物传感器透皮地产生信号。

本申请主题的方面提供了用于测定受试者中的葡萄糖水平的方法。该方法可以包括使来自受试者的生物样品与用于葡萄糖的生物传感器在使得生物传感器结合生物样品中存在的葡萄糖的条件下接触。生物传感器包括与报告基团附接的葡萄糖-半乳糖结合蛋白，并且葡萄糖与葡萄糖-半乳糖结合蛋白的葡萄糖结合结构域的结合引起通过报告基团进行的信号传导的改变。在各种实施例中，受试者患有或疑似患有糖尿病，如I型糖尿病或II型糖尿病。在一些实施例中，生物样品包括血液、血浆、血清、汗液、泪液或尿液。在某些实施例中，生物样品存在于所述受试者内或受试者的表面上。在各种实施方式中，生物传感器被施加到受试者上或被插入受试者中。例如，生物传感器可以刺入受试者内或是在被植入所述受试者内的装置之中或之上。在一些实施例中，生物传感器可以存在于由受试者佩戴的隐形眼镜之中或之上。用于确定例如在患有或疑似患有糖尿病的受试者中的葡萄糖水平的方法，可以在没有与作为一系列临床测试的一部分进行的与糖尿病相关的其他测试的情况下进行。

本申请主题包括用于监测配体水平的方法，该方法包括周期性或连续性检测配体的水平，其中检测配体的水平包括(a)提供或获得样品；(b)使所述样品与根据权利要求1所述的用于所述配体的生物传感器在使得所述生物传感器的配体结合蛋白与所述配体结合的条件下接触，和(c)检测由所述生物传感器产生的信号。

本申请主题的方面还提供了用于监测受试者中配体(例如，葡萄糖和/或半乳糖)的水平的方法，该方法包括周期性检测受试者中配体的水平。检测受试者中配体的水平可以包括(a)提供或获得来自所述受试者的生物样品；(b)使生物样品与本文所提供的用于配体的生物传感器在如果在所述生物样品中存在配体则使得生物传感器的配体结合蛋白与配体结合的条件下接触，和(c)检测(i)由所述生物传感器的报告基团产生的信号、或(ii)信号是否由所述生物传感器的报告基团产生。可以检测所述配体的水平，例如至少每1、2、3、6或12小时一次，至少每1、2、3或4天一次，至少每1、2或三周一次，或至少每1、2、3、4、6或12个月一次。

本申请主题还提供了用于监测受试者中配体的水平的方法。该方法包括(a)将本文所提供的生物传感器或包括本文所提供的生物传感器的装置施用于所述受试者，其中在施用后，生物传感器与通常包括所述配体的体液或表面接触，和(b)检测(i)以相隔小于约30分钟(m)、15m、10m、5m、1m、30秒钟(s)、15s、10s、5s、1s、0.1s、0.001s、0.0001s、或0.00001s的间隔连续或重复地由生物传感器的报告基团产生的信号、和/或(ii)信号是否以相隔小于约30m、15m、10m、5m、1m、30s、15s、10s、5s、1s、0.1s、0.001s、0.0001s、或0.00001s的间隔连续或重复地由生物传感器的报告基团产生。

连续监测葡萄糖水平的非限制性方面描述于Weidemaier等人(2011)Biosensorsand Bioelectronics[生物传感器和生物电子学]26,4117-4123以及Judge等人(2011)Diabetes Technology&Therapeutics[糖尿病技术和治疗],13(3):309-317，将其中的每一个的全部内容通过引用并入本文。同样在本发明内的是包括经纯化的热稳定性葡萄糖结合荧光响应性传感蛋白和固体基质(例如，颗粒、珠粒(如磁珠)或平面表面(如芯片或载玻片))的组合物，其中传感蛋白被固定在固体基质上。示例性固体基质包括环烯烃共聚物。

传感蛋白含有单个半胱氨酸残基，其中单个半胱氨酸残基位于蛋白质的葡萄糖接触位点中。热稳定性葡萄糖传感蛋白是活性(葡萄糖结合)不受较高温度影响的蛋白质。例如，葡萄糖传感蛋白包括大于50℃、大于60℃、大于70℃、大于80℃、大于90℃、或大于100℃的中点热熔融转变。在一些实例中，蛋白质包括SEQ ID NO:298的氨基酸序列，并且在一些实例中，单个半胱氨酸与Badan、Acrylodan或其衍生物轭合。例如，衍生物包括用三环蒽、芴或苯乙烯置换Acrylodan或Badan的双环萘。报告基团与单个半胱氨酸共价结合。在一些情况下，固体基质包括多种传感蛋白，每种传感蛋白包括不同的针对葡萄糖的解离常数(K_D)，例如用于检测和定量跨许多浓度范围的葡萄糖水平。

本发明还包括包含经纯化的葡萄糖传感蛋白和固体基质的组合物，该传感蛋白与SEQ ID NO:1、16或17具有小于65％的一致性且大于27％的一致性(例如，44％-48％的序列一致性)，其中该传感蛋白包括单个半胱氨酸残基，所述残基位于蛋白质的葡萄糖接触位点中，这样使得传感蛋白被固定在所述固体基质上。如上所述，报告基团与单个半胱氨酸共价结合。在一些实例中，固体基质包括多种传感蛋白，每种传感蛋白包括不同的针对葡萄糖的解离常数(K_D)，用于在大范围的或多个范围的葡萄糖浓度上进行检测。

使用以下步骤来进行检测在测试样品中葡萄糖的存在或量的方法：使测试样品与生物传感器或传感蛋白/固体支持物构建体接触以产生葡萄糖与配体结合蛋白或生物传感蛋白的复合物；使复合物与激发光接触；从至少两个波长测量报告基团的发射强度；从两个(或更多个)波长计算比率信号；并且将该信号与信号的已知葡萄糖结合曲线进行比较，以鉴定葡萄糖在该测试样品中的存在或计算葡萄糖在所述测试样品中的量。测试样品可以从各种来源获得。例如，测试样品选自体液、食品、饮料或生物反应器培养肉汤。测试方法可以在体内进行，例如使用可植入装置或皮肤贴片，或离体进行。

在各种实施例中，待测试的受试者是哺乳动物(例如，灵长类动物(如人、猴、黑猩猩或大猩猩))、鱼、鸟、爬行动物、两栖动物或节肢动物。在一些实施例中，受试者是鱼、牛、猪、骆驼、美洲驼、马、赛马、役马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狼、狗(例如，宠物狗、工作犬、警犬或军犬)、大鼠、小鼠、海豹、鲸、海牛、蜥蜴、蛇、鸡、鹅、天鹅、鸭、或企鹅。

包括生物传感器的示例性装置和组合物

本申请主题的方面提供了包括一个或多个本文所提供的生物传感器的装置。此类装置可以是例如可佩带的、可植入的、便携式的或固定的。

在一些实施例中，该装置是包括所述生物传感器的纳米颗粒或微粒。装置的非限制性实例包括如下装置，这些装置包括具有本文所提供的生物传感器的测试条、贴片、平板、珠粒或芯片。在某些实施例中，装置可以包括干燥的生物传感器。

本申请主题还提供了包括本文所提供的生物传感器的隐形眼镜或皮肤贴片。在一些实施例中，生物传感器遍及隐形眼镜或皮肤贴片或在隐形眼镜或皮肤贴片的特定范围或区域内(例如，处于一种或多种形状(例如，正方形、圆形或星形)、点、线或区域，位于隐形眼镜或贴片的周围或周围的一部分)。在一些实施例中，皮肤贴片包括促进将贴片附接到皮肤表面的粘合剂。

本文提供的装置可以包括各种结构组合物。例如，可以使用许多聚合物(包括共聚物)和塑料。用于某些装置的组合物的非限制性实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、环烯烃共聚物、乙烯-降冰片烯共聚物、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、纸、天然纤维素、改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩、金和磁铁矿(及其组合)。在一些实施例中，装置包括水凝胶、晶胶(cryogel)或可溶性凝胶。例如，生物传感器可以掺入水凝胶、晶胶或可溶性凝胶之中或之上。在各种实施例中，装置包括包含纳米孔、微孔和/或大孔的基质。在某些实施例中，装置的表面包括聚合物。在一个实施例中，表面包括直径为约0.001-1、0.001-0.1、0.01-0.1、0.001-0.01、0.1-1、0.1-0.5、或0.01-0.5厘米(cm)的颗粒或珠粒的表面。例如，颗粒包括纳米颗粒或微粒。

聚合物的非限制性实例包括环烯烃共聚物、乙烯-降冰片烯共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、琼脂糖、海藻酸盐、聚(丙交酯-共-乙交酯)、明胶、胶原蛋白、琼脂糖、天然和合成多糖、聚氨基酸、聚(赖氨酸)、聚酯、聚羟基丁酸酯、聚酐、聚磷嗪、聚乙烯醇、聚环氧烷、聚环氧乙烷、聚烯丙胺、聚丙烯酸酯、改性苯乙烯聚合物、聚(4-氨甲基苯乙烯)、普朗尼克(pluronic)多元醇、泊洛沙姆(polyoxamer)、聚糖醛酸和聚乙烯吡咯烷酮。

在一些实施例中，装置包括包含环烯烃共聚物(COC)的塑料聚合物，例如， COC。基于不同类型的环状单体和聚合方法可获得几种类型的环烯烃共聚物。通过环状单体(如8,9,10-三降冰片-2-烯(降冰片烯)或1,2,3,4,4a,5,8,8a-八氢-1,4:5,8-二甲桥萘(四环十二碳烯))与乙烯(如TOPAS高级聚合物公司(TOPAS Advanced Polymer)的TOPAS、三井化学公司(Mitsui Chemical)的APEL)的链共聚合，或通过各种环状单体进行开环易位聚合、接着进行氢化(日本合成橡胶公司(Japan Synthetic Rubber)的ARTON，瑞翁化学公司(Zeon Chemical)的Zeonex和Zeonor)来产生环烯烃共聚物。参见例如International Union of Pure and Applied Chemistry[国际纯粹和应用化学联合会](2005)Purr.Appl.Chem.[纯粹与应用化学]77(5):801-814。使用单一类型单体的这些后来材料可以被称为环烯烃聚合物(COP)°COC的CAS登记号是26007-43-2。

在某些实施例中，装置附接到装置的表面或未附接到所述装置的表面(例如，生物传感器作为溶液或粉末的组分松散地存在于装置内)。

生物传感器可以经由各种方式(例如，经由附接基序)附接到装置上。在一些实施例中，附接基序附接至生物传感器的N-末端或C-末端。在某些实施例中，生物传感器经由共价键附接至附接基序。在各种实施例中，生物传感器经由接头附接至所述附接基序。接头的非限制性实例是包括2个、3个、4个、5个或更多个甘氨酸且任选地进一步包括丝氨酸的聚甘氨酸。在一些实施例中，附接基序包括多肽。用于附接部分的多肽的非限制性实例包括六聚组氨酸肽、六聚赖氨酸肽、锌指结构域(ZF-QNK)和含二硫化物的截短的锌指(βZif)。六聚赖氨酸肽的实例包括SEQ ID NO:296的序列中的氨基酸，ZF-QNK的实例包括SEQ ID NO:294的序列中的氨基酸，并且βZif的实例包括SEQ ID NO:293的序列中的氨基酸。在一些实施例中，附接基序包括与塑料或纤维素结合的多肽。

六聚组氨酸、六聚赖氨酸、βZif和QNK-ZF融合物(SEQ ID NO:173和175-181)使得FRS能够被固定在化学官能化表面上。化学官能化表面的非限制性方面在Biju,V.(2014)Chem Soc Rev[化学学会评论],43,744-64以及McDonagh(2008)Chem Rev[化学评论],108,400-422中讨论，将其全部内容通过引用并入本文。定向进化方法已被用于开发直接与非功能化表面结合的肽(Care,Bergquist和Sunna 2015Trends Biotechnol[生物技术趋势],33,259-68；Baneyx 2007Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前述评],18,312-317；Gunay和Klok 2015Bioconjug Chem[生物共轭化学],26,2002-15)，包括各种塑料(Adey等人1995Gene[基因],156,27-31；Serizawa等人2005J Am Chem Soc[美国化学学会杂志],127,13780-1；Serizawa,Sawada和Kitayama 2007a Angew Chem Int Ed Engl[应用化学英文国际版],46,723-6；Serizawa,Sawada和Matsuno 2007bLangmuir[朗缪尔],23,11127-33；Serizawa,Techawanitchai和Matsuno 2007c Chembiochem,8,989-93；Matsuno等人2008Langmuir[朗缪尔],24,6399-403；Chen,Serizawa和Komiyama 2011J Pept Sci[肽科学杂志],17,163-8；Kumada 2010J.Biosci.and BioEng.[生物科学与生物工程杂志],109,583-587；Date等人2011ACS Appl Mater Interfaces[美国化学学会应用材料与界面],3,351-9；Kumada 2012,Vodnik,Strukelj和Lunder 2012J.Biotech.[生物技术杂志],160,222-228；Kumada 2014Biochem.et Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报],1844,1960-1969；Ejima,Matsuno和Serizawa 2010Langmuir[朗缪尔],26,17278-85)、无机材料(Hnilova 2012Soft Matter[软物质],8,4327-4334；Care等人2015Trends Biotechnol[生物技术趋势],33,259-68)、纳米颗粒(Avvakumova等人2014Trends Biotechnol[生物技术趋势],32,11-20)、以及纤维素纸(Guo等人2013Biomacromolecules[生物大分子],14,1795-805)。此类肽、或天然材料结合结构域(Oliveira等人2015Biotechnol Adv[生物技术进展]33,358-69)也可以与FRS融合以便指导在其靶材料上的位点特异性的定向固定，同时保持FRS功能。例如，已经开发出塑料结合肽，这些塑料结合肽直接固定在聚苯乙烯(Adey等人1995Gene[基因],156,27-31；Serizawa等人2007c Chembiochem,8,989-93；Kumada2010Biochem.et Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报],1844,1960-1969；Vodnik等人2012Anal Biochem[分析生物化学],424,83-6)、聚丙烯酸甲酯(Serizawa等人2005J AmChem Soc[美国化学学会杂志],127,13780-1；Serizawa等人2007a Angew Chem Int EdEngl[应用化学英文国际版],46,723-6；Serizawa等人2007b Langmuir[朗缪尔],23,11127-33；Kumada 2014Biochem.et Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1844,1960-1969)、聚碳酸酯(Kumada 2012J.Biotech.[生物技术杂志]160,222-228)、聚丙交酯(Matsuno等人2008Langmuir[朗缪尔],24,6399-403)、以及聚苯撑乙烯撑(polyphenylenevinylene)(Ejima等人2010Langmuir[朗缪尔],26,17278-85)。纤维素结合肽(Guo等人2013Biomacromolecules[生物大分子]，14,1795-805)和天然结构域(Oliveira等人2015Biotechnol Adv[生物技术进展]33,358-69；Shoseyov,Shani和Levy 2006MicrobiolMol Biol Rev[微生物学与分子生物学评论]70,283-95)可以用于将融合蛋白固定在纸上。无机材料包括贵金属(Hnilova 2012Soft Matter[软物质]8,4327-4334)、半导体(Care等人2015Trends Biotechnol[生物技术趋势]33,259-68)和荧光量子点(Medintz等人2005Nat Mater[自然材料]4,435-46；Lee等人2002Science[科学]296,892-5)。将上述参考文献中的每一篇(以及本文中所有其他参考文献)的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，附接基序附接至装置表面和/或装置的矩阵内。在一些实施例中，生物传感器经由共价键附接至附接基序，并且附接基序经由共价键附接至装置。共价键的非限制性实例包括二硫键、酯键、硫酯键、酰胺键、以及已经通过点击反应形成的键。点击反应的非限制性实例包括以下物质之间的反应：叠氮化物和炔烃；在Cu(I)存在下的叠氮化物和炔烃；叠氮化物和应变环辛炔；叠氮化物和二苄基环辛炔、二氟辛炔或二芳基氮杂环辛炔酮；二芳基应变环辛炔和1,3-硝酮；叠氮化物、四嗪、或四唑和应变烯烃；叠氮化物、四嗪、或三唑和氧杂降冰片二烯、环辛烯或反式环烯烃；四唑和烯烃；或具有被紫外线活化的氨基或苯乙烯基基团的四唑、和烯烃。

可替代地或另外地，装置的表面可以被修饰成含有促进生物传感器的附接和/或与生物传感器结合的部分(例如反应性基团)。在一些实施例中，生物传感器经由生物素-抗生物素蛋白相互作用与表面附接。

在各种实施方式中，装置包括用于接收样品的第一区域和包括生物传感器的第二区域，其中所述第一区域通过过滤器与所述第二区域分开。在一些实例中，过滤器对尺寸大于约1、2、3、4、5、10、50、200、或250千道尔顿(kDa)的化合物是不可渗透的。样品可以包括例如管(如配置用于离心的管)。当将样品放入第一区域并对装置离心时，包括配体的样品的一部分流过过滤器进入生物传感器接触的第二区域。

本文所提供的装置的非限制性实例包括内窥镜检探针和结肠镜检探针。

在一些实施例中，装置包括光极。在非限制性实例中，光极包括光纤和单个生物传感器或复合生物传感器。在某些实施例中，单个生物传感器或复合生物传感器固定在光纤的表面上或端部。在一些实施例中，光极被配置用于植入受试者中。可替代地或另外地，光极被配置用于插入样品中。

本文所提供的装置可以任选地包括生物传感器面板、复合传感器、传感器阵列、和/或包括复数个生物传感器的组合物。在各种实施例中，装置包括多个葡萄糖和/或半乳糖生物传感器，所述生物传感器检测单个样品和/或测定运行中的一系列不同的葡萄糖和/或半乳糖浓度(即，每个生物传感器对葡萄糖和/或半乳糖具有不同的亲和力)。装置可以提供多个生物传感器的空间定位，以提供多传感器阵列中的不同元件的必要的可寻址能力，该多传感器阵列包括对于大范围的葡萄糖浓度的覆盖不同于其工程化亲和力的传感器或各自检测不同分析物的传感器。

本申请主题的方面提供了包括复数个生物传感器的生物传感器面板，其中所述复数个生物传感器包括至少一个本文所披露的生物传感器。在一些实施例中，复数个包括至少约2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、或100个生物传感器。

本申请主题还提供了复合传感器。复合传感器可以包括传感器元件，其中该传感器元件包括2个或更多个生物传感器，其中所述2个或更多个生物传感器中的至少1个是本文所披露的生物传感器。在一些实施例中，生物传感器在传感器元件中没有空间分离，例如，生物传感器在溶液内或传感器元件的表面上混合。在各种实施例中，复合传感器包括复数个传感器元件，其中复数个传感器元件中的每个传感器元件包括2个或更多个生物传感器，其中2个或更多个生物传感器中的至少1个是本文所提供的生物传感器。在一些实施例中，复数个传感器元件包括至少约2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、或100个传感器元件。

本文还包括的是包括本申请主题的复数个生物传感器的传感器阵列。传感器阵列可以包括例如多通道阵列或多路复用阵列。在一些实施例中，复数个生物传感器的生物传感器在空间上彼此分离。在某些实施例中，生物传感器在所述阵列的表面上线性排列或以网格排列。

本申请主题提供了包括复数个生物传感器(包括至少一个本文所披露的生物传感器)的组合物。还提供了包括本文所披露的生物传感器或装置的非人类哺乳动物。

示例性多肽和多核苷酸

本申请主题提供了编码本文所披露的任何一种多肽的多核苷酸。还提供了多肽。在各种实施例中，将多核苷酸密码子优化用于在所希望的宿主细胞(如细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母、昆虫细胞、植物细胞、藻细胞或哺乳动物细胞)中表达。本文所提供的多肽包括包含SEQ ID NO:1-103、157-292、197或198中任一个的氨基酸序列的多肽。本文所提供的多核苷酸包括对包含SEQ ID NO:1-103、157-292、197或198中任一个的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸。

本文所提供的多肽和生物传感器可以处于各种形式，例如，在溶液中纯化的、如以粉末等形式干燥的(例如冷冻干燥的)、以及处于晶体的形式(例如，适合用于X射线结晶学的晶体)。因此，本申请主题的方面提供了本文所披露的配体结合蛋白和生物传感器的晶体结构和结晶形式。此类晶体结构和结晶蛋白对于使用本文所讨论的原理和方法来设计和优化生物传感器是有用的。

还提供了包括本申请主题的多核苷酸和/或对本文所披露的多肽进行编码的多核苷酸的表达载体。表达载体的非限制性实例包括病毒载体和质粒载体。在一些实施例中，表达载体包括如SEQ ID NO:105-156所示的序列中的核苷酸。在各种实施例中，编码配体结合蛋白和/或生物传感器的多核苷酸可操作地连接至启动子。启动子可以例如在原核和/或真核细胞中表达。

主题进一步包括包含本文所提供的表达载体的分离的细胞。分离的细胞可以是例如细菌细胞、酵母细胞、藻细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。还包括包含本文所披露的表达载体的非人类多细胞生物体，如植物或动物(例如，昆虫、哺乳动物、蠕虫、鱼、鸟或爬行动物)。

用于设计生物传感器的示例性方法

本申请主题的方面提供了鉴定用于在生物传感器中使用的候选配体结合蛋白的方法，该方法包括：(a)选择具有已知氨基酸序列(种子序列)的第一蛋白质，其中第一蛋白质是葡萄糖-半乳糖结合蛋白；(b)鉴定具有与种子序列有至少15％序列一致性的氨基酸序列(命中序列)的第二蛋白质；(c)比对种子氨基酸序列和命中序列，并且在种子序列的对应于至少5个主要互补表面(PCS)氨基酸的位置处将命中序列与种子序列进行比较，其中当葡萄糖与第一蛋白质结合时，该至少5个PCS氨基酸中的每一个与葡萄糖具有氢键相互作用或范德华力相互作用；和(d)如果命中序列包括与PCS一致的至少5个氨基酸，则将第二蛋白质鉴定为候选配体结合蛋白。

本申请主题还包括用于构建候选生物传感器的方法，该方法包括：(a)提供候选配体结合蛋白；(b)产生第二蛋白质的结构；(c)基于该结构鉴定第二蛋白质的至少一个推定的变构位点、内部空间位点或外周空间位点；(d)使第二蛋白质突变以用半胱氨酸取代第二蛋白质的所述至少一个推定的变构位点、内部空间位点或外周空间位点处的氨基酸；和(e)将荧光化合物轭合至半胱氨酸上。在一些实施例中，该结构包括使用第一蛋白质的结构产生的第二蛋白质的同源模型。在一些实施例中，该结构包括通过核磁共振光谱法或X射线晶体学实验性地确定的结构。

本申请主题的方面进一步提供了用于构建针对葡萄糖具有所希望的解离常数(KD)的生物传感器的方法，该方法包括：(a)提供针对葡萄糖不具有所希望的KD的初始生物传感器，其中所述初始生物传感器是本文所提供的生物传感器；(b)使初始生物传感器突变以(i)改变在初始生物传感器与结合的葡萄糖之间的PCS中的直接相互作用；(ii)操纵在初始生物传感器的开放状态和闭合状态之间的平衡；(iii)改变在初始生物传感器的配体结合蛋白与报告基团之间的相互作用；或(iv)改变使生物传感器的结合位点的几何学发生改变的间接相互作用，以产生经修饰的生物传感器；和(c)如果经修饰的生物传感器针对葡萄糖具有所希望的KD，则选择经修饰的生物传感器。在一些实施例中，报告基团包括Acrylodan、Badan、或其衍生物，并且在(b)中使初始生物传感器突变包括改变在配体结合蛋白与Acrylodan、Badan、或其衍生物的羰基基团之间的相互作用。在一些实施例中，报告基团包括Acrylodan、Badan、或其衍生物，并且在(b)中使初始生物传感器突变包括改变在配体结合蛋白与Acrylodan、Badan、或其衍生物的萘环之间的相互作用。在一些实施例中，使初始生物传感器突变包括将取代突变引入所述初始生物传感器。在一些实施例中，该方法进一步包括将所述亲和力调整的生物传感器固定在基质上。

在一些实施例中，第二蛋白质包括(i)SEQ ID NO:1-15或17-31的序列中的氨基酸；(ii)与SEQ ID NO:1-31的序列具有至少约95％、96％、97％、98％、或99％一致性的序列中的一段氨基酸；(iii)与SEQ ID NO:1-31内的序列具有至少约95％、96％、97％、98％、或99％一致性的序列中的一段至少约50个、100个、150个、200个、250个、300个、或350个氨基酸；或(iv)与SEQ ID NO:1-31内的序列一致的序列中的一段至少约50个、100个、150个、200个、250个、300个、或350个氨基酸。在各种实施例中，将报告基团附接至第一蛋白质的推定的变构位点、内部空间位点或外周空间位点包括用半胱氨酸取代该位点的半胱氨酸。例如，报告基团与半胱氨酸轭合。优选地，将报告基团附接至第二蛋白质的相应氨基酸产生功能性生物传感器。

所选择的第一蛋白质(例如，其氨基酸序列)可以是新颖的或已知的。但是，在许多情况下，第一蛋白质的功能将不为人知。在非限制性实例中，鉴定先前不知道具有葡萄糖结合活性的蛋白质可以包括结构辅助的功能评价(SAFE)同系物搜索方法，该同系物搜索方法包括以下步骤：

(1)使用BLAST序列比对工具，使用本文所披露的葡萄糖-半乳糖结合蛋白(GGBP)序列作为种子开始，收集序列同源性集。使用宽容设置，这样使得成对命中需要与种子序列仅具有例如20％、25％、30％、35％或40％序列一致性的最小值。命中和种子的长度是相互约束的，这样使得比对在每个配偶体内覆盖至少例如60％、65％、70％、85％或90％。

(2)生物功能的基于结构的编码：包括与结合的葡萄糖形成氢键和范德华力接触的蛋白质残基的主要互补表面(PCS)使用GGBP-葡萄糖复合物的三维结构的计算机辅助的目视检查来进行定义。该定义规定了残基位置及其允许的氨基酸一致性。在每个位置允许多个氨基酸一致性来编码功能等同的残基。该定义建立了搜索过滤器，用于精确预测(1)中收集的序列同系物的领域内的葡萄糖结合蛋白。例如，对应于ecGGBP的位置14的候选物的残基可以是D或N，对应于ecGGBP的位置16的候选物的残基可以是F、Y或W，对应于ecGGBP的位置91的候选物的残基可以是N或D，对应于ecGGBP的位置152的候选物的残基可以是H、N或Q，对应于ecGGBP的位置154的候选物的残基可以是D或N，对应于ecGGBP的位置158的候选物的残基可以是R，对应于ecGGBP的位置183的候选物的残基可以是W、F或Y，对应于ecGGBP的位置211的候选物的残基可以是N或D，对应于ecGGBP的位置236的候选物的残基可以是D或N，并且对应于ecGGBP的位置256的候选物的残基可以是N或D。

(3)精确的序列比对：使用工具如ClustalW来构建所有序列同系物的精确比对。GGBP种子序列包括在比对中。该多重序列比对建立在每种序列同系物中种子GGBP(主要互补表面)PCS的等同位置。

(4)功能评价：通过测量它们对PCS序列过滤器的符合性来确定比对的序列同系物中每一个的葡萄糖结合特性。为每个同系物分配“汉明距离”(Hamming distance)(H)，其规定了在比对的PCS位置处所有残基的序列一致性的程度。H＝0的值表示在比对的PCS位置处的所有残基的一致性匹配在PCS搜索过滤器中允许的一个或多个氨基酸；H>0表示一个或多个对齐的位置具有不允许的残基。预测H＝0的序列编码葡萄糖结合蛋白。

(5)代表性SAFE同系物的选择：通过(a)与种子PCS的一致性(如通过汉明距离所测量的)、(b)与种子序列的分数总体序列一致性，对序列同系物进行排序。选择H＝0的序列的子集(对分数总体序列一致性进行取样)以用于实验验证。

在非限制性实例中，鉴定先前不知道具有葡萄糖结合活性的蛋白质可以包括以下步骤：

(1)对序列数据库进行计算搜索以限定任何已知的葡萄糖-半乳糖结合蛋白的一大组简单序列或结构同系物；

(2)使用来自步骤(1)的列表，导出含有由列表成员共享的共同序列和/或结构基序的搜索谱[例如，通过使用计算机程序，如MEME(Multiple Em for Motif Elicitation，可获得自meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi)、或BLAST]；

(3)使用来自步骤(2)的基于共同序列或结构基序的导出搜索谱作为查询来搜索序列/结构数据库(例如，使用计算机程序如BLAST、或MAST(基序比对搜索工具(MotifAlignment Search Tool)，可获得自meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/mast.cgi)，并且鉴定候选序列，其中与参考葡萄糖-半乳糖结合蛋白的序列同源性和/或结构相似性是预定的百分比阈值；

(4)编译候选序列的列表以产生候选葡萄糖-半乳糖结合蛋白的列表；

(5)在宿主生物体中表达候选葡萄糖结合蛋白；和

(6)测试葡萄糖和/或半乳糖结合活性，其中检测所述生物体(或其培养基)中的葡萄糖和/或半乳糖结合表明候选序列包括新颖的葡萄糖和/或半乳糖结合蛋白。

在非限制性实例中，序列分析工具的MEME套件(meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi)也可以被用作BLAST的替代物。序列基序是使用程序“MEME”发现的。然后，使用程序“MAST”，这些基序可以被用来搜索序列数据库。BLAST搜索算法是众所周知的。

本文所披露的每个实施例被设想为适用于每个其他所披露的实施例。因此，本文所描述的各种元件的所有组合都在本发明的范围内。

本发明的其他特征和优点将从下面对其优选实施例的描述以及从权利要求书中显而易见。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似或等同于本文中所描述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。

附图说明

图1A-C是说明配体与FRS结合时发射光谱变化的草图和图。(A)FRS可以通过将荧光团特异性地附接至在结合配体(三角形)时经历构象变化的蛋白质而构建，这样使得荧光共轭发射光谱的形状和强度改变。(B)在不存在配体的情况下，发射的荧光颜色主要为蓝色，然而配体复合物发绿色荧光。箭头表示配体添加时变化的方向。(C)通过测量蓝色与绿色发射强度的比率来确定配体结合。

图2A-C是显示大肠杆菌葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ecGGBP)的示例性特征的结构图示和表格。(A)葡萄糖和钙复合物[PDB标识符2gbp(Vyas等人1988)]，葡萄糖通过与Phe16和Trp183的环的范德华力接触夹在一起。(B)与结合的葡萄糖形成氢键的残基。主要互补表面(PCS)包括芳香族夹心和氢键残基。(C)用于鉴定序列ecGGBP同系物家族内的葡萄糖结合蛋白子集的PCS序列过滤器。注意在每个位置处在允许的残基中的冗余(所列出的第一个氨基酸对应于野生型ecGGBP序列)。

图3是预测为葡萄糖结合蛋白的同系物的比对(由ClustalW产生的比对；按与ecGGBP种子序列的分数序列一致性进行排序)。取自表1的序列(名称、表1中的行号、登录码、物种、与ecGGBP的分数一致性)：

ecGGBP，2，NC_013654|YP_003350022.1，大肠杆菌，100％；

ttGGBP，96，NC_014410|YP_003852930.1，热解糖嗜热厌氧杆菌(Thermoanearobacterium thermosaccharolyticum)，48％；

cobGGBP，94，NC_014392|YP_003839461.1，黑曜石热解纤维素菌(Caldicellosiruptor obsidiansis)，48％；

chyGGBP，101，NC_014652|YP_003991244.1，热水热解纤维素菌，47％；

pspGGBP，112，NC_013406|YP_003243743.1，类芽孢杆菌属物种，44％；

ereGGBP，123，NC_012781|YP_002936409.1，直肠真杆菌，37％；

cauGGBP，127，NC_022592|CAETHG_2982，自产乙醇梭菌，36％；

erhGGBP，124，N_015601|YP_004561181.1，红斑丹毒丝菌(Erysipelthrixrhusiopathiae)，36％；

rinGGBP_B，126，NC_021012|YP_00777811241，肠罗氏菌，36％；

cljGGBP，128，NC_014328|CLJU_c08950，扬氏梭菌(Clostridium ljunghaldii)，35％；

fprGGBP，129，NC_021020|YP_007799070.1，普拉粪杆菌，34％；

rinGGBP_A，132，NC_021012|YP_007778116.1，肠罗氏菌，33％；

bprGGBP，137，NC_014387|YP_003830205.1，分裂蛋白丁酸弧菌(Butyvibrioproteoclasticus)，30％；

csaGGBP，138，NC_014376|YP_003822565.1，解糖梭菌，29％。根据ecGGBP进行编号。浅灰色：前导肽；深灰色，主要互补表面(PCS)残基；-，插入的位置。指出了在ecGGBP结构中观察到的α螺旋(α_x)、β折叠(β_x)、结构域间铰链区段(h_x)和钙结合位点EF手(EF)的位置。

图4A和4B是与通过配体介导的蛋白质热稳定性的增加进行的葡萄糖结合分析有关的图。通过作为温度的函数的SYPRO与非折叠状态的结合来监测蛋白质(非)折叠。SYPRO与非折叠状态结合时荧光强度增加。(A)在存在不同量的葡萄糖的情况下csaGGBP的荧光发射强度的温度依赖性(参见表1和2)。(B)中点变性温度(T_m)在添加葡萄糖时增加，表明葡萄糖与csaGGBP的折叠状态的结合，如所预测的。

图5是显示GGBP同系物的Acrylodan轭合物的温度依赖性和葡萄糖依赖性比率荧光景观的一系列图。行对应于大肠杆菌(ecGGBP)、热解糖热厌氧杆菌(ttGGBP)、黑曜石热解纤维素菌(cobGGBP)和热水热解纤维素菌(chyGGBP)葡萄糖-半乳糖结合蛋白，这些葡萄糖-半乳糖结合蛋白在内部空间半胱氨酸突变处用Acrylodan进行位点特异性标记，该半胱氨酸突变置换了接触葡萄糖吡喃糖环的色氨酸(ecGGPB中的W183)。第I列：代表作为温度和葡萄糖浓度的函数的在488nm和510nm处的荧光发射强度的比率(Z轴)的三维景观。指出了主要平衡状态：N，天然的脱辅基蛋白(apo-protein)；D，变性蛋白；S，饱和的葡萄糖复合物。下标表示温度依赖性构象亚态(参见正文)。虚线表示潜在反应的平衡的近似中点(即，ΔG＝0)：黑线(----)，结合；红线(-·-·-)，热变性；紫线(····)，热构象变化。第II列：在310K(37℃)下确定的等温葡萄糖结合曲线的实例。对于每种蛋白质，显示两个小图：顶图，拟合比率信号(红线，仅拟合比率数据；蓝线，联合拟合比率发射强度和单色发射强度)；底图，拟合单色发射强度(红色，488nm；蓝色，510nm)。

图6A是显示用于引入可以与荧光团共价轭合用于无试剂生物传感器构建的半胱氨酸突变的示例性位置的结构：位置157、159和300，内部空间的；位置11、16、42、67、92、111、148、181和183，外周空间的；位置17、91、151和182，变构的。图6B显示了Acrylodan的结构。图6C显示了Badan的结构。

图7A-F是ttGGBP的Y11C、F17C和W182C突变体的Acrylodan和Badan轭合物的葡萄糖依赖性发射光谱的一系列图。校正光谱(脱辅基蛋白，红色；饱和葡萄糖，紫色；中等葡萄糖浓度，黑色)：左列，Acrylodan；右列，Badan。插图，比率信号的拟合(等式1和2；20nm积分带宽)：蓝色圆圈，实验观察的比率；黑线，计算的拟合(基线；脱辅基蛋白，恒定的；饱和葡萄糖复合物，线性的)。(A)Y11C·Acrylodan(等色的；λ₁，458nm；λ₂，511nm；^近似K_d(^appK_d)，0.14mM)；(B)Y11C·Badan(蓝移的；λ₁，492nm；λ₂，528nm；^近似K_d，0.28mM)；(C)F17C·Acrylodan(蓝移的；λ₁，482nm；λ₂，545nm；^近似K_d，0.08mM)；(D)F17C·Badan(蓝移的；λ₁，470nm；λ₂，542nm；^近似K_d，0.18mM)；(E)F182C·Acrylodan(红移的；λ₁，475nm；λ₂，545nm；^近似K_d，2.2mM)；(F)F182C·Badan(等色的；λ₁，474nm；λ₂，518nm；^近似K_d，26mM)。

图8A-P是荧光团结构的图示。萘家族：(A)Acrylodan；(B)Badan；(C)IAEDANS。呫吨家族：(D)荧光素(5-IAF和6-IAF)；(E)俄勒冈绿；(F)Alexa 432；(G)Alexa 532；(H)Alexa546；(I)德克萨斯红。香豆素家族：(J)太平洋蓝；(K)CPM。苯并噁二唑家族：(L)IANBD。氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)家族：(M)BODIPY 499/508；(N)BODIPY 507/545。花菁家族：(O)Cy5。其他：(P)PyMPO。

图9A-H是通过X射线晶体学确定的ttGGBP轭合物的结构的图示。(A)浏览三个铰链链(h₁-h₃)从蛋白质背面观察的ttGGBP F17C·Badan轭合物的概况。W182(洋红)与结合的葡萄糖(青色)形成广泛的范德华力接触(半透明表面)。F17C突变除去在苯环与葡萄糖之间的野生型接触(半透明表面)。Badan轭合物(蓝色)指出葡萄糖结合位点进入溶剂中。(B)ttGGBP182C2.0·Acrylodan轭合物的概况(注意观察点与(A)不同)。轭合的Acrylodan也指出进入溶剂中。(C)图示出结合的葡萄糖周围的通道的剖面图，在通道内放置了Badan、Acrylodan和半乳糖苷R基团(Sooriyaarachchi等人2009)(深灰色)。该视图沿着ttGGBP的长轴向下，着眼于N-末端结构域的葡萄糖结合表面C-末端结构域(具有Ca²⁺位点)已被切掉(平分铰链)。(D)很好地限定了Badan荧光团和结合的糖的电子密度(灰线，在1σ等值线上的2F_o-F_c电子密度)。(E)Badan的特写侧视图说明荧光团羰基被拧出萘环平面。(F)端视图，朝着结合位点外部的接头向下看，显示羰基扭转是约28°(灰线，在1σ等值线上的2F_o-F_c电子密度；箭头，半胱氨酸硫醇)。(G)ecGGBP W183C·Acrylodan的相同视图表明，在该荧光团中，羰基与萘环共平面(蓝线，在1σ等值线上的2F_o-F_c电子密度；箭头，半胱氨酸硫醇)。(H)荧光团羰基突出物(knob)进入由与D238和N258的范德华力接触形成的孔(半透明表面)之间的配合的特写视图。

图10A和B是关于亲和突变体的结构指导设计的结构。(A)ttGGBP182C2.0Acrylodan轭合物结构显示存在充满水和冷冻保护剂乙二醇的空腔，替换了突变的色氨酸的吲哚环。(B)已经发生突变的结构域间氢键。

图11A-C是与确定ttGGBP182C.2.0中葡萄糖的^真实K_d(^trueK_d)和^近似K_d值有关的曲线图(参见表5)。(A)ttGGBP182C.2.0·Acrylodan突变体轭合物的荧光发射强度的葡萄糖依赖性(参见表4)。箭头指示随着葡萄糖浓度增加的变化的方向。(B)使用在475nm和545nm(20nm带宽)处的发射强度的比率(R)确定^近似K_d。(C)通过单色拟合两个比率强度(I(λ)：绿色，475nm；红色，545nm)确定^真实K_d。使用脱辅基蛋白和饱和蛋白质两者的恒定基线，使用等式1和5将^近似K_d(4.5mM)和^真实K_d(6.0mM)的值同时拟合到三个实验结合等温线，其中两个单色等温线共享相同的^真实K_d。

图12A和B是显示组合几个ttGGBP突变体(表6)的传感器阵列的图，这些ttGGBP突变体可以跨越比90％的最大可能精度更好的完整病理生理学范围。(A)在ttGGBP182CAcrylodan背景中的突变体。响应显示为相对精度，根据等式8从对实验数据的拟合计算，从左到右为：ttGBP182C，低血糖；ttGGBP182C.2.0，正常血糖；ttGGBP182C.2.3，轻度高血糖；ttGGBP182C.8，严重高血糖；ttGGBP182C.9，高渗性高血糖状态。(B)在ttGGBP17C Badan背景中的突变体。比率信号从左到右显示的是：ttGGBP 17C·Acrylodan(^近似K_d＝0.06mM)、ttGGBP 17C.1·Badan(^近似K_d＝1.2mM)、ttGGBP 17C.3·Badan(^近似K_d＝3.9mM)、ttGGBP17C.5·Badan(^近似K_d＝19.3mM)。黑色圆圈：实验数据点

图13是显示用于传感器固定的融合构建体的一组草图。浅灰色，ttGGBP182C.2.0；斜条纹，六聚赖氨酸固定标签；深灰色，六聚组氨酸亲和纯化标签；横条纹，ZF-QNK锌指结构域；竖条纹，截短的锌指βZif结构域；波浪线，Gly-Gly-Ser接头(两个区段，表示Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser)。左列，构建体名称。

图14A-F是显示ttGGBP182C2.0 Acrylodan的固定不影响其热稳定性的图。通过在罗氏(Roche)LightCycler中测量作为温度的函数的通过488nm和510nm滤波器的荧光发射强度比率来确定热稳定性。小图A-C：ttGBP182C.2.0-Imm0；小图D-F：ttGBP182C.2.0-Imm1(参见图13)。(A)溶液(T_m＝347.6K)。(B)固定在镍-次氮基乙酸(Ni-NTA)珠粒(T_m＝346.7K)上。(C)重构的、干燥的Ni-NTA珠粒(T_m＝347.6K)。(D)固定在NHS官能化琼脂糖珠粒上的ttGGBP5.2Imm1的荧光响应。在罗氏LightCycler实时PCS仪器上收集数据，在384孔微量滴定板中记录作为温度函数的在488nm和510nm处的发射强度。孔含有不同葡萄糖浓度的水凝胶中带有标记的固定化蛋白质的珠粒。十二个不同的孔的温度熔体。如通过变性中点温度报告的脱辅基蛋白热稳定性是349K，类似于溶液中无蛋白质。(E)显示作为葡萄糖浓度和温度的函数的比率信号的三维景观基本上与溶液中无蛋白质无区别。(F)从三维数据中提取的代表性朗缪尔(Langmuir)配体结合曲线。在25℃的K_d(葡萄糖)值为4.8mM，其与溶液中无蛋白质类似。

图15是针对用固定的ttGGBP182C2.0 Acrylodan包被的磁性Ni-NTA珠粒确定的葡萄糖滴定曲线的图。数据高度精确，可重复，变异系数<0.2％。

图16A-F是显示ttGGBP的Y11C、F17C和W182C突变体的Acrylodan和Badan轭合物的葡萄糖依赖性校正光谱的奇异值分解的图。(A)Y11C·Acrylodan；(B)Y11C·Badan；(C)F17C·Acrylodan；(D)F17C·Badan；(E)F182C·Acrylodan；(F)F182C·Badan。光谱的频率变换(等式11)被分解为主要组分(等式12)。第一组分C₁(黑色)的贡献在很大程度上随葡萄糖浓度不变，而第二组分C₂(灰色)编码说明了光谱中葡萄糖依赖性变化(组分贡献在表1中给出)。插图，每种组分的分数贡献的葡萄糖依赖性(等式13)。

图17A-F是显示ttGGBP的Y11C、F17C和W182C突变体的Acrylodan和Badan轭合物的荧光发射强度光谱中电子跃迁的葡萄糖依赖性的图。(A)Y11C·Acrylodan；(B)Y11C·Badan；(C)F17C·Acrylodan；(D)F17C·Badan；(E)F182C·Acrylodan；(F)F182C·Badan。通过两个激发态电子跃迁可以将发射强度解释为第一近似值(图16)：低能量，绿色，S₁(Acrylodan：521±9nm；Badan：530±14nm)，以及高能量，蓝色，S₂(Acrylodan：477±14nm；Badan：477±16nm)跃迁。S₁跃迁出现在所有光谱中；S₂存在于所有葡萄糖响应性轭合物和36％的非响应性轭合物中(表7和8)。在表现出荧光发射强度的葡萄糖响应性变化的轭合物中，葡萄糖结合使这些激发态的群体移位。在每个滴定点，实验观察到的发射强度用S₁和S₂电子跃迁的高斯(Gaussians)拟合(等式14)建模(表3中的模型参数值)。仅显示脱辅基蛋白和饱和葡萄糖复合物的实验发射光谱和高斯拟合。发射光谱：黑色虚线，脱辅基蛋白；黑色实线，葡萄糖复合物。高斯拟合(S₁，绿线；S₂，蓝线)：虚线，脱辅基蛋白；实线，葡萄糖复合物。细黑线：每个滴定点的残差(等式16)。插图显示从每个滴定点的光谱中提取的S₁和S₂跃迁的群体分数(等式15)(黑色圆圈)拟合到朗缪尔结合等温线(实线)，其中对于两个群体，^近似K_d值被约束为相同。作为第一近似值，S₁或S₂跃迁的波长在脱辅基蛋白和饱和葡萄糖复合物中是相同的。残差表明该近似值不适用于所有的轭合物，并且需要更广泛的处理，其中S₁和S₂被分成多个跃迁(参见下面的讨论)。如果在脱辅基蛋白和饱和配体复合物中存在两种激发态群体的显著的再分布，则发生波长移位。在红移比率182C Acrylodan轭合物中，在葡萄糖复合物中S₁状态占优势(小图E)；在蓝移共轭物17C Badan(小图D)和17C·Acrylodan(小图C)中，脱辅基蛋白包括两种状态的混合物，然而它们的葡萄糖复合物几乎完全包含S₂状态。在蓝移11C Badan传感器(小图B)中，系统在不存在葡萄糖的情况下从主要的S₁移位至在葡萄糖复合物中几乎平均构成的S₁和S₂状态。S₁和S₂群体的分数的移位也出现在在其发射强度最大值的波长中没有表现出明显的移位的轭合物中。例如，11C Acrylodan和182C Badan在结合葡萄糖时都没有表现出发射最大值的显著移位。尽管如此，SVD分析揭示了如对明显比率传感器观察到的变量C₂组分的相似变化，但具有较小的贡献(图16A和F)。高斯分析揭示了S₁和S₂群体响应于葡萄糖的小移位(小图A和F)。这种模式也在其他非比率响应性轭合物中观察到(表7和8)。如果C₂组分构成总贡献的>5％，则观察到波长移位。

图18A-H是显示S₁和S₂电子跃迁对大肠杆菌GGBP Acrylodan和Badan轭合物的荧光发射强度光谱的贡献的葡萄糖依赖性的一系列图。颜色方案、符号和线如图2-4中表示。16CAcrylodan：(A)发射光谱(蓝移的)和比率葡萄糖结合曲线(插图：λ₁，454nm；λ₂，540nm；^近似K_d，1.0mM)；(C)奇异值分解；(E)S₁和S₂群体的高斯拟合和葡萄糖依赖性(插图)。16C Badan：(B)发射光谱(蓝移的)和比率葡萄糖结合曲线(插图：λ₁，465nm；λ₂，555nm；^近似K_d，0.4mM)；(D)奇异值分解；(F)S₁和S₂群体的高斯拟合和葡萄糖依赖性(插图)。182C Acrylodan：(G)奇异值分解；(H)S₁和S₂群体的高斯拟合和葡萄糖依赖性(插图)。

图19A-F是显示ttGGBP Acrylodan和Badan轭合物的吸收光谱的葡萄糖依赖性的图，这些ttGGBP Acrylodan和Badan轭合物响应于配体结合而经历其荧光发射强度的波长移位。ttGGBP F17C Badan：(A)吸收光谱(红色，无葡萄糖；紫色，饱和葡萄糖；黑色，中等葡萄糖浓度)。通过将朗缪尔配体结合等温线(等式1)与吸收强度的比率分析拟合来对蓝移响应进行建模(插图：λ₁，390nm；λ₂，340nm；^近似K_d，1.7mM)；(C)奇异值分解(组分：黑色，C₁；灰色，C₂)；(E)将电子跃迁的高斯代表与G₁(386nm，绿色；脱辅基蛋白，虚线；葡萄糖复合物，实线)和G₂(359nm，蓝色；脱辅基蛋白，虚线；葡萄糖复合物，实线)基态电子跃迁的吸收光谱(黑色虚线，脱辅基蛋白；实心黑线，葡萄糖复合物)的拟合。插图，将G₁和G₂跃迁在每个葡萄糖滴定处的群体分数(黑色圆圈)的葡萄糖依赖性拟合至朗缪尔结合等温线(实线)，其中对于两个群体^近似K_d值被约束为相同(残差，细线)。ttGGBP F182C Acrylodan(颜色方案、线表示、符号如上文)：(B)吸收光谱(红移响应)和葡萄糖结合(插图：λ₁，375nm；λ₂，430nm；^近似K_d，1.1mM；^真实K_d，1.9mM)；(D)奇异值分解；(F)G₁和G₂电子跃迁和群体。残差表明G₁和G₂跃迁的最大波长在脱辅基蛋白和葡萄糖中不同(还参见图17的图例)。

图20显示了示例性csaGGBP(表2)表达构建体的序列(SEQ ID NO:105)。

图21显示了示例性bprGGBP(表2)表达构建体的序列(SEQ ID NO:106)。

图22显示了示例性rinGGBP_A(表2)表达构建体的序列(SEQ ID NO:107)。

图23显示了示例性fprGGBP(表2)表达构建体的序列(SEQ ID NO:108)。

图24显示了示例性cljGGBP(表2)表达构建体的序列(SEQ ID NO:109)。

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图26显示了示例性rinGGBP_B(表2)表达构建体的序列(SEQ ID NO:111)。

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图29显示了示例性ttGGBP(表2)表达构建体的序列(SEQ ID NO:114)。

图30显示了示例性cobGGBP(表2)表达构建体的序列(SEQ ID NO:115)。

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图33显示了示例性ttGGBP11C半胱氨酸扫描突变体(表3)表达构建体的序列(SEQID NO:118)。

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图41显示了示例性ttGGBP148C半胱氨酸扫描突变体(表3)表达构建体的序列(SEQID NO:126)。

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图44显示了示例性ttGGBP181C半胱氨酸扫描突变体(表3)表达构建体的序列(SEQID NO:129)。

图45显示了示例性ttGGBP182C半胱氨酸扫描突变体(表3)表达构建体的序列(SEQID NO:130)。

图46显示了示例性ttGGBP183C半胱氨酸扫描突变体(表3)表达构建体的序列(SEQID NO:131)。

图47显示了示例性ttGGBP257C半胱氨酸扫描突变体(表3)表达构建体的序列(SEQID NO:132)。

图48显示了示例性ttGGBP259C半胱氨酸扫描突变体(表3)表达构建体的序列(SEQID NO:133)。

图49显示了示例性ttGGBP300C半胱氨酸扫描突变体(表3)表达构建体的序列(SEQID NO:134)。

图50显示了示例性ttGGBP17C.1亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:135)。

图51显示了示例性ttGGBP17C.2亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:136)。

图52显示了示例性ttGGBP17C.3亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:137)。

图53显示了示例性ttGGBP17C.4亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:138)。

图54显示了示例性ttGGBP17C.5亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:139)。

图55显示了示例性ttGGBP17C.6亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:140)。

图56显示了示例性ttGGBP17C.7亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:141)。

图57显示了示例性ttGGBP17C.8亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:142)。

图58显示了示例性ttGGBP17C.9亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:143)。

图59显示了示例性ttGGBP17C.10亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:144)。

图60显示了示例性ttGGBP17C.11亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:145)。

图61显示了示例性ttGGBP17C.19亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:146)。

图62显示了示例性ttGGBP17C.20亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:147)。

图63显示了示例性ttGGBP17C.21亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:148)。

图64显示了示例性ttGGBP17C.22亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:149)。

图65显示了示例性ttGGBP17C.23亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:150)。

图66显示了示例性ttGGBP17C.24亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:151)。

图67显示了示例性ttGGBP17C.25亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:152)。

图68显示了示例性ttGGBP17C.26亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:153)。

图69显示了示例性ttGGBP17C.27亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:154)。

图70显示了示例性ttGGBP17C.28亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:155)。

图71显示了示例性ttGGBP17C.29亲和力调整突变体(17C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:156)。

图72显示了示例性ttGGBP182C.2.0亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:157)。

图73显示了示例性ttGGBP182C.2.1亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:158)。

图74显示了示例性ttGGBP182C.2.3亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:159)。

图75显示了示例性ttGGBP182C.2.4亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:160)。

图76显示了示例性ttGGBP182C.2.5亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:161)。

图77显示了示例性ttGGBP182C.2.6亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:162)。

图78显示了示例性ttGGBP182C.2.7亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:163)。

图79显示了示例性ttGGBP182C.2.8亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:164)。

图80显示了示例性ttGGBP182C.2.9亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:165)。

图81显示了示例性ttGGBP182C.3亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:166)。

图82显示了示例性ttGGBP182C.4亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:167)。

图83显示了示例性ttGGBP182C.5亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:168)。

图84显示了示例性ttGGBP182C.6亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:169)。

图85显示了示例性ttGGBP182C.7亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:170)。

图86显示了示例性ttGGBP182C.8亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:171)。

图87显示了示例性ttGGBP182C.9亲和力调整突变体(182C背景)(表6)表达构建体的序列(SEQ ID NO:172)。

图88是说明连续葡萄糖监测的非限制性方面的草图。

图89是说明用生物传感器进行样品分析的非限制性实例的草图。

具体实施方式

基于工程化蛋白的荧光响应传感器(FRS)将配体结合事件与固有或半合成掺入的发色团的发射特性的变化相结合，在细胞生物学和分析化学中具有广泛的应用。如果工程化FRS的荧光发射光谱响应于配体结合而改变形状，这样使得在两个适当选择的波长处的强度比率报告配体浓度(二色性响应)，则可以使用比率测量来监测分析物浓度。比率优势(Ratiometry Advantage)对于依赖荧光发射强度变化的装置是必不可少的，因为它提供了内部一致的参考。比率测量的自我校准性质消除了在每次测量之前执行机载校准测试的必要性，从而避免了对多个组分和射流线路的需求。因此，无试剂的比率荧光传感器在过程工程、环境或临床化学中有许多用途，包括一次性定点照护应用、可穿戴设备或经皮询问的植入的“纹身”。

周质结合蛋白(PBP)超家族提供了丰富的FRS来源，因为PBP将大量不同的配体特异性与共同结构机制组合，该结构机制非常适合构建荧光信号转导方案。三维PBP单体结构包括通过图1A的β-链铰链连接的两个α/β结构域。配体的结合伴随着大的铰链弯曲运动，该运动将蛋白质从开放状态转变为闭合状态，其中配体被包埋在两个结构域之间的裂隙内。半合成FRS可以通过位点特异性附接的单一、硫醇反应性、对环境敏感的荧光团用PBP进行工程化，这些荧光团响应配体介导的构象变化(图1A-C)。这里，我们描述了从葡萄糖结合PBP家族的热稳定性成员衍生的稳健的、比率的、荧光响应的葡萄糖传感器的构建。

葡萄糖监测对于糖尿病的管理至关重要，糖尿病是一种影响全球至少3.66亿人的疾病，每年都在增加。目前大多数葡萄糖监测技术依赖于葡萄糖是底物之一的酶。因此，葡萄糖浓度测量经受酶反应中消耗的第二底物浓度(例如在葡萄糖氧化酶的情况下的氧)的变化。在测量固定在电极上的酶的反应速率的系统中会出现另外的并发症。在这样的安排中，精确度受到改变葡萄糖到达电极表面的速率干扰精确度的因素(例如血细胞比容水平)、或由在异物反应中蛋白质和细胞的沉积形成的表面“污垢”的影响。比率荧光葡萄糖传感器避免了这些问题，并且因此已成功地并入用于动物和人类中的连续葡萄糖监测的光极。

在基于FRS的传感器中，信号产生自分析物(配体)与受体的可逆结合平衡。这些信号在匹配受体配体-解离常数的配体浓度下最为精确。精度保持在该最高水平的约80％内，浓度范围为大约高于或低于该点的3倍。因此，构建有效的FRS需要将配体结合亲和力与相关分析物浓度匹配。多个传感器的阵列可能必须一致使用以覆盖大的浓度范围。临床上相关的葡萄糖水平变化大约100倍(从极端低血糖中的约1mM至高渗的、高血糖状态的约100mM，健康的正常血糖水平在约6mM(Association 2000Clinical Diabetes[临床糖尿病],18；Pasquel 2014Diabetes Care[糖尿病护理],37,3124-3131))，需要具有不同葡萄糖亲和力的多个FRS传感器的阵列以高精度直接报告临床相关葡萄糖浓度的全范围。这里，我们报告了一组经适当调整的热稳定性葡萄糖响应FRS，这些FRS通过突变它们的葡萄糖结合位点而构建。

将FRS固定在固体表面上(对分子传感机制具有最小的扰动)是将生物传感器并入装置中的重要步骤。固定使得能够将传感器保持在取样元件内(例如用于体内传感应用的光极表面或植入珠粒；或用于离体传感的样品处理盒中)。固定也可以提供空间定位以提供多传感器阵列中的不同元件的必要的可寻址能力，该多传感器阵列包括对于大范围的葡萄糖浓度的覆盖不同于其工程化亲和力的传感器或各自检测不同分析物的传感器。

离体临床化学如定点照护应用要求将FRS并入测量时引入样品的盒中。这样的“一次性用品”需要具有较长的保质期，优选不需要温度控制(例如冷藏)来储存或分配。优选将固定的蛋白质以稳定的干燥形式掺入这样的一次性用品中。对热稳定性蛋白质变性的固有抗性使在制造和储存期间对温度控制的需求最小化，并且可以延伸至干燥状态的长期稳定性。本文所描述的蛋白质传感器符合这些要求。

这里报告的稳健的热稳定性葡萄糖FRS的光谱响应、结合亲和力和热稳定性在位点特异性固定在基质(如珠粒)上后得以维持。此外，这些性能在干燥和在加速老化条件下长时间储存后重构时迅速恢复。因此，这些工程化蛋白质可用于高精度、大的动态范围的葡萄糖传感应用，包括连续监测、定点照护和可穿戴传感器系统。

生物传感器

生物传感器是将配体结合事件转换为物理信号的分子识别元件。如本文详述的生物传感器结合至少一种配体并发出信号。配体结合的生物传感器产生与未结合的生物传感器不同的信号。这种差异促进至少一种配体的检测和/或配体浓度的确定。生物传感器可以在没有其他试剂的帮助下使用。

本文描述了新颖的工程化生物传感器。这些生物传感器可能具有改变的配体结合亲和力、定制的配体结合特异性和/或配体结合或稳定性的温度依赖性。例如，本文所描述的工程化葡萄糖和半乳糖生物传感器提供与延长的葡萄糖浓度范围有关的高精确度信息。

配体的结合介导生物传感器的构象变化，如多肽的铰链弯曲运动。构象变化会影响报告基团的环境，这样使得报告基团产生的信号发生变化。也就是说，在没有配体结合的情况下，生物传感器导致由报告基团产生的信号，并且当配体结合时，由报告基团产生的信号改变。配体结合的生物传感器导致与未结合的生物传感器不同的报告基团产生的信号。

在一些实施例中，这些方法和组合物包括复数个单一类型的生物传感器。生物传感器在结构和功能方面可以相同。例如，单一类型的生物传感器可以具有相同的多肽、相同的报告基团以及相同的配体亲和力。

在其他实施例中，这些方法和组合物包括复数个不同类型的生物传感器。复数个这些不同类型的生物传感器可以被安排在或并入面板中。如本文所使用的，“面板”是指两个或更多个生物传感器。这两个或更多个生物传感器可以彼此不同。生物传感器在结构和/或功能方面可以不同。生物传感器在多肽序列、报告基团、配体亲和力或其组合方面可以不同。因此，可以存在不同类型的生物传感器。在一些实施例中，面板中的每个生物传感器包括相同的报告基团。在一些实施例中，面板中的每个生物传感器包括不同的报告基团。面板可以包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、或至少100个生物传感器。

生物传感器的面板包括至少一个传感器元件。“传感器元件”是指至少一个生物传感器的单个点、位点、位置或孔，在其上可以施用样品或其等分试样。面板可以是复合传感器或阵列。

在一些实施例中，面板是复合传感器。在复合传感器中，每个传感器元件包括两种或更多种不同的生物传感器的混合物。在一些实施例中，复合传感器包括一个传感器元件。在一些实施例中，复合传感器包括两个或更多个传感器元件。在一些实施例中，从复合传感器测量信号，其中信号产生自传感器元件中的一个或多个生物传感器。例如，可以从复合传感器测量信号，其中信号产生自传感器元件中生物传感器总数的子集。例如，可以从复合传感器测量信号，其中信号产生自传感器元件中的五个生物传感器中的两个。

在一些实施例中，面板是阵列。在阵列中，每个传感器元件包括单一类型的生物传感器。阵列包括复数个单独和空间定位的传感器元件。每个传感器元件包括与不同传感器元件的生物传感器不同或相同的生物传感器。在一些实施例中，从阵列测量信号，其中信号分别产生自在分离的传感器元件中的两个或更多个选择的生物传感器。阵列可以包括多种尺寸和配置的复数个传感器元件。阵列可以包括线性排列的复数个传感器元件。例如，阵列可以包括排列成单行的复数个微米尺寸的传感器元件。阵列可以包括排列在网格中的复数个传感器元件。网格可以是二维或三维的。在一些实施例中，网格是空间可定址的网格。在一些实施例中，将生物传感器并入阵列中，如多通道或多路复用阵列。

本披露的生物传感器可以用于葡萄糖检测是需要的或所希望的任何环境中，例如医疗环境(例如，确定受试者中的血糖水平)、环境背景(例如，确定环境样品中的葡萄糖水平)、生物环境(例如，确定反应中葡萄糖的存在或量)、或在工艺工程中，例如监测发酵反应(例如啤酒/葡萄酒生产等)中的葡萄糖的量。其他实例包括但不限于在以下各项中的用途：在食品工业中(Suleiman等人,在:Biosensor Design and Application[生物传感器设计和应用]:Mathewson和Finley编辑；American Chemical Society[美国化学学会],Washington，DC[华盛顿特区]1992，第511卷)；在临床化学中(Wilkins等人,Med.Eng.Phys.[医学工程与物理学]1996,18,273-288；Pickup,Tr.Biotech.[生物技术趋势]1993,11,285-291；Meyerhoff等人,Endricon 1966,6,51-58；Riklin等人,Nature[自然]1995,376,672-675)；Willner等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1996,118,10321-10322)；作为构建含有固定的GGBP-FAST轭合物的荧光流动池的基础(参见，例如，Wilkins等人,Med.Eng.Phys.[医学工程与物理学]1966,18,273-288；Pickup,Tr.Biotech.[生物技术趋势]1993,11,285-291；Meyerhoff等人,Endricon.1966,6，51；Group,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]1993,329,977-986；Gough等人,Diabetes[糖尿病]1995,44,1005-1009)；以及在可植入装置中，例如适合用作人工胰腺的那些。

如本文详述的生物传感器可以按本领域技术人员已知的各种方式施用，对于每种应用酌情施用。可以在溶液中提供生物传感器。溶液可以是缓冲的。可以在溶液中提供生物传感器并将其直接与样品混合。在一些实施例中，生物传感器被固定在表面上。可以将生物传感器固定在可以将样品引入或施用于其中的一次性盒中。可以将生物传感器植入或并入可穿戴设备中。可以将生物传感器作为光极提供。

可以将生物传感器附接至或并入可穿戴设备中。可穿戴设备可以包括例如粘合带、贴片和隐形眼镜。生物传感器可以被配置为与受试者的皮肤或黏膜表面接触放置。在一些实施例中，生物传感器被配置为粘合带。在一些实施例中，生物传感器被配置在隐形眼镜的表面之内或之上。在一些实施例中，隐形眼镜由成形为直接佩戴在受试者眼睛上的透明基质形成，如例如在美国专利号8,608,310中所述的。

可以将生物传感器植入。可以将生物传感器植入受试者的体内。可以将生物传感器植入受试者的血管、静脉、眼睛、天然或人工胰腺、皮肤或消化道内的任何位置，包括胃、肠和食道。可以用微珠将生物传感器植入受试者中。在一些实施例中，生物传感器被配置成植入皮肤中。可以将生物传感器皮下植入受试者中。生物传感器可以经皮产生信号。在一些实施例中，可以用经皮微珠将生物传感器植入受试者中，其中光学信号可以在生物传感器和检测装置之间远程传输。

在一些实施例中，生物传感器作为光极施用。如本文所使用的，“光极”是指具有固定在表面或末端的单个生物传感器或复合生物传感器的光纤。“光极”(optode)也可以被称为“光极”(optrode)。在一些实施例中，生物传感器作为光极植入受试者中。光极可以与针结合或插入针内。光极可以与探针(如内窥镜检探针或结肠镜检探针)结合。光极可以用于肿瘤、肿瘤附近或肿瘤周围。在一些实施例中，生物传感器可以作为光极植入受试者中，其中光学信号可以使用物理链路在生物传感器与检测装置之间传输。在一些实施例中，生物传感器作为光极施用至样品或反应。光极可以与样品或反应接触。在一些实施例中，使用光极连续或偶发地监测样品或反应中的配体。

检测配体的存在的方法

本文提供了检测样品中配体的存在的方法。该方法可以包括使生物传感器与样品接触；测量来自生物传感器的信号；和将信号与无配体的对照进行比较。信号的差异表明样品中存在配体。

本文还提供了检测样品中葡萄糖的存在的方法。该方法可以包括(a)提供本文所披露的葡萄糖生物传感器，其中报告基团与GGBP附接，使得当GGBP与葡萄糖结合时由报告基团转导的信号与当GGBP不与葡萄糖结合时由报告基团转导的信号不同；(b)使生物传感器与测试样品在使得生物传感器可以结合测试样品中存在的葡萄糖的条件下接触；和(c)将当生物传感器与测试样品接触时由报告基团转导的信号与当生物传感器与无葡萄糖的对照样品接触时由报告基团转导的信号进行比较，其中与当生物传感器与对照样品接触时相比，当生物传感器与测试样品接触时由报告基团转导的信号的差异表明测试样品含有葡萄糖。

确定配体的浓度的方法

本文提供了确定样品中配体的浓度的方法。该方法可以包括使生物传感器与样品接触；测量来自生物传感器的信号；和将该信号与标准双曲线配体结合曲线进行比较以确定测试样品中配体的浓度。可以通过测量当与含有已知浓度的配体的对照样品接触时由生物传感器转导的信号来制备标准双曲线配体结合曲线。

本披露的另一个方面提供了确定测试样品中葡萄糖的浓度的方法，该方法包括以下各项、由以下各项组成或基本上由以下各项组成：(a)提供包括如本文所描述的葡萄糖生物传感器在内的葡萄糖生物传感器，其中报告基团与GGBP附接，使得当GGBP与葡萄糖结合时由报告基团转导的信号与当GGBP不与葡萄糖结合时由报告基团转导的信号不同；(b)使生物传感器与测试样品在使得生物传感器可以结合测试样品中存在的葡萄糖的条件下接触；和(c)将当生物传感器与测试样品接触时由报告基团转导的信号与标准双曲线葡萄糖结合曲线进行比较，以确定测试样品中葡萄糖的浓度，该标准双曲线葡萄糖结合曲线通过测量当生物传感器与含有已知量的葡萄糖的对照样品接触时由报告基团转导的信号来制备。

监测配体的存在的方法

本发明涉及偶发或连续监测反应中配体的存在的方法。在某些实施例中，生物传感器可以用于连续监测反应中的葡萄糖。在某些实施例中，葡萄糖传感器可以用于偶发监测样品等分试样。

偶发或连续监测在反应中配体的存在的方法可以包括使生物传感器与反应接触；在使得多肽能够结合在反应中存在的配体的条件下维持该反应；和偶发或连续监测在反应中来自生物传感器的信号。

偶发或连续监测在反应中配体的存在的方法可以包括使生物传感器与反应接触；在使得多肽能够结合在反应中存在的配体的条件下维持该反应；偶发或连续监测在反应中来自生物传感器的信号；和将该信号与标准双曲线配体结合曲线进行比较以确定测试样品中配体的浓度。可以通过测量当与含有已知浓度的配体的对照样品接触时由生物传感器转导的信号来制备标准双曲线配体结合曲线。

在一些实施例中，该方法进一步包括将该信号与无配体对照进行比较，其中信号的差异表明反应中配体的存在。

在一些实施例中，该方法进一步包括将该信号与标准双曲线配体结合曲线进行比较以确定测试样品中配体的浓度。可以通过测量当与含有已知浓度的配体的对照样品接触时由生物传感器转导的信号来制备标准双曲线配体结合曲线。

本披露的另一个方面提供了连续监测反应中葡萄糖的存在的方法，该方法包括以下各项、由以下各项组成或基本上由以下各项组成：(a)提供如本文所描述的葡萄糖生物传感器，其中报告基团与GGBP附接，使得当GGBP与葡萄糖结合时由报告基团转导的信号与当GGBP不与葡萄糖结合时由报告基团转导的信号不同；(b)在反应中并且在使得生物传感器可以结合反应中存在的葡萄糖的条件下维持生物传感器；(c)当生物传感器与反应中存在的葡萄糖接触时，连续监测由报告基团转导的信号；和任选地(d)将当生物传感器与反应中存在的葡萄糖接触时由报告基团转导的信号与当生物传感器与无葡萄糖的对照样品接触时由报告基团转导的信号进行比较，其中与当生物传感器与对照样品接触时相比，当生物传感器与反应中存在的葡萄糖接触时由报告基团转导的信号的差异表明在反应中存在葡萄糖。

本披露的又另一个方面提供了连续监测反应中葡萄糖的浓度的方法，该方法包括以下各项、由以下各项组成或基本上由以下各项组成：(a)提供包括如本文所描述的葡萄糖生物传感器在内的葡萄糖生物传感器，其中报告基团与GGBP附接，使得当GGBP与葡萄糖结合时由报告基团转导的信号与当GGBP不与葡萄糖结合时由报告基团转导的信号不同；(b)在使得生物传感器可以结合反应中存在的葡萄糖的条件下在反应内维持生物传感器；和(c)当生物传感器与反应中存在的葡萄糖接触时，连续监测由报告基团转导的信号；和(d)将当生物传感器与反应中存在的葡萄糖接触时由报告基团转导的信号与标准双曲线葡萄糖结合曲线进行比较，以确定反应中葡萄糖的浓度，该标准双曲线葡萄糖结合曲线通过测量当生物传感器与含有已知量的葡萄糖的对照样品接触时由报告基团转导的信号来制备。

一般定义

除非另有明确定义，本文所使用的所有技术和科学术语应视为具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同含义(例如，在细胞培养、分子遗传学和生物化学方面)。

如本文所使用的，在数值或范围的上下文中的术语“约”意指所列举或要求保护的数值或范围的±10％，除非上下文需要更有限的范围。

在上面的描述和在权利要求书中，诸如“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”等短语可以出现在元件或特征的联合列表之前。术语“和/或”也可以出现在两个或更多个元件或特征的列表中。除非另外暗示或明确地与其使用的上下文相矛盾，这样的短语旨在意指单独列出的元件或特征中的任何一个或者任何列举的元件或特征与任何其他列举的元件或特征的组合。例如，短语“A和B中的至少一个/种”；“A和B中的一个/种或多个/种”；和“A和/或B”各自旨在意指“单独A、单独B、或A和B一起”。类似的解释也旨在包括三个/种或更多个/种物品的列表。例如，短语“A、B和C中的至少一个/种”；“A、B和C中的一个/种或多个/种”；以及“A、B和/或C”各自旨在意指“单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、或A和B和C一起”。另外，在上面和在权利要求书中，使用术语“基于”旨在意指“至少部分地基于”，使得未列举的特征或元件也是可允许的。

应该理解，在提供参数范围的情况下，本发明还提供了该范围内的所有整数及其十等分的数。例如，“0.2-5mg”是0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg等直至并包括5.0mg的披露。

小分子是质量小于2000道尔顿的化合物。小分子的分子量优选小于1000道尔顿、更优选小于600道尔顿，例如化合物小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、200道尔顿或100道尔顿。

如本文所使用的，“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽或蛋白质基本上不含其他细胞材料、或培养基(当通过重组技术产生时)、或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。纯化的化合物为按重量(干重)计至少60％的感兴趣的化合物。优选地，制剂是按重量计至少75％、更优选至少90％、并且最优选至少99％的感兴趣的化合物。例如，纯化的化合物是按重量计所希望化合物的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、或100％(w/w)的化合物。纯度通过任何适当的标准方法测量，例如通过柱层析、薄层层析、或高效液相层析(HPLC)分析。纯化的或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))在其天然存在的状态下不含在其侧翼的基因/核酸或序列/氨基酸。纯化的还定义了对于给予人类受试者是安全的无菌程度，例如，缺乏感染剂或毒性剂。在肿瘤抗原的情况下，可以纯化抗原或加工制剂如肿瘤细胞裂解物。

类似地，“基本上纯的”意指已经从天然伴随其的组分分离的核苷酸或多肽。典型地，当核苷酸和多肽按重量计至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％不含与它们天然关联的蛋白质和天然存在的有机分子时，它们是基本上纯的。

过渡性术语“包括”(comprising)与“包括”(including)、“含有”(containing)或“由……表征”(characterized by)同义，是包含性的或开放性的，并且不排除另外的未列举的元件或方法步骤。相比之下，过渡性短语“由……组成”排除在权利要求书中未指定的任何元件、步骤或成分。过渡性短语“基本上由……组成”将一项权利要求的范围限制到指定的材料或步骤、“以及本质上不影响所要求保护的本发明的一个或多个基本和新颖特征的那些”。

如本文所使用的，“受试者”是指从其获得生物样品的任何生物体。例如，样品是生物流体或组织。例如，受试者是希望或需要用本文所描述的生物传感器检测配体或确定配体的浓度的受试者。“受试者”可以是人或非人类动物。受试者可以是哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类动物或非灵长类动物。哺乳动物可以是灵长类动物如人；非灵长类动物例如像狗、猫、马、牛、猪、小鼠、大鼠、骆驼、美洲驼、山羊、兔、绵羊、仓鼠和豚鼠；或非人类灵长类动物例如像猴、黑猩猩、大猩猩、猩猩和长臂猿。受试者可以具有任何年龄或发育阶段，例如像成人、青少年或婴儿。

如本文所使用的，“表达载体”是能够实现一种或多种多核苷酸表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体也能够在宿主细胞内复制。表达载体可以是原核生物的或真核生物的，并且通常包括质粒。本发明的表达载体包括在本发明的宿主细胞中(包括在本文所描述的原核或真核细胞之一中)起作用(即，指导基因表达)的任何载体，这些宿主细胞是例如革兰氏阳性、革兰氏阴性、致病性、非致病性、共生性、球菌、芽孢杆菌或螺旋形细菌细胞；古细菌细胞；或原生动物、藻类、真菌、酵母、植物、动物、脊椎动物、无脊椎动物、节肢动物、哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物或人类细胞。本发明的表达载体含有调节序列，例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点、以及与宿主细胞相容且控制多核苷酸表达的其他调节序列。具体地，本发明的表达载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，如启动子、增强子、操纵子和阻遏子序列。合适的转录控制序列包括可以在本发明的至少一种细胞中起作用的任何转录控制序列。多种这样的转录控制序列是本领域技术人员已知的。

如本文所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外清楚指明。因此，例如，对“一种疾病”、“一种疾病状态”或“一种核酸”的提及是对一种或多种这样的实施例的提及，并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。

如本文所使用的，“药学上可接受的”载体或赋形剂是指适合与人类和/或动物一起使用而与合理的益处/风险比相称没有过度的不利副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)的载体或赋形剂。它可以是例如药学上可接受的溶剂、悬浮剂或运载体，用于将本发明化合物递送至受试者。

术语“诊断”是指疾病存在于受试者中的确定。类似地，术语“预后”是指在受试者中可能发生某种未来结果的相对概率。例如，在本披露的上下文中，预后可以是指个体将患上疾病的可能性或疾病的可能严重程度(例如，症状的严重程度、功能衰退的速率、存活等)。

取决于上下文，术语“多肽”和“蛋白质”可以互换使用。

一种多肽或一类多肽可以通过其氨基酸序列与参考氨基酸序列的一致性程度(％一致性)来定义，或者通过与一个参考氨基酸序列具有比另一参考氨基酸序列更高的％一致性来定义。本文所披露的任何基因或基因产物的变体可以与本文所描述的核酸或氨基酸序列具有例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列一致性。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“％一致性”是指如使用序列比较算法或通过目视检查测量的，当比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。例如，％一致性是相对于被比较序列的编码区的全长、或其特定片段或功能结构域的长度。如本文所披露的变体还包括本文所描述的基因或基因产物的同系物、直系同源物或旁系同源物。在一些实施例中，变体可以表现出一定百分比的同源性或一致性，例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致性，对于生物功能重要的保守结构域，例如在功能结构域中，例如配体结合或催化结构域。

对于序列比较，一个序列用作参考序列，测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法然后计算一个或多个测试序列相对于参考序列的百分比序列一致性。使用BLAST确定百分比一致性。对于BLAST搜索，采用以下参数：(1)期望阈值为10；(2)空位成本是存在:11(Existence:11)和延伸:1(Extension:1)；(3)所使用的矩阵是BLOSUM62；(4)低复杂度区域的过滤器是“开”。

本发明还提供了本文所描述的基因或基因产物的功能片段。蛋白质片段的特征在于长度(氨基酸数量)小于蛋白质的全长成熟形式的长度。在本文所提供的这些序列和所有其他序列的情况下，片段可以是整体的一部分，该部分小于整体。此外，片段的大小范围是从多核苷酸或多肽序列内的单个核苷酸或氨基酸到比整个多核苷酸或多肽序列少一个核苷酸或氨基酸。最后，将片段定义为介于以上所定义的极端之间的完整多核苷酸或多肽序列的任何部分。

例如，本文所披露的或由本文所披露的任何基因编码的任何蛋白质或酶的片段可以是10个至20个氨基酸、10个至30个氨基酸、10个至40个氨基酸、10个至50个氨基酸、10个至60个氨基酸、10个至70个氨基酸、10个至80个氨基酸、10个至90个氨基酸、10个至100个氨基酸、50个至100个氨基酸、75个至125个氨基酸、100个至150个氨基酸、150个至200个氨基酸酸、200个至250个氨基酸、250个至300个氨基酸、或300个至350个氨基酸。在本申请主题中涵盖的片段包括保留功能片段的片段。因此，片段优选保留对于功能活性所需或对其重要的结合结构域。通过使用本文的序列信息可以确定或产生片段，并且可以使用本领域已知的标准方法测试片段的功能活性。例如，所编码的蛋白质可以通过本领域已知的任何重组技术表达，并且可以确定蛋白质的结合活性。

如本文所使用的，“生物活性”片段是维持全长参考多肽活性的多肽的一部分。如本文所使用的生物活性片段不包括全长多肽。生物活性片段可以是任何大小，只要它们维持所定义的活性即可。优选地，生物活性片段维持至少10％、至少50％、至少75％或至少90％的全长蛋白质的活性。

本文所定义的多肽的氨基酸序列变体/突变体可以通过将适当的核苷酸变化引入本文所定义的核酸中、或通过体外合成所希望的多肽来制备。此类变体/突变体包括例如氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。可以进行缺失、插入和取代的组合以达到最终构建体，条件是最终的肽产物具有所希望的活性和/或特异性。

突变的(改变的)肽可以使用本领域已知的任何技术来制备。例如，如由Harayama(1998)广泛描述的，本文所定义的多核苷酸可以进行体外诱变或DNA改组技术。衍生自突变的/改变的DNA的产物可以使用本文所描述的技术容易地筛选以确定它们是否具有例如葡萄糖和/或半乳糖结合活性。

在设计氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的一个或多个特征。可以例如通过(1)首先用保守的氨基酸选择进行取代，并且然后取决于所获得的结果用更多的基团选择进行取代；(2)缺失靶残基；或(3)邻近所在位点插入其他残基来单独地或系列地修饰突变位点。

氨基酸序列缺失的范围通常是从约1个至15个残基、更优选约1个至10个残基并且通常约1个至5个连续残基。在一些实施例中，突变的或修饰的蛋白质不包括任何缺失或插入。在各种实施例中，突变的或修饰的蛋白质具有少于约10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、或2个缺失的或插入的氨基酸。

取代突变体的至少一个氨基酸残基在多肽分子中被除去并且不同的残基被插入其位置中。为了维持活性和/或特异性，可以按相对保守的方式取代位点。此类保守取代在“示例性取代”的标题下显示在下表中。

在某些实施例中，与天然存在的多肽相比，突变体/变体多肽具有仅仅或不超过一个或两个或三个或四个保守氨基酸改变。下表中提供了保守氨基酸改变的细节。如本领域技术人员将意识到的，可以合理地预测此类微小变化不会改变多肽在重组细胞中表达时的活性。

示例性取代

可以将突变引入核酸序列中，这样使得编码的氨基酸序列通过标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变而改变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。某些氨基酸具有超过一种可分类特征的侧链。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸)；非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸)；β-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在给定的多肽中预测的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。可替代地，在另一个实施例中，可以沿着给定的编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以针对给定的多肽生物活性筛选所得的突变体以鉴定保留活性的突变体。相反地，本发明还提供了具有增强或增加内源性生物活性的突变的变体。在对核酸序列进行诱变后，所编码的蛋白质可以通过本领域已知的任何重组技术表达，并且可以确定蛋白质的活性/特异性。本领域普通技术人员可以容易地测量本文所披露的变体的给定生物活性的增加、减少或消除，即通过测量结合配体和/或信号转导的能力。

在各种实施例中，多肽包括突变，这样使得1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个，或少于约10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、或2个氨基酸被半胱氨酸和/或赖氨酸取代。

根据本领域已知的方法，可以按各种方式产生多肽，包括天然多肽或重组多肽的产生和回收。在一个实施例中，通过在有效产生多肽的条件下培养能够表达多肽的细胞(如本文所定义的宿主细胞)来产生重组多肽。

序列表的关键

下面提供了实例以有助于更全面地理解本发明。以下实例阐明了制造和实践本发明的示例性模式。然而，本发明的范围不限于在这些实例中披露的具体实施例，这些实例仅出于说明的目的，因为可以利用替代性方法来获得类似的结果。

实例1.荧光响应性传感器工程化阶段

FRS的工程化可以分为五个阶段：

1.结合蛋白发现。鉴定了一组葡萄糖结合蛋白序列同系物。其配体结合功能的精确分配利用预测方法的应用，该预测方法并入在实验确定的周质葡萄糖结合蛋白的三维结构中编码的信息。

2.实验主导验证。构建合成基因，其针对一种或多种预测的葡萄糖结合蛋白序列在大肠杆菌中的异源表达进行了优化。评价相应表达的纯化蛋白质的葡萄糖结合特性和热稳定性。

3.荧光响应的工程化。通过将荧光团附接至单个半胱氨酸突变体来构建实验验证的前导物(lead)的半合成荧光轭合物。评价葡萄糖结合对那些轭合物的荧光发射特性的影响。证明强烈的比率响应的那些轭合物被选作FRS。

4.亲和力调整。通过定点诱变引入单个或多个突变以改变葡萄糖响应性FRS的葡萄糖结合亲和力。选择一组FRS变体，这些变体一起以高精确度覆盖临床葡萄糖浓度范围。

5.设备集成。FRS以保留其荧光响应和葡萄糖亲和力的方式固定在分析装置的取样组件中。建立长期储存条件。

实例2.使用结构辅助功能评价鉴定周质葡萄糖结合蛋白同系物的家族(第1阶段步骤)。

作为构建稳健的葡萄糖传感器候选物的第一步骤，我们检查了细菌基因组序列以鉴定在已知嗜热菌中的周质葡萄糖结合蛋白序列。来自此类生物体的同系物可能编码热稳定性蛋白质。酶家族的分析显示低于约60％的总体序列一致性是功能保守的弱预测因子(Todd 2001J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]307,1113-1143；Tian 2003J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]333,863-882)。此外，已知基于单独的序列同源性的功能分配在PBP超家族中是特别有问题的。例如，预测按总体序列一致性与寡肽结合的PBP被发现结合寡糖。如果包括基于从蛋白质结构鉴定的催化残基的保守性的序列选择过滤器，则酶功能分配得以大大改善。此类催化残基包括与酶底物或抑制剂接触的所有残基的子集。在PBP的情况下，功能选择过滤器需要考虑编码配体结合功能的所有蛋白质-配体接触。因此，我们开发了一种结构辅助功能评价(SAFE)方法来鉴定具有精确预测功能的PBP序列同系物。SAFE同系物搜索方法由ProteinHunter软件包中编码的五个步骤组成：

1.使用BLAST序列比对工具(Altschul等人1990)，用标准设置(预期阈值：10.0；空位成本存在：11；空位延伸：1；取代矩阵：Blosum62；用于低复杂度区域的过滤器：开)，以大肠杆菌周质葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ecGGBP)序列(SEQ ID NO:17)作为种子(Vyas,Vyas和Quiocho 1988Science[科学],242,1290-5)开始收集序列同系物集合。ProteinHunter程序仅选择(a)具有最小20％序列一致性、以及(b)通过比对区域具有其整个序列长度的70％覆盖的那些成对BLAST比对。这组序列定义了可能的葡萄糖结合蛋白的范围，但没有分配功能。

2.生物功能的基于结构的编码。包括与结合的葡萄糖形成氢键和范德华力接触的蛋白质残基的PCS使用ecGGBP-葡萄糖复合物的三维结构的计算机辅助目视检查来进行定义。ProteinHunter鉴定所计算的其原子中的任一个与任何葡萄糖原子之间的距离是否小于并且其主链C_α与葡萄糖中任何原子之间的距离是否大于它们的C_β原子和葡萄糖中的任何原子之间的距离。不形成氢键或范德华力接触的二级壳残基通过检查从所得的集合中除去。允许的残基的选择由结构中残基的身份以及可能维持该相互作用的突变体指导。所得的定义规定了残基位置及其允许的氨基酸一致性。在每个位置允许多个氨基酸一致性来编码功能等同的残基。该定义建立了搜索过滤器，用于精确预测(1)中收集的序列同系物的领域内的葡萄糖结合蛋白。

3.精确的序列比对。使用工具如ClustalW(Chenna等人2003Nucleic Acids Res[核酸研究],31,3497-500)来构建所有序列同系物的精确比对。ecGGBP种子序列包括在此比对中。该多重序列比对建立在每种序列同系物中ecGGBP PCS的等同位置。

4.功能评价。通过测量它们对PCS序列过滤器的符合性来确定比对的序列同系物中每一个的葡萄糖结合特性。为每个同系物通过ProteinHunter程序分配“汉明距离”(H)，其规定了在比对的PCS位置处所有残基的序列一致性的程度。H＝0的值表示在比对的PCS位置处的所有残基的一致性匹配在PCS搜索过滤器中允许的一个或多个氨基酸；H>0表示一个或多个对齐的位置具有不允许的残基。预测H＝0的序列编码葡萄糖结合蛋白。

5.代表性SAFE同系物的选择。通过(a)与种子PCS的一致性(如通过汉明距离所测量的)、(b)与种子序列的分数总体序列一致性，对序列同系物进行排序。选择H＝0的序列的子集(对分数总体序列一致性进行取样)以用于实验验证。

ProteinHunter软件工具编码执行流，应用PCS搜索过滤器，并将包括生物体注释(如嗜热性)和革兰氏染色状态的结果可视化。

这些步骤在ProteinHunter软件工具中编码，该工具编码执行流，应用PCS搜索过滤器，并将结果可视化和处理生物体注释(如嗜热性)和革兰氏染色状态。

从国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information)下载了5062种原核生物的注释基因组和质粒序列(下载日期：2015年5月17日；ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/all.gbk.tar.gz)。从蛋白质结构文件2gbp中提取大肠杆菌葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ecGGBP)的蛋白质序列(Vyas等人1988Science[科学],242,1290-5)，并且将其用作上文所述的BLAST搜索的种子序列。总共鉴定出1822种序列同系物。

在ecGGBP中，葡萄糖结合由包括10个残基的PCS编码。两个芳香族残基(F16、W182)通过与吡喃糖环的任一表面的广泛的范德华力相互作用将结合的葡萄糖夹在中间。其他八个残基与所有葡萄糖羟基形成氢键。指定这10个位置处的多个氨基酸的PCS过滤器用于预测葡萄糖结合蛋白(图2A-C)。基于其汉明距离评分(H＝0)，预测总共139种同系物编码葡萄糖结合蛋白。这些同系物相对于ecGGBP种子的总体序列一致性从100％至29％变化(表1)。

实例3.使用配体介导的热稳定性移位进行前导蛋白质验证(第2阶段步骤)

预测为葡萄糖结合蛋白的13种同系物(图3)被选择来探测与ecGGBP种子不同程度的序列一致性，并且实验性地确定它们的葡萄糖结合特性(表2)。这些实验包括四个连续的步骤：

1.合成基因构建。同源前导物的氨基酸序列被回译成DNA序列。使用OrfOpt(美国专利公开号2011/0171737)(通过引用特此并入)或OrfMorph(本文所述)程序，这些被优化用于指导蛋白质同系物在大肠杆菌中的异源胞质表达。这些程序预测指导在大肠杆菌中高水平蛋白质表达的mRNA序列。所预测的基因序列从合成寡核苷酸从头组装。

2.同系物在大肠杆菌中的异源蛋白质表达。将携带合成表达构建体(参见上文)的质粒转化到KRX(大肠杆菌K12衍生株)感受态细胞(普洛麦格公司(Promega)，技术公告(Technical Bulletin)TB352)中。如材料和方法中所述，在这些培养物的细菌培养物中诱导蛋白质产生。

3.如材料和方法中所述，使用固定化金属亲和层析法纯化成功表达的蛋白质。

4.葡萄糖结合的验证。如材料和方法中所述，使用热稳定性移位测定确定纯化的蛋白质的葡萄糖结合特性。

13个合成表达构建体中有7个成功地指导了大肠杆菌中GGBP同系物的异源胞质表达。这些中的五个的葡萄糖结合特性直接使用热移位测定来确认(图4A-B)。两种同系物的热稳定性对于该测定过高(^apoT_m>90℃)而不适用。通过测量Acrylodan标记的单个半胱氨酸突变体(参见第5部分)对葡萄糖的温度依赖性荧光响应(图5A-B)来确认它们的葡萄糖结合特性。

令人惊讶的是，所有这些实验验证的葡萄糖结合同系物相对于ecGGBP种子的序列一致性都大大低于60％阈值，范围从29％至48％。几种在位置152处在PCS中使用替代性氨基酸，从而证明了允许功能等同残基的预测能力。因此，这些结果表明，即使在与原始种子具有低分数一致性的序列同系物中，也可以用SAFE技术精确预测生物功能。

三种实验验证的GGBP同系物表现出在347-350K范围内的中点热变性温度(T_m值)，该范围比ecGGBP种子(T_m＝322K)更稳定至少25K。其中，来自热解糖热厌氧杆菌(ttGGBP)的同系物通过在大肠杆菌中异源表达而以最高水平产生。选择这种蛋白质作为构建稳健的葡萄糖传感器的候选物。

实例4.半胱氨酸突变体扫描和荧光团筛选以鉴定荧光响应性葡萄糖传感器(第3阶段步骤)

半合成FRS通过位点特异性附接的硫醇反应性、环境敏感的荧光团来工程化，这些荧光团响应配体介导的构象变化。鉴定对传感应用有用的FRS候选物包括三个步骤：

1.半胱氨酸扫描。构建含有单个半胱氨酸的突变葡萄糖结合蛋白用于硫醇反应性荧光团的位点特异性附接。确定了附接的单个荧光团可能表现出配体依赖性响应的PBP中的位置(de Lorimier等人2002Protein Sci[蛋白质科学]11,2655-75)。候选位置分为三类：内部空间的，替换直接接触配体的残基；外部空间的，位于结合位点的边缘；变构的(Marvin等人1997Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊]94,4366-71；Marvin1998J Am Chem Soc[美国化学学会杂志]，120,7-11)，位于结合位点之外的经历与铰链弯曲运动相呼应的局部结构变化的位点处。

2.荧光团筛选。硫醇反应性、环境敏感的荧光团与步骤1中制备的每个半胱氨酸突变体附接。

3.评价步骤2中制备的所有荧光轭合物的葡萄糖介导的改变。对荧光发射强度和光谱形状两者都有变化的配体结合响应对于化学计量学应用至关重要，因为此类改变使得能够实现比率测量。光谱形状的变化通常伴随着发射强度最大值波长的移位。可能有三类荧光响应：

i.没有响应。

ii.单色响应(发射强度增大或减小，光谱形状没有变化)

iii.二色响应(强度和光谱形状两者都变化)，可以被分为两个子类：

i.向蓝移(Hypsochromatic)：结合葡萄糖时发射强度移位至较短的波长(“蓝移”)。

ii.向红移(Bathochromatic)：结合葡萄糖时发射强度移位至较长的波长(“红移”)。

我们在ttGGBP中构建了17个单个半胱氨酸突变体，探索了4个内部空间位置、10个外部空间位置和3个变构位置(图6A-B)。在每个位置，我们附接了Prodan衍生的荧光团，如Acrylodan和Badan，它们的硫醇反应性连接部分中的一个亚甲基基团不同。7种Acrylodan和5种Badan轭合物的荧光发射强度在7个附接位置对葡萄糖响应(表3)。只有4个附接位置是两个荧光团的响应，该响应在性质上相似，而在数量上却不。我们还通过测量配体介导的蛋白质热稳定性的移位来测试葡萄糖结合(表3)。按此标准，大多数非响应性轭合物结合葡萄糖。两种不结合葡萄糖的轭合物(N42C Badan、V67C Badan)在总体热稳定性中也表现出较大的损失(apo T_m值降低28-30K)，表明所附接的荧光团对其结构完整性有不利影响。相比之下，所有其他轭合物在脱辅基蛋白热稳定性中仅表现出小的变化(1-4K)，表明荧光团引起最小的扰动不稳定性。

内部空间附接位置响应于配体结合表现出荧光发射的最显著的变化。在10个外部空间位置中的3个处的轭合物对葡萄糖有响应。没有变构轭合物表现出对葡萄糖的荧光响应。

我们在1个外部空间(Y11C)和2个内部空间(F17C、W182C)位点(图7A-F)观察到发射强度最大值的波长处的配体依赖性移位，从而使得能够进行二色比率测量；其他葡萄糖响应性轭合物的最大强度保持不变(单色响应)。在两个方向都发生波长移位：在ttGGBPW182C·Acrylodan轭合物中，结合葡萄糖时脱辅基蛋白光谱从短波长发射状态转变至长波长发射状态(红移)，然而F17C·Acrylodan、F17C·Badan和Y11C·Badan轭合物的发射移位至较短的波长(蓝移)。分别与F17C和W182C附接的Badan和Acrylodan轭合物表现出荧光发射强度的最大的波长依赖性变化(图7A-C)。

对许多其他荧光团(图8A-P)的葡萄糖的响应也在位置182C和17C处进行测试(表4)。几种轭合物在葡萄糖添加时表现出发光强度的显著变化，但是这些中没有一种伴随着它们最大值的大波长移位。观察到荧光的增加和减少。

发现的最有效的传感器是分别与内部空间半胱氨酸突变F17C和W182C附接的Badan和Acrylodan轭合物。例如，具有SEQ ID NO:61(ttGGBP182C)、SEQ ID NO:88(ttGGBP182C.2.0)、SEQ ID NO:90(ttGGBP182C.2.3)和SEQ ID NO:102(ttGGBP182C.8)的肽对于临床诊断是特别有用的，因为它们分别跨越低血糖、正常血糖、轻度高血糖、严重高血糖和高渗性高血糖葡萄糖浓度。这两种荧光团仅在其接头几何学上不同，但是这种小的差异决定了观察到特定轭合物的二色还是单色响应。在位置17C处，只有Badan而不是Acrylodan轭合物引起二色响应；在182C处，令人惊讶地，观察到相反的情况。在给定的细菌周质结合蛋白内，一些附接位点比其他附接位点更有效，并且在给定的附接位点内，一些荧光团比其他荧光团更有效(DeLorimier等人,2002,Protein Science[蛋白质科学]11:2655-2675)。因此，响应的性质因此是特质的，并且因此选择哪个位点进行突变(例如，用单个半胱氨酸取代)以及在特定位点使用哪个荧光团是非显而易见的。接头几何学和发色团修饰的变化引起特定荧光团与蛋白质(甚至在密切相关分子的家族内)的详细相互作用的显著差异，从而显著影响了传感器特性，与先前的观察一致。

实例5：示例性荧光轭合物结构的确定。

具有显著二色响应的荧光轭合物ttGGBP17C Badan和ttGGBP182C.2.0 Acrylodan(SEQ ID NO:88)(这是葡萄糖结合亲和力已被操纵的变体)的结构通过X射线晶体学确定(表5；图9)。还确定了大肠杆菌GGBP同系物轭合物ecGGBP W183C Acrylodan(ecGGBPW183C，SEQ ID NO:32)的结构。

像周质结合蛋白(PBP)超家族的所有成员一样，GGBP包括通过柔性铰链连接的两个结构域，其中配体结合位点位于两个结构域之间的裂隙中。在不存在配体的情况下，PBP采用开放构象，其中两个结构域分开移动并且裂隙很宽。在配体复合物中，铰链弯曲运动将两个结构域移动得更近，从而形成完全包封配体的结合位点，令人想起蛋白质内部。ecGGBP和ttGGBP轭合物的总体结构类似于主链C_αRMSD(对于N-末端和C-末端结构域分别为和(C-末端结构域含有Ca²⁺结合位点))，如对于48％一致的蛋白质所预期的那样(Chothia 1986EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志],5,823-826)。封闭程度的小变化可能影响关键的结构域间氢键相互作用。除突变的芳香族基团外，在蛋白质与结合的葡萄糖之间的相互作用是保守的。这些轭合物的结构使得我们能够确定在蛋白质与荧光团之间的相互作用以及荧光团的内部构象。这些观察的集合指导操纵葡萄糖亲和力的突变的选择。

在F17C Badan和W182C Acrylodan两者中，轭合的荧光团指出进入溶液中。沿着ttGGBP长轴向下从C-末端向N-末端结构域到配体结合位点中的观察揭示，三个通道(每个通道相隔大约120°)将位于中心的结合的单糖与蛋白质表面连接(图9c)。一个通道被天然半乳糖苷配体的R基团占据(该位置被葡萄糖和半乳糖复合物中的水占据)，另外两个通道由它们各自的轭合物中的Badan和Acrylodan填充。

在野生型蛋白质中，F17和W182的环与结合的葡萄糖形成广泛的范德华力接触。W182C Acrylodan轭合物中荧光团的向外取向留下了由吲哚环空出的空腔，该空腔被水和冷冻保护剂填充。在F17C Badan中由于失去较小的苄基环而形成的空腔大部分被接头填充；没有观察到水或冷冻保护剂。

Acrylodan和Badan荧光团含有两个重要的内部自由度(图6a-c)：二甲氨基基团和羰基的扭曲。这两个角度的状态通过改变系统内电子共轭的程度以及激发偶极的极化程度来影响荧光团的荧光特性。Badan在ttGGBP F17C轭合物中的电子密度定义明确，使得我们能够以高可信度确定内部荧光团构象(图9d-f)。二甲氨基基团与萘环是共平面的。羰基基团被拧出平面大约30°。相比之下，在ecGGBP.183C Acrylodan中，羰基是共平面的(图9g)。该基团也可能在ttGGBP.182C Acrylodan结构中是共平面的，但是轭合物在该结构中的部分占据排除了确定的结论。然而，ecGGBP 183C和ttGGBP 182C Acrylodan轭合物的结构和光谱特性的高度相似性表明Acrylodan羰基在两种同系物轭合物中是共平面的。

在ttGGBP 17C Badan和182C Acrylodan(和ecGGBP 183C Acrylodan)轭合物中，荧光团羰基所处的口袋包括由每个结构域贡献的残基，并且仅在封闭的葡萄糖结合蛋白构象中完全形成。在荧光团羰基与蛋白质之间在任一个附接位置处都没有观察到氢键。在ttGGBP 17C Badan中，扭曲的羰基构象的“突出物”结合在由两个结构域贡献的残基形成的小“孔”中(图9h)。羰基通过邻近附接位点与残基的范德华力相互作用固定就位，这些残基位于与F17C位点相反的结构域中：N258的C_β碳接触羰基；残基239-241的主链原子与两个萘环面中的一个相互作用。因此，扭曲的ttGGBP F17C Badan构象通过蛋白质与萘环和羰基两者的相互作用而稳定。这些相互作用仅在闭合状态下完全形成。相比之下，在ecGGBP 183CAcrylodan中，羰基孔没有明确定义。羰基侧翼为E149(与附接位点相同的结构域)和K92(相反结构域)，但是这些残基在结构中不形成直接接触。该平面轭合物的羰基和萘环都不受蛋白质闭合构象中明确相互作用的限制。

实例6.亲和力调整(第4阶段步骤)

血糖浓度范围是从约3mM(低血糖)至约30mM(高血糖)，对于高渗性高血糖状态(HHS)高达约100mM，健康水平在约6mM(正常血糖)。使用无试剂传感器的测量在与解离常数匹配的分析物浓度下最为敏感。ttGGBP182C Acrylodan的葡萄糖亲和力太高，并且因此必须通过提高K_d值来“调整”。

改变葡萄糖亲和力的突变落入四个类别：

1.改变在PCS中蛋白质与结合的葡萄糖之间的直接相互作用。

2.操纵在开放状态与闭合状态之间的平衡。

3.改变在蛋白质与荧光轭合物之间的相互作用。可以区分两个子类：

a.与羰基基团的相互作用

b.与萘环的相互作用

4.改变结合位点的几何学的间接相互作用。

在ttGGBP182C和ttGGBP17C背景中使用Acrylodan和Badan轭合物构建了突变体类别1-3的代表以便评价它们对葡萄糖结合的影响(表6)。

PCS残基中的突变(类别1)不会提供许多精细操纵亲和力的机会。ecGGBP的诱变已经表明，大多数PCS位置不能容忍突变，除了与6-羟基相互作用的组氨酸以及结合差向异构4-羟基的天冬氨酸以外。在ttGGBP182C Acrylodan中，H151Q突变精细地降低亲和力至病理生理浓度范围的中间，然而在ttGGBP17C Badan中，H151Q降低亲和力，但几乎消除了比率。在ttGGBP182C Acrylodan中，D15N将葡萄糖结合削弱至HHS范围中并增加在葡萄糖与半乳糖之间的区分。在ttGGBP17C Badan中，D15A削弱配体结合并增强二色响应。

独特地在ttGGBP182C Acrylodan中，也可以通过突变与W182缺失的吲哚环空出的空腔相邻的位置154来操纵PCS(图10a)。Ala154中的三个突变将亲和力改变50倍，跨越整个病理生理学葡萄糖浓度范围。A154M突变使亲和力增加约10倍，推测是通过(部分地)恢复在蛋白质与结合的葡萄糖之间的直接范德华力相互作用，其在除去色氨酸时丧失。154S突变导致热稳定性降低19K；其他突变对热稳定性表现出可忽略不计的影响。

构象平衡可以通过操纵在N-末端与C-末端结构域之间的那些氢键来改变，这些氢键预测在闭合状态而不是开放状态中形成(类别2突变)。在ttGGBP的蛋白质闭合构象(图10b)中，四个位置形成结构域间氢键：T16-D211、R69-G150(主链)、R91-Q148、和E92(主链)-Q152。这些相互作用中的第一个位于Badan和Acrylodan通道之间，然而其他三个位于Acrylodan和半乳糖苷R基团通道之间(图9c)。结构域间相互作用的破坏改变了在开放构象与闭合构象之间的内在平衡，从而降低了配体亲和力。因此，在ttGGBP W182C Acrylodan轭合物突变体中，在类别2突变中葡萄糖亲和力降低了(K_d值升高了)。这些突变也改变了荧光发射光谱。在ttGGBPF17C Acrylodan和Badan轭合物两者的所有类别2突变体中，光谱响应发生改变，从而增强了或消除了波长移位。这些观察表明，结构域间氢键的突变导致闭合状态结构(小的)变化，这些变化影响荧光团环境。

在蛋白质与轭合的荧光团之间的相互作用中的突变(类别3突变体)，改变了羰基孔(类别3a)或荧光团通道壁(类别3b)，对葡萄糖结合和荧光光谱有很大影响。在ttGGBP17CBadan中，羰基孔中的大部分N258突变体不响应葡萄糖。在存在葡萄糖的情况下热稳定性没有变化表明这些突变体不再结合配体。17C Acrylodan N258S突变体轭合物是例外：它结合并响应葡萄糖，但结合不引起荧光响应。位于通道壁的任一侧的残基的突变强烈影响荧光轭合物的光谱特性。在ttGGBP17C Badan中，除了A260W以外，A260的突变将二色响应转变为单色响应。在ttGGBP182C Acrylodan中，R91和Q148相互作用中突变的行为是复杂的，因为这些潜在地影响结构域间氢键和在蛋白质与轭合的荧光团之间的相互作用。荧光团阻断ttGGBP182C.2.0 Acrylodan双突变体结构中R91K-Q148E的形成，但在ecGGBP183CAcrylodan中E149-K92存在，反映了荧光团构象和结构域间封闭角度的微妙差异。两种单个Q148E和R91K突变体都表现出ttGGBP182C Acrylodan中葡萄糖亲和力的适度增加，表明这种结构域间得以维持并略微改善。相比之下，Q148E+R91K双突变体表现出2.6倍的亲和力降低，这与在ttGGBP182C2.0 Acrylodan双突变体结构(SEQ ID NO:88)中观察到的相互作用丧失一致。ttGGBP182C.2.0 Acrylodan双突变体(SEQ ID NO:88)的葡萄糖亲和力落入正常血糖浓度范围内(图13),这就是为什么选择该变体用于结构分析(图11)。

在ttGGBP17C Badan或ttGGBP182C Acrylodan背景中引入的亲和力调整突变产生了覆盖临床化学中遇到的大范围的葡萄糖浓度的二色传感器集合。

实例7.用于检测大范围的葡萄糖浓度的传感器阵列

个别传感器的精确度(误差的倒数)在K_d值处最大，并且在较低或较高的葡萄糖浓度下降低(Marvin等人1997Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊]94,4366-71)。因此，能够跨越从极端低血糖到HHS的整个100倍临床浓度范围的高精度传感器的构建需要将多个传感器组合在一起以维持高精度水平。在ttGGBP182C Acrylodan背景中，一系列5种亲和力突变体可以组合起来一起提供从1-100mM的高精度覆盖(图12)。在ttGGBP17CBadan背景中，一系列4种突变体提供了类似的覆盖。应该注意的是，ttGGBP17C Badan变体在结合葡萄糖时从暗绿色变为亮蓝色，然而ttGGBP182C Acrylodan变体从亮蓝色变为暗绿色。响应于葡萄糖结合的颜色和亮度的这些相反变化提供了对阵列中观察的完整性的另外的内部检查，该阵列结合了来自两种背景的传感器。

实例8.设备集成(第5阶段步骤)。

将蛋白质固定在固体表面(例如聚合物平面结构或珠粒结构、纸、玻璃、二氧化硅或金属)上，是将生物传感器并入装置的重要步骤。固定使得能够(i)空间定位，(ii)控制传感器向读数器的呈现(例如通过编码用于光学读出的几何学)，(iii)在样品分离程序中的选择性保留。有利的是控制蛋白质附接至固体表面的几何学，以便使荧光传感机制的扰动最小化。此类构建体将可以介导位点特异性附接的N-末端或C-末端蛋白质结构域融合到适当的化学活化表面。例如，用于金属介导的固定的六聚组氨酸肽、用于附接胺反应性基团的六聚赖氨酸肽、或锌指结构域(ZF-QNK)(Smith等人2005Protein Sci[蛋白质科学]14,64-73)、或在FRS的N-末端或C-末端的含二硫化物的截短的锌指(βZif)(Smith等人2005Protein Sci[蛋白质科学]14,64-73)融合到硫醇反应性基团(图13)。这里，我们显示了稳健的葡萄糖传感器与适当衍生的琼脂糖珠粒的位点特异性附接保存了其发射荧光光谱响应、结合亲和力和热稳定性。

ttGGBP182C.2.0 Acrylodan蛋白通过其C-末端六聚组氨酸标签被位点特异性固定在可商购的用Ni-NTA包被的磁珠上。磁珠的使用提供了一种直接的方式用于将珠粒固定在磁场内取样盒中各自的传感器贴片内。位点特异性固定使传感机制的扰动最小化。在溶液中和在珠粒上确定的蛋白质热稳定性的比较表明，蛋白质的稳定性不受固定扰动(图14A-F)。这些葡萄糖响应性磁珠也可用于测量高度精确的葡萄糖滴定曲线(图15)。类似地，将六聚赖氨酸融合结构域固定在用N-羟基琥珀酰亚胺衍生的琼脂糖珠粒上，并且将QNK融合结构域或βZif融合结构域固定在碘乙酰衍生的珠粒上。这些融合蛋白也维持了其光谱、葡萄糖亲和力和热稳定性(图14D-F)。

使用水性碳酸氢铵缓冲液，通过在50℃孵育20分钟使葡萄糖响应性磁珠干燥。在重新水化时传感器的稳定性特性完全恢复(图14c)。通过在黑暗中在25℃、37℃和50℃孵育长达7天，将干燥的珠粒在完全组装好的样品处理盒内部原位老化。在存储1、2和7天的盒中测试荧光和葡萄糖响应性特性。在所有温度下，在不存在葡萄糖的情况下的荧光比率、和葡萄糖亲和力在观察误差内保持不变。因此，基于ttGGBP的FRS的显著优势在于它们足够稳健以致于能够在环境温度下在干燥状态进行处理，从而大大简化了制造、分配和长期储存条件。

实例9.荧光机制。

所鉴定的最有效的葡萄糖传感FRS是基于单独标记的Acrylodan和Badan轭合物。这两种染料及其亲本Prodan(Weber 1979Biochemistry[生物化学],18,3075-3078)属于一类可以经历内部旋转的荧光团，这些内部旋转改变激发态偶极的电子结构(Rettig1986Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版],25,971-988；Grabowski等人2003Chem Rev[化学评论],103,3899-4032)。Prodan的X射线结构显示，在不存在外部因素的情况下，二甲氨基(DMA)和羰基基团与萘核心是共平面的，并且该系统最大化轭合。然而，DMA或羰基基团可以拧出平面，从而减小了系统内轭合的程度，并增加了这些基团的极化程度。这种增强的极化增加激发态偶极的大小，并相应地增加其对周围极性的敏感性，这将其本身表现为一般的溶剂致变色效应和对特定的氢键相互作用的响应。已经有相当多的争论是关于Prodan中处于极化状态的偶极的大小(Weber 1979Biochemistry[生物化学],18,3075-3078；Balter 1988Chem.Phys.Lett.[化学物理学通讯],143,565-570；Catalan1991Journal of Fluorescence[荧光杂志],1,215-223；Nemkovich 2007Journal ofPhotochemistry and Photobiology A:Chemistry[光化学和光生物学杂志A辑：化学],185,26-31；Samanta 2000Journal of Physical Chemistry[物理化学杂志],104,8972-8975；Kawski 2001Zeitschrift fur Naturforschung[自然研究杂志],56a,407-411；Kawski 2002Zeitschrift fur Naturforschung[自然研究杂志],57a,716-722)，分子是否经历了激发态的扭曲，并且如果是这样，羰基或DMA基团是否扭曲(Nowak 1986Journal ofMolecular Structure[分子结构杂志],139,13-23；Heisel 1987Chemical PhysicsLetters[化学物理学通讯],138,321-326；Parusel 1997J.Molec.Struct.[分子结构杂志],398,341-346；Parusel 1998b Journal of Physical Chemistry[物理化学杂志],102,7149-7156；Parusel 1998a J.Chem.Soc.,Faraday Trans.[化学学会杂志，法拉第学会汇刊],94,2923-2927；Mennucci 2008Journal of Physical Chemistry[物理化学杂志],112,414-423；Adhikary 2009Journal of Physical Chemistry[物理化学杂志],113,11999-12004；Marini 2010Journal of Physical Chemistry[物理化学杂志],114,17128-17135；Pederzoli 2014Chemical Physics Letters[化学物理学通讯],597,57-62；Cwiklik 2011J.Phys.Chem.[物理化学杂志],115,11428-11437；Fukuda2012Chem.Phys.Lett.[化学物理学通讯],552,53-57；Barucha-Kraszewska 2010BiochimBiophys Acta[生物化学与生物物理学学报],1798,1724-1734；Nitschke2012J.Phys.Chem.[物理化学杂志],116,2713-2721)。其中DMA(Lobo 2003Journal ofPhysical Chemistry[物理化学杂志],107,10938-10943；Davis 2005J.Phys.Chem.[物理化学杂志],109,1295-1298)或羰基(Everett 2010Journal of Physical Chemistry[物理化学杂志],114,4946-4950)基团被保持在平面内构象或平面外构象的一系列衍生物已经表明，羰基而不是DMA基团的扭曲改变Prodan极化。

本文构建和描述的突变体ecGGBP和ttGGBP的Acrylodan和Badan轭合物的集合含有几种半合成的葡萄糖传感器，这些葡萄糖传感器响应于葡萄糖结合而表现出荧光发射强度的波长依赖性变化。对于与ttGGBP F17C(SEQ ID NO:51)和ttGGBP W182C(SEQ ID NO:61)半胱氨酸内部空间突变体附接的轭合物观察到最佳响应，这些半胱氨酸内部空间突变体替换与吡喃糖葡萄糖环形成范德华力接触的残基。引人注目的是，在这两个位置发射强度最大值在相反的方向上变化：葡萄糖结合引起ttGGBP W182C和ecGGBP W183C Acrylodan轭合物的红移，然而在ttGGBP F17C和ecGGBP F16C，Acrylodan和Badan都表现出蓝移响应。分析其激发态和基态电子跃迁群体中配体介导的变化以及三种不同轭合物的X射线结构使得我们能够描述对葡萄糖结合的荧光响应的机制。

发射强度(图16-18，表7和8)和吸收光谱(图19)的分析表明，葡萄糖结合改变了激发态(S₁和S₂)和基态(G₁和G₂)两者中两要主导电子跃迁的群体。在蓝移响应中，主要激发态电子跃迁从脱辅基蛋白中的S₁(绿色)转移到葡萄糖复合物中的S₂(蓝色)；在红移响应中，观察到相反的再分布，并且葡萄糖复合物由S₁(绿色)激发态占主导。类似地，在基态中，蓝移响应将吸收光谱中的电子跃迁从低能态(G₁)转移到高能态(G₂)；对于红移响应，转移是G₂→G₁。ttGGBP F17C Badan(蓝移响应)和ttGGBP W182C Acrylodan或ecGGBP W183CAcrylodan(红移响应)的高分辨率X射线结构的比较揭示了葡萄糖复合物的荧光团结构在这些轭合物中不同(图9和10)。根据这些观察，我们推断ecGGBP W183C Acrylodan中的G₁基态与平面荧光团对应，然而F17C Badan的G₂态与其中羰基重新定位在萘环的平面外的扭曲荧光团羰基对应。

这些观察表明，葡萄糖响应性Acrylodan和Badan轭合物的荧光强度的变化由于在蛋白质构象群体中的配体介导的移位与荧光团羰基相对于其萘环的内部扭曲之间的构象偶联的结果而出现。像所有周质结合蛋白一样，GGBP经历了从开放状态至闭合状态的大的配体介导的构象变化，在该闭合状态中配体被包封在通过柔性铰链连接的两个结构域之间。ttGGBP F17C Badan、ttGGBP W182C Acrylodan和ecGGBP W183C Acrylodan轭合物的葡萄糖复合物的蛋白质构象与未经修饰的野生型蛋白质一样闭合。荧光团不占据它们所替换的野生型芳香族环的位置，而是指向外部进入溶剂中，这样使得它们的二甲氨基基团不与蛋白质接触并且与萘环共平面(例如，在ttGGBP17C Badan的情况下，这个基团的结构是清楚的)。相比之下，羰基位于接头的末端，通过该接头荧光团与蛋白质半胱氨酸偶联。因此，在它与萘环之间的扭转受到与附接位点邻近的残基的相互作用和与环的远端相互作用的组合的影响。如果满足两个条件，配体介导的信号传导就发生：(i)蛋白质与萘和羰基两者都相互作用，从而使它们的相对扭曲稳定；和(ii)这些相互作用在开放状态和闭合状态不同。

所有轭合物的光谱分析(表7和8)显示，如果在开放的无配体的蛋白质构象中荧光团是平面的并且在葡萄糖复合物的闭合构象中扭曲，则这些信号传导条件最普遍得到满足。在F17C Badan结构的情况下，闭合的蛋白质构象通过与羰基和萘环两者的相互作用来稳定扭曲形式。这些相互作用由位于荧光团附接点对面的结构域中的远端残基贡献，并且因此可能存在于闭合而不是开放的蛋白质构象中。较不常见的是，荧光团通过近端相互作用在开放蛋白质构象中扭曲，并且在闭合构象中变为非扭曲。ttGGBP W182C Acrylodan和ecGGBP W183C Acrylodan轭合物代表了这种情况。尚未鉴定使开放蛋白质构象中的扭曲状态稳定的相互作用，但是闭合构象的结构揭示不存在将萘环和羰基相对于彼此扭曲的相互作用，并且荧光团采取低能平面状态。

影响配体结合的突变(表6)也可能影响光谱学特性(表8)。在类别1PCS突变体中，通过减少在葡萄糖复合物中形成的S₂的分数，H151Q比率被消除。在D15A中，两种激发群体的再分布增强了两种轭合物中的比率响应。在类别2突变体中，操纵在开放构象与闭合构象之间的内在平衡。在F17C Acrylodan和Badan轭合物两者的所有类别2突变体中，脱辅基蛋白中的S₁状态的分数(^apof(S₁))改变了。这些效应可以增强或消除波长移位(表7和8)。例如，移位在突变体Badan轭合物中加强，但在Acrylodan轭合物中被消除，如C₂组分的大小所证明的。羰基孔(类别3a)和荧光通道壁(类别3b)中的突变对葡萄糖结合和荧光光谱有很大影响。羰基孔中的许多N258突变体不响应葡萄糖。在存在葡萄糖的情况下热稳定性没有变化表明这些突变体不再结合配体。17C Acrylodan N258S突变体轭合物是例外：它结合并响应葡萄糖，但结合不会改变激发态群体的分布。位于通道壁任一侧的残基中的突变强烈影响在无配体的蛋白质中激发态的分布以及它们的配体介导的再分布。A260中的突变全部都将17C Badan轭合物从脱辅基蛋白中的S₁和S₂状态的混合物转变为主要S₁状态，其对葡萄糖响应表现出小的再分布。因此，大多数突变体轭合物表现出对葡萄糖的等色而不是蓝移响应，除了保留(减弱的)蓝移的17C Badan A260W以外。相比之下，17C Acrylodan A260突变体保留了脱辅基蛋白中混合的S₁和S₂群体，但是全部都对葡萄糖结合响应。

尽管蛋白质的开放和闭合形式与荧光团内部扭转平衡之间的构象偶联是确定Acrylodan和Badan轭合物的荧光的配体响应性变化的主要因素，但是对激发态偶极强度的环境影响也有贡献，如通过在模型与观察结果之间的残差中存在精细结构所证明的(图17和18)。轭合物或它们的突变体在精细结构存在于发射光谱中和对葡萄糖响应的程度方面不同。这种精细结构是由于S₁和S₂激发态的能量变化与它们在开放和闭合构象中的局部环境的差异相关联。这里呈现的分析将这些差异视为总体平均近似值。

所描述的机制符合Prodan衍生物的实验特性的观察，其中DMA或羰基基团的扭曲状态由构象约束基团的合成控制(Lobo 2003Journal of Physical Chemistry[物理化学杂志],107,10938-10943；Davis 2005J.Phys.Chem.[物理化学杂志],109,1295-1298；Green 2012J.Org.Chem.[有机化学杂志],78,1784-1789；Everett 2010Journal ofPhysical Chemistry[物理化学杂志],114,4946-4950；Naughton 2013J.Phys.Chem.[物理化学杂志],117,3323-3327；Nikitina 2013J.Phys.Chem.[物理化学杂志],117,9189-9195；Daneri 2015Journal of Photochemistry and Photobiology A:Chemistry[光化学和光生物学杂志A辑：化学]310,106-112)。

半合成的荧光响应性蛋白可用于开发具有各种应用的无试剂生物传感器。然而，在没有指导荧光团的选择和放置的设计原则的情况下，系统鉴定合适的荧光轭合物仍然是其构建中的重大挑战。本文描述的机械学见解揭示了荧光信号转导机制的三个关键方面，这些关键方面使得荧光响应的合理工程化成为可能、通知并指导荧光响应的合理工程化：

1.信号传导由羰基基团的扭曲控制，并且经由配体介导的蛋白质构象变化改变其与蛋白质矩阵之间的特异性相互作用。

2.接头长度和伴随的扭转自由度决定了在给定的附接位置处在蛋白质与羰基之间的配体介导的构象偶联的有效性。

3.确定波长吸收和发射特征的平面环系统不受蛋白质矩阵约束，而是指向外部进入溶剂中。

前两个观察使得能够并指导基于结构的方法用于鉴定附接位置和优化用于共价修饰的官能化接头。在此类方法中，接头的内部柔性被建模，并且所得的荧光团构象文库被放置在蛋白质宿主的三维模型中，检查与其环境的空间相容性，并且鉴定出附接位点和(去)稳定仅仅在脱辅基蛋白或配体复合物中的特定构象或与蛋白质的氢键的可能的另外的突变。第三个观察表明引入改变基本Prodan框架的荧光特征的替代性发色团结构同时维持配体响应性信号传导的可行性，条件是羰基和接头的结构特征得以维持。特别感兴趣的是具有在血液的透明窗中的波长(>600nm)的发色团变体的设计和构建。这些原理不仅适用于周质结合蛋白和Prodan衍生物，而且也适用于建立经历在蛋白质构象方面的配体介导的变化的蛋白质中任何适当放置的内部扭曲的荧光团的构象偶联。

与表1中列出的登录号相关的每个核苷酸和氨基酸序列通过引用以其整体特此并入。

表2.大肠杆菌GGBP SAFE序列同系物的葡萄糖结合特性。

^aY，有；N，没有。

^b使用荧光Acrylodan轭合物确定的(参见正文)。

表3.Acrylodan和Badan轭合物在ttGGBP支架的半胱氨酸扫描中的葡萄糖响应。

^aa，变构的；e，内部空间的；p，外部空间的。

^bm，单色的；d，二色的(即光谱形状变化)。

^cA，Acrylodan；B，Badan。

^d噪声数据和或差的拟合。

^enb；不结合，nd；未确定。

表4.与ttGGBP的F17C和W182C突变体轭合的荧光团的响应。^a

^aλ_ex，优选的激发波长(来自供应商)；^apoλ_max，观察到的脱辅基蛋白的最大发射波长；^apoI_max，在^apoλ_max处观察到的强度；^apoλ_max，观察到的葡萄糖复合物的最大发射波长；^satI_max，在^satλ_max处观察到的强度；^真实K_d，从等式1与单色发射强度的拟合确定的亲和力。使用约10μM蛋白质在Nanodrop3300上测量发射光谱。观察到的绝对发射强度是轭合物亮度的粗略指南，因为每个实验的蛋白质浓度大约相同。

^b缩写、化学名称和供应商目录编号如下：Acrylodan(A433)；Badan(B6057)；5-IAF(I30451)；俄勒冈绿488(O6034)；CPM(D346)；IANBD(D2004)；IAEDANS(I14)；太平洋蓝(P30506)；BODIPY 499(D20350)；BODIPY 507(D6004)；BODIPY 577(D20351)；Alexa 532(A10255)；Alexa 555(A20346)；德克萨斯红(T6008)；来自生命技术公司(LifeTechnologies)的PyMPO(M6026)和来自Lumiprobe公司的Cy5(13080)。

^c使用最密切匹配λ_ex的Nanodrop3300固定波长LED(参见材料与方法)。

表5.晶体学数据收集和细化统计。^a

^a最高分辨率壳(shell)的值在括号中给出。

^b两种构象。

^c五个分子。

表6.突变体ttGGBP17C和ttGGBP182C轭合物的响应。^a

^a在室温在Nanodrop上测量。λ_max是对应于最大发射强度的波长。根据材料与方法中所述的分析(等式7)确定最佳比率波长。从单色滴定曲线确定^真实K_d；从二色比率(等式5和6)确定^近似K_d。^真实K_d值的平均相对误差是5％，^近似K_d值的平均相对误差是1％。S是在葡萄糖与半乳糖之间的选择性，S＝^真实K_d(半乳糖)/^真实K_d(葡萄糖)；S>1，对葡萄糖具有选择性。

^b1，PCS；2，结构域间相互作用；3，在蛋白质与荧光团之间的接触

^cA，Acrylodan；B，Badan。

^dnb，不结合；nd，未确定。

^e噪声数据或差的拟合。

^f在ttGGBP182C中构建的另外的突变。

^g在ttGGBP182C.2.0中构建的另外的突变。

表7.ttGGBP和ecGGBP Acrylodan和Badan轭合物的光谱分析。^a

^a在Nanodrop3300上确定发射光谱。根据等式11-13进行SVD分析。

根据等式14-15进行高斯拟合。

^bA，Acrylodan；B，Badan；n，没有观察到对葡萄糖的响应；r(h)，比率的(蓝移)；

r(b)，比率的(红移)；i，强度仅增大；d，强度仅减小。

表8.ttGGBP.17C Acrylodan和Badan轭合物的光谱分析。^a

^a在Nanodrop3300上确定发射光谱。根据等式11-13进行SVD分析。

根据等式14-15进行高斯拟合。

r(b)，比率的(红移)；i，强度仅增大；d，强度仅减小。

实例10.大肠杆菌葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ecGGBP183C(与W183C突变体附接的acrylodan))的晶体结构坐标

命名是标准的三字母氨基酸代码。

原子位置使用标准的蛋白质数据库(PDB)格式以笛卡儿坐标(Cartesiancoordinate)提供。ATOM记录是指氨基酸原子；HETATM记录是指非氨基酸原子。

第1列：记录类型(ATOM或HETATM)；第2列：原子编号；第3列：原子名称(氨基酸的标准命名方案)；第4列：残基名称(ATOM记录)或组分名称(HETATM记录)；第5列：链标识符(A，B，C，...)；第6列：氨基酸残基序列编号(ATOM记录)或组分编号(HETATM记录)；第7-9列：x，y，z原子笛卡尔位置坐标；第10列：分数占用(在此列表中设置为1.0)；第11列：B因子(在此列表中被忽略)；第12列：文件标识符(在此列表中被忽略)；第13列：行号(与此列表中的原子编号相同)。

对于杂原子(HETATM)记录，组分名称(第4列)如下所示：

CA，钙

HOH，水

ACR，Acrylodan

K，钾

EDO，乙二醇

实例11.热解糖热厌氧杆菌葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ttGGBP.17C.Badan(与F17C突变体附接的badan))的晶体结构坐标

命名是标准的三字母氨基酸代码。

原子位置使用标准的蛋白质数据库(PDB)格式以笛卡儿坐标提供。ATOM记录是指氨基酸原子；HETATM记录是指非氨基酸原子。

对于杂原子(HETATM)记录，组分名称(第4列)如下所示：

CA，钙

HOH，水

BAD，Badan

K，钾

EDO，乙二醇

实例12.热解糖热厌氧杆菌葡萄糖-半乳糖结合蛋白(tthGBP182C.Acrylodan(与W182C突变体+R91K,Q18E双突变体附接的Acrylodan))的晶体结构坐标

命名是标准的三字母氨基酸代码。

对于杂原子(HETATM)记录：

CA，钙

HOH，水

ACR，Acrylodan

K，钾

EDO，乙二醇

实例13.稳健的热稳定性无试剂荧光响应性葡萄糖生物传感器

我们报告了稳健的热稳定性无试剂荧光响应性葡萄糖生物传感器及其衍生自热解糖热厌氧杆菌(ttGGBP)的变体的构建。这些蛋白质可用于跨越整个临床和工业葡萄糖浓度范围的高精度化学计量学测量，使用直接的廉价的仪器测量的荧光比率。

使用生物信息学搜索策略鉴定大肠杆菌葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ecGGBP)的热稳定性同系物，该生物信息学搜索策略应用基于结构的序列过滤器以鉴定在更大的比对序列同系物集合内保留原始功能的序列子集。感兴趣的同系物以ecGGBP探针的低于60％的序列一致性出现，这是一个不寻常且令人惊讶的发现。在这个水平上，总体一致性是生物功能的弱预测因子，因此基于结构的过滤器的应用对于精确鉴定是必不可少的。通过构建针对大肠杆菌中异源蛋白质表达而优化的合成基因并确定表达的蛋白质的葡萄糖结合特性来实验性地测试预测命中的葡萄糖结合特性。该搜索导致将来自热解糖热厌氧杆菌的同系物(ttGGBP)鉴定为葡萄糖传感器工程的合适候选物。

发现内部空间放置的Acrylodan和Badan荧光共轭物是高度有效的比率葡萄糖传感器。引入一系列另外的突变来操纵葡萄糖亲和力。鉴定了跨越四个数量级(0.1-100mM)的变体。其中，突变体的子集覆盖整个病理生理葡萄糖浓度范围，并且响应保持在最大可达到的精确度的90％以内。

基于ttGGBP的FRS可以在磁珠或其他固体或半固体基质上进行位点特异性固定，而不影响蛋白质稳定性、荧光响应或葡萄糖亲和力。可以将它们干燥并积极老化(在50℃下孵育7天或更长时间，例如模拟和/或超过现场、储存或运输中的环境条件)，而不会不利地影响传感性能。

无试剂的荧光响应性传感器与基于酶的生物传感器相比呈现许多优点，包括自我校准、消除化学转化和多种基质，其共同导致简单的样品处理射流线路和快速响应时间。FRS可以被用于一次性、偶发性和连续性监测测量。此外，使用基于嗜热蛋白质的稳健的工程化葡萄糖传感器可能会简化制造和分配过程。将这里报告的突变体葡萄糖传感器组合成多路复用阵列或复合物在一次测量中以高精度确定了从低血糖到高渗性高血糖状态样品的葡萄糖浓度。此类系统对于在连续监测、定点照护或可穿戴系统中开发下一代高精确度、大的动态范围传感应用具有重大潜力。

将以下材料和方法用于生成本文所描述的数据。

生物信息学搜索。从国家生物技术信息中心下载了4592种原核生物的注释基因组和质粒序列(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/all.gbk.tar.gz)，以及记录原核生物生活方式的注释(../ProkaryotesOrganismInfo.txt)。我们开发了“ProteinHunter”程序来为组织、查询和分析这些基因组序列以及蛋白质结构提供界面和方法。ProteinHunter包括图形用户界面、一组计算机脚本和并行计算环境。这些一起建立计算，在每个计算阶段管理信息流和执行，控制执行特定计算的其他程序(如BLAST和ClustalW)，并将结果可视化。从蛋白质结构文件2gbp中提取大肠杆菌葡萄糖-半乳糖结合蛋白(ecGGBP)的蛋白质序列(Vyas等人1988Science[科学],242,1290-5)，并且将其用作用于单向BLAST搜索下载的原核生物的种子序列。如果成对的BLAST比对含有25％或相同的残基，并且如果比对覆盖至少70％的探针和靶序列，则在ProteinHunter中选择这些作为命中。使用ClustalW来比对在ProteinHunter中鉴定的BLAST命中(Chenna等人2003NucleicAcids Res[核酸研究]31,3497-500)。基于结构的序列过滤器用于精确区分命中内的葡萄糖结合蛋白和其他功能。使用ProteinHunter在2gbp结构(图1A-C)中鉴定包括在蛋白质与结合的葡萄糖之间的主要互补表面(PCS)的10个残基的非连续序列。如果所计算的任何PCS残基的原子与任何葡萄糖原子之间的距离小于并且其主链C_α与葡萄糖中任何原子之间的距离大于它们的C_β原子与葡萄糖中的任何原子之间的距离，则选择这些PCS残基作为PCS的成员。不形成氢键或范德华力接触的二级壳残基通过检查从所得的集合中除去。使用总体ClustalW比对，在每个同系物内鉴定PCS残基的子集并进行比对。对于每个同系物，计数相对于ecGGBP PCS(汉明距离，H_PCS)的PCS突变的数量。H_PCS＝0的值表示PCS序列与ecGGBP的序列相同；推测具有这种H_PCS值的同系物是葡萄糖结合蛋白。将PCS序列按其H_PCS值显示和排序，并且在每个H_PCS值中按其分数一致残基排序，指示它们所在的复制子(染色体或质粒)、该复制子是否含有旁系同源物、以及温度耐受性(超嗜热菌、嗜热菌、嗜温菌、嗜冷菌、未知)、其革兰氏染色分类(如果已知)、和基因组AT含量百分比。如果生物体名称(属和种)、分数一致性和旁系同源物相同，则重复命中将从该列表中自动除去。从该列表中可以容易地通过检查来鉴定H_PCS＝0的独特的超(嗜热菌)ecGGBP同系物。

基因合成和诱变。从ClustalW比对文件中提取生物信息学搜索中鉴定的GGBP同系物的氨基酸序列(参见上文)，并且将其进一步编辑以构建具有单个半胱氨酸替换ecGGBP中的W183等同物的成熟多肽用于用Acrylodan进行位点特异性标记，使用AaEditor(一种开发来操纵蛋白质序列的内部程序)。通过检查多重序列比对并除去成熟的ecGGBP氨基酸序列的起始的N-末端的序列来缺失推定的前导肽，该前导肽介导将周质结合蛋白锚定在膜(革兰氏阳性菌)外部或将分泌物导向周质(革兰氏阴性菌)内。将ecGGBP序列中等同于W183的残基突变为半胱氨酸；所有其他半胱氨酸被改为丙氨酸。将六聚组氨酸标签放置在成熟蛋白质C-末端的GGS接头后面以使得能够进行金属介导的亲和纯化(Hengen 1995MethodsEnzymol[酶学方法]210,129-192)。将最终的氨基酸序列回译成编码开放阅读框(ORF)的DNA序列，将其置于有效的Shine-Dalgarno核糖体结合位点后的构建体中，并且在5'和3'末端分别侧接T7启动子和终止子，使用GeneFab程序(Cox等人2007Protein Sci[蛋白质科学],16,379-90)。通过设计用于预测大肠杆菌中高度表达的mRNA序列的OrfOpt或OrfMorph程序，在上下文中对所得的ORF序列进行了优化。所得的DNA序列通过寡核苷酸装配合成，并且克隆到GeneWiz公司(南普莱恩菲尔德，新泽西州)的pUC57中。随后的单点和多点突变通过使用GfMutagenesis制备合成ORF序列的突变序列来构建，该GfMutagenesis是一种使用大肠杆菌中氨基酸最普遍的密码子将点突变引入ORF中，接着进行总基因合成的内部程序。

合成基因优化。OrfOpt和OrfMorph程序使用改变在ORF内选择的不同密码子而不改变氨基酸序列的随机优化算法，以优化设计用于鉴定在大肠杆菌中以高水平表达蛋白质的mRNA序列的靶功能。OrfOpt同时在ORF的5'和3'末端施加富含AU的核苷酸组成、低RNA二级结构含量和有利的密码子使用(Allert等人2010J Mol Biol[分子生物学杂志],402,905-18)。OrfMorph程序重现在蛋白质的亲本基因组中观察到的密码子使用模式和RNA二级模式，但使用大肠杆菌密码子偏好和核苷酸组成。

如针对OrfOpt所描述的，使用针对所检查的基因组计算的密码子频率表，使用密码子适应指数(CAI)计算密码子使用。在基因组中的所有密码子上计算基因组的平均CAI值(μ_c)及其标准偏差(σ_c)。通过在9密码子窗上平均CAI，计算开放阅读框(ORF)中每个密码子的密码子使用分数(c)，该窗口集中在计算该分数的密码子上。对于每个密码子，计算归一化密码子使用分数(z_c)作为Z分数：z_c＝(c-μ_c)/σ_c。沿着ORF的z_c绘图确立了该ORF的密码子使用模式。假设罕用密码子(z_c<0)减慢核糖体翻译的延伸速率，从而在末端引入“暂停”位点。假设此类暂停位点指导共翻译蛋白质折叠的动力学，从而允许新合成的片段在合成更多蛋白质之前折叠。通过总结其在所有可以在其邻近形成的可能的发夹中的参与来确定每个核苷酸的RNA二级结构分数(s)(设置：最小茎双链体长度，4个碱基对；最大环长度，30个碱基；邻近长度，100个碱基)，如针对OrfOpt所描述的。在基因组中的所有核苷酸上计算平均二级结构能量(μ_s)及其标准偏差(σ_s)。对于每个密码子，计算归一化二级结构能量分数(z_s)作为Z分数：z_s＝(s-μ_s)/σ_s。沿着ORF的z_s绘图确立了该ORF的二级结构模式。假设上述平均二级结构的区域(z_s>0)减慢核糖体翻译的延伸速率，从而在末端引入“暂停”位点。与CAI介导的暂停位点一样，假设二级结构驱动的暂停位点指导共翻译蛋白质折叠的动力学。为了模拟用于在大肠杆菌中异源表达ORF的这些模式，首先使用亲本生物体密码子表、μ_c、σ_c、μ_s、和σ_s值来计算z_c和z_s分数。其次，使用随机搜索算法，该算法在简并密码子之间随机选择来构建试验mRNA核苷酸序列，针对每个试验序列计算z_c和z_s分数，但使用大肠杆菌密码子表和大肠杆菌μ_c、σ_c、μ_s、和σ_s值。对于每个试验序列，在大肠杆菌试验分数与野生型分数之间的绝对差异在整个ORF上求和。OrfMorph程序搜索这些差异的最小值。随机搜索算法的操作是：首先选择密码子位置，其次在该位置处允许的密码子内选择简并密码子。如果选择导致分数改善，则保留序列，否则拒绝该序列。在选择某一位置后，将其从允许的位置的池中除去，并从剩余的位置中选择下一个位置。当序列中的所有密码子都已检查时，“扫除(sweep)”完成。当两次连续的扫除不会进一步产生分数改善时，算法终止。所得的RNA核苷酸序列则具有与其亲本基因组背景中的野生型mRNA序列的那些密切匹配的密码子使用模式和二级结构模式。假设是这样的匹配通过模拟使错误折叠的蛋白质中间体聚集最小化的共翻译折叠贡献来改善可溶性蛋白质的产生。

蛋白质表达、纯化和荧光轭合物制备。将携带表达构建体(参见上文)的质粒转化到KRX感受态细胞(普洛麦格公司)中，并在37℃下在LB琼脂平板(100mg/mL氨苄青霉素)上生长过夜。挑取单菌落并在37℃在极品肉汤(Terrific Broth)(TB；研究产品国际公司(Research Products International))中生长过夜。将过夜培养物在500mL TB(100mg/mL氨苄青霉素、1mM CaCl₂)中以1:20稀释，在37℃下在剧烈充气的摇瓶中生长至A₆₀₀＝0.5的光密度，通过添加2.5mL鼠李糖(20％w/v)诱导，并且进一步生长3-4小时。通过离心(5,000rpm，10分钟)收集细胞。在倾析上清液后，将细胞沉淀物储存在-80℃。将细胞沉淀物解冻，重悬于8mL结合缓冲液(10mM咪唑、20mM MOPS、500mM NaCl、1mM CaCl₂，pH 7.8)中。重悬后，添加3mL的BugBuster HT(EMD密理博公司(Millipore))。孵育(20分钟，25℃)后，通过超声处理(1秒开/关脉冲，2分钟，20％-30％功率)将细胞在冰上裂解。通过离心(15,000rpm，20分钟，4℃)制备澄清的裂解物，从该裂解物中通过批量固定化金属亲和层析(IMAC)纯化重组蛋白。将重悬的IMAC琼脂糖珠粒(5mL；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，P6611)添加至裂解物中。在4℃在Mini LabRoller(莱伯特国际公司(Labnet International))中孵育1小时后，用结合缓冲液将珠粒洗涤至少5次。将固定的蛋白质珠粒重悬于标记缓冲液(20mM MOPS、100mM NaCl、1mM CaCl₂，pH 6.9)中，并用硫醇反应性荧光团(超过蛋白质5倍化学计量过量)标记过夜(4℃，上下颠倒旋转)。用标记缓冲液漂洗两次以除去未掺入的标记后，将蛋白质从珠粒上洗脱下来。为了从IMAC珠粒上洗脱标记的蛋白质，添加6mL洗脱缓冲液(400mM咪唑、500mM NaCl、1mM CaCl₂、20mM MOPS，pH 7.8)，孵育30分钟(4℃，上下颠倒旋转)，并通过离心除去珠粒。在使用10kDa半透膜(蛇皮管(Snakeskin tubing)，赛默科技公司(Thermo Scientific))通过三次更换测定缓冲液(20mM MOPS、20mM KCl、1mM CaCl₂，pH 7.4)对洗脱液进行透析之后，将在10kDa截留旋转浓缩器(Vivaspin，GE医疗集团(GEHealthcare))中浓缩荧光轭合物。通过SDS/PAGE评估蛋白质纯度。通过(Nanodrop1000)在280nm处(使用从它们的序列计算的消光系数(Gill和von Hippel 1989Anal Biochem[分析生物化学],182,319-26；Artimo等人2012Nucleic Acids Res[核酸研究],40,W597-603)、或在荧光团吸收峰处(Acrylodan，391nm；和Badan，387nm)确定蛋白质浓度。

温度依赖性和配体依赖性荧光景观的确定。在Tecan Freedom液体处理机器人上使用内部程序“TitrationPlate”制备了12点、24点或48点对数滴定系列，该内部程序将多组分滴定系列的抽象描述汇编成用于操作机器人的机器说明书。在20mM KCl、20mM MOPS(pH 7.4)(补充有1mM EGTA或1mM CaCl₂)中，葡萄糖浓度从0-1.7M变化。在LightCycler480II(罗氏公司(Roche))中，使用该仪器可用的最密切匹配荧光轭合物的光学特征的激发和发射波长，在384孔微量滴定板中测量20μL等分试样(每个包含10μM蛋白质)的温度依赖性荧光发射强度。温度以1K步长前进。在每个温度下，以1秒间隔收集数据持续60秒，此时信号已经放宽至与新温度相关的稳定值。在这些实验中没有观察到光漂白。使用内部程序“TitrationMeltPlate”将这些观察转换为时间无关数据集，这些数据集将每个孔的荧光记录为温度的函数并且将孔与其滴定剂和添加剂的浓度相关联。开发管理工具来维护滴定的数据库及其分析。

发射强度光谱的确定。在室温下在Nanodrop3300(赛默科技公司)上记录配体依赖性和波长依赖性发射强度。使用最接近荧光团的最佳激发波长的LED(UV，365nm；蓝色，470nm；“白色”，460-550nm)。

葡萄糖结合的比率分析。从如上所述获得的荧光景观或发射光谱数据集中提取等温葡萄糖滴定。单色发射强度I_λ(这些强度对应于带通强度，在罗氏LightCycler的情况下用物理滤波器记录，或在发射光谱的情况下通过在区间λ-δ,λ+δ中积分来记录)，拟合到

其中，^apoβ_λ和^satβ_λ分别是与蛋白质的无配体和配体结合状态相关的荧光基线，并且是蛋白质的分数饱和度(Layton和Hellinga 2010Biochemistry[生物化学],49,10831-41)。基线函数可以是常数、线性、或二阶多项式。对于配体依赖性和温度依赖性荧光景观，我们使用^apoβ_x的常数值，但是^satβ_x通过对葡萄糖浓度[L]的线性相关来描述：

^satβ_x＝a_x+b_x[L] 2

对于单个葡萄糖结合位点，部分饱和度由下式给出

其中，[L]是配体(葡萄糖)浓度，并且K_d是解离常数，^真实K_d是关于

二色的比率信号被定义为在两个独立波长λ₁和λ₂处的强度比率

R_1，2＝I_λ1/I_λ2 4

该信号除去了由于轭合物浓度、光漂白、激发源强度的波动和检测效率的变化而引起的波长无关发射强度衰减效应(Demchenko 2010J Fluoresc[荧光杂志]20，1099-128；Demchenko 2014Journal of Molecular Structure[分子结构杂志]1077，51-67)。这是使用这里描述的无试剂荧光响应性传感器进行高精度传感的关键方面。比率信号也可以拟合到结合等温线：

其中，^apoβ_R和^satβ_R是基线，并且是蛋白质(具有^近似K_d)的表观分数饱和度。一般来说，^真实K_d≠^近似K_d；如果两条基线都是恒定的，则可以导出关于^近似K_d与^真实K_d的简单关系：(Grimley等人2013J Neurosci[神经科学杂志]，33，16297-309)

其中，^apoI_λ2和^satI_λ2分别是无配体和配体结合蛋白在波长λ₂处的单色信号的发射强度。

化学计量浓度测量中的部分误差取决于如下结合等温线的一阶导数(Marvin等人1997ProcNatl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊]，94，4366-71)：

其中，R_1，2是比率信号(等式5)，ε_1，2是其实验误差，并且δS是所得的浓度的化学计量误差。然后，我们可以定义一个相对精度的函数

其中，P(S)是在浓度S处的相对精度，其在K_d处达到最大值(即最低误差)P_max。

对于给定的等温滴定，使用非线性拟合算法获得^近似K_d和^真实K_d的值，其中这两个参数使用等式1和5同时拟合到三条实验结合等温线，其中两条单色等温线共享相同的^真实K_d值。在这个程序中拟合^apoβ和^satβ的三个独立对。开发了程序“Nanodrop3300”和“TitrationMeltAnalysis”来分别分析波长依赖性或温度依赖性配体结合数据集。

温度依赖性和配体依赖性荧光景观的分析。为了获得结合反应的温度依赖性，将所有单独确定的等温线的K_d值拟合到Gibbs-Hemholtz方程(Layton和Hellinga2010Biochemistry[生物化学]49,10831-41)：

其中，是在温度T在1M配体下的标准结合自由能，

和分别是在参考温度T_ref下的结合摩尔焓和摩尔熵，并且ΔC_p,b是结合反应的热容。该数据分析使用“TitrationMeltAnalysis”进行。

发射光谱组分的分析。将波长依赖性发射强度I(λ)转换为波数依赖性强度I(v)(Valeur 2012Principles and Applications[原理与应用].Weinheim:Wiley[魏因海姆：威利公司]；Lakowicz 2006Principles of fluorescence spectroscopy[荧光光谱学原理].Springer[施普林出版社],纽约)：

I(ν)＝λ²I(λ) 11

奇异值分解用于发射光谱中相对于葡萄糖浓度变化的区域的无模型鉴定(Henry1992Methods Enzymol[酶学方法],210,129-192)。A_mn数据矩阵通过记录行中n个滴定点的列中m个频率的I(v)值来构建。这个矩阵被分解为

A_mn＝U_mnS_nnV_nn ^T 12

其中，U_mn记录m个频率处的n个光谱组分，其中m个频率按其对实验数据重建的贡献的权重排序，V_nn记录第n个组分对第n个滴定点的贡献，S_nn记录第n个组分的权重。使用由Python编写的内部Nanodrop3300程序进行分解。开源Python scipy软件包(www.scipy.org，版本0.7.2)中的linalg.svd方法用于解决分解。通过用其迹线对S中的值进行归一化，从S_nn计算U_mn中的第n个组分的相对权重f_n：

通过拟合n个高斯(Valeur 2012Principles and Applications[原理与应用].Weinheim:Wiley[魏因海姆：威利公司]；Lakowicz 2006Principles of fluorescencespectroscopy[荧光光谱学原理].Springer[施普林格出版社],纽约)到转化为频域(等式6)的校正光谱的发射强度(等式5)来确定光谱中n个单独电子跃迁的分数状态：

其中，μ_i是对应于第i个跃迁的峰值强度的波数，A_i是通过该跃迁贡献总光谱的面积，并且σ是所有跃迁的光谱宽度。第i个跃迁的分数f_i由下式给出：

波长相关残差由下式给出：

Δ(ν)＝^obsI(ν)-^calcI(ν) 16

使用在Nanodrop3300中实施的单纯形和轭合梯度方法(scipy软件包方法分别为optimize.fmin和optimize.leastsq)，通过使在观察光谱与计算光谱之间的最小平方差最小化来进行拟合。对于具有N个光谱的滴定系列(作为滴定剂浓度的函数收集)，使用全局拟合，其中，作为第一近似值，μi值在脱辅基蛋白和饱和葡萄糖复合物中保持相同，并且σ在所有光谱中对所有跃迁是通用的。A_i,k值允许在每个第k个光谱中变化。然后，将每个跃迁的分数变化f_i,k拟合到结合等温线(等式1)，从而将^近似K_d值调整到对于所有跃迁是共同的。

通过X射线晶体学确定结构。将葡萄糖结合蛋白荧光轭合物与2mM D-葡萄糖和1mMCaCl₂混合。使用稀疏基质筛选条件在17℃下进行坐滴法蒸气扩散结晶试验。将ecGGBP183CAcrylodan、ttGGBP182C Acrylodan和ttGGBP.17C Badan轭合物在20％PEG 3350和0.2M硫氰酸钾中结晶为针簇。机械分离单晶(Micro-Tools，汉普顿研究公司(HamptonResearch))，逐步转移到含有30％乙二醇的母液中，并在液氮中快速冷冻。在先进光子源(Advanced Photon Source)SER-CAT光束线22-ID处远程收集衍射数据；使用XDS程序收集和处理0.5°振荡角度框架(Kabsch 2010Acta Cryst.[晶体学报],D66,125-132)。使用大肠杆菌葡萄糖-半乳糖结合蛋白的聚丙氨酸(2gbp(Vyas等人1988Science[科学],242,1290-5))作为搜索模型，使用PHASER(MCCoy 2007J.Appl.Cryst.[应用晶体学杂志]D66,125-312)通过分子置换将数据分阶段。在PHENIX的AutoBuild中进行10次刚体细化循环之后建立初始模型(Adams 2010Acta Crystallogr D Biol Crystallogr[晶体学报D辑：生物晶体学],66,213-331)。在PHENIX和COOT中分别进行了多轮定位的单独的B因子和占用细化以及随后的模型构建。如在phenix.refine中实施的自动地和通过人工检查添加溶剂分子。这些结构使用PHENIX工具进行验证。最终的细化模型具有在这些分辨率下细化的平均值范围内的晶体学R_因子和R_自由值(Kleywegt 1996Structure[结构],4,897-904)。

实例14.FRS用途

可以将葡萄糖传感器并入定点照护临床装置中以在患者床边精确地并且快速地测量葡萄糖浓度。在这样的装置中，使用刺血针借助于手指棒获得小血样(<10μL)。然后将该样品液滴置于一次性盒的孔中，该盒含有在小的测量室内的干燥的、固定化的葡萄糖传感器。样品通过被动毛细管作用进入测量室，从而在接触时润湿传感器。一旦传感器被润湿，它们就会结合葡萄糖，并且通过工程化荧光传感器机制报告其浓度。将盒置于小的读数器(手持式或桌面式)内，并且其荧光信号由读数器的(廉价的)光电子组件测量。激发光由发光二极管(LED)提供。在Acrylodan或Badan的情况下，使用可商购的400nm蓝色LED，并且通过两个带通滤波器测量发射的光。盒可以含有多个传感器，跨越可能的葡萄糖浓度的整个临床范围。每个传感器固定在盒内的特定的已知位置，从而提供了“空间可寻址性”。然后通过使用廉价的照相机对这些传感器成像来记录特定波长处的强度，该照相机例如是在消费类电子产品中常见的互补金属氧化物半导体(CMOS)装置如手机。照相机中的每个像素都会以灰度记录发射的光。通过两个信号成像的信号的积分通过机载计算机分析以计算每个固定传感器的比率信号。然后，预先记录的双曲线结合曲线用于计算样品中的葡萄糖浓度。通过多个传感器进行记录，在不同的葡萄糖浓度下调整用于精确检测，提供高精确度读数。这个过程在不到一分钟内完成。

类似的仪器可以用于任何类型的偶发测量，例如使用其他体液、或从动物获得的样品、或非生物样品如食品和饮料。

FRS葡萄糖传感器也可以用于连续监测葡萄糖水平。例如，可以将传感器固定在细光纤的尖端以构建葡萄糖响应性光极。可以使用小针将这样的光极皮下引入体内。激发光和发射光分别往返通过固定的传感器。传感器与样品持续接触。通过轭合荧光团的传感机制，葡萄糖样品中的波动改变了在葡萄糖结合蛋白的开放状态与闭合状态之间的动态平衡，其被转换成荧光发射信号的波动。发射的光强度通过连接到光极的读数器通过滤波器读取。该读数器持续显示信号的变化以及相应的计算的葡萄糖浓度。使用含有一个或多个固定化葡萄糖生物传感器(例如，光纤生物传感器)的装置来完成连续葡萄糖监测，该装置是皮内或皮下引入受试者中的(Judge等人,2011,Diabetes Technology&Therapeutics[糖尿病技术与治疗学]13(3):309-317；Weidemaier等人,2011,Biosensors andBioelectronics[生物传感器和生物电子学]26:4117-4123；通过引用特此并入)。例如，可以使用皮下放置的传感器来监测患者中的葡萄糖水平，从而指导胰岛素在人工胰腺中的自动递送。

可以使用类似的仪器来监测发酵器或生物反应器中的葡萄糖水平，以及自动注射葡萄糖用于优化细菌、真菌和真核细胞的生长。

如上所讨论的，区分所述构建体、装置和方法与早期葡萄糖测定系统的特征包括：

·自我校准

·响应时间快速

·样品处理射流线路简单

·没有另外的组分/基质(“无试剂”)

·没有孵育时间以产生信号读取是几乎瞬时且持续的

·稳定性(简化了制造、分配、存储)

·样品量小(<10μL)

·能够在延长的葡萄糖浓度范围内(从低血糖到高血糖-高渗性范围)进行精确测量

·多个传感器还提供冗余，从而降低了误差

·大范围的用途：偶发、连续、离体、体内、光极、植入物。

其他实施例

虽然本发明已经结合其详细的描述进行了描述，但是前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修饰都在以下权利要求书的范围之内。

本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可用的知识。本文引用的所有美国专利和公开的或未公开的美国专利申请都通过引用而并入。本文引用的所有公开的外文专利合专利申请都通过引用特此并入。本文引用的登录号指示的Genbank和NCBI提交内容通过引用特此并入。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献都通过引用特此并入。

虽然本发明参考其优选实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。

序列表

<110> 杜克大学（Duke University）

H·W·赫林卡（Hellinga, Homme W）

M·J·阿勒特（Allert, Malin J）

<120> 葡萄糖生物传感器及其用途

<130> 35327-516001WO

<150> US 62/257,784

<151> 2015-11-20

<150> US 62/257,796

<151> 2015-11-20

<160> 298

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 332

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 1

Met Asn Lys Lys Val Leu Thr Leu Ser Ala Ile Met Ala Ser Met Leu

1 5 10 15

Phe Gly Ala Ala Ala His Ala Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr Ile

20 25 30

Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn Phe Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu

35 40 45

Gln Asp Ala Lys Ala Ala Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser

50 55 60

Gln Asn Asp Gln Ser Lys Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala

65 70 75 80

Lys Gly Val Lys Ala Leu Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala

85 90 95

Gly Thr Val Ile Glu Lys Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe

100 105 110

Phe Asn Lys Glu Pro Ser Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala

115 120 125

Tyr Tyr Val Gly Thr Asp Ser Lys Glu Ser Gly Ile Ile Gln Gly Asp

130 135 140

Leu Ile Ala Lys His Trp Ala Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys

145 150 155 160

Asp Gly Gln Ile Gln Phe Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro

165 170 175

Asp Ala Glu Ala Arg Thr Thr Tyr Val Ile Lys Glu Leu Asn Asp Lys

180 185 190

Gly Ile Lys Thr Glu Gln Leu Gln Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp Thr

195 200 205

Ala Gln Ala Lys Asp Lys Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala

210 215 220

Asn Lys Ile Glu Val Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly

225 230 235 240

Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe

245 250 255

Gly Val Asp Ala Leu Pro Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala

260 265 270

Leu Ala Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr

275 280 285

Phe Asp Leu Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly

290 295 300

Thr Asn Trp Lys Ile Asp Asn Lys Val Val Arg Val Pro Tyr Val Gly

305 310 315 320

Val Asp Lys Asp Asn Leu Ala Glu Phe Ser Lys Lys

325 330

<210> 2

<211> 360

<212> PRT

<213> 热解糖热厌氧杆菌

<400> 2

Met Lys Lys Ile Leu Thr Tyr Leu Val Leu Val Val Leu Val Leu Ser

1 5 10 15

Ala Leu Leu Thr Gly Cys Gly Asn Ser Asn Thr Thr Ser Ser Asn Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Ser Gln Gln Ser Asp Lys Thr Ala Ser Ser Asp Ser

35 40 45

Gly Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

50 55 60

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

65 70 75 80

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

85 90 95

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

100 105 110

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

115 120 125

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

130 135 140

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

165 170 175

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

180 185 190

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

195 200 205

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

210 215 220

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

225 230 235 240

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn

245 250 255

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

260 265 270

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

275 280 285

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

290 295 300

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

305 310 315 320

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

325 330 335

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

340 345 350

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln

355 360

<210> 3

<211> 332

<212> PRT

<213> 肠道沙门氏菌

<400> 3

Met Asn Lys Lys Val Leu Thr Leu Ser Ala Val Met Ala Ser Leu Leu

1 5 10 15

Phe Gly Ala His Ala His Ala Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr Ile

20 25 30

Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn Phe Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu

35 40 45

Lys Asp Gly Lys Ser Ala Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser

50 55 60

Gln Asn Asp Gln Ser Lys Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala

65 70 75 80

Lys Gly Val Lys Ala Leu Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala

85 90 95

Gly Thr Val Ile Glu Lys Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe

100 105 110

Phe Asn Lys Glu Pro Ser Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala

115 120 125

Tyr Tyr Val Gly Thr Asp Ser Lys Glu Ser Gly Val Ile Gln Gly Asp

130 135 140

Leu Ile Ala Lys His Trp Gln Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys

145 150 155 160

Asp Gly Lys Ile Gln Tyr Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro

165 170 175

Asp Ala Glu Ala Arg Thr Thr Tyr Val Val Lys Glu Leu Asn Asp Lys

180 185 190

Gly Ile Gln Thr Glu Gln Leu Ala Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp Thr

195 200 205

Ala Gln Ala Lys Asp Lys Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala

210 215 220

Asn Lys Ile Glu Val Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly

225 230 235 240

Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe

245 250 255

Gly Val Asp Ala Leu Pro Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala

260 265 270

Met Ala Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr

275 280 285

Phe Asp Leu Ala Lys Asn Leu Ala Glu Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly

290 295 300

Thr Ser Trp Lys Ile Glu Asn Lys Ile Val Arg Val Pro Tyr Val Gly

305 310 315 320

Val Asp Lys Asp Asn Leu Ser Glu Phe Thr Gln Lys

325 330

<210> 4

<211> 356

<212> PRT

<213> 热水热解纤维素菌

<400> 4

Met Phe Asn Lys Lys Lys Phe Trp Val Val Leu Val Ser Met Val Leu

1 5 10 15

Ile Ile Ser Leu Val Leu Val Gly Cys Gly Lys Lys Ser Thr Asn Asp

20 25 30

Ser Ser Asn Gly Thr Ser Glu Glu Asn Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala

35 40 45

Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile

50 55 60

Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala Lys Leu Asp Phe Val Asp Cys Gln

65 70 75 80

Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys

85 90 95

Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly

100 105 110

Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe

115 120 125

Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr

130 135 140

Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile

145 150 155 160

Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asn

165 170 175

Gly Ile Met Glu Tyr Val Met Ile Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp

180 185 190

Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly

195 200 205

Ile Lys Thr Lys Ala Leu Ala Gln Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val

210 215 220

Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Arg

225 230 235 240

Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile

245 250 255

Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Lys Asn Gly Lys Tyr Ile Pro

260 265 270

Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu

275 280 285

Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys

290 295 300

Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr

305 310 315 320

Lys Glu Asn Val Gly Phe Asp Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val

325 330 335

Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr

340 345 350

Val Asn Glu Gln

355

<210> 5

<211> 356

<212> PRT

<213> 黑曜石热解纤维素菌

<400> 5

Met Leu Asn Lys Lys Lys Phe Trp Val Val Leu Val Ser Ile Val Leu

1 5 10 15

Ala Ile Ser Leu Val Leu Val Gly Cys Gly Lys Lys Ser Thr Asn Glu

20 25 30

Asn Ser Gly Gly Thr Ser Glu Asp Asn Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala

35 40 45

Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile

50 55 60

Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala Lys Leu Asp Phe Val Asp Cys Gln

65 70 75 80

Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys

85 90 95

Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly

100 105 110

Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe

115 120 125

Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr

130 135 140

Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile

145 150 155 160

Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp

165 170 175

Gly Ile Met Gln Tyr Val Met Ile Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp

180 185 190

Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly

195 200 205

Ile Arg Val Lys Cys Leu Ala Gln Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val

210 215 220

Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Lys

225 230 235 240

Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile

245 250 255

Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Val Pro

260 265 270

Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu

275 280 285

Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys

290 295 300

Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr

305 310 315 320

Lys Glu Asn Val Gly Phe Glu Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val

325 330 335

Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr

340 345 350

Val Asn Glu Gln

355

<210> 6

<211> 350

<212> PRT

<213> 类芽孢杆菌属物种

<400> 6

Met Lys Lys Lys Trp Leu Phe Val Leu Met Ala Gly Met Met Leu Thr

1 5 10 15

Thr Ala Ala Cys Asn Asn Gly Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Asp Ser

20 25 30

Thr Gly Gly Asp Ala Val Gly Gly Ser Thr Pro Gln Val Gly Val Ala

35 40 45

Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met

50 55 60

Ser Asp Ala Ala Asn Gly Val Ala Lys Leu Asp Ile Val Asp Ser Gln

65 70 75 80

Asn Ala Gln Pro Thr Gln Asn Glu Lys Ile Asp Leu Phe Ile Ser Lys

85 90 95

Lys Tyr Ser Ser Met Ile Ile Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly

100 105 110

Val Ile Ile Asp Lys Ala Lys Thr Ala Asn Thr Pro Val Val Phe Leu

115 120 125

Asn Arg Glu Pro Ile Ala Glu Asp Met Asn Lys Trp Asp Lys Val Tyr

130 135 140

Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Glu Ser Gly Thr Ile Ser Gly Gln Leu

145 150 155 160

Ile Val Asp Tyr Trp Lys Ala Asn Pro Lys Ala Asp Lys Asn Gly Asp

165 170 175

Gly Lys Leu Gln Tyr Val Leu Leu Gln Gly Glu Pro Gly His Gln Asp

180 185 190

Ala Glu Leu Arg Thr Lys Phe Ser Val Gln Ala Ile Gln Asp Ala Gly

195 200 205

Ile Glu Val Glu Ala Leu Ala Val Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val

210 215 220

Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Thr Phe Leu Ala Ser His Gly Asp Lys

225 230 235 240

Ile Glu Ala Val Leu Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile

245 250 255

Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Ser Gly Asp Lys Tyr Met Pro

260 265 270

Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Gln Ala Leu Glu Asp

275 280 285

Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Lys Ser Gln Gly Lys

290 295 300

Ala Ser Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Ser Lys Gly Glu Ala Pro Asn

305 310 315 320

Lys Glu Asn Thr Gly Phe Asp Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile

325 330 335

Ala Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ala Asp Ala Lys

340 345 350

<210> 7

<211> 354

<212> PRT

<213> 解糖梭菌

<400> 7

Met Lys Arg Leu Arg Lys Gly Ile Phe Leu Phe Phe Phe Ile Val Trp

1 5 10 15

Thr Ala Phe Pro Leu Tyr Gly Cys Ala Pro Met Glu Gln Lys Lys Asp

20 25 30

Val Gly Glu Ser Ala Thr Ser Glu Ala Gly Thr Glu Gly Val Pro Glu

35 40 45

Glu Thr Gly Pro Lys Ile Gly Val Ser Ile Tyr Arg Tyr Asp Asp Thr

50 55 60

Phe Met Lys Leu Tyr Arg Gln Glu Leu Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Thr

65 70 75 80

Tyr His Ala Glu Val Ile Met Arg Asn Ala Gly Gly Asp Gln Lys Glu

85 90 95

Gln Asp Lys Gln Val Asn Gln Phe Ile Ser Asp Gly Cys Asp Gly Ile

100 105 110

Ile Val Asn Pro Val Glu Ile Pro Ala Ala Gln Glu Leu Ala Asp Ala

115 120 125

Cys Ser Arg Ala Gly Ile Pro Leu Val Phe Ile Asn Arg Glu Pro Lys

130 135 140

Glu Glu Glu Gln Lys Arg Trp Arg Glu Lys Gln Met Ala Val Ser Cys

145 150 155 160

Val Gly Thr Asp Ser Arg Gln Ala Gly Thr Tyr Gln Gly Glu Ile Ile

165 170 175

Leu Glu Thr Leu Asn Lys Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Val Val Ser

180 185 190

Tyr Val Met Leu Met Gly Glu Lys Gly Asn Glu Asp Ser Gln Tyr Arg

195 200 205

Thr Glu Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Glu Glu Gly Gly Met Lys Thr Glu

210 215 220

Glu Leu Phe Ser Gly Asn Gly Asn Trp Asn Lys Asp Glu Gly Lys Lys

225 230 235 240

Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Ser Trp Gly Asn Arg Ile Glu Val Phe

245 250 255

Phe Cys Asn Asn Asp Ser Met Ala Asn Gly Ala Leu Glu Ala Val Glu

260 265 270

Glu Ala Gly Arg Ile Pro Gly Lys Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val Asp

275 280 285

Ala Leu Gln Asp Thr Val Thr Tyr Ile Lys Glu Gly Arg Met Thr Gly

290 295 300

Thr Val Leu Asn Asp His Glu Gly Gln Ser Gln Met Ala Ala Asp Thr

305 310 315 320

Leu Lys Lys Met Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Thr Arg Tyr Gln Val

325 330 335

Asp Tyr Ile Lys Val Thr Ala Ile Ser Thr Phe Gln Thr Leu Lys Gly

340 345 350

Glu Asp

<210> 8

<211> 354

<212> PRT

<213> 分裂蛋白丁酸弧菌

<400> 8

Met Lys Lys Lys Met Ile Cys Tyr Met Ile Ile Ala Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ser Leu Met Ala Gly Cys Ser Asn Thr Gln Glu Ser Glu Pro Val Gln

20 25 30

Glu Ser Val Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Asp Ala Lys Val Gly Val Cys

35 40 45

Ile Tyr Gln Lys Ser Asp Asn Phe Met Ser Leu Phe Ser Ser Glu Leu

50 55 60

Val Lys Tyr Leu Val Ser Arg Gly Phe Ser Lys Asp Asn Ile Ile Leu

65 70 75 80

Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Glu Asn Val Gln Leu Ser Gln Val Glu Glu

85 90 95

Leu Ile Ala Ser Gly Ile Asn Ala Leu Ile Ile Asn Pro Val Asn Ser

100 105 110

Ser Val Ala His Ser Ile Thr Asp Met Ala Ser Ala Ser Asn Ile Pro

115 120 125

Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro Ser Gly Asp Glu Glu Asn Arg Trp

130 135 140

Glu Met Tyr Gln Leu Asn Val Cys Tyr Val Gly Cys Asp Ala Arg Gln

145 150 155 160

Ser Gly Ile Tyr Gln Gly Glu Ile Leu Leu Ser Leu Gly Lys Asn Lys

165 170 175

Leu Asp His Asn Gly Asp Gly Lys Ile Gln Tyr Phe Met Ile Glu Gly

180 185 190

Ala Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gly Tyr Arg Thr Leu Tyr Ser Val Ser

195 200 205

Ala Leu Gln Asn Ser Glu Met Glu Met Asp Cys Leu Leu Asp Glu Val

210 215 220

Gly Asn Trp Asp Glu Thr Thr Ala Ser Leu Leu Val Ser Lys Gly Ile

225 230 235 240

Gln Asn Gly Leu Lys Pro Glu Val Ile Ile Cys Asn Asn Asp Ala Met

245 250 255

Ala Leu Gly Ala Ile Lys Ala Ala Glu Lys Ser Gly Leu Val Pro Gly

260 265 270

Glu Asp Val Tyr Ile Val Gly Val Asp Ala Leu Pro Glu Ala Ile Glu

275 280 285

Met Ile Lys Ala Gly Lys Leu Ala Gly Thr Val Tyr Asn Asp Tyr Val

290 295 300

Leu Gln Ser His Lys Ser Ala Asp Ala Val Ile Asn Tyr Leu Lys Gly

305 310 315 320

Ile Asp Asn Glu His Tyr Ile Gly Cys Asp Tyr Val Lys Val Asp Ile

325 330 335

Asp Asn Ala Glu Ser Ile Ala Gly Leu Thr Asn Thr Asp Glu Glu Asp

340 345 350

Ile Asp

<210> 9

<211> 383

<212> PRT

<213> 肠罗氏菌

<400> 9

Met Lys Arg Lys Val Val Ser Val Ile Leu Ala Thr Ala Met Val Ala

1 5 10 15

Ser Met Val Ala Gly Cys Gly Gly Ser Asn Asn Ala Ser Thr Asn Asn

20 25 30

Ala Gly Thr Thr Thr Asp Ala Ala Ala Ser Asp Ala Ser Ser Asp Thr

35 40 45

Ser Asn Asp Ala Ala Ala Thr Glu Ala Ala Asp Ala Gly Asp Ala Ala

50 55 60

Ala Asp Ala Ala Thr Asp Ala Asp Ala Ser Leu Ala Asp Lys Lys Val

65 70 75 80

Gly Val Cys Ile Tyr Gln Phe Ser Asp Asn Phe Met Thr Leu Phe Arg

85 90 95

Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Leu Val Glu Lys Gly Phe Ser Lys Asp Asn

100 105 110

Ile Thr Ile Val Asp Gly Ala Asn Asp Gln Ala Thr Gln Thr Gly Gln

115 120 125

Ile Asp Asn Phe Ile Thr Glu Gly Val Asp Val Leu Ile Ile Asn Pro

130 135 140

Val Asn Ser Ser Ser Ala Ala Thr Ile Thr Asp Lys Val Val Ala Ala

145 150 155 160

Gly Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro Asp Glu Glu Glu Gln

165 170 175

Lys Arg Trp Ser Asp Asn Asn Trp Asp Val Thr Tyr Val Gly Cys Asp

180 185 190

Ala Arg Gln Ser Gly Thr Phe Gln Gly Glu Met Ile Ser Asp Leu Gly

195 200 205

Leu Asp Thr Val Asp Leu Asn Gly Asn Gly Lys Ile Asp Tyr Val Met

210 215 220

Val Glu Gly Asp Pro Glu Asn Val Asp Ala Gln Tyr Arg Thr Glu Tyr

225 230 235 240

Ser Val Lys Ala Leu Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val Asn Cys Leu Ser

245 250 255

Asp Gln Val Gly Asn Trp Gln Gln Asp Gln Ala Gln Gln Ile Val Ala

260 265 270

Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Gly Asn Asp Val Glu Val Val Phe Cys Asn

275 280 285

Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ala Ile Gln Ser Ala Gly

290 295 300

Arg Thr Val Gly Thr Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Ser

305 310 315 320

Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Ala Gly Thr Met Thr Gly Thr Val Phe

325 330 335

Asn Asp His Phe Ser Gln Ser His Ser Ala Ala Asp Ala Ala Ile Asn

340 345 350

Tyr Ile Thr Gly Ala Gly Asn Asp His Tyr Ile Gly Cys Asp Tyr Val

355 360 365

Lys Val Thr Lys Asp Asn Ala Gln Asp Val Leu Asp Met Val Lys

370 375 380

<210> 10

<211> 350

<212> PRT

<213> 普拉粪杆菌

<400> 10

Met Lys Met Ile Ser Arg Arg Asp Phe Leu Lys Ala Ser Ala Val Val

1 5 10 15

Gly Ala Thr Ala Ala Met Thr Ala Cys Gly Gly Ser Ser Ser Thr Ser

20 25 30

Thr Ala Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ala

35 40 45

Thr Asn Gly Ser Ala Asn Ile Gly Val Cys Ile Tyr Gln Phe Ala Asp

50 55 60

Asn Phe Met Thr Leu Tyr Arg Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Leu Lys Asp

65 70 75 80

Met Gly Tyr Ser Val Thr Ile Met Asp Gly Lys Asn Asp Gln Asn Thr

85 90 95

Gln Thr Glu Gln Ile Asn Thr Phe Leu Gln Gln Gly Val Asp Val Leu

100 105 110

Val Ile Asn Pro Val Gln Thr Thr Ser Ala Gln Thr Ile Val Asp Thr

115 120 125

Val Ser Pro Ser Gly Thr Pro Ile Val Phe Ile Asn Arg Glu Pro Glu

130 135 140

Glu Ser Val Leu Asp Ser Tyr Lys Gly Lys Cys Cys Tyr Val Gly Ala

145 150 155 160

Asp Ala Arg Gln Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Glu Leu Ile Leu Ala Thr

165 170 175

Asp Thr Gln Gly Asp Ile Asn Gly Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Ile Met

180 185 190

Cys Lys Gly Asp Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gln Tyr Arg Thr Glu Tyr

195 200 205

Ser Ile Lys Ala Leu Thr Asp Ala Gly Lys Glu Val Glu Cys Leu Tyr

210 215 220

Glu Tyr Leu Asp Asn Trp Asp Gln Thr Thr Ala Gln Gln Asp Val Ala

225 230 235 240

Asn Ala Leu Ser Gln Tyr Gly Glu Lys Ile Glu Val Val Phe Cys Asn

245 250 255

Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ser Ile Gln Gln Ala Gly

260 265 270

Arg Thr Val Gly Lys Asp Val Tyr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Val

275 280 285

Glu Ala Val Gln Asn Val Val Asp Gly Asn Met Thr Gly Thr Val Leu

290 295 300

Asn Asp Asp Val Gly Gln Ala Thr Lys Ala Ala Glu Ala Thr Lys Leu

305 310 315 320

Phe Val Glu Gly Lys Asp Val Glu Lys Tyr Tyr Trp Val Asp Tyr Val

325 330 335

Lys Val Thr Lys Asp Asn Ala Ser Gln Tyr Leu Lys Glu Asp

340 345 350

<210> 11

<211> 338

<212> PRT

<213> 扬氏梭菌

<400> 11

Met Ile Val Lys Lys Cys Met Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Leu Leu

1 5 10 15

Thr Ile Ile Leu Gly Thr Gly Cys Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asn Lys

20 25 30

Asn Glu Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Trp

35 40 45

Ile Thr Glu Leu Lys Asn Glu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Gly Lys Ala

50 55 60

Arg Val Asp Ile Trp Asn Gly Asp Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp

65 70 75 80

Lys Ile Asn Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asn Val Leu Asp Ile Asn

85 90 95

Pro Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Cys Lys Lys

100 105 110

Ala Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp

115 120 125

Met Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

130 135 140

Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His

145 150 155 160

Pro Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Thr

165 170 175

Arg Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu

180 185 190

Lys Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met

195 200 205

Trp Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser

210 215 220

Tyr Gly Pro Asn Phe Asp Cys Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala

225 230 235 240

Leu Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly

245 250 255

Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys

260 265 270

Ala Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala

275 280 285

Lys Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly

290 295 300

Lys Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Val Thr Asp Gly Lys

305 310 315 320

Tyr Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp

325 330 335

Ala Lys

<210> 12

<211> 336

<212> PRT

<213> 自产乙醇梭菌

<400> 12

Met Lys Lys Cys Met Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Leu Leu Thr Ile

1 5 10 15

Ile Leu Gly Thr Gly Cys Ser Asn Ser Leu Ser Ser Asn Lys Asn Glu

20 25 30

Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Trp Ile Thr

35 40 45

Glu Leu Lys Asn Glu Met Tyr Lys Val Ser Asn Gly Lys Ala Arg Val

50 55 60

Asp Ile Trp Asn Gly Asn Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp Lys Ile

65 70 75 80

Ser Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asp Val Leu Asp Ile Asn Pro Val

85 90 95

Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Cys Lys Lys Ala Asn

100 105 110

Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp Val Glu

115 120 125

Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser Gly

130 135 140

Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His Pro Thr

145 150 155 160

Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Met Arg Asn

165 170 175

Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Glu Asp

180 185 190

Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met Trp Asp

195 200 205

Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser Tyr Gly

210 215 220

Pro Asn Phe Asp Cys Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly Lys Tyr

245 250 255

Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys Ala Val

260 265 270

Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala Lys Gln

275 280 285

Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile

290 295 300

Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Ile

305 310 315 320

Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp Ala Lys

325 330 335

<210> 13

<211> 367

<212> PRT

<213> 肠罗氏菌

<400> 13

Met Cys Gly Ala Glu Lys Val Arg His Met Leu Met Gly Glu Gln Val

1 5 10 15

Leu Lys Lys Trp Lys Lys Ser Lys Lys Met Thr Val Ala Phe Gly Gly

20 25 30

Ile Leu Val Met Ser Val Val Ile Gly Gly Cys Gly Gly Arg Glu Asp

35 40 45

Ala Lys Lys Ser Ile Lys Ile Gly Ile Ser Val Tyr Asp Gln Tyr Asp

50 55 60

Thr Phe Val Ser Glu Met Met Lys Asp Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Lys

65 70 75 80

Lys Glu Glu Glu Thr Gly Val Ala Ile Asn Ile Asp Thr Tyr Asn Ala

85 90 95

Ser Ala Ser Gln Ser Thr Gln Asn Ser Gln Val Glu Asn Met Ile Thr

100 105 110

Glu Gly Cys Asp Val Ile Cys Val Asn Leu Val Asp Arg Thr Asp Pro

115 120 125

Thr Ala Ile Ile Asp Leu Ala Glu Lys Asn Asn Ile Pro Val Ile Phe

130 135 140

Phe Asn Arg Glu Leu Val Glu Glu Asp Leu Glu Arg Trp Thr Arg Leu

145 150 155 160

Tyr Tyr Val Gly Ala Gln Ala Phe Glu Ser Gly Ile Met Gln Gly Glu

165 170 175

Leu Ala Ala Glu Ala Phe Leu Thr Asp Gln Ser Leu Asp Lys Asn Gly

180 185 190

Asp Gly Ile Phe Gln Tyr Val Val Leu Glu Gly Glu Ala Gly His Gln

195 200 205

Asp Ala Ile Val Arg Thr Glu Tyr Ser Val Ser Thr Met Ile Asp Ser

210 215 220

Gly Val Glu Val Glu Lys Leu Gly Tyr Ala Ile Ala Asn Trp Asn Arg

225 230 235 240

Ala Gln Ala Gln Thr Lys Met Ala Gln Leu Met Ser Gln Phe Gly Asp

245 250 255

Ser Ile Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala

260 265 270

Ile Asp Ala Leu Lys Ala Ser Gly Leu Thr Lys Asp Glu Trp Pro Ala

275 280 285

Val Ile Gly Ile Asp Gly Thr Asp Val Gly Leu Glu Ala Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Met Ile Gly Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Asp

305 310 315 320

Ala Met Leu Asn Leu Ala Tyr Glu Leu Ser Thr Gly Ser Asp Leu Ser

325 330 335

Asp Leu Asn Leu Ile Asp Gly Lys Tyr Ile Arg Leu Pro Tyr Ala Arg

340 345 350

Val Thr Cys Asp Asp Val Asp Ser Tyr Met Glu Gly Asp Thr Glu

355 360 365

<210> 14

<211> 360

<212> PRT

<213> 红斑丹毒丝菌

<400> 14

Met Lys Lys Leu Ser Lys Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Phe Gly Cys Ser Ser Lys Gly Gly Ala Glu Gly Asn Ala Asn Glu

20 25 30

Gly Gly Lys Thr Tyr Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp

35 40 45

Asn Phe Met Thr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Ala Ser Tyr Phe Lys Glu

50 55 60

Val Gly Glu Lys Asp Gly Asn Thr Tyr Lys Leu Asp Ile Gln Asp Gly

65 70 75 80

Lys Gln Asp Gln Ala Asn Gln Thr Glu Gln Ile Asn Asn Phe Ile Ala

85 90 95

Gln Gly Lys Asp Leu Ile Ile Ala Asn Met Val Asp Pro Thr Ala Ala

100 105 110

Gly Ser Ile Ile Asn Ser Ala Lys Ala Lys Glu Ile Pro Val Val Phe

115 120 125

Ile Asn Arg Glu Pro Glu Thr Gln Glu Leu Glu Ile Trp Pro Gly Lys

130 135 140

Thr Thr Tyr Val Gly Ala Asp Ala Thr Gln Ser Gly Thr Ile Gln Gly

145 150 155 160

Tyr Met Ile Ala Asn Leu Glu Asn Lys Gly Asp Ile Asp Gly Asp Gly

165 170 175

Ser Val Ser Tyr Ile Thr Leu Met Gly Asp Pro Ala Asn Val Asp Ala

180 185 190

Lys Gln Arg Thr Glu Tyr Ser Val Lys Gly Leu Glu Glu Lys Gly Val

195 200 205

Lys Thr Asn Ala Leu Ala Gln Pro Tyr Gln Ala Asn Trp Asp Thr Ala

210 215 220

Lys Gly Gln Glu Phe Thr Ala Asn Ala Leu Glu Gln Phe Gly Asn Lys

225 230 235 240

Leu Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp Gly Met Ala Val Gly Ala Val

245 250 255

Thr Ala Ile Glu Ala Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Asp Ile Phe Val

260 265 270

Val Gly Val Asp Ala Ile Pro Asp Ala Ile Glu Leu Leu Lys Gly Gly

275 280 285

Lys Leu Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp His Phe Asn Gln Ser His Thr

290 295 300

Ala Val Asp Val Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gly Lys Asp Val Ser Ala

305 310 315 320

Tyr Tyr Trp His Asp Tyr Val Gly Val Thr Lys Pro Glu Glu Ala Glu

325 330 335

Leu Lys Arg Ala Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val Glu Glu Ala Val Lys

340 345 350

Arg Tyr Ala Glu Arg Asp Ala Gln

355 360

<210> 15

<211> 338

<212> PRT

<213> 直肠真杆菌

<400> 15

Met Met Ile Leu Cys Phe Ala Leu Ile Leu Ser Phe Val Ser Cys Ser

1 5 10 15

Asn Thr Arg Val Asp Glu Lys Lys Gln Ile Tyr Ile Gly Val Thr Cys

20 25 30

Tyr Asp Gln Lys Asp Thr Phe Ile Gly Glu Leu Ile Glu Thr Phe Lys

35 40 45

Lys Glu Cys Ala Ser Leu Asp Thr Asp Lys Tyr Asp Ile Ser Met Thr

50 55 60

Ile Met Asp Ala Ala Gly Ser Gln Arg Ala Gln Asp Asp Gln Val Gln

65 70 75 80

Glu Met Ile Glu Asp Gly Cys Asn Val Leu Cys Ile Asn Leu Ala Asp

85 90 95

Arg Thr Asp Leu Ser His Ile Ile Asn Ala Ala Met Glu Lys Asp Ile

100 105 110

Pro Ile Ile Phe Phe Asn Arg Glu Pro Val Asp Glu Asp Leu Asn Arg

115 120 125

Trp Asp Lys Leu Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Lys Gln Ser Gly Gln

130 135 140

Met Gln Gly Glu Leu Ile Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Asn Pro Gly Val

145 150 155 160

Asp Lys Asn Gly Asp Gly Arg Ile Gln Tyr Val Ile Leu Glu Gly Glu

165 170 175

Met Gly His Gln Asp Ala Ile Val Arg Thr Glu Ser Val Thr Glu Ser

180 185 190

Met Lys Asn Asn Gly Leu Gln Ile Glu Lys Leu Ser Cys Gln Ile Ala

195 200 205

Asn Trp Asn Arg Ala Gln Ala Gln Asn Arg Met Thr Gln Leu Ile Gly

210 215 220

Gln Tyr Lys Asn Ser Ile Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met

225 230 235 240

Ala Leu Gly Ala Ile Asp Ala Tyr Glu Lys Leu Gly Val Thr Glu Ser

245 250 255

Asn Val Pro Ala Phe Phe Gly Val Asp Gly Thr Asp Asp Gly Leu Glu

260 265 270

Ala Val Gln Gln Ser Lys Leu Ala Ala Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu

275 280 285

Gly Gln Ala Met Ala Met Ala Gln Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Thr Gly

290 295 300

Gly Ser Met Lys Asn Ile Lys Phe Glu Asp Lys Lys Tyr Val Tyr Leu

305 310 315 320

Pro Tyr Glu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Asn Glu Phe Val Lys Asp

325 330 335

Glu Gln

<210> 16

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ecGGBP（信号肽被M置换）

<400> 16

Met Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr Ile Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn

1 5 10 15

Phe Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu Gln Asp Ala Lys Ala Ala

20 25 30

Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser Gln Asn Asp Gln Ser Lys

35 40 45

Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala Lys Gly Val Lys Ala Leu

50 55 60

Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala Gly Thr Val Ile Glu Lys

65 70 75 80

Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Ser

85 90 95

Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Asp

100 105 110

Ser Lys Glu Ser Gly Ile Ile Gln Gly Asp Leu Ile Ala Lys His Trp

115 120 125

Ala Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys Asp Gly Gln Ile Gln Phe

130 135 140

Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr

145 150 155 160

Thr Tyr Val Ile Lys Glu Leu Asn Asp Lys Gly Ile Lys Thr Glu Gln

165 170 175

Leu Gln Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp Thr Ala Gln Ala Lys Asp Lys

180 185 190

Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala Asn Lys Ile Glu Val Val

195 200 205

Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly Ala Val Glu Ala Leu Lys

210 215 220

Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe Gly Val Asp Ala Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu Ala Lys Asn

260 265 270

Gln Ala Asp Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly Thr Asn Trp Lys Ile Asp

275 280 285

Asn Lys Val Val Arg Val Pro Tyr Val Gly Val Asp Lys Asp Asn Leu

290 295 300

Ala Glu Phe Ser Lys Lys

305 310

<210> 17

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ecGGBP（信号肽被除去）

<400> 17

Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr Ile Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu Gln Asp Ala Lys Ala Ala Pro

20 25 30

Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser Gln Asn Asp Gln Ser Lys Gln

35 40 45

Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala Lys Gly Val Lys Ala Leu Ala

50 55 60

Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala Gly Thr Val Ile Glu Lys Ala

65 70 75 80

Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Ser Arg

85 90 95

Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Asp Ser

100 105 110

Lys Glu Ser Gly Ile Ile Gln Gly Asp Leu Ile Ala Lys His Trp Ala

115 120 125

Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys Asp Gly Gln Ile Gln Phe Val

130 135 140

Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr Thr

145 150 155 160

Tyr Val Ile Lys Glu Leu Asn Asp Lys Gly Ile Lys Thr Glu Gln Leu

165 170 175

Gln Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp Thr Ala Gln Ala Lys Asp Lys Met

180 185 190

Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala Asn Lys Ile Glu Val Val Ile

195 200 205

Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala

210 215 220

His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe Gly Val Asp Ala Leu Pro Glu

225 230 235 240

Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu Asn

245 250 255

Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu Ala Lys Asn Gln

260 265 270

Ala Asp Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly Thr Asn Trp Lys Ile Asp Asn

275 280 285

Lys Val Val Arg Val Pro Tyr Val Gly Val Asp Lys Asp Asn Leu Ala

290 295 300

Glu Phe Ser Lys Lys

305

<210> 18

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP（信号肽被M置换）

<400> 18

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

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65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln

305 310

<210> 19

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> stGGBP（信号肽被M置换）

<400> 19

Met Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr Ile Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn

1 5 10 15

Phe Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu Lys Asp Gly Lys Ser Ala

20 25 30

Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser Gln Asn Asp Gln Ser Lys

35 40 45

Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala Lys Gly Val Lys Ala Leu

50 55 60

Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala Gly Thr Val Ile Glu Lys

65 70 75 80

Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Ser

85 90 95

Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Asp

100 105 110

Ser Lys Glu Ser Gly Val Ile Gln Gly Asp Leu Ile Ala Lys His Trp

115 120 125

Gln Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys Asp Gly Lys Ile Gln Tyr

130 135 140

Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr

145 150 155 160

Thr Tyr Val Val Lys Glu Leu Asn Asp Lys Gly Ile Gln Thr Glu Gln

165 170 175

Leu Ala Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp Thr Ala Gln Ala Lys Asp Lys

180 185 190

Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala Asn Lys Ile Glu Val Val

195 200 205

Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly Ala Val Glu Ala Leu Lys

210 215 220

Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe Gly Val Asp Ala Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala Met Ala Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu Ala Lys Asn

260 265 270

Leu Ala Glu Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly Thr Ser Trp Lys Ile Glu

275 280 285

Asn Lys Ile Val Arg Val Pro Tyr Val Gly Val Asp Lys Asp Asn Leu

290 295 300

Ser Glu Phe Thr Gln Lys

305 310

<210> 20

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> chyGGBP（信号肽被M置换）

<400> 20

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Cys Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asn Gly Ile Met Glu Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Lys Thr Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Arg Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asn Gly Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Asp Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln

305 310 315

<210> 21

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cobGGBP（信号肽被M置换）

<400> 21

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Cys Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

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Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

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Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Ile Met Gln Tyr Val Met Ile

130 135 140

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Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Arg Val Lys Cys Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Glu Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln

305 310 315

<210> 22

<211> 307

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pspGGBP（信号肽被M置换）

<400> 22

Met Val Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly

1 5 10 15

Val Arg Asn Ala Met Ser Asp Ala Ala Asn Gly Val Ala Lys Leu Asp

20 25 30

Ile Val Asp Ser Gln Asn Ala Gln Pro Thr Gln Asn Glu Lys Ile Asp

35 40 45

Leu Phe Ile Ser Lys Lys Tyr Ser Ser Met Ile Ile Asn Pro Val Asp

50 55 60

Arg Thr Ala Ala Gly Val Ile Ile Asp Lys Ala Lys Thr Ala Asn Thr

65 70 75 80

Pro Val Val Phe Leu Asn Arg Glu Pro Ile Ala Glu Asp Met Asn Lys

85 90 95

Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Glu Ser Gly Thr

100 105 110

Ile Ser Gly Gln Leu Ile Val Asp Tyr Trp Lys Ala Asn Pro Lys Ala

115 120 125

Asp Lys Asn Gly Asp Gly Lys Leu Gln Tyr Val Leu Leu Gln Gly Glu

130 135 140

Pro Gly His Gln Asp Ala Glu Leu Arg Thr Lys Phe Ser Val Gln Ala

145 150 155 160

Ile Gln Asp Ala Gly Ile Glu Val Glu Ala Leu Ala Val Asp Thr Ala

165 170 175

Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Thr Phe Leu Ala

180 185 190

Ser His Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Leu Ala Asn Asn Asp Asp Met

195 200 205

Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Ser Gly

210 215 220

Asp Lys Tyr Met Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val

225 230 235 240

Gln Ala Leu Glu Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala

245 250 255

Lys Ser Gln Gly Lys Ala Ser Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Ser Lys

260 265 270

Gly Glu Ala Pro Asn Lys Glu Asn Thr Gly Phe Asp Ile Thr Asp Gly

275 280 285

Lys Tyr Val Trp Ile Ala Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ala

290 295 300

Asp Ala Lys

305

<210> 23

<211> 307

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> csaGGBP （信号肽被M置换）

<400> 23

Met Glu Thr Gly Pro Lys Ile Gly Val Ser Ile Tyr Arg Tyr Asp Asp

1 5 10 15

Thr Phe Met Lys Leu Tyr Arg Gln Glu Leu Lys Gln Tyr Leu Glu Glu

20 25 30

Thr Tyr His Ala Glu Val Ile Met Arg Asn Ala Gly Gly Asp Gln Lys

35 40 45

Glu Gln Asp Lys Gln Val Asn Gln Phe Ile Ser Asp Gly Cys Asp Gly

50 55 60

Ile Ile Val Asn Pro Val Glu Ile Pro Ala Ala Gln Glu Leu Ala Asp

65 70 75 80

Ala Cys Ser Arg Ala Gly Ile Pro Leu Val Phe Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

Lys Glu Glu Glu Gln Lys Arg Trp Arg Glu Lys Gln Met Ala Val Ser

100 105 110

Cys Val Gly Thr Asp Ser Arg Gln Ala Gly Thr Tyr Gln Gly Glu Ile

115 120 125

Ile Leu Glu Thr Leu Asn Lys Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Val Val

130 135 140

Ser Tyr Val Met Leu Met Gly Glu Lys Gly Asn Glu Asp Ser Gln Tyr

145 150 155 160

Arg Thr Glu Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Glu Glu Gly Gly Met Lys Thr

165 170 175

Glu Glu Leu Phe Ser Gly Asn Gly Asn Trp Asn Lys Asp Glu Gly Lys

180 185 190

Lys Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Ser Trp Gly Asn Arg Ile Glu Val

195 200 205

Phe Phe Cys Asn Asn Asp Ser Met Ala Asn Gly Ala Leu Glu Ala Val

210 215 220

Glu Glu Ala Gly Arg Ile Pro Gly Lys Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Gln Asp Thr Val Thr Tyr Ile Lys Glu Gly Arg Met Thr

245 250 255

Gly Thr Val Leu Asn Asp His Glu Gly Gln Ser Gln Met Ala Ala Asp

260 265 270

Thr Leu Lys Lys Met Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Thr Arg Tyr Gln

275 280 285

Val Asp Tyr Ile Lys Val Thr Ala Ile Ser Thr Phe Gln Thr Leu Lys

290 295 300

Gly Glu Asp

305

<210> 24

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bprGGBP （信号肽被M置换）

<400> 24

Met Asp Ala Lys Val Gly Val Cys Ile Tyr Gln Lys Ser Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Ser Leu Phe Ser Ser Glu Leu Val Lys Tyr Leu Val Ser Arg Gly

20 25 30

Phe Ser Lys Asp Asn Ile Ile Leu Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Glu Asn

35 40 45

Val Gln Leu Ser Gln Val Glu Glu Leu Ile Ala Ser Gly Ile Asn Ala

50 55 60

Leu Ile Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Val Ala His Ser Ile Thr Asp

65 70 75 80

Met Ala Ser Ala Ser Asn Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

Ser Gly Asp Glu Glu Asn Arg Trp Glu Met Tyr Gln Leu Asn Val Cys

100 105 110

Tyr Val Gly Cys Asp Ala Arg Gln Ser Gly Ile Tyr Gln Gly Glu Ile

115 120 125

Leu Leu Ser Leu Gly Lys Asn Lys Leu Asp His Asn Gly Asp Gly Lys

130 135 140

Ile Gln Tyr Phe Met Ile Glu Gly Ala Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Leu Tyr Ser Val Ser Ala Leu Gln Asn Ser Glu Met Glu

165 170 175

Met Asp Cys Leu Leu Asp Glu Val Gly Asn Trp Asp Glu Thr Thr Ala

180 185 190

Ser Leu Leu Val Ser Lys Gly Ile Gln Asn Gly Leu Lys Pro Glu Val

195 200 205

Ile Ile Cys Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Lys Ala Ala

210 215 220

Glu Lys Ser Gly Leu Val Pro Gly Glu Asp Val Tyr Ile Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Pro Glu Ala Ile Glu Met Ile Lys Ala Gly Lys Leu Ala

245 250 255

Gly Thr Val Tyr Asn Asp Tyr Val Leu Gln Ser His Lys Ser Ala Asp

260 265 270

Ala Val Ile Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Asp Asn Glu His Tyr Ile Gly

275 280 285

Cys Asp Tyr Val Lys Val Asp Ile Asp Asn Ala Glu Ser Ile Ala Gly

290 295 300

Leu Thr Asn Thr Asp Glu Glu Asp Ile Asp

305 310

<210> 25

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_A（信号肽被M置换）

<400> 25

Met Lys Val Gly Val Cys Ile Tyr Gln Phe Ser Asp Asn Phe Met Thr

1 5 10 15

Leu Phe Arg Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Leu Val Glu Lys Gly Phe Ser

20 25 30

Lys Asp Asn Ile Thr Ile Val Asp Gly Ala Asn Asp Gln Ala Thr Gln

35 40 45

Thr Gly Gln Ile Asp Asn Phe Ile Thr Glu Gly Val Asp Val Leu Ile

50 55 60

Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Ser Ala Ala Thr Ile Thr Asp Lys Val

65 70 75 80

Val Ala Ala Gly Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Glu Gln Lys Arg Trp Ser Asp Asn Asn Trp Asp Val Thr Tyr Val

100 105 110

Gly Cys Asp Ala Arg Gln Ser Gly Thr Phe Gln Gly Glu Met Ile Ser

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Asp Thr Val Asp Leu Asn Gly Asn Gly Lys Ile Asp

130 135 140

Tyr Val Met Val Glu Gly Asp Pro Glu Asn Val Asp Ala Gln Tyr Arg

145 150 155 160

Thr Glu Tyr Ser Val Lys Ala Leu Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val Asn

165 170 175

Cys Leu Ser Asp Gln Val Gly Asn Trp Gln Gln Asp Gln Ala Gln Gln

180 185 190

Ile Val Ala Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Gly Asn Asp Val Glu Val Val

195 200 205

Phe Cys Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ala Ile Gln

210 215 220

Ser Ala Gly Arg Thr Val Gly Thr Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val Asp

225 230 235 240

Ala Leu Ser Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Ala Gly Thr Met Thr Gly

245 250 255

Thr Val Phe Asn Asp His Phe Ser Gln Ser His Ser Ala Ala Asp Ala

260 265 270

Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Ala Gly Asn Asp His Tyr Ile Gly Cys

275 280 285

Asp Tyr Val Lys Val Thr Lys Asp Asn Ala Gln Asp Val Leu Asp Met

290 295 300

Val Lys

305

<210> 26

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> fprGGBP（信号肽被M置换）

<400> 26

Met Ser Ala Asn Ile Gly Val Cys Ile Tyr Gln Phe Ala Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Thr Leu Tyr Arg Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Leu Lys Asp Met Gly

20 25 30

Tyr Ser Val Thr Ile Met Asp Gly Lys Asn Asp Gln Asn Thr Gln Thr

35 40 45

Glu Gln Ile Asn Thr Phe Leu Gln Gln Gly Val Asp Val Leu Val Ile

50 55 60

Asn Pro Val Gln Thr Thr Ser Ala Gln Thr Ile Val Asp Thr Val Ser

65 70 75 80

Pro Ser Gly Thr Pro Ile Val Phe Ile Asn Arg Glu Pro Glu Glu Ser

85 90 95

Val Leu Asp Ser Tyr Lys Gly Lys Cys Cys Tyr Val Gly Ala Asp Ala

100 105 110

Arg Gln Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Glu Leu Ile Leu Ala Thr Asp Thr

115 120 125

Gln Gly Asp Ile Asn Gly Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Ile Met Cys Lys

130 135 140

Gly Asp Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gln Tyr Arg Thr Glu Tyr Ser Ile

145 150 155 160

Lys Ala Leu Thr Asp Ala Gly Lys Glu Val Glu Cys Leu Tyr Glu Tyr

165 170 175

Leu Asp Asn Trp Asp Gln Thr Thr Ala Gln Gln Asp Val Ala Asn Ala

180 185 190

Leu Ser Gln Tyr Gly Glu Lys Ile Glu Val Val Phe Cys Asn Asn Asp

195 200 205

Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ser Ile Gln Gln Ala Gly Arg Thr

210 215 220

Val Gly Lys Asp Val Tyr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Val Glu Ala

225 230 235 240

Val Gln Asn Val Val Asp Gly Asn Met Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp

245 250 255

Asp Val Gly Gln Ala Thr Lys Ala Ala Glu Ala Thr Lys Leu Phe Val

260 265 270

Glu Gly Lys Asp Val Glu Lys Tyr Tyr Trp Val Asp Tyr Val Lys Val

275 280 285

Thr Lys Asp Asn Ala Ser Gln Tyr Leu Lys Glu Asp

290 295 300

<210> 27

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cljGGBP（信号肽被M置换）

<400> 27

Met Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Trp Ile

1 5 10 15

Thr Glu Leu Lys Asn Glu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Gly Lys Ala Arg

20 25 30

Val Asp Ile Trp Asn Gly Asp Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp Lys

35 40 45

Ile Asn Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asn Val Leu Asp Ile Asn Pro

50 55 60

Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Cys Lys Lys Ala

65 70 75 80

Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp Met

85 90 95

Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser

100 105 110

Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His Pro

115 120 125

Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Thr Arg

130 135 140

Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Lys

145 150 155 160

Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met Trp

165 170 175

Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Gly Pro Asn Phe Asp Cys Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu

195 200 205

Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly Lys

210 215 220

Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys Ala

225 230 235 240

Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala Lys

245 250 255

Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly Lys

260 265 270

Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Val Thr Asp Gly Lys Tyr

275 280 285

Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp Ala

290 295 300

Lys

305

<210> 28

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cauGGBP（信号肽被M置换）

<400> 28

Met Glu Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Trp

1 5 10 15

Ile Thr Glu Leu Lys Asn Glu Met Tyr Lys Val Ser Asn Gly Lys Ala

20 25 30

Arg Val Asp Ile Trp Asn Gly Asn Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Ser Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asp Val Leu Asp Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Cys Lys Lys

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp

85 90 95

Val Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His

115 120 125

Pro Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Met

130 135 140

Arg Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu

145 150 155 160

Glu Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met

165 170 175

Trp Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Gly Pro Asn Phe Asp Cys Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala

195 200 205

Leu Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly

210 215 220

Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys

225 230 235 240

Ala Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala

245 250 255

Lys Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly

260 265 270

Lys Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Ile Thr Asp Gly Lys

275 280 285

Tyr Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp

290 295 300

Ala Lys

305

<210> 29

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_B（信号肽被M置换）

<400> 29

Met Lys Ser Ile Lys Ile Gly Ile Ser Val Tyr Asp Gln Tyr Asp Thr

1 5 10 15

Phe Val Ser Glu Met Met Lys Asp Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Lys Lys

20 25 30

Glu Glu Glu Thr Gly Val Ala Ile Asn Ile Asp Thr Tyr Asn Ala Ser

35 40 45

Ala Ser Gln Ser Thr Gln Asn Ser Gln Val Glu Asn Met Ile Thr Glu

50 55 60

Gly Cys Asp Val Ile Cys Val Asn Leu Val Asp Arg Thr Asp Pro Thr

65 70 75 80

Ala Ile Ile Asp Leu Ala Glu Lys Asn Asn Ile Pro Val Ile Phe Phe

85 90 95

Asn Arg Glu Leu Val Glu Glu Asp Leu Glu Arg Trp Thr Arg Leu Tyr

100 105 110

Tyr Val Gly Ala Gln Ala Phe Glu Ser Gly Ile Met Gln Gly Glu Leu

115 120 125

Ala Ala Glu Ala Phe Leu Thr Asp Gln Ser Leu Asp Lys Asn Gly Asp

130 135 140

Gly Ile Phe Gln Tyr Val Val Leu Glu Gly Glu Ala Gly His Gln Asp

145 150 155 160

Ala Ile Val Arg Thr Glu Tyr Ser Val Ser Thr Met Ile Asp Ser Gly

165 170 175

Val Glu Val Glu Lys Leu Gly Tyr Ala Ile Ala Asn Trp Asn Arg Ala

180 185 190

Gln Ala Gln Thr Lys Met Ala Gln Leu Met Ser Gln Phe Gly Asp Ser

195 200 205

Ile Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile

210 215 220

Asp Ala Leu Lys Ala Ser Gly Leu Thr Lys Asp Glu Trp Pro Ala Val

225 230 235 240

Ile Gly Ile Asp Gly Thr Asp Val Gly Leu Glu Ala Val Lys Asn Lys

245 250 255

Glu Met Ile Gly Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Asp Ala

260 265 270

Met Leu Asn Leu Ala Tyr Glu Leu Ser Thr Gly Ser Asp Leu Ser Asp

275 280 285

Leu Asn Leu Ile Asp Gly Lys Tyr Ile Arg Leu Pro Tyr Ala Arg Val

290 295 300

Thr Cys Asp Asp Val Asp Ser Tyr Met Glu Gly Asp Thr Glu

305 310 315

<210> 30

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> erhGGBP（信号肽被M置换）

<400> 30

Met Lys Thr Tyr Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Asn

1 5 10 15

Phe Met Thr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Ala Ser Tyr Phe Lys Glu Val

20 25 30

Gly Glu Lys Asp Gly Asn Thr Tyr Lys Leu Asp Ile Gln Asp Gly Lys

35 40 45

Gln Asp Gln Ala Asn Gln Thr Glu Gln Ile Asn Asn Phe Ile Ala Gln

50 55 60

Gly Lys Asp Leu Ile Ile Ala Asn Met Val Asp Pro Thr Ala Ala Gly

65 70 75 80

Ser Ile Ile Asn Ser Ala Lys Ala Lys Glu Ile Pro Val Val Phe Ile

85 90 95

Asn Arg Glu Pro Glu Thr Gln Glu Leu Glu Ile Trp Pro Gly Lys Thr

100 105 110

Thr Tyr Val Gly Ala Asp Ala Thr Gln Ser Gly Thr Ile Gln Gly Tyr

115 120 125

Met Ile Ala Asn Leu Glu Asn Lys Gly Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser

130 135 140

Val Ser Tyr Ile Thr Leu Met Gly Asp Pro Ala Asn Val Asp Ala Lys

145 150 155 160

Gln Arg Thr Glu Tyr Ser Val Lys Gly Leu Glu Glu Lys Gly Val Lys

165 170 175

Thr Asn Ala Leu Ala Gln Pro Tyr Gln Ala Asn Trp Asp Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gln Glu Phe Thr Ala Asn Ala Leu Glu Gln Phe Gly Asn Lys Leu

195 200 205

Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp Gly Met Ala Val Gly Ala Val Thr

210 215 220

Ala Ile Glu Ala Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Asp Ile Phe Val Val

225 230 235 240

Gly Val Asp Ala Ile Pro Asp Ala Ile Glu Leu Leu Lys Gly Gly Lys

245 250 255

Leu Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp His Phe Asn Gln Ser His Thr Ala

260 265 270

Val Asp Val Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gly Lys Asp Val Ser Ala Tyr

275 280 285

Tyr Trp His Asp Tyr Val Gly Val Thr Lys Pro Glu Glu Ala Glu Leu

290 295 300

Lys Arg Ala Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val Glu Glu Ala Val Lys Arg

305 310 315 320

Tyr Ala Glu Arg Asp Ala Gln

325

<210> 31

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ereGGBP（信号肽被M置换）

<400> 31

Met Lys Gln Ile Tyr Ile Gly Val Thr Cys Tyr Asp Gln Lys Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Gly Glu Leu Ile Glu Thr Phe Lys Lys Glu Cys Ala Ser Leu

20 25 30

Asp Thr Asp Lys Tyr Asp Ile Ser Met Thr Ile Met Asp Ala Ala Gly

35 40 45

Ser Gln Arg Ala Gln Asp Asp Gln Val Gln Glu Met Ile Glu Asp Gly

50 55 60

Cys Asn Val Leu Cys Ile Asn Leu Ala Asp Arg Thr Asp Leu Ser His

65 70 75 80

Ile Ile Asn Ala Ala Met Glu Lys Asp Ile Pro Ile Ile Phe Phe Asn

85 90 95

Arg Glu Pro Val Asp Glu Asp Leu Asn Arg Trp Asp Lys Leu Tyr Tyr

100 105 110

Val Gly Ala Lys Ala Lys Gln Ser Gly Gln Met Gln Gly Glu Leu Ile

115 120 125

Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Asn Pro Gly Val Asp Lys Asn Gly Asp Gly

130 135 140

Arg Ile Gln Tyr Val Ile Leu Glu Gly Glu Met Gly His Gln Asp Ala

145 150 155 160

Ile Val Arg Thr Glu Ser Val Thr Glu Ser Met Lys Asn Asn Gly Leu

165 170 175

Gln Ile Glu Lys Leu Ser Cys Gln Ile Ala Asn Trp Asn Arg Ala Gln

180 185 190

Ala Gln Asn Arg Met Thr Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Lys Asn Ser Ile

195 200 205

Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Asp

210 215 220

Ala Tyr Glu Lys Leu Gly Val Thr Glu Ser Asn Val Pro Ala Phe Phe

225 230 235 240

Gly Val Asp Gly Thr Asp Asp Gly Leu Glu Ala Val Gln Gln Ser Lys

245 250 255

Leu Ala Ala Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Met Ala Met

260 265 270

Ala Gln Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Thr Gly Gly Ser Met Lys Asn Ile

275 280 285

Lys Phe Glu Asp Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Glu Lys Val Thr

290 295 300

Pro Asp Asn Val Asn Glu Phe Val Lys Asp Glu Gln

305 310 315

<210> 32

<211> 319

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ecGGBPW183C（信号肽被M置换；W183C突变；

并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 32

Met Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr Ile Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn

1 5 10 15

Phe Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu Gln Asp Ala Lys Ala Ala

20 25 30

Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser Gln Asn Asp Gln Ser Lys

35 40 45

Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala Lys Gly Val Lys Ala Leu

50 55 60

Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala Gly Thr Val Ile Glu Lys

65 70 75 80

Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Ser

85 90 95

Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Asp

100 105 110

Ser Lys Glu Ser Gly Ile Ile Gln Gly Asp Leu Ile Ala Lys His Trp

115 120 125

Ala Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys Asp Gly Gln Ile Gln Phe

130 135 140

Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr

145 150 155 160

Thr Tyr Val Ile Lys Glu Leu Asn Asp Lys Gly Ile Lys Thr Glu Gln

165 170 175

Leu Gln Leu Asp Thr Ala Met Cys Asp Thr Ala Gln Ala Lys Asp Lys

180 185 190

Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala Asn Lys Ile Glu Val Val

195 200 205

Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly Ala Val Glu Ala Leu Lys

210 215 220

Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe Gly Val Asp Ala Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu Ala Lys Asn

260 265 270

Leu Ala Asp Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly Thr Asn Trp Lys Ile Asp

275 280 285

Asn Lys Val Val Arg Val Pro Tyr Val Gly Val Asp Lys Asp Asn Leu

290 295 300

Ala Glu Phe Ser Lys Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 33

<211> 319

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ecGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 33

Met Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr Ile Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn

1 5 10 15

Phe Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu Gln Asp Ala Lys Ala Ala

20 25 30

Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser Gln Asn Asp Gln Ser Lys

35 40 45

Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala Lys Gly Val Lys Ala Leu

50 55 60

Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala Gly Thr Val Ile Glu Lys

65 70 75 80

Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Ser

85 90 95

Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Asp

100 105 110

Ser Lys Glu Ser Gly Ile Ile Gln Gly Asp Leu Ile Ala Lys His Trp

115 120 125

Ala Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys Asp Gly Gln Ile Gln Phe

130 135 140

Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr

145 150 155 160

Thr Tyr Val Ile Lys Glu Leu Asn Asp Lys Gly Ile Lys Thr Glu Gln

165 170 175

Leu Gln Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp Thr Ala Gln Ala Lys Asp Lys

180 185 190

Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala Asn Lys Ile Glu Val Val

195 200 205

Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly Ala Val Glu Ala Leu Lys

210 215 220

Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe Gly Val Asp Ala Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu Ala Lys Asn

260 265 270

Gln Ala Asp Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly Thr Asn Trp Lys Ile Asp

275 280 285

Asn Lys Val Val Arg Val Pro Tyr Val Gly Val Asp Lys Asp Asn Leu

290 295 300

Ala Glu Phe Ser Lys Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 34

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> csaGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 34

Met Glu Thr Gly Pro Lys Ile Gly Val Ser Ile Tyr Arg Tyr Asp Asp

1 5 10 15

Thr Phe Met Lys Leu Tyr Arg Gln Glu Leu Lys Gln Tyr Leu Glu Glu

20 25 30

Thr Tyr His Ala Glu Val Ile Met Arg Asn Ala Gly Gly Asp Gln Lys

35 40 45

Glu Gln Asp Lys Gln Val Asn Gln Phe Ile Ser Asp Gly Cys Asp Gly

50 55 60

Ile Ile Val Asn Pro Val Glu Ile Pro Ala Ala Gln Glu Leu Ala Asp

65 70 75 80

Ala Cys Ser Arg Ala Gly Ile Pro Leu Val Phe Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

Lys Glu Glu Glu Gln Lys Arg Trp Arg Glu Lys Gln Met Ala Val Ser

100 105 110

Cys Val Gly Thr Asp Ser Arg Gln Ala Gly Thr Tyr Gln Gly Glu Ile

115 120 125

Ile Leu Glu Thr Leu Asn Lys Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Val Val

130 135 140

Ser Tyr Val Met Leu Met Gly Glu Lys Gly Asn Glu Asp Ser Gln Tyr

145 150 155 160

Arg Thr Glu Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Glu Glu Gly Gly Met Lys Thr

165 170 175

Glu Glu Leu Phe Ser Gly Asn Gly Asn Trp Asn Lys Asp Glu Gly Lys

180 185 190

Lys Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Ser Trp Gly Asn Arg Ile Glu Val

195 200 205

Phe Phe Cys Asn Asn Asp Ser Met Ala Asn Gly Ala Leu Glu Ala Val

210 215 220

Glu Glu Ala Gly Arg Ile Pro Gly Lys Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Gln Asp Thr Val Thr Tyr Ile Lys Glu Gly Arg Met Thr

245 250 255

Gly Thr Val Leu Asn Asp His Glu Gly Gln Ser Gln Met Ala Ala Asp

260 265 270

Thr Leu Lys Lys Met Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Thr Arg Tyr Gln

275 280 285

Val Asp Tyr Ile Lys Val Thr Ala Ile Ser Thr Phe Gln Thr Leu Lys

290 295 300

Gly Glu Asp Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 35

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bprGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 35

Met Asp Ala Lys Val Gly Val Cys Ile Tyr Gln Lys Ser Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Ser Leu Phe Ser Ser Glu Leu Val Lys Tyr Leu Val Ser Arg Gly

20 25 30

Phe Ser Lys Asp Asn Ile Ile Leu Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Glu Asn

35 40 45

Val Gln Leu Ser Gln Val Glu Glu Leu Ile Ala Ser Gly Ile Asn Ala

50 55 60

Leu Ile Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Val Ala His Ser Ile Thr Asp

65 70 75 80

Met Ala Ser Ala Ser Asn Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

Ser Gly Asp Glu Glu Asn Arg Trp Glu Met Tyr Gln Leu Asn Val Cys

100 105 110

Tyr Val Gly Cys Asp Ala Arg Gln Ser Gly Ile Tyr Gln Gly Glu Ile

115 120 125

Leu Leu Ser Leu Gly Lys Asn Lys Leu Asp His Asn Gly Asp Gly Lys

130 135 140

Ile Gln Tyr Phe Met Ile Glu Gly Ala Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Leu Tyr Ser Val Ser Ala Leu Gln Asn Ser Glu Met Glu

165 170 175

Met Asp Cys Leu Leu Asp Glu Val Gly Asn Trp Asp Glu Thr Thr Ala

180 185 190

Ser Leu Leu Val Ser Lys Gly Ile Gln Asn Gly Leu Lys Pro Glu Val

195 200 205

Ile Ile Cys Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Lys Ala Ala

210 215 220

Glu Lys Ser Gly Leu Val Pro Gly Glu Asp Val Tyr Ile Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Pro Glu Ala Ile Glu Met Ile Lys Ala Gly Lys Leu Ala

245 250 255

Gly Thr Val Tyr Asn Asp Tyr Val Leu Gln Ser His Lys Ser Ala Asp

260 265 270

Ala Val Ile Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Asp Asn Glu His Tyr Ile Gly

275 280 285

Cys Asp Tyr Val Lys Val Asp Ile Asp Asn Ala Glu Ser Ile Ala Gly

290 295 300

Leu Thr Asn Thr Asp Glu Glu Asp Ile Asp Gly Gly Ser His His His

305 310 315 320

His His His

<210> 36

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_A（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 36

Met Lys Val Gly Val Cys Ile Tyr Gln Phe Ser Asp Asn Phe Met Thr

1 5 10 15

Leu Phe Arg Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Leu Val Glu Lys Gly Phe Ser

20 25 30

Lys Asp Asn Ile Thr Ile Val Asp Gly Ala Asn Asp Gln Ala Thr Gln

35 40 45

Thr Gly Gln Ile Asp Asn Phe Ile Thr Glu Gly Val Asp Val Leu Ile

50 55 60

Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Ser Ala Ala Thr Ile Thr Asp Lys Val

65 70 75 80

Val Ala Ala Gly Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Glu Gln Lys Arg Trp Ser Asp Asn Asn Trp Asp Val Thr Tyr Val

100 105 110

Gly Cys Asp Ala Arg Gln Ser Gly Thr Phe Gln Gly Glu Met Ile Ser

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Asp Thr Val Asp Leu Asn Gly Asn Gly Lys Ile Asp

130 135 140

Tyr Val Met Val Glu Gly Asp Pro Glu Asn Val Asp Ala Gln Tyr Arg

145 150 155 160

Thr Glu Tyr Ser Val Lys Ala Leu Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val Asn

165 170 175

Cys Leu Ser Asp Gln Val Gly Asn Trp Gln Gln Asp Gln Ala Gln Gln

180 185 190

Ile Val Ala Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Gly Asn Asp Val Glu Val Val

195 200 205

Phe Cys Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ala Ile Gln

210 215 220

Ser Ala Gly Arg Thr Val Gly Thr Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val Asp

225 230 235 240

Ala Leu Ser Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Ala Gly Thr Met Thr Gly

245 250 255

Thr Val Phe Asn Asp His Phe Ser Gln Ser His Ser Ala Ala Asp Ala

260 265 270

Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Ala Gly Asn Asp His Tyr Ile Gly Cys

275 280 285

Asp Tyr Val Lys Val Thr Lys Asp Asn Ala Gln Asp Val Leu Asp Met

290 295 300

Val Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 37

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> fprGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 37

Met Ser Ala Asn Ile Gly Val Cys Ile Tyr Gln Phe Ala Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Thr Leu Tyr Arg Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Leu Lys Asp Met Gly

20 25 30

Tyr Ser Val Thr Ile Met Asp Gly Lys Asn Asp Gln Asn Thr Gln Thr

35 40 45

Glu Gln Ile Asn Thr Phe Leu Gln Gln Gly Val Asp Val Leu Val Ile

50 55 60

Asn Pro Val Gln Thr Thr Ser Ala Gln Thr Ile Val Asp Thr Val Ser

65 70 75 80

Pro Ser Gly Thr Pro Ile Val Phe Ile Asn Arg Glu Pro Glu Glu Ser

85 90 95

Val Leu Asp Ser Tyr Lys Gly Lys Cys Cys Tyr Val Gly Ala Asp Ala

100 105 110

Arg Gln Ser Gly Thr Tyr Gln Gly Glu Leu Ile Leu Ala Thr Asp Thr

115 120 125

Gln Gly Asp Ile Asn Gly Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Ile Met Cys Lys

130 135 140

Gly Asp Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gln Tyr Arg Thr Glu Tyr Ser Ile

145 150 155 160

Lys Ala Leu Thr Asp Ala Gly Lys Glu Val Glu Cys Leu Tyr Glu Tyr

165 170 175

Leu Asp Asn Trp Asp Gln Thr Thr Ala Gln Gln Asp Val Ala Asn Ala

180 185 190

Leu Ser Gln Tyr Gly Glu Lys Ile Glu Val Val Phe Cys Asn Asn Asp

195 200 205

Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ser Ile Gln Gln Ala Gly Arg Thr

210 215 220

Val Gly Lys Asp Val Tyr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Val Glu Ala

225 230 235 240

Val Gln Asn Val Val Asp Gly Asn Met Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp

245 250 255

Asp Val Gly Gln Ala Thr Lys Ala Ala Glu Ala Thr Lys Leu Phe Val

260 265 270

Glu Gly Lys Asp Val Glu Lys Tyr Tyr Trp Val Asp Tyr Val Lys Val

275 280 285

Thr Lys Asp Asn Ala Ser Gln Tyr Leu Lys Glu Asp Gly Gly Ser His

290 295 300

His His His His His

305

<210> 38

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cljGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 38

Met Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Trp Ile

1 5 10 15

Thr Glu Leu Lys Asn Glu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Gly Lys Ala Arg

20 25 30

Val Asp Ile Trp Asn Gly Asp Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp Lys

35 40 45

Ile Asn Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asn Val Leu Asp Ile Asn Pro

50 55 60

Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Cys Lys Lys Ala

65 70 75 80

Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp Met

85 90 95

Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser

100 105 110

Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His Pro

115 120 125

Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Thr Arg

130 135 140

Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Lys

145 150 155 160

Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met Trp

165 170 175

Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Gly Pro Asn Phe Asp Cys Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu

195 200 205

Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly Lys

210 215 220

Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys Ala

225 230 235 240

Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala Lys

245 250 255

Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly Lys

260 265 270

Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Val Thr Asp Gly Lys Tyr

275 280 285

Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp Ala

290 295 300

Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310

<210> 39

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cauGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 39

Met Glu Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Trp

1 5 10 15

Ile Thr Glu Leu Lys Asn Glu Met Tyr Lys Val Ser Asn Gly Lys Ala

20 25 30

Arg Val Asp Ile Trp Asn Gly Asn Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Ser Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asp Val Leu Asp Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Cys Lys Lys

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp

85 90 95

Val Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His

115 120 125

Pro Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Met

130 135 140

Arg Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu

145 150 155 160

Glu Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met

165 170 175

Trp Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Gly Pro Asn Phe Asp Cys Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala

195 200 205

Leu Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly

210 215 220

Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys

225 230 235 240

Ala Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala

245 250 255

Lys Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly

260 265 270

Lys Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Ile Thr Asp Gly Lys

275 280 285

Tyr Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp

290 295 300

Ala Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 40

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_B（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 40

Met Lys Ser Ile Lys Ile Gly Ile Ser Val Tyr Asp Gln Tyr Asp Thr

1 5 10 15

Phe Val Ser Glu Met Met Lys Asp Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Lys Lys

20 25 30

Glu Glu Glu Thr Gly Val Ala Ile Asn Ile Asp Thr Tyr Asn Ala Ser

35 40 45

Ala Ser Gln Ser Thr Gln Asn Ser Gln Val Glu Asn Met Ile Thr Glu

50 55 60

Gly Cys Asp Val Ile Cys Val Asn Leu Val Asp Arg Thr Asp Pro Thr

65 70 75 80

Ala Ile Ile Asp Leu Ala Glu Lys Asn Asn Ile Pro Val Ile Phe Phe

85 90 95

Asn Arg Glu Leu Val Glu Glu Asp Leu Glu Arg Trp Thr Arg Leu Tyr

100 105 110

Tyr Val Gly Ala Gln Ala Phe Glu Ser Gly Ile Met Gln Gly Glu Leu

115 120 125

Ala Ala Glu Ala Phe Leu Thr Asp Gln Ser Leu Asp Lys Asn Gly Asp

130 135 140

Gly Ile Phe Gln Tyr Val Val Leu Glu Gly Glu Ala Gly His Gln Asp

145 150 155 160

Ala Ile Val Arg Thr Glu Tyr Ser Val Ser Thr Met Ile Asp Ser Gly

165 170 175

Val Glu Val Glu Lys Leu Gly Tyr Ala Ile Ala Asn Trp Asn Arg Ala

180 185 190

Gln Ala Gln Thr Lys Met Ala Gln Leu Met Ser Gln Phe Gly Asp Ser

195 200 205

Ile Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile

210 215 220

Asp Ala Leu Lys Ala Ser Gly Leu Thr Lys Asp Glu Trp Pro Ala Val

225 230 235 240

Ile Gly Ile Asp Gly Thr Asp Val Gly Leu Glu Ala Val Lys Asn Lys

245 250 255

Glu Met Ile Gly Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Asp Ala

260 265 270

Met Leu Asn Leu Ala Tyr Glu Leu Ser Thr Gly Ser Asp Leu Ser Asp

275 280 285

Leu Asn Leu Ile Asp Gly Lys Tyr Ile Arg Leu Pro Tyr Ala Arg Val

290 295 300

Thr Cys Asp Asp Val Asp Ser Tyr Met Glu Gly Asp Thr Glu Gly Gly

305 310 315 320

Ser His His His His His His

325

<210> 41

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> erhGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 41

Met Lys Thr Tyr Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Asn

1 5 10 15

Phe Met Thr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Ala Ser Tyr Phe Lys Glu Val

20 25 30

Gly Glu Lys Asp Gly Asn Thr Tyr Lys Leu Asp Ile Gln Asp Gly Lys

35 40 45

Gln Asp Gln Ala Asn Gln Thr Glu Gln Ile Asn Asn Phe Ile Ala Gln

50 55 60

Gly Lys Asp Leu Ile Ile Ala Asn Met Val Asp Pro Thr Ala Ala Gly

65 70 75 80

Ser Ile Ile Asn Ser Ala Lys Ala Lys Glu Ile Pro Val Val Phe Ile

85 90 95

Asn Arg Glu Pro Glu Thr Gln Glu Leu Glu Ile Trp Pro Gly Lys Thr

100 105 110

Thr Tyr Val Gly Ala Asp Ala Thr Gln Ser Gly Thr Ile Gln Gly Tyr

115 120 125

Met Ile Ala Asn Leu Glu Asn Lys Gly Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser

130 135 140

Val Ser Tyr Ile Thr Leu Met Gly Asp Pro Ala Asn Val Asp Ala Lys

145 150 155 160

Gln Arg Thr Glu Tyr Ser Val Lys Gly Leu Glu Glu Lys Gly Val Lys

165 170 175

Thr Asn Ala Leu Ala Gln Pro Tyr Gln Ala Asn Trp Asp Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gln Glu Phe Thr Ala Asn Ala Leu Glu Gln Phe Gly Asn Lys Leu

195 200 205

Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp Gly Met Ala Val Gly Ala Val Thr

210 215 220

Ala Ile Glu Ala Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Asp Ile Phe Val Val

225 230 235 240

Gly Val Asp Ala Ile Pro Asp Ala Ile Glu Leu Leu Lys Gly Gly Lys

245 250 255

Leu Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp His Phe Asn Gln Ser His Thr Ala

260 265 270

Val Asp Val Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gly Lys Asp Val Ser Ala Tyr

275 280 285

Tyr Trp His Asp Tyr Val Gly Val Thr Lys Pro Glu Glu Ala Glu Leu

290 295 300

Lys Arg Ala Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val Glu Glu Ala Val Lys Arg

305 310 315 320

Tyr Ala Glu Arg Asp Ala Gln Gly Gly Ser His His His His His His

325 330 335

<210> 42

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ereGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 42

Met Lys Gln Ile Tyr Ile Gly Val Thr Cys Tyr Asp Gln Lys Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Gly Glu Leu Ile Glu Thr Phe Lys Lys Glu Cys Ala Ser Leu

20 25 30

Asp Thr Asp Lys Tyr Asp Ile Ser Met Thr Ile Met Asp Ala Ala Gly

35 40 45

Ser Gln Arg Ala Gln Asp Asp Gln Val Gln Glu Met Ile Glu Asp Gly

50 55 60

Cys Asn Val Leu Cys Ile Asn Leu Ala Asp Arg Thr Asp Leu Ser His

65 70 75 80

Ile Ile Asn Ala Ala Met Glu Lys Asp Ile Pro Ile Ile Phe Phe Asn

85 90 95

Arg Glu Pro Val Asp Glu Asp Leu Asn Arg Trp Asp Lys Leu Tyr Tyr

100 105 110

Val Gly Ala Lys Ala Lys Gln Ser Gly Gln Met Gln Gly Glu Leu Ile

115 120 125

Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Asn Pro Gly Val Asp Lys Asn Gly Asp Gly

130 135 140

Arg Ile Gln Tyr Val Ile Leu Glu Gly Glu Met Gly His Gln Asp Ala

145 150 155 160

Ile Val Arg Thr Glu Ser Val Thr Glu Ser Met Lys Asn Asn Gly Leu

165 170 175

Gln Ile Glu Lys Leu Ser Cys Gln Ile Ala Asn Trp Asn Arg Ala Gln

180 185 190

Ala Gln Asn Arg Met Thr Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Lys Asn Ser Ile

195 200 205

Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Asp

210 215 220

Ala Tyr Glu Lys Leu Gly Val Thr Glu Ser Asn Val Pro Ala Phe Phe

225 230 235 240

Gly Val Asp Gly Thr Asp Asp Gly Leu Glu Ala Val Gln Gln Ser Lys

245 250 255

Leu Ala Ala Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Met Ala Met

260 265 270

Ala Gln Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Thr Gly Gly Ser Met Lys Asn Ile

275 280 285

Lys Phe Glu Asp Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Glu Lys Val Thr

290 295 300

Pro Asp Asn Val Asn Glu Phe Val Lys Asp Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 43

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 43

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 44

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cobGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 44

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Cys Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Ile Met Gln Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Arg Val Lys Cys Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Glu Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 45

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> chyGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 45

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Cys Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asn Gly Ile Met Glu Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Lys Thr Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Arg Ile Glu Ala Val Phe Cys Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asn Gly Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Asp Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 46

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pspGGBP（信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 46

Met Val Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly

1 5 10 15

Val Arg Asn Ala Met Ser Asp Ala Ala Asn Gly Val Ala Lys Leu Asp

20 25 30

Ile Val Asp Ser Gln Asn Ala Gln Pro Thr Gln Asn Glu Lys Ile Asp

35 40 45

Leu Phe Ile Ser Lys Lys Tyr Ser Ser Met Ile Ile Asn Pro Val Asp

50 55 60

Arg Thr Ala Ala Gly Val Ile Ile Asp Lys Ala Lys Thr Ala Asn Thr

65 70 75 80

Pro Val Val Phe Leu Asn Arg Glu Pro Ile Ala Glu Asp Met Asn Lys

85 90 95

Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Glu Ser Gly Thr

100 105 110

Ile Ser Gly Gln Leu Ile Val Asp Tyr Trp Lys Ala Asn Pro Lys Ala

115 120 125

Asp Lys Asn Gly Asp Gly Lys Leu Gln Tyr Val Leu Leu Gln Gly Glu

130 135 140

Pro Gly His Gln Asp Ala Glu Leu Arg Thr Lys Phe Ser Val Gln Ala

145 150 155 160

Ile Gln Asp Ala Gly Ile Glu Val Glu Ala Leu Ala Val Asp Thr Ala

165 170 175

Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Thr Phe Leu Ala

180 185 190

Ser His Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Leu Ala Asn Asn Asp Asp Met

195 200 205

Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Ser Gly

210 215 220

Asp Lys Tyr Met Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val

225 230 235 240

Gln Ala Leu Glu Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala

245 250 255

Lys Ser Gln Gly Lys Ala Ser Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Ser Lys

260 265 270

Gly Glu Ala Pro Asn Lys Glu Asn Thr Gly Phe Asp Ile Thr Asp Gly

275 280 285

Lys Tyr Val Trp Ile Ala Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ala

290 295 300

Asp Ala Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 47

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cobGGBP.W181C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的cobGGBP的信号传导cys突变体）

<400> 47

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Ala Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Ile Met Gln Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Arg Val Lys Ser Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Cys Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Glu Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 48

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> chyGGBP.W181C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的chyGGBP的信号传导cys突变体）

<400> 48

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Ala Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asn Gly Ile Met Glu Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Lys Thr Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

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180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Arg Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asn Gly Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

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Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

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Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

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His His His His His

325

<210> 49

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP11C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 49

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Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 50

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP16C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 50

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1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 51

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 51

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1 5 10 15

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35 40 45

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130 135 140

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145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 52

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP42C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 52

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1 5 10 15

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Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 53

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP67C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 53

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

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130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 54

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP91C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 54

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

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50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

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Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

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130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 55

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP92C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 55

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

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Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 56

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP111C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 56

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

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130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 57

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP148C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 57

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

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Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

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His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Cys Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 58

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP151C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 58

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly Cys Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 59

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP152C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 59

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Cys Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 60

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP181C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 60

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Cys Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 61

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 61

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

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85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 62

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP183C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 62

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

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85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Cys Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 63

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP257C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 63

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Cys Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 64

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP259C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 64

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Cys Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 65

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP300C（信号肽被M置换并且在C-末端具有

GGSHHHHHH的ttGGBP cys突变体）

<400> 65

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Cys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 66

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.1（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 66

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 67

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.2（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 67

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Pro Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Pro Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 68

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.3（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 68

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Asn

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 69

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.4（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 69

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly Gln Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 70

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.5（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 70

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Ala Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

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<210> 71

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.6（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 71

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 72

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.7（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 72

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305 310 315 320

His

<210> 73

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.8（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 73

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1 5 10 15

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165 170 175

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180 185 190

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245 250 255

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275 280 285

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290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 74

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.9（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 74

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Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

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275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 75

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.10（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 75

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1 5 10 15

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145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

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275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 76

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.11（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 76

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

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Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

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130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Ala

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 77

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.19（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 77

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

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Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asp Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

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Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 78

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.20（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 78

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

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195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

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Leu Ser Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

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275 280 285

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Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 79

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.21（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 79

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

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130 135 140

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Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Ala Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 80

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.22（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 80

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

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Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Asn Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 81

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.23（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 81

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

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50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

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His

<210> 82

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.24（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 82

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100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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195 200 205

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275 280 285

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Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 83

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.25（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 83

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1 5 10 15

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275 280 285

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305 310 315 320

His

<210> 84

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.26（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 84

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 85

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.27（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 85

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

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Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 86

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.28（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 86

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

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Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

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145 150 155 160

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165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Trp Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Tyr Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 87

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.29（亲和力调整突变体，17C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 87

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Cys Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

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Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

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Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

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165 170 175

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180 185 190

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Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

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225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

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260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 88

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 88

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

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Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

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130 135 140

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Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 89

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.1（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 89

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

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Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 90

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.3（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 90

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

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85 90 95

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Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

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130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Asn Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 91

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.4（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 91

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Met Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 92

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.5（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 92

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

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<213> 人工序列

<220>

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信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

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<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.7（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

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<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

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<210> 96

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.9（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

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<210> 97

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.3（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

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275 280 285

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290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 98

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.4（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

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275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 99

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.5（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 99

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Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 100

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.6（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 100

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Asn

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290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 101

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.7（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 101

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

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130 135 140

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165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 102

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.8（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 102

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

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Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

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130 135 140

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165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

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Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

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<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.9（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 103

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asn Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Gln Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 104

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GGSHHHHHH标签序列

<400> 104

Gly Gly Ser His His His His His His

1 5

<210> 105

<211> 1328

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> csaGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 105

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tggaaacagg 180

tccaaaaatt ggtgtaagta tatacaggta cgacgacacc ttcatgaagc tgtatcgcca 240

ggaactgaag cagtacctgg aagaaaccta ccatgcggaa gtgatcatgc gcaatgctgg 300

tggtgaccag aaagagcagg acaaacaggt gaaccagttc atctcagacg gatgtgacgg 360

gatcatagtg aatccggtgg aaattccggc agctcaggag cttgcggatg cgtgcagtcg 420

tgcgggaatc ccccttgtgt tcataaaccg tgaacccaag gaagaagaac agaaacgttg 480

gcgcgaaaag cagatggcag tttcgtgtgt aggcaccgat agccgtcagg cgggtaccta 540

tcagggcgaa atcatcctgg aaaccctgaa caaaggcgac ttcaacggtg atggtgtcgt 600

gtcctacgtg atgctcatgg gtgagaaggg caatgaggac tcgcaatacc ggacggaata 660

cagcatcaaa gcgctggaag aaggcggcat gaaaaccgaa gagctgtttt cgggcaacgg 720

caactggaac aaagacgaag gcaagaaact ggcgaaacag gcgcttgcct cttggggtaa 780

ccgcatagag gtgttcttct gcaacaacga ttcgatggcg aatggtgcgt tggaagcagt 840

ggaggaggca ggtaggatcc caggcaaaga catctacctg gttggtgtgg atgcgttgca 900

ggatacggtg acctacatca aagaaggccg tatgaccgga acagtcctga acgaccacga 960

aggtcagagc cagatggcag ctgatacgct gaagaaaatg atcgatggag agtcagtgga 1020

gactcggtat caggtggact acatcaaagt gactgccatc tctacgtttc aaactttaaa 1080

aggtgaagat ggaggaagcc atcatcatca tcatcattaa taatgaaagg gcgatatcca 1140

gcacactggc ggccgttact agtggatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag 1200

ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 1260

ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggag cgactcccac ggcacgttgg 1320

caagctcg 1328

<210> 106

<211> 1349

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bprGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 106

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tggatgcaaa 180

agttggtgta tgtatatatc aaaaatcgga caacttcatg tcgctcttct ccagcgaact 240

ggtgaagtac ctggtgagtc gtgggttcag caaggacaac atcatcctgt acgactccaa 300

caacgacgag aacgtgcagt tgtcgcaggt ggaagagctc attgcgtctg ggatcaatgc 360

gctcatcatc aacccagtga actcgagtgt tgctcactcg atcacggaca tggcatctgc 420

ctcgaacatc ccgttagtct acatcaaccg tgaaccgtct ggtgacgaag agaaccgttg 480

ggagatgtat cagctgaacg tgtgctatgt cggctgtgat gcacgccaat ctggcatcta 540

ccagggggaa atcctcctgt ctctgggcaa aaacaagctg gatcacaacg gagatggcaa 600

gatccagtac ttcatgatcg aaggtgcacc ggagaacatc gatgcaggct atcgtacgct 660

gtactccgtt tctgctctgc agaacagcga aatggagatg gattgcctgc tggatgaagt 720

gggcaactgg gatgaaacca ctgccagtct gctggtctcc aagggcatcc agaatgggct 780

caaaccggag gtcatcatct gcaacaacga cgcgatggca ctgggtgcca tcaaagcggc 840

ggaaaaatcg ggtctggttc cgggtgaaga cgtctacatc gtgggtgttg acgccttgcc 900

tgaagcgatc gaaatgatca aagcagggaa gctcgcaggt accgtgtaca acgactacgt 960

gctgcagtcc cacaaaagcg cagatgcggt catcaactac ctgaaaggga tcgacaacga 1020

gcactacatc ggttgcgatt acgtgaaagt ggatatcgac aacgcggaaa gcattgcggg 1080

gttgacaaat acagatgaag aagatattga tggaggaagc catcatcatc atcatcatta 1140

gtaataaaag ggcgatatcc agcacactgg cggccgttac tagtggatcc ggctgctaac 1200

aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc 1260

cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga 1320

gcgactccca cggcacgttg gcaagctcg 1349

<210> 107

<211> 1325

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_A示例性表达构建体（表2）

<400> 107

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaagttgg 180

tgtatgtatt taccaattta gtgacaactt catgacgctc ttccgtaccg aactggaaaa 240

ctacctggtg gaaaaaggct ttagcaagga caacatcacc atcgttgatg gcgctaacga 300

tcaggctacg cagactggcc agatcgacaa cttcatcacc gaaggggtgg atgtcctcat 360

catcaatccg gtcaacagca gcagtgcagc gacgattacc gataaagtgg tggcagcagg 420

cattccgctg gtctacatca accgagaacc ggatgaagaa gagcagaaac gctggagtga 480

caacaactgg gacgtgacgt acgtgggttg cgatgcgcgt cagtctggga cattccaggg 540

tgagatgatc agcgatcttg gcctggatac ggtcgatctg aacggaaacg ggaaaatcga 600

ctacgtcatg gtggaaggtg atccagagaa cgtggatgcc cagtatcgca cggaatactc 660

cgtgaaagca ctggaagatg cgggtctcga agtgaactgc ttgagcgatc aggttgggaa 720

ctggcagcag gatcaggcac agcagattgt ggcgaatgct ctcggtcagt atggcaacga 780

cgtagaggtt gtgttctgca acaacgacgc tatggcgtta ggtgccttac aggcgattca 840

gagcgcaggt cgtaccgttg gtactgacat ctacctggtt ggtgtggatg cgttgagcga 900

agcactggag gatgtgctgg ctggtaccat gaccggaact gtgttcaacg accacttcag 960

tcagtcccat agtgcggcag atgcggctat caactacatc acaggagctg gaaacgacca 1020

ctacatcggc tgcgattacg tgaaagtgac caaagacaac gcacaagatg tgttagatat 1080

ggttaaagga ggaagccatc atcatcatca tcattaatga taaaagggcg atatccagca 1140

cactggcggc cgttactagt ggatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 1200

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 1260

aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggagcga ctcccacggc acgttggcaa 1320

gctcg 1325

<210> 108

<211> 1307

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> fprGGBP 示例性表达构建体（表2）

<400> 108

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgtctgctaa 180

tattggagtt tgtatttatc aatttgccga caacttcatg accctctatc gtgctgacct 240

ggaaggctac ctgaaggaca tgggctattc cgtcaccatc atggacggga aaaacgacca 300

gaacacccaa accgagcaga tcaacacctt cctgcagcaa ggcgttgacg tgctggtcat 360

caacccagtt cagaccacta gtgcacagac catcgtagac accgtttctc cgtctggtac 420

cccaatcgtg ttcatcaacc gtgaacctga ggaaagcgtc ctggatagct acaagggcaa 480

gtgctgctac gtgggagctg atgctcggca gagtggtacg taccagggtg agctgatcct 540

ggcaaccgat acgcaaggcg acatcaacgg tgatggcaag atcacctaca tcatgtgcaa 600

aggcgatccg gagaacatcg acgcacagta ccgtaccgag tacagcatca aggcactgac 660

cgatgcaggc aaggaagtgg agtgcctgta cgagtacctg gacaactggg atcagaccac 720

tgcacagcaa gacgtggcta acgcactgtc ccagtatggc gagaagatcg aagtcgtctt 780

ctgcaacaac gacgctatgg cactgggcgc attgcagagc atccagcaag ctggtcgtac 840

cgttggcaaa gacgtctacc tggttggagt cgatgcgctg gtagaggctg tccagaacgt 900

tgtcgacggt aacatgaccg gaaccgtgct caacgacgac gttggtcagg caacgaaagc 960

tgcagaagcg accaagctgt tcgtggaggg caaagacgtg gagaagtact actgggtgga 1020

ctacgtcaaa gtcaccaagg ataatgcaag tcaatatctg aaagaagatg gaggaagcca 1080

tcatcatcat catcattagt aataaaaggg cgatatccag cacactggcg gccgttacta 1140

gtggatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 1200

caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 1260

ggaggaacta tatccggagc gactcccacg gcacgttggc aagctcg 1307

<210> 109

<211> 1322

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cljGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 109

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgccagttat 180

tggatttgtt gcttatgaat ttaacaacac gtggatcacc gaactgaaga acgagatcta 240

caaggtgtct agcggcaaag cgcgtgtgga catctggaac ggcgataaca tccagaccgt 300

tgagaacgac aagatcaacc tcttcatcaa ccgcaaagtg aacgtgctcg acatcaaccc 360

ggttgatgtc aacgcagctg gacagatcat cgaaaagtgc aaaaaagcga acattccgac 420

cgtgttcgtg aatcgccaac cgaaaaaaga ggatatggag aaatggaaca aagtgtacta 480

cgttggtgcc aaagccgaac agtcgggtac catccaaggg cagatgctcg tgaactactt 540

caaaggccat ccgactcagg atggcactat ccgctacatc atgctcaagg gtgaaacgcg 600

aaaccaggat gcggagaaac gcacccagta cagcatcaaa gcgctgaaag acagcggttt 660

caaggtgcag aaggttgcgg aagacaccgc aatgtgggat cgtacgaagg cacaggagaa 720

gatgacttcg ttcatatcct cctacggacc caacttcgac tgtgtgatag cgaacaacga 780

cgacatggcc ttaggagccg ttgatgccct caaagcggca ggctacttca acggcggcaa 840

atatgtgccg gtggttggtg tggatgccac tgctccggct gtcaaagcag tggaagacgg 900

aacgttgttc ggaactgtgc tgaacgatgc tgcgaaacag ggtgatgcgg cctttgatct 960

gtcgtacatc ctttccaaag ggaagatccc ggatgaaagc aacttcaagt acaaggtgac 1020

ggatggcaag tacatttgga tcgactacaa gatgatcact aaagaaaatg ttcaagatgc 1080

aaaaggagga agccatcatc atcatcatca ttagtgataa aagggcgata tccagcacac 1140

tggcggccgt tactagtgga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct 1200

gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg 1260

ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggagcgactc ccacggcacg ttggcaagct 1320

cg 1322

<210> 110

<211> 1325

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cauGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 110

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tggaaccagt 180

aattggtttt gttgcttatg agttcaacaa cacgtggatt accgaactga agaacgagat 240

gtacaaggtg tctaacggca aagcgcgtgt ggacatctgg aacggcaaca acatccagac 300

ggtcgagaac gacaagatct ccctgttcat caaccgcaaa gtcgacgttc tggacatcaa 360

cccggttgac gtgaacgcag ctggacagat catcgagaaa tgcaaaaaag cgaacattcc 420

gacggtgttc gtgaaccgtc aaccgaaaaa ggaagatgtg gaaaagtgga acaaagtcta 480

ctacgttggt gcgaaagccg aacagtctgg caccatacag ggacagatgc tggtgaacta 540

cttcaaaggg catccgaccc aggatggaac catccgctac atcatgctca aaggggaaat 600

gcgcaaccag gatgcggaga aacgcaccca gtacagcatc aaagccctgg aagattctgg 660

gttcaaggtc cagaaggtgg cagaagacac cgctatgtgg gatcgtacca aggctcagga 720

gaagatgact tcgttcatct cctcatacgg accgaacttc gactgtgtga tcgccaacaa 780

cgacgacatg gccttaggag ctgttgatgc cctgaaagct gcaggctact tcaacggcgg 840

caaatatgtg ccggtggttg gtgtggatgc tactgctccg gcagtgaaag ctgtcgagga 900

tgggacactg ttcggaactg tcctgaacga tgcagcgaaa cagggtgatg cggcctttga 960

tctgtcgtac atcctttcca aggggaagat tccggatgaa agcaacttca agtacaagat 1020

cacggatggc aagtacattt ggatcgacta caagatgatt actaaagaaa atgttcaaga 1080

tgctaaagga ggaagccatc atcatcatca tcattagtaa taaaagggcg atatccagca 1140

cactggcggc cgttactagt ggatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 1200

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 1260

aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggagcga ctcccacggc acgttggcaa 1320

gctcg 1325

<210> 111

<211> 1361

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_B示例性表达构建体（表2）

<400> 111

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaatcaat 180

aaaaattggt ataagtgttt atgatcagta tgacaccttt gtgagcgaaa tgatgaaaga 240

cttcaacgat tatgcgacca agaaagaaga agagactggt gttgccatca acatcgacac 300

atacaacgct agtgcaagcc agtctacgca gaacagtcag gtcgagaaca tgatcacgga 360

aggctgcgat gtgatctgtg tcaacctggt tgacaggacg gatccaactg cgatcatcga 420

tcttgcggag aaaaacaaca tccccgtgat ttttttcaac cgtgaactgg tggaggaaga 480

cctggaacgt tggacaaggc tgtactacgt tggtgcacag gcgttcgaaa gcggcatcat 540

gcagggtgaa ctggctgcag aagcctttct gaccgatcag agcctggaca agaacggaga 600

tgggatcttc cagtacgtgg tgcttgaagg tgaggctgga caccaggatg ccatcgtgcg 660

tacggagtac tcggttagca ccatgatcga tagcggagtg gaagtggaga aactgggcta 720

cgcaatcgcc aactggaatc gtgcacaggc tcagacgaaa atggcgcagc tgatgtccca 780

gtttggtgac agcatagagc tggtcatcgc caacaacgac gacatggctc taggagccat 840

agatgcgctc aaggcgtctg gtctgaccaa ggacgaatgg ccggcagtca ttgggatcga 900

tggaacggat gtgggcttag aggcggtcaa gaacaaagag atgatcggta ccgtgtacaa 960

cgataaggaa ggccaagcgg atgcgatgct gaacctggcg tacgaactga gtaccggtag 1020

cgatctgtcg gatctgaacc tgatcgatgg caaatacatc cgtctgcctt atgcgcgagt 1080

gacgtgtgat gatgtggata gttatatgga aggtgatacc gaaggaggaa gccatcatca 1140

tcatcatcat taataatgaa agggcgatat ccagcacact ggcggccgtt actagtggat 1200

ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 1260

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 1320

actatatccg gagcgactcc cacggcacgt tggcaagctc g 1361

<210> 112

<211> 1388

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> erhGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 112

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaaactta 180

taatattggt gttgcaattt ataagttcga tgacaacttc atgacgctgt atcgtgaaga 240

actggcgagc tacttcaaag aagtgggtga gaaagacggc aacacgtaca aactggacat 300

ccaggatggc aagcaggacc aagctaacca gaccgaacag atcaacaact ttatcgcaca 360

gggtaaagac ctgatcatcg cgaacatggt cgatccgacc gcagcgggta gcatcatcaa 420

cagcgcgaaa gcgaaagaaa tcccggtggt cttcatcaac cgagaaccgg aaacccagga 480

actggaaatc tggccgggca aaaccaccta cgttggtgcg gatgcgaccc agtcaggcac 540

cattcagggc tacatgatcg cgaacttgga gaacaaaggc gacatcgacg gtgatgggag 600

tgtcagctac atcacgctga tgggagatcc tgcgaacgtg gatgcgaaac agcgtaccga 660

atacagcgtg aaaggcctgg aagagaaagg cgtgaaaacc aacgcgcttg cgcagccgta 720

ccaagcgaac tgggataccg cgaaaggcca ggaattcacc gcaaacgcgc tggaacagtt 780

tggcaacaaa ctggaagtgg tgttcgcgaa caacgatggc atggcggttg gtgcggtgac 840

cgcgattgaa gctgcgggac gcaaagtcgg agaggacatc ttcgtggttg gtgtcgatgc 900

cattccggat gccatcgagc tcctgaaagg cggtaaactg accggtactg tcctcaacga 960

ccacttcaac cagagccata ccgcggtgga tgtggcactg gaactgctgc agggcaaaga 1020

tgtgagcgcc tactactggc atgactacgt tggcgtgacc aaaccggaag aagcggaact 1080

gaaacgtgca gaagcacgca aagagaccgt ggaagaagcg gttaaacgtt atgcagaacg 1140

tgatgctcaa ggaggaagcc atcatcatca tcatcattaa taatgaaagg gcgatatcca 1200

gcacactggc ggccgttact agtggatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag 1260

ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 1320

ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggag cgactcccac ggcacgttgg 1380

caagctcg 1388

<210> 113

<211> 1355

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ereGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 113

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacagat 180

ttatattggt gtaacttgtt atgatcagaa ggataccttc attggagagc tgatcgagac 240

cttcaagaag gaatgcgcgt ctctggatac cgacaagtac gacatcagca tgaccatcat 300

ggatgctgca ggtagccagc gtgcacagga tgatcaggtg caggagatga tcgaagacgg 360

ttgcaacgta ctgtgcatca acctggcaga tcgtaccgac ttgtcgcaca tcatcaacgc 420

ggcgatggag aaggatatcc cgatcatctt cttcaaccga gaaccggtgg atgaggatct 480

caaccgttgg gacaagctgt actacgtagg agcaaaggcg aaacagagcg gtcagatgca 540

aggagagctc attgcggact acatcaaaaa caacccgggt gtggacaaga acggtgatgg 600

gaggatccag tacgtcatcc tggaagggga aatgggtcat caggatgcca tcgtacggac 660

tgaaagcgtg accgaatcga tgaagaacaa cggtctgcag atcgagaagc tgagctgcca 720

gatcgcgaac tggaatcgag ctcaagctca gaaccggatg acgcagctga ttggccagta 780

caagaactcg atcgagctgg tgatcgccaa caacgatgcc atggctctag gtgcgatcga 840

tgcctacgag aaactcggtg taacggaaag caacgttcca gcgtttttcg gtgtggatgg 900

tacagacgat ggactggaag cagtgcagca gagcaagctt gcggcaacgg tgtacaacga 960

caaggaaggt caggcgatgg cgatggctca gttggcctat ctcgctgcaa ctggtggaag 1020

catgaagaac atcaaattcg aagacaaaaa gtatgtgtat ctgccgtatg agaaggtgac 1080

accggataac gttaatgaat ttgttaaaga tgaacaagga ggaagccatc atcatcatca 1140

tcattgataa taaaagggcg atatccagca cactggcggc cgttactagt ggatccggct 1200

gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca 1260

taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata 1320

tccggagcga ctcccacggc acgttggcaa gctcg 1355

<210> 114

<211> 1343

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 114

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaatt 180

aaatattggt gttgcgattt ataaattcga tgacaccttc atgaccggtg ttcggaatgc 240

gatgactgcg gaagcgcaag gcaaggcgaa gctcaacatg gttgacagcc agaacagcca 300

accaacccag aacgatcagg ttgacctgtt catcacgaag aagatgaacg cacttgcgat 360

caacccggtg gatcgcactg cagcaggcac catcatcgac aaagccaaac aggccaacat 420

tccggtggtc ttcttcaacc gtgaaccgct gccggaagac atgaagaaat gggataaagt 480

gtactatgtg ggtgcgaaag cggaacagag tggcattttg cagggtcaga tcatggctga 540

ctactggaaa gcccatcctg aagcggacaa gaaccatgat ggcgtgatgc agtacgtcat 600

gctgatgggt cagccaggtc atcaggatgc gatactgcgt acacagtaca gcatccaaac 660

ggtgaaagat gcaggcatca aagtgcagga actggccaaa gactacgcaa actgggatcg 720

cgttaccgcg catgacaaaa tggcagcgtg gttgtcgagc tttggcgaca agatcgaagc 780

cgtcttctgc aacaacgacg acatggcgtt gggtgccatc gaagcgctga agtctgcagg 840

ctacttcacc ggcaacaaat acatcccggt tgtgggcgtg gatgcgaccg caccgggcat 900

tcaggcgatc aaggatggta ccctgttggg aaccgtgttg aacgatgcga agaaccaggc 960

gaaagccacc ttcaacatcg cctacgaact ggctcagggc attaccccga cgaaggacaa 1020

catagggtac gacatcacag acgggaagta cgtgtggatt ccgtacaaaa agatcacgaa 1080

agacaatata tcagatgctg aacaaggagg aagccatcat catcatcatc attagtaata 1140

aaagggcgat atccagcaca ctggcggccg ttactagtgg atccggctgc taacaaagcc 1200

cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg 1260

gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggagcgact 1320

cccacggcac gttggcaagc tcg 1343

<210> 115

<211> 1355

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cobGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 115

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacctta 180

tataggtgtt gctatatata agtttgacga caccttcatg accggtgtgc gtaacgcgat 240

tgcgaaagaa ggcgaaggca aagcgaaact ggatttcgtc gattgccaga acagccagtc 300

gacccagaac gacaagatcg acctgttcat caccaagaag gtcgatgcac tggcgatcaa 360

cccagttgat cgcacagcag caggtgtgct catcgacaag gcgaaacagg cgaacatccc 420

tgttgtcttc ttcaaccgtg aaccgcttcc ggaagacatg aagaaatggg ataaggtgta 480

ctacgtgggt gcgaaagcgg aacagagtgg cactctgcaa ggcgaaatca tggcggagta 540

ctggaaaagc catccggaag cggacaaaaa ccatgatggc attatgcagt atgtcatgat 600

cactggtgaa cctggacacc aggatgccat actccggact gagtactcca taaaggcggt 660

ggaagcggct ggtatccgcg tgaaatgcct ggcgcaggat accgcgatgt gggatcgagt 720

gaaaggccag gaaaagatgc aggcattcct tgcgagcttt ggcgacaaaa tcgaagccgt 780

gttctgcaac aacgacgaca tggcactggg tgcgattgaa gcgctgaaag cggctggcta 840

cttcaaggat ggcaagtatg tgccggttgt gggcgtggat gcgaccaccc cgggtctgca 900

ggcgctggaa gaaggtaccc tgcttggtac cgtgttgaac gatgcgaaag cgcaaggtaa 960

ggctactttc aacctcgctt acgtgctggc gaaaggcgaa aaaccgacca aagaaaacgt 1020

gggtttcgaa atcaccgatg gcaaatacat ctgggttccg taccagaaag tgaccaaaga 1080

caacctggaa gaaatgaaaa aatatgtgaa tgaacaggga ggaagccatc atcatcatca 1140

tcattaataa tgaaagggcg atatccagca cactggcggc cgttactagt ggatccggct 1200

gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca 1260

taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata 1320

tccggagcga ctcccacggc acgttggcaa gctcg 1355

<210> 116

<211> 1355

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> chyGGBP示例性表达构建体（表2）

<400> 116

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacctta 180

tattggtgtt gcaatatata agtttgacga cacattcatg accggtgttc gcaacgcgat 240

tgcgaaagaa ggcgaaggca aagcgaaact ggactttgtc gattgccaga acagccagtc 300

gacccagaac gacaagatcg acctcttcat aaccaagaaa gtggacgctt tggcgatcaa 360

tccggttgat cgtaccgcgg caggtgtgtt gatcgacaag gcgaaacagg cgaacatccc 420

agtcgtcttc ttcaaccgag agccgttacc ggaagatatg aagaaatggg ataaggtgta 480

ctacgttggt gccaaagctg aacagtcagg cactctgcag ggggaaatca tggcagagta 540

ctggaaaagc catccggaag ccgacaagaa ccacaacggc atcatggaat acgtgatgat 600

caccggtgaa ccgggtcatc aggatgcgat cttgcgtacc gagtactcga tcaaagcggt 660

tgaggctgcg ggtatcaaga ccaaagcgct tgctcaggat acagccatgt gggatagggt 720

gaaaggtcag gagaagatgc aggcgttcct tgcgagcttt ggcgatcgga ttgaggctgt 780

attctgcaac aacgacgata tggcactggg tgccattgaa gcgctcaaag cagcagggta 840

cttcaagaac ggcaaataca tccctgttgt gggtgtggat gcgaccactc cgggtctgca 900

ggcgctggaa gaaggtaccc tgctgggtac cgtcttgaac gacgccaaag ctcagggtaa 960

ggctacgttc aacttggcgt atgtgctggc gaaaggcgaa aaaccgacca aagagaatgt 1020

cggcttcgac atcacggatg gcaagtacat ttgggtgccg taccagaaag tgaccaagga 1080

caacttggaa gagatgaaaa aatacgtaaa tgaacaagga ggaagccatc atcatcatca 1140

tcattaataa tgaaagggcg atatccagca cactggcggc cgttactagt ggatccggct 1200

gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca 1260

taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata 1320

tccggagcga ctcccacggc acgttggcaa gctcg 1355

<210> 117

<211> 1328

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pspGGBP23示例性表达构建体（表2）

<400> 117

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tggttggtgt 180

agcaatttat aagtttgatg ataccttcat gacaggcgtt cgaaacgcga tgagcgatgc 240

agcgaacggt gtagcgaaac tggacatcgt ggattcgcaa aacgcccaac cgacccagaa 300

cgagaaaatc gacctgttca tcagcaaaaa gtacagcagc atgatcatca accccgttga 360

tcgtaccgca gctggcgtca tcatcgacaa agccaaaacc gccaataccc cggtggtttt 420

cctgaatcgc gaaccgattg cggaagacat gaacaaatgg gacaaggtgt actatgtcgg 480

tgccaaagcg gaggaaagcg gtaccatcag cggtcagctg atcgtggact actggaaagc 540

gaacccgaaa gccgacaaga acggagatgg caaactgcag tacgtgctgt tgcagggtga 600

accgggtcat caggatgccg aactgcgtac caagttcagc gttcaggcta tccaggatgc 660

aggcatcgag gtggaagcgt tagcggtgga taccgctatg tgggatcgtg tgaaagggca 720

ggaaaagatg cagaccttcc ttgcgtctca tggcgacaaa atcgaagcgg ttctggcgaa 780

caacgacgat atggcgttag gagcgattga ggccttgaaa gctgcaggct acttcagtgg 840

cgataagtac atgccggtgg ttggtgtgga tgcaaccgct ccagccgttc aggcgctgga 900

agatggcaca ttgctcggaa ccgtgctcaa cgacgcgaaa agccagggca aagcgagtgt 960

tgcgatagca gcggcgcttt cgaagggtga agcgccgaac aaagagaaca ccggtttcga 1020

catcaccgat gggaagtacg tgtggattgc gtacaagaag atcaccaaag ataatattgc 1080

agatgctaaa ggcggcagcc atcatcatca tcatcattaa tgataaaagg gcgatatcca 1140

gcacactggc ggccgttact agtggatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag 1200

ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 1260

ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggag cgactcccac ggcacgttgg 1320

caagctcg 1328

<210> 118

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP11C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 118

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt gcaaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 119

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP16C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 119

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgactgcttc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 120

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 120

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 121

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP42C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 121

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agtgctcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 122

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP67C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 122

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caacccttgc gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 123

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP91C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 123

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaact gcgaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 124

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP92C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 124

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc ggtgcccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 125

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP111C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 125

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagt gcgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

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gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 126

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP148C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 126

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

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acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc tgcccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 127

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP151C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 127

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggt gccaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 128

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP152C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 128

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc actgcgacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 129

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP181C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 129

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcct gctgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 130

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 130

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 131

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP183C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 131

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attggtgccg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 132

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP257C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 132

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtctgc aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 133

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP259C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 133

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aactgcgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 134

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP300C示例性半胱氨酸扫描突变体表达构建体（表3）

<400> 134

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatattgca aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 135

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.1示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 135

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 136

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.2示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 136

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatccgaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc acccggacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 137

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.3示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 137

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacaactgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg cgatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 138

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.4示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 138

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc agcaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 139

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.5示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 139

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgcgacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 140

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.6示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 140

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgaaacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 141

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.7示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 141

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga caacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 142

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.8示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 142

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacaactgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 143

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.9示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 143

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacagctgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 144

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.10示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 144

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgcgg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 145

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.11示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 145

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccgcgg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 146

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.19示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 146

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg gatgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 147

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.20示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 147

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg agcgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 148

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.21示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 148

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg gcggacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 149

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.22示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 149

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacaaca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 150

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.23示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 150

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgaccaga aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 151

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.24示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 151

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgaccgca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 152

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.25示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 152

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacaaaa aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 153

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.26示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 153

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgactgga aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 154

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.27示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 154

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacttta aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 155

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.28示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 155

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgactata aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 156

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP17C.29示例性亲和力调整突变体（17C背景）

表达构建体（表6）

<400> 156

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacatgc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgggatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacagca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 157

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 157

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 158

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.1示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 158

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc accaagacag catcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 159

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.3示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 159

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc accaagacaa catcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 160

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.4示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 160

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc accaagacat gatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 161

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.5示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 161

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc agcaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 162

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.6示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 162

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccgggga accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 163

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.7示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 163

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggt ttcaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 164

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.8示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 164

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga caacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 165

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.9示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 165

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc accaagactt tatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 166

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.3示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 166

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 167

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.4示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 167

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc gaaccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 168

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.5示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 168

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatccgaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc acccggacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 169

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.6示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 169

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacaacttc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg cgatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 170

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.7示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 170

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc agcccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 171

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.8示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 171

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga cgacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaaca aagaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc aaaccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 172

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.9示例性亲和力调整突变体（182C背景）

表达构建体（表6）

<400> 172

cggtcacgct tgggactgcc ataggctggc ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg 60

tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 120

ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgaaacaact 180

caatatcggt gtagctattt ataaattcga caacacattc atgactgggg tccggaatgc 240

tatgaccgca gaagcccaag gcaaggccaa gttaaacatg gtagacagtc agaactcaca 300

acctacacaa aatgatcagg tcgacctctt catcacgaaa aaaatgaatg cgttggcaat 360

caaccctgta gatcgcaccg cagctgggac tatcatcgac aaggcaaagc aagcaaatat 420

ccctgtagtg ttcttcaacc gggaaccttt accagaagac atgaaaaaat gggataaggt 480

atattacgta ggcgcaaagg ccgaacagag tggcattctc caaggtcaaa tcatggctga 540

ttattggaaa gctcatccgg aagcggacaa gaaccacgac ggggttatgc aatatgtcat 600

gttaatgggc cagccggggc accaagacgc aatcttacgt acgcaatact cgatccaaac 660

cgtgaaagat gcaggcatca aggtccagga gctggctaaa gactacgcca attgcgatcg 720

tgtcaccgct catgacaaaa tggctgcttg gctctcgtcc tttggcgaca agattgaagc 780

cgtttttgca aataacgacg atatggccct gggtgccatt gaagccctca agtctgctgg 840

ctatttcacg ggcaacaagt acatcccagt tgtaggcgtc gacgccaccg ccccagggat 900

ccaggcgatc aaagacggta cattactggg gacagtcctg aacgacgcca aaaaccaggc 960

gaaagccact ttcaacattg catacgaact tgcacaaggg atcacgccaa ccaaagataa 1020

catcggttac gacatcaccg acggcaaata cgtttggatt ccatataaaa aaattacaaa 1080

agacaacatt tcggatgcag agcaaggtgg ttcacatcat catcatcatc attaatgaaa 1140

gggcgatatc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cggctgctaa caaagcccga 1200

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 1260

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg agcgactccc 1320

acggcacgtt ggcaagctcg 1340

<210> 173

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0_Imm0

<400> 173

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 174

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGBP，R91K，Q148E

<400> 174

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His

305 310 315 320

His

<210> 175

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0_Imm1

<400> 175

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Lys

305 310 315 320

Lys Lys Lys Lys Gly Gly Ser His His His His His His

325 330

<210> 176

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0_Imm2

<400> 176

Met His His His His His His Gly Gly Ser Lys Gln Leu Asn Ile Gly

1 5 10 15

Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly Val Arg Asn

20 25 30

Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys Ala Lys Leu Asn Met Val Asp

35 40 45

Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile

50 55 60

Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala

65 70 75 80

Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys Gln Ala Asn Ile Pro Val Val

85 90 95

Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys

100 105 110

Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly

115 120 125

Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala His Pro Glu Ala Asp Lys Asn

130 135 140

His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met Leu Met Gly Glu Pro Gly His

145 150 155 160

Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp

165 170 175

Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp

180 185 190

Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly

195 200 205

Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly

210 215 220

Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr

225 230 235 240

Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile

245 250 255

Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln

260 265 270

Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr

275 280 285

Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val

290 295 300

Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu

305 310 315 320

Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys

325 330

<210> 177

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0_Imm3

<400> 177

Met Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gln Leu

1 5 10 15

Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly

20 25 30

Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys Ala Lys Leu Asn

35 40 45

Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn Asp Gln Val Asp

50 55 60

Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile Asn Pro Val Asp

65 70 75 80

Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys Gln Ala Asn Ile

85 90 95

Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu Asp Met Lys Lys

100 105 110

Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser Gly Ile

115 120 125

Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala His Pro Glu Ala

130 135 140

Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met Leu Met Gly Glu

145 150 155 160

Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Gln Thr

165 170 175

Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala Lys Asp Tyr Ala

180 185 190

Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala Ala Trp Leu Ser

195 200 205

Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn Asp Asp Met

210 215 220

Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Phe Thr Gly

225 230 235 240

Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Gly Ile

245 250 255

Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala

260 265 270

Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr Glu Leu Ala Gln

275 280 285

Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp Ile Thr Asp Gly

290 295 300

Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ser

305 310 315 320

Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser His His His His His His

325 330

<210> 178

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0_Imm4

<400> 178

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Gly

305 310 315 320

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser

325 330 335

Asp His Leu Ser Arg His Gln Arg Thr His Gln Asn Lys Lys Gly Gly

340 345 350

Ser His His His His His His

355

<210> 179

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0_Imm5

<400> 179

Met Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe

1 5 10 15

Ser Arg Ser Asp His Leu Ser Arg His Gln Arg Thr His Gln Asn Lys

20 25 30

Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile

35 40 45

Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr

50 55 60

Ala Glu Ala Gln Gly Lys Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn

65 70 75 80

Ser Gln Pro Thr Gln Asn Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys

85 90 95

Met Asn Ala Leu Ala Ile Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr

100 105 110

Ile Ile Asp Lys Ala Lys Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn

115 120 125

Lys Glu Pro Leu Pro Glu Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr

130 135 140

Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met

145 150 155 160

Ala Asp Tyr Trp Lys Ala His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly

165 170 175

Val Met Gln Tyr Val Met Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala

180 185 190

Ile Leu Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile

195 200 205

Lys Val Gln Glu Leu Ala Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr

210 215 220

Ala His Asp Lys Met Ala Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile

225 230 235 240

Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu

245 250 255

Ala Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val

260 265 270

Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly

275 280 285

Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala

290 295 300

Thr Phe Asn Ile Ala Tyr Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys

305 310 315 320

Asp Asn Ile Gly Tyr Asp Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro

325 330 335

Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly

340 345 350

Ser His His His His His His

355

<210> 180

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0_Imm6

<400> 180

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Gly

305 310 315 320

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser

325 330 335

Gly Gly Ser His His His His His His

340 345

<210> 181

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0_Imm7

<400> 181

Met Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe

1 5 10 15

Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val

20 25 30

Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala

35 40 45

Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser

50 55 60

Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr

65 70 75 80

Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala

85 90 95

Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe

100 105 110

Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val

115 120 125

Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln

130 135 140

Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His

145 150 155 160

Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln

165 170 175

Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala

180 185 190

Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg

195 200 205

Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp

210 215 220

Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala

225 230 235 240

Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile

245 250 255

Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys

260 265 270

Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala

275 280 285

Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro

290 295 300

Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp

305 310 315 320

Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln

325 330 335

Gly Gly Ser His His His His His His

340 345

<210> 182

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 182

Ile Tyr Lys Xaa Asp Asp Xaa Phe Met

1 5

<210> 183

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 183

Tyr Lys Xaa Asp Asp Xaa Phe Met

1 5

<210> 184

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 184

Tyr Lys Xaa Asp Asp Xaa Phe

1 5

<210> 185

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 185

Lys Xaa Asp Asp Xaa Phe

1 5

<210> 186

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 186

Tyr Lys Xaa Asp Asp

1 5

<210> 187

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 187

Lys Xaa Asp Asp

1

<210> 188

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 188

Asp Asp Xaa Phe

1

<210> 189

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 189

Asp Xaa Phe Met Xaa Xaa Val Arg

1 5

<210> 190

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 190

Asp Xaa Phe Met Xaa Xaa Val

1 5

<210> 191

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 191

Asp Xaa Phe Met

1

<210> 192

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 192

Ile Tyr Lys Xaa Asp Asn Xaa Phe Met

1 5

<210> 193

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 193

Tyr Lys Xaa Asp Asn Xaa Phe Met

1 5

<210> 194

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 194

Tyr Lys Xaa Asp Asn Xaa Phe

1 5

<210> 195

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 195

Lys Xaa Asp Asn Xaa Phe

1 5

<210> 196

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 196

Tyr Lys Xaa Asp Asn

1 5

<210> 197

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 197

Lys Xaa Asp Asn

1

<210> 198

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 198

Asp Asn Xaa Phe

1

<210> 199

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 199

Asn Xaa Phe Met Xaa Xaa Val Arg

1 5

<210> 200

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 200

Asn Xaa Phe Met Xaa Xaa Val

1 5

<210> 201

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 201

Asn Xaa Phe Met

1

<210> 202

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 202

Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro

1 5

<210> 203

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 203

Pro Val Val Phe Xaa Asn Lys Glu Pro

1 5

<210> 204

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 204

Pro Val Val Phe Phe Asn Xaa Glu Pro

1 5

<210> 205

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 205

Pro Val Val Phe Xaa Asn Xaa Glu Pro

1 5

<210> 206

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 206

Val Val Phe Xaa Asn Xaa Glu Pro

1 5

<210> 207

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 207

Val Phe Xaa Asn Xaa Glu Pro

1 5

<210> 208

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 208

Pro Val Val Phe Xaa Asn Xaa Glu

1 5

<210> 209

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 209

Pro Val Val Phe Xaa Asn

1 5

<210> 210

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 210

Pro Xaa Val Phe Xaa Asn

1 5

<210> 211

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 211

Pro Val Xaa Phe Xaa Asn

1 5

<210> 212

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 212

Phe Xaa Asn Xaa Glu Pro

1 5

<210> 213

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 213

Phe Xaa Asn Xaa Glu

1 5

<210> 214

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 214

Pro Gly His Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr

1 5 10

<210> 215

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 215

Pro Gly His Xaa Asp Ala Xaa Xaa Arg Thr

1 5 10

<210> 216

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 216

Gly His Xaa Asp Ala Xaa Xaa Arg Thr

1 5

<210> 217

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 217

His Xaa Asp Ala Xaa Xaa Arg Thr

1 5

<210> 218

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 218

Asp Ala Xaa Xaa Arg Thr

1 5

<210> 219

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 219

Pro Gly His Xaa Asp Ala Xaa Xaa Arg

1 5

<210> 220

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 220

Pro Gly His Xaa Asp Ala

1 5

<210> 221

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 221

Pro Gly His Xaa Asp

1 5

<210> 222

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 222

Pro Gly Asn Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr

1 5 10

<210> 223

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 223

Pro Gly Asn Xaa Asp Ala Xaa Xaa Arg Thr

1 5 10

<210> 224

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 224

Gly Asn Xaa Asp Ala Xaa Xaa Arg Thr

1 5

<210> 225

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 225

Asn Xaa Asp Ala Xaa Xaa Arg Thr

1 5

<210> 226

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 226

Pro Gly Asn Xaa Asp Ala Xaa Xaa Arg

1 5

<210> 227

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 227

Pro Gly Asn Xaa Asp Ala

1 5

<210> 228

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 228

Pro Gly Asn Xaa Asp

1 5

<210> 229

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 229

Asp Thr Ala Met Trp Asp

1 5

<210> 230

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DTAMCD（保守的序列）

<400> 230

Asp Thr Ala Met Cys Asp

1 5

<210> 231

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 231

Asp Thr Ala Met Trp

1 5

<210> 232

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 232

Asp Thr Ala Met Cys

1 5

<210> 233

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 233

Thr Ala Met Trp Asp

1 5

<210> 234

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 234

Thr Ala Met Cys Asp

1 5

<210> 235

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 235

Ala Xaa Trp Xaa Xaa

1 5

<210> 236

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 236

Ala Xaa Cys Xaa Xaa

1 5

<210> 237

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 237

Ile Glu Val Val Ile Ala Asn Asn Asp

1 5

<210> 238

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 238

Glu Val Val Ile Ala Asn Asn Asp

1 5

<210> 239

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 239

Ile Glu Val Val Ile Ala Asn Asn

1 5

<210> 240

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 240

Glu Val Val Ile Ala Asn Asn

1 5

<210> 241

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 241

Ile Glu Xaa Val Xaa Xaa Asn Asn Asp

1 5

<210> 242

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 242

Ile Glu Xaa Val Xaa Xaa Asn Asn

1 5

<210> 243

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 243

Glu Xaa Val Xaa Xaa Asn Asn Asp

1 5

<210> 244

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 244

Glu Xaa Val Xaa Xaa Asn Asn

1 5

<210> 245

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 245

Pro Val Phe Gly Val Asp Ala

1 5

<210> 246

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 246

Val Phe Gly Val Asp Ala

1 5

<210> 247

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 247

Pro Val Phe Gly Val Asp

1 5

<210> 248

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 248

Phe Gly Val Asp Ala

1 5

<210> 249

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 249

Pro Val Xaa Gly Val Asp Ala

1 5

<210> 250

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 250

Val Xaa Gly Val Asp Ala

1 5

<210> 251

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 251

Pro Val Xaa Gly Val Asp

1 5

<210> 252

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 252

Val Xaa Gly Val Asp

1 5

<210> 253

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 253

Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala

1 5

<210> 254

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 254

Gly Thr Val Leu Asn Asp

1 5

<210> 255

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 255

Gly Thr Val Leu Asn

1 5

<210> 256

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守的GGBP序列

<400> 256

Thr Val Leu Asn Asp

1 5

<210> 257

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> chyGGBP_F12C（chGGBP，信号序列被M置换；F12C、

C39A、和C206A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 257

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Cys Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Ala Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asn Gly Ile Met Glu Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Lys Thr Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Arg Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asn Gly Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Asp Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 258

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> chyGGBP_F16C（chGGBP，信号序列被M置换；F16C、

C39A、和C206A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 258

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Cys

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Ala Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asn Gly Ile Met Glu Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Lys Thr Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Arg Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asn Gly Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Asp Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 259

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> chyGGBP_W181C（chGGBP，信号序列被M置换；W181C、

C39A、和C206A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 259

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Ala Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asn Gly Ile Met Glu Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Lys Thr Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Cys Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Arg Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asn Gly Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Asp Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 260

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cobGGBP_F12C（cobGGBP，信号序列被M置换；F12C、C39A、

C173A、和C206A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 260

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Cys Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Ala Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Ile Met Gln Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Arg Val Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Glu Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 261

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cobGGBP_F16C（cobGGBP，信号序列被M置换；F16C、C39A、

C173A、和C206A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 261

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Cys

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Ala Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Ile Met Gln Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Arg Val Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Glu Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 262

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cobGGBP_W181C（cobGGBP，信号序列被M置换；

W181C、C39A、C173A、和C206A突变；并且在C-末端

具有GGSHHHHHH）

<400> 262

Met Lys Pro Tyr Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Phe

1 5 10 15

Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Ile Ala Lys Glu Gly Glu Gly Lys Ala

20 25 30

Lys Leu Asp Phe Val Asp Ala Gln Asn Ser Gln Ser Thr Gln Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Val Asp Ala Leu Ala Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Val Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Arg Glu Pro Leu Pro Glu Asp

85 90 95

Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Leu Gln Gly Glu Ile Met Ala Glu Tyr Trp Lys Ser His

115 120 125

Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Ile Met Gln Tyr Val Met Ile

130 135 140

Thr Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Glu Tyr Ser

145 150 155 160

Ile Lys Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile Arg Val Lys Ala Leu Ala Gln

165 170 175

Asp Thr Ala Met Cys Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Ala

180 185 190

Phe Leu Ala Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn Asn

195 200 205

Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr

210 215 220

Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ala Thr Phe Asn Leu Ala Tyr Val

260 265 270

Leu Ala Lys Gly Glu Lys Pro Thr Lys Glu Asn Val Gly Phe Glu Ile

275 280 285

Thr Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Val Pro Tyr Gln Lys Val Thr Lys Asp

290 295 300

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Tyr Val Asn Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 263

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pspGGPB_F13C（pspGGBP，信号序列被M置换；F13C

突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 263

Met Val Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Cys Met Thr Gly

1 5 10 15

Val Arg Asn Ala Met Ser Asp Ala Ala Asn Gly Val Ala Lys Leu Asp

20 25 30

Ile Val Asp Ser Gln Asn Ala Gln Pro Thr Gln Asn Glu Lys Ile Asp

35 40 45

Leu Phe Ile Ser Lys Lys Tyr Ser Ser Met Ile Ile Asn Pro Val Asp

50 55 60

Arg Thr Ala Ala Gly Val Ile Ile Asp Lys Ala Lys Thr Ala Asn Thr

65 70 75 80

Pro Val Val Phe Leu Asn Arg Glu Pro Ile Ala Glu Asp Met Asn Lys

85 90 95

Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Glu Ser Gly Thr

100 105 110

Ile Ser Gly Gln Leu Ile Val Asp Tyr Trp Lys Ala Asn Pro Lys Ala

115 120 125

Asp Lys Asn Gly Asp Gly Lys Leu Gln Tyr Val Leu Leu Gln Gly Glu

130 135 140

Pro Gly His Gln Asp Ala Glu Leu Arg Thr Lys Phe Ser Val Gln Ala

145 150 155 160

Ile Gln Asp Ala Gly Ile Glu Val Glu Ala Leu Ala Val Asp Thr Ala

165 170 175

Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Thr Phe Leu Ala

180 185 190

Ser His Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Leu Ala Asn Asn Asp Asp Met

195 200 205

Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Ser Gly

210 215 220

Asp Lys Tyr Met Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val

225 230 235 240

Gln Ala Leu Glu Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala

245 250 255

Lys Ser Gln Gly Lys Ala Ser Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Ser Lys

260 265 270

Gly Glu Ala Pro Asn Lys Glu Asn Thr Gly Phe Asp Ile Thr Asp Gly

275 280 285

Lys Tyr Val Trp Ile Ala Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ala

290 295 300

Asp Ala Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 264

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pspGGPB_F9C（pspGGBP，信号序列被M置换；F9C

突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 264

Met Val Gly Val Ala Ile Tyr Lys Cys Asp Asp Thr Phe Met Thr Gly

1 5 10 15

Val Arg Asn Ala Met Ser Asp Ala Ala Asn Gly Val Ala Lys Leu Asp

20 25 30

Ile Val Asp Ser Gln Asn Ala Gln Pro Thr Gln Asn Glu Lys Ile Asp

35 40 45

Leu Phe Ile Ser Lys Lys Tyr Ser Ser Met Ile Ile Asn Pro Val Asp

50 55 60

Arg Thr Ala Ala Gly Val Ile Ile Asp Lys Ala Lys Thr Ala Asn Thr

65 70 75 80

Pro Val Val Phe Leu Asn Arg Glu Pro Ile Ala Glu Asp Met Asn Lys

85 90 95

Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Glu Ser Gly Thr

100 105 110

Ile Ser Gly Gln Leu Ile Val Asp Tyr Trp Lys Ala Asn Pro Lys Ala

115 120 125

Asp Lys Asn Gly Asp Gly Lys Leu Gln Tyr Val Leu Leu Gln Gly Glu

130 135 140

Pro Gly His Gln Asp Ala Glu Leu Arg Thr Lys Phe Ser Val Gln Ala

145 150 155 160

Ile Gln Asp Ala Gly Ile Glu Val Glu Ala Leu Ala Val Asp Thr Ala

165 170 175

Met Trp Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Thr Phe Leu Ala

180 185 190

Ser His Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Leu Ala Asn Asn Asp Asp Met

195 200 205

Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Ser Gly

210 215 220

Asp Lys Tyr Met Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val

225 230 235 240

Gln Ala Leu Glu Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala

245 250 255

Lys Ser Gln Gly Lys Ala Ser Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Ser Lys

260 265 270

Gly Glu Ala Pro Asn Lys Glu Asn Thr Gly Phe Asp Ile Thr Asp Gly

275 280 285

Lys Tyr Val Trp Ile Ala Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ala

290 295 300

Asp Ala Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 265

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pspGGPB_W178C（pspGGBP，信号序列被M置换；

W178C突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 265

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1 5 10 15

Val Arg Asn Ala Met Ser Asp Ala Ala Asn Gly Val Ala Lys Leu Asp

20 25 30

Ile Val Asp Ser Gln Asn Ala Gln Pro Thr Gln Asn Glu Lys Ile Asp

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Leu Phe Ile Ser Lys Lys Tyr Ser Ser Met Ile Ile Asn Pro Val Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Pro Val Val Phe Leu Asn Arg Glu Pro Ile Ala Glu Asp Met Asn Lys

85 90 95

Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Glu Ser Gly Thr

100 105 110

Ile Ser Gly Gln Leu Ile Val Asp Tyr Trp Lys Ala Asn Pro Lys Ala

115 120 125

Asp Lys Asn Gly Asp Gly Lys Leu Gln Tyr Val Leu Leu Gln Gly Glu

130 135 140

Pro Gly His Gln Asp Ala Glu Leu Arg Thr Lys Phe Ser Val Gln Ala

145 150 155 160

Ile Gln Asp Ala Gly Ile Glu Val Glu Ala Leu Ala Val Asp Thr Ala

165 170 175

Met Cys Asp Arg Val Lys Gly Gln Glu Lys Met Gln Thr Phe Leu Ala

180 185 190

Ser His Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Leu Ala Asn Asn Asp Asp Met

195 200 205

Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Ser Gly

210 215 220

Asp Lys Tyr Met Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val

225 230 235 240

Gln Ala Leu Glu Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala

245 250 255

Lys Ser Gln Gly Lys Ala Ser Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Ser Lys

260 265 270

Gly Glu Ala Pro Asn Lys Glu Asn Thr Gly Phe Asp Ile Thr Asp Gly

275 280 285

Lys Tyr Val Trp Ile Ala Tyr Lys Lys Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ala

290 295 300

Asp Ala Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 266

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> csaGGBP_F18C（csaGGBP，信号序列被M置换；F18C、C62A、

C82A、C113A、和C211A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 266

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1 5 10 15

Thr Cys Met Lys Leu Tyr Arg Gln Glu Leu Lys Gln Tyr Leu Glu Glu

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Arg Thr Glu Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Glu Glu Gly Gly Met Lys Thr

165 170 175

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180 185 190

Lys Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Ser Trp Gly Asn Arg Ile Glu Val

195 200 205

Phe Phe Ala Asn Asn Asp Ser Met Ala Asn Gly Ala Leu Glu Ala Val

210 215 220

Glu Glu Ala Gly Arg Ile Pro Gly Lys Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Gln Asp Thr Val Thr Tyr Ile Lys Glu Gly Arg Met Thr

245 250 255

Gly Thr Val Leu Asn Asp His Glu Gly Gln Ser Gln Met Ala Ala Asp

260 265 270

Thr Leu Lys Lys Met Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Thr Arg Tyr Gln

275 280 285

Val Asp Tyr Ile Lys Val Thr Ala Ile Ser Thr Phe Gln Thr Leu Lys

290 295 300

Gly Glu Asp Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 267

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> csaGGBP_W186C（csaGGBP，信号序列被M置换；W186C、C62A、

C82A、C113A、和C211A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 267

Met Glu Thr Gly Pro Lys Ile Gly Val Ser Ile Tyr Arg Tyr Asp Asp

1 5 10 15

Thr Phe Met Lys Leu Tyr Arg Gln Glu Leu Lys Gln Tyr Leu Glu Glu

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Thr Tyr His Ala Glu Val Ile Met Arg Asn Ala Gly Gly Asp Gln Lys

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50 55 60

Ile Ile Val Asn Pro Val Glu Ile Pro Ala Ala Gln Glu Leu Ala Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ser Arg Ala Gly Ile Pro Leu Val Phe Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

Lys Glu Glu Glu Gln Lys Arg Trp Arg Glu Lys Gln Met Ala Val Ser

100 105 110

Ala Val Gly Thr Asp Ser Arg Gln Ala Gly Thr Tyr Gln Gly Glu Ile

115 120 125

Ile Leu Glu Thr Leu Asn Lys Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Val Val

130 135 140

Ser Tyr Val Met Leu Met Gly Glu Lys Gly Asn Glu Asp Ser Gln Tyr

145 150 155 160

Arg Thr Glu Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Glu Glu Gly Gly Met Lys Thr

165 170 175

Glu Glu Leu Phe Ser Gly Asn Gly Asn Cys Asn Lys Asp Glu Gly Lys

180 185 190

Lys Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Ser Trp Gly Asn Arg Ile Glu Val

195 200 205

Phe Phe Ala Asn Asn Asp Ser Met Ala Asn Gly Ala Leu Glu Ala Val

210 215 220

Glu Glu Ala Gly Arg Ile Pro Gly Lys Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Gln Asp Thr Val Thr Tyr Ile Lys Glu Gly Arg Met Thr

245 250 255

Gly Thr Val Leu Asn Asp His Glu Gly Gln Ser Gln Met Ala Ala Asp

260 265 270

Thr Leu Lys Lys Met Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Thr Arg Tyr Gln

275 280 285

Val Asp Tyr Ile Lys Val Thr Ala Ile Ser Thr Phe Gln Thr Leu Lys

290 295 300

Gly Glu Asp Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 268

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> csaGGBP_Y14C（csaGGBP，信号序列被M置换；Y14C、C62A、

C82A、C113A、和C211A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 268

Met Glu Thr Gly Pro Lys Ile Gly Val Ser Ile Tyr Arg Cys Asp Asp

1 5 10 15

Thr Phe Met Lys Leu Tyr Arg Gln Glu Leu Lys Gln Tyr Leu Glu Glu

20 25 30

Thr Tyr His Ala Glu Val Ile Met Arg Asn Ala Gly Gly Asp Gln Lys

35 40 45

Glu Gln Asp Lys Gln Val Asn Gln Phe Ile Ser Asp Gly Ala Asp Gly

50 55 60

Ile Ile Val Asn Pro Val Glu Ile Pro Ala Ala Gln Glu Leu Ala Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ser Arg Ala Gly Ile Pro Leu Val Phe Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

Lys Glu Glu Glu Gln Lys Arg Trp Arg Glu Lys Gln Met Ala Val Ser

100 105 110

Ala Val Gly Thr Asp Ser Arg Gln Ala Gly Thr Tyr Gln Gly Glu Ile

115 120 125

Ile Leu Glu Thr Leu Asn Lys Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Val Val

130 135 140

Ser Tyr Val Met Leu Met Gly Glu Lys Gly Asn Glu Asp Ser Gln Tyr

145 150 155 160

Arg Thr Glu Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Glu Glu Gly Gly Met Lys Thr

165 170 175

Glu Glu Leu Phe Ser Gly Asn Gly Asn Trp Asn Lys Asp Glu Gly Lys

180 185 190

Lys Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Ser Trp Gly Asn Arg Ile Glu Val

195 200 205

Phe Phe Ala Asn Asn Asp Ser Met Ala Asn Gly Ala Leu Glu Ala Val

210 215 220

Glu Glu Ala Gly Arg Ile Pro Gly Lys Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Gln Asp Thr Val Thr Tyr Ile Lys Glu Gly Arg Met Thr

245 250 255

Gly Thr Val Leu Asn Asp His Glu Gly Gln Ser Gln Met Ala Ala Asp

260 265 270

Thr Leu Lys Lys Met Ile Asp Gly Glu Ser Val Glu Thr Arg Tyr Gln

275 280 285

Val Asp Tyr Ile Lys Val Thr Ala Ile Ser Thr Phe Gln Thr Leu Lys

290 295 300

Gly Glu Asp Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 269

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bprGGBP_F16C（bprGGBP，信号序列被M置换；F16C、C8A、

C112A、C116A、C179A、C211A、和C289A突变；并且在C-末端

具有GGSHHHHHH）

<400> 269

Met Asp Ala Lys Val Gly Val Ala Ile Tyr Gln Lys Ser Asp Asn Cys

1 5 10 15

Met Ser Leu Phe Ser Ser Glu Leu Val Lys Tyr Leu Val Ser Arg Gly

20 25 30

Phe Ser Lys Asp Asn Ile Ile Leu Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Glu Asn

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Val Gln Leu Ser Gln Val Glu Glu Leu Ile Ala Ser Gly Ile Asn Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Met Ala Ser Ala Ser Asn Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Leu Ser Leu Gly Lys Asn Lys Leu Asp His Asn Gly Asp Gly Lys

130 135 140

Ile Gln Tyr Phe Met Ile Glu Gly Ala Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Leu Tyr Ser Val Ser Ala Leu Gln Asn Ser Glu Met Glu

165 170 175

Met Asp Ala Leu Leu Asp Glu Val Gly Asn Trp Asp Glu Thr Thr Ala

180 185 190

Ser Leu Leu Val Ser Lys Gly Ile Gln Asn Gly Leu Lys Pro Glu Val

195 200 205

Ile Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Lys Ala Ala

210 215 220

Glu Lys Ser Gly Leu Val Pro Gly Glu Asp Val Tyr Ile Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Pro Glu Ala Ile Glu Met Ile Lys Ala Gly Lys Leu Ala

245 250 255

Gly Thr Val Tyr Asn Asp Tyr Val Leu Gln Ser His Lys Ser Ala Asp

260 265 270

Ala Val Ile Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Asp Asn Glu His Tyr Ile Gly

275 280 285

Ala Asp Tyr Val Lys Val Asp Ile Asp Asn Ala Glu Ser Ile Ala Gly

290 295 300

Leu Thr Asn Thr Asp Glu Glu Asp Ile Asp Gly Gly Ser His His His

305 310 315 320

His His His

<210> 270

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bprGGBP_K12C（bprGGBP，信号序列被M置换；K12C、C8A、

C112A、C116A、C179A、C211A、和C289A突变；并且在C-末端

具有GGSHHHHHH）

<400> 270

Met Asp Ala Lys Val Gly Val Ala Ile Tyr Gln Cys Ser Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Ser Leu Phe Ser Ser Glu Leu Val Lys Tyr Leu Val Ser Arg Gly

20 25 30

Phe Ser Lys Asp Asn Ile Ile Leu Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Glu Asn

35 40 45

Val Gln Leu Ser Gln Val Glu Glu Leu Ile Ala Ser Gly Ile Asn Ala

50 55 60

Leu Ile Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Val Ala His Ser Ile Thr Asp

65 70 75 80

Met Ala Ser Ala Ser Asn Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

Ser Gly Asp Glu Glu Asn Arg Trp Glu Met Tyr Gln Leu Asn Val Ala

100 105 110

Tyr Val Gly Ala Asp Ala Arg Gln Ser Gly Ile Tyr Gln Gly Glu Ile

115 120 125

Leu Leu Ser Leu Gly Lys Asn Lys Leu Asp His Asn Gly Asp Gly Lys

130 135 140

Ile Gln Tyr Phe Met Ile Glu Gly Ala Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Leu Tyr Ser Val Ser Ala Leu Gln Asn Ser Glu Met Glu

165 170 175

Met Asp Ala Leu Leu Asp Glu Val Gly Asn Trp Asp Glu Thr Thr Ala

180 185 190

Ser Leu Leu Val Ser Lys Gly Ile Gln Asn Gly Leu Lys Pro Glu Val

195 200 205

Ile Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Lys Ala Ala

210 215 220

Glu Lys Ser Gly Leu Val Pro Gly Glu Asp Val Tyr Ile Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Pro Glu Ala Ile Glu Met Ile Lys Ala Gly Lys Leu Ala

245 250 255

Gly Thr Val Tyr Asn Asp Tyr Val Leu Gln Ser His Lys Ser Ala Asp

260 265 270

Ala Val Ile Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Asp Asn Glu His Tyr Ile Gly

275 280 285

Ala Asp Tyr Val Lys Val Asp Ile Asp Asn Ala Glu Ser Ile Ala Gly

290 295 300

Leu Thr Asn Thr Asp Glu Glu Asp Ile Asp Gly Gly Ser His His His

305 310 315 320

His His His

<210> 271

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bprGGBP_W187C（bprGGBP，信号序列被M置换；W187C、C8A、

C112A、C116A、C179A、C211A、和C289A突变；并且在C-末端

具有GGSHHHHHH）

<400> 271

Met Asp Ala Lys Val Gly Val Ala Ile Tyr Gln Lys Ser Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Ser Leu Phe Ser Ser Glu Leu Val Lys Tyr Leu Val Ser Arg Gly

20 25 30

Phe Ser Lys Asp Asn Ile Ile Leu Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Glu Asn

35 40 45

Val Gln Leu Ser Gln Val Glu Glu Leu Ile Ala Ser Gly Ile Asn Ala

50 55 60

Leu Ile Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Val Ala His Ser Ile Thr Asp

65 70 75 80

Met Ala Ser Ala Ser Asn Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro

85 90 95

Ser Gly Asp Glu Glu Asn Arg Trp Glu Met Tyr Gln Leu Asn Val Ala

100 105 110

Tyr Val Gly Ala Asp Ala Arg Gln Ser Gly Ile Tyr Gln Gly Glu Ile

115 120 125

Leu Leu Ser Leu Gly Lys Asn Lys Leu Asp His Asn Gly Asp Gly Lys

130 135 140

Ile Gln Tyr Phe Met Ile Glu Gly Ala Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Leu Tyr Ser Val Ser Ala Leu Gln Asn Ser Glu Met Glu

165 170 175

Met Asp Ala Leu Leu Asp Glu Val Gly Asn Cys Asp Glu Thr Thr Ala

180 185 190

Ser Leu Leu Val Ser Lys Gly Ile Gln Asn Gly Leu Lys Pro Glu Val

195 200 205

Ile Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Lys Ala Ala

210 215 220

Glu Lys Ser Gly Leu Val Pro Gly Glu Asp Val Tyr Ile Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Leu Pro Glu Ala Ile Glu Met Ile Lys Ala Gly Lys Leu Ala

245 250 255

Gly Thr Val Tyr Asn Asp Tyr Val Leu Gln Ser His Lys Ser Ala Asp

260 265 270

Ala Val Ile Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Asp Asn Glu His Tyr Ile Gly

275 280 285

Ala Asp Tyr Val Lys Val Asp Ile Asp Asn Ala Glu Ser Ile Ala Gly

290 295 300

Leu Thr Asn Thr Asp Glu Glu Asp Ile Asp Gly Gly Ser His His His

305 310 315 320

His His His

<210> 272

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_A_F10C（rinGGBP_A，信号序列被M置换；F10C、

C6A、C114A、C177A、C210A、和C288A突变；并且

在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 272

Met Lys Val Gly Val Ala Ile Tyr Gln Cys Ser Asp Asn Phe Met Thr

1 5 10 15

Leu Phe Arg Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Leu Val Glu Lys Gly Phe Ser

20 25 30

Lys Asp Asn Ile Thr Ile Val Asp Gly Ala Asn Asp Gln Ala Thr Gln

35 40 45

Thr Gly Gln Ile Asp Asn Phe Ile Thr Glu Gly Val Asp Val Leu Ile

50 55 60

Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Ser Ala Ala Thr Ile Thr Asp Lys Val

65 70 75 80

Val Ala Ala Gly Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Glu Gln Lys Arg Trp Ser Asp Asn Asn Trp Asp Val Thr Tyr Val

100 105 110

Gly Ala Asp Ala Arg Gln Ser Gly Thr Phe Gln Gly Glu Met Ile Ser

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Asp Thr Val Asp Leu Asn Gly Asn Gly Lys Ile Asp

130 135 140

Tyr Val Met Val Glu Gly Asp Pro Glu Asn Val Asp Ala Gln Tyr Arg

145 150 155 160

Thr Glu Tyr Ser Val Lys Ala Leu Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val Asn

165 170 175

Ala Leu Ser Asp Gln Val Gly Asn Trp Gln Gln Asp Gln Ala Gln Gln

180 185 190

Ile Val Ala Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Gly Asn Asp Val Glu Val Val

195 200 205

Phe Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ala Ile Gln

210 215 220

Ser Ala Gly Arg Thr Val Gly Thr Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val Asp

225 230 235 240

Ala Leu Ser Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Ala Gly Thr Met Thr Gly

245 250 255

Thr Val Phe Asn Asp His Phe Ser Gln Ser His Ser Ala Ala Asp Ala

260 265 270

Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Ala Gly Asn Asp His Tyr Ile Gly Ala

275 280 285

Asp Tyr Val Lys Val Thr Lys Asp Asn Ala Gln Asp Val Leu Asp Met

290 295 300

Val Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 273

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_A_F14C（rinGGBP_A，信号序列被M置换；F14C、

C6A、C114A、C177A、C210A、和C288A突变；并且在

C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 273

Met Lys Val Gly Val Ala Ile Tyr Gln Phe Ser Asp Asn Cys Met Thr

1 5 10 15

Leu Phe Arg Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Leu Val Glu Lys Gly Phe Ser

20 25 30

Lys Asp Asn Ile Thr Ile Val Asp Gly Ala Asn Asp Gln Ala Thr Gln

35 40 45

Thr Gly Gln Ile Asp Asn Phe Ile Thr Glu Gly Val Asp Val Leu Ile

50 55 60

Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Ser Ala Ala Thr Ile Thr Asp Lys Val

65 70 75 80

Val Ala Ala Gly Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Glu Gln Lys Arg Trp Ser Asp Asn Asn Trp Asp Val Thr Tyr Val

100 105 110

Gly Ala Asp Ala Arg Gln Ser Gly Thr Phe Gln Gly Glu Met Ile Ser

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Asp Thr Val Asp Leu Asn Gly Asn Gly Lys Ile Asp

130 135 140

Tyr Val Met Val Glu Gly Asp Pro Glu Asn Val Asp Ala Gln Tyr Arg

145 150 155 160

Thr Glu Tyr Ser Val Lys Ala Leu Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val Asn

165 170 175

Ala Leu Ser Asp Gln Val Gly Asn Trp Gln Gln Asp Gln Ala Gln Gln

180 185 190

Ile Val Ala Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Gly Asn Asp Val Glu Val Val

195 200 205

Phe Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ala Ile Gln

210 215 220

Ser Ala Gly Arg Thr Val Gly Thr Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val Asp

225 230 235 240

Ala Leu Ser Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Ala Gly Thr Met Thr Gly

245 250 255

Thr Val Phe Asn Asp His Phe Ser Gln Ser His Ser Ala Ala Asp Ala

260 265 270

Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Ala Gly Asn Asp His Tyr Ile Gly Ala

275 280 285

Asp Tyr Val Lys Val Thr Lys Asp Asn Ala Gln Asp Val Leu Asp Met

290 295 300

Val Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 274

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_A_W185C（rinGGBP_A，信号序列被M置换；

W185C、C6A、C114A、C177A、C210A、和C288A突变；

并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 274

Met Lys Val Gly Val Ala Ile Tyr Gln Phe Ser Asp Asn Phe Met Thr

1 5 10 15

Leu Phe Arg Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Leu Val Glu Lys Gly Phe Ser

20 25 30

Lys Asp Asn Ile Thr Ile Val Asp Gly Ala Asn Asp Gln Ala Thr Gln

35 40 45

Thr Gly Gln Ile Asp Asn Phe Ile Thr Glu Gly Val Asp Val Leu Ile

50 55 60

Ile Asn Pro Val Asn Ser Ser Ser Ala Ala Thr Ile Thr Asp Lys Val

65 70 75 80

Val Ala Ala Gly Ile Pro Leu Val Tyr Ile Asn Arg Glu Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Glu Gln Lys Arg Trp Ser Asp Asn Asn Trp Asp Val Thr Tyr Val

100 105 110

Gly Ala Asp Ala Arg Gln Ser Gly Thr Phe Gln Gly Glu Met Ile Ser

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Asp Thr Val Asp Leu Asn Gly Asn Gly Lys Ile Asp

130 135 140

Tyr Val Met Val Glu Gly Asp Pro Glu Asn Val Asp Ala Gln Tyr Arg

145 150 155 160

Thr Glu Tyr Ser Val Lys Ala Leu Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val Asn

165 170 175

Ala Leu Ser Asp Gln Val Gly Asn Cys Gln Gln Asp Gln Ala Gln Gln

180 185 190

Ile Val Ala Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Gly Asn Asp Val Glu Val Val

195 200 205

Phe Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ala Ile Gln

210 215 220

Ser Ala Gly Arg Thr Val Gly Thr Asp Ile Tyr Leu Val Gly Val Asp

225 230 235 240

Ala Leu Ser Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Ala Gly Thr Met Thr Gly

245 250 255

Thr Val Phe Asn Asp His Phe Ser Gln Ser His Ser Ala Ala Asp Ala

260 265 270

Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Ala Gly Asn Asp His Tyr Ile Gly Ala

275 280 285

Asp Tyr Val Lys Val Thr Lys Asp Asn Ala Gln Asp Val Leu Asp Met

290 295 300

Val Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 275

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_B_F17C（rinGGBP_B，信号序列被M置换；F17C、C66A、

C70A、和C306A；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 275

Met Lys Ser Ile Lys Ile Gly Ile Ser Val Tyr Asp Gln Tyr Asp Thr

1 5 10 15

Cys Val Ser Glu Met Met Lys Asp Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Lys Lys

20 25 30

Glu Glu Glu Thr Gly Val Ala Ile Asn Ile Asp Thr Tyr Asn Ala Ser

35 40 45

Ala Ser Gln Ser Thr Gln Asn Ser Gln Val Glu Asn Met Ile Thr Glu

50 55 60

Gly Ala Asp Val Ile Ala Val Asn Leu Val Asp Arg Thr Asp Pro Thr

65 70 75 80

Ala Ile Ile Asp Leu Ala Glu Lys Asn Asn Ile Pro Val Ile Phe Phe

85 90 95

Asn Arg Glu Leu Val Glu Glu Asp Leu Glu Arg Trp Thr Arg Leu Tyr

100 105 110

Tyr Val Gly Ala Gln Ala Phe Glu Ser Gly Ile Met Gln Gly Glu Leu

115 120 125

Ala Ala Glu Ala Phe Leu Thr Asp Gln Ser Leu Asp Lys Asn Gly Asp

130 135 140

Gly Ile Phe Gln Tyr Val Val Leu Glu Gly Glu Ala Gly His Gln Asp

145 150 155 160

Ala Ile Val Arg Thr Glu Tyr Ser Val Ser Thr Met Ile Asp Ser Gly

165 170 175

Val Glu Val Glu Lys Leu Gly Tyr Ala Ile Ala Asn Trp Asn Arg Ala

180 185 190

Gln Ala Gln Thr Lys Met Ala Gln Leu Met Ser Gln Phe Gly Asp Ser

195 200 205

Ile Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile

210 215 220

Asp Ala Leu Lys Ala Ser Gly Leu Thr Lys Asp Glu Trp Pro Ala Val

225 230 235 240

Ile Gly Ile Asp Gly Thr Asp Val Gly Leu Glu Ala Val Lys Asn Lys

245 250 255

Glu Met Ile Gly Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Asp Ala

260 265 270

Met Leu Asn Leu Ala Tyr Glu Leu Ser Thr Gly Ser Asp Leu Ser Asp

275 280 285

Leu Asn Leu Ile Asp Gly Lys Tyr Ile Arg Leu Pro Tyr Ala Arg Val

290 295 300

Thr Ala Asp Asp Val Asp Ser Tyr Met Glu Gly Asp Thr Glu Gly Gly

305 310 315 320

Ser His His His His His His

325

<210> 276

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_B_Q13C（rinGGBP_B，信号序列被M置换；Q13C、C66A、

C70A、和C306A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 276

Met Lys Ser Ile Lys Ile Gly Ile Ser Val Tyr Asp Cys Tyr Asp Thr

1 5 10 15

Phe Val Ser Glu Met Met Lys Asp Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Lys Lys

20 25 30

Glu Glu Glu Thr Gly Val Ala Ile Asn Ile Asp Thr Tyr Asn Ala Ser

35 40 45

Ala Ser Gln Ser Thr Gln Asn Ser Gln Val Glu Asn Met Ile Thr Glu

50 55 60

Gly Ala Asp Val Ile Ala Val Asn Leu Val Asp Arg Thr Asp Pro Thr

65 70 75 80

Ala Ile Ile Asp Leu Ala Glu Lys Asn Asn Ile Pro Val Ile Phe Phe

85 90 95

Asn Arg Glu Leu Val Glu Glu Asp Leu Glu Arg Trp Thr Arg Leu Tyr

100 105 110

Tyr Val Gly Ala Gln Ala Phe Glu Ser Gly Ile Met Gln Gly Glu Leu

115 120 125

Ala Ala Glu Ala Phe Leu Thr Asp Gln Ser Leu Asp Lys Asn Gly Asp

130 135 140

Gly Ile Phe Gln Tyr Val Val Leu Glu Gly Glu Ala Gly His Gln Asp

145 150 155 160

Ala Ile Val Arg Thr Glu Tyr Ser Val Ser Thr Met Ile Asp Ser Gly

165 170 175

Val Glu Val Glu Lys Leu Gly Tyr Ala Ile Ala Asn Trp Asn Arg Ala

180 185 190

Gln Ala Gln Thr Lys Met Ala Gln Leu Met Ser Gln Phe Gly Asp Ser

195 200 205

Ile Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile

210 215 220

Asp Ala Leu Lys Ala Ser Gly Leu Thr Lys Asp Glu Trp Pro Ala Val

225 230 235 240

Ile Gly Ile Asp Gly Thr Asp Val Gly Leu Glu Ala Val Lys Asn Lys

245 250 255

Glu Met Ile Gly Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Asp Ala

260 265 270

Met Leu Asn Leu Ala Tyr Glu Leu Ser Thr Gly Ser Asp Leu Ser Asp

275 280 285

Leu Asn Leu Ile Asp Gly Lys Tyr Ile Arg Leu Pro Tyr Ala Arg Val

290 295 300

Thr Ala Asp Asp Val Asp Ser Tyr Met Glu Gly Asp Thr Glu Gly Gly

305 310 315 320

Ser His His His His His His

325

<210> 277

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> rinGGBP_B_W189C（rinGGBP_B，信号序列被M置换；W189C、

C66A、C70A、和C306A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 277

Met Lys Ser Ile Lys Ile Gly Ile Ser Val Tyr Asp Gln Tyr Asp Thr

1 5 10 15

Phe Val Ser Glu Met Met Lys Asp Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Lys Lys

20 25 30

Glu Glu Glu Thr Gly Val Ala Ile Asn Ile Asp Thr Tyr Asn Ala Ser

35 40 45

Ala Ser Gln Ser Thr Gln Asn Ser Gln Val Glu Asn Met Ile Thr Glu

50 55 60

Gly Ala Asp Val Ile Ala Val Asn Leu Val Asp Arg Thr Asp Pro Thr

65 70 75 80

Ala Ile Ile Asp Leu Ala Glu Lys Asn Asn Ile Pro Val Ile Phe Phe

85 90 95

Asn Arg Glu Leu Val Glu Glu Asp Leu Glu Arg Trp Thr Arg Leu Tyr

100 105 110

Tyr Val Gly Ala Gln Ala Phe Glu Ser Gly Ile Met Gln Gly Glu Leu

115 120 125

Ala Ala Glu Ala Phe Leu Thr Asp Gln Ser Leu Asp Lys Asn Gly Asp

130 135 140

Gly Ile Phe Gln Tyr Val Val Leu Glu Gly Glu Ala Gly His Gln Asp

145 150 155 160

Ala Ile Val Arg Thr Glu Tyr Ser Val Ser Thr Met Ile Asp Ser Gly

165 170 175

Val Glu Val Glu Lys Leu Gly Tyr Ala Ile Ala Asn Cys Asn Arg Ala

180 185 190

Gln Ala Gln Thr Lys Met Ala Gln Leu Met Ser Gln Phe Gly Asp Ser

195 200 205

Ile Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile

210 215 220

Asp Ala Leu Lys Ala Ser Gly Leu Thr Lys Asp Glu Trp Pro Ala Val

225 230 235 240

Ile Gly Ile Asp Gly Thr Asp Val Gly Leu Glu Ala Val Lys Asn Lys

245 250 255

Glu Met Ile Gly Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Asp Ala

260 265 270

Met Leu Asn Leu Ala Tyr Glu Leu Ser Thr Gly Ser Asp Leu Ser Asp

275 280 285

Leu Asn Leu Ile Asp Gly Lys Tyr Ile Arg Leu Pro Tyr Ala Arg Val

290 295 300

Thr Ala Asp Asp Val Asp Ser Tyr Met Glu Gly Asp Thr Glu Gly Gly

305 310 315 320

Ser His His His His His His

325

<210> 278

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> fprGGBP_F12C（fprGGBP，信号序列被M置换；F12C、

C8A、C105A、C106A、C143A、和C205A突变；并且

在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 278

Met Ser Ala Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Gln Cys Ala Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Thr Leu Tyr Arg Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Leu Lys Asp Met Gly

20 25 30

Tyr Ser Val Thr Ile Met Asp Gly Lys Asn Asp Gln Asn Thr Gln Thr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Val Leu Asp Ser Tyr Lys Gly Lys Ala Ala Tyr Val Gly Ala Asp Ala

100 105 110

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115 120 125

Gln Gly Asp Ile Asn Gly Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Ile Met Ala Lys

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Gly Asp Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gln Tyr Arg Thr Glu Tyr Ser Ile

145 150 155 160

Lys Ala Leu Thr Asp Ala Gly Lys Glu Val Glu Cys Leu Tyr Glu Tyr

165 170 175

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180 185 190

Leu Ser Gln Tyr Gly Glu Lys Ile Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp

195 200 205

Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ser Ile Gln Gln Ala Gly Arg Thr

210 215 220

Val Gly Lys Asp Val Tyr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Val Glu Ala

225 230 235 240

Val Gln Asn Val Val Asp Gly Asn Met Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp

245 250 255

Asp Val Gly Gln Ala Thr Lys Ala Ala Glu Ala Thr Lys Leu Phe Val

260 265 270

Glu Gly Lys Asp Val Glu Lys Tyr Tyr Trp Val Asp Tyr Val Lys Val

275 280 285

Thr Lys Asp Asn Ala Ser Gln Tyr Leu Lys Glu Asp Gly Gly Ser His

290 295 300

His His His His His

305

<210> 279

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> fprGGBP_F16C（fprGGBP，信号序列被M置换；F16C、

C8A、C105A、C106A、C143A、和C205A突变；并且

在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 279

Met Ser Ala Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Gln Phe Ala Asp Asn Cys

1 5 10 15

Met Thr Leu Tyr Arg Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Leu Lys Asp Met Gly

20 25 30

Tyr Ser Val Thr Ile Met Asp Gly Lys Asn Asp Gln Asn Thr Gln Thr

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50 55 60

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115 120 125

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130 135 140

Gly Asp Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gln Tyr Arg Thr Glu Tyr Ser Ile

145 150 155 160

Lys Ala Leu Thr Asp Ala Gly Lys Glu Val Glu Cys Leu Tyr Glu Tyr

165 170 175

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180 185 190

Leu Ser Gln Tyr Gly Glu Lys Ile Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp

195 200 205

Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ser Ile Gln Gln Ala Gly Arg Thr

210 215 220

Val Gly Lys Asp Val Tyr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Val Glu Ala

225 230 235 240

Val Gln Asn Val Val Asp Gly Asn Met Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp

245 250 255

Asp Val Gly Gln Ala Thr Lys Ala Ala Glu Ala Thr Lys Leu Phe Val

260 265 270

Glu Gly Lys Asp Val Glu Lys Tyr Tyr Trp Val Asp Tyr Val Lys Val

275 280 285

Thr Lys Asp Asn Ala Ser Gln Tyr Leu Lys Glu Asp Gly Gly Ser His

290 295 300

His His His His His

305

<210> 280

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> fprGGBP_W180C（fprGGBP，信号序列被M置换；W180C、

C8A、C105A、C106A、C143A、和C205A突变；并且在

C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 280

Met Ser Ala Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Gln Phe Ala Asp Asn Phe

1 5 10 15

Met Thr Leu Tyr Arg Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Leu Lys Asp Met Gly

20 25 30

Tyr Ser Val Thr Ile Met Asp Gly Lys Asn Asp Gln Asn Thr Gln Thr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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115 120 125

Gln Gly Asp Ile Asn Gly Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Ile Met Ala Lys

130 135 140

Gly Asp Pro Glu Asn Ile Asp Ala Gln Tyr Arg Thr Glu Tyr Ser Ile

145 150 155 160

Lys Ala Leu Thr Asp Ala Gly Lys Glu Val Glu Cys Leu Tyr Glu Tyr

165 170 175

Leu Asp Asn Cys Asp Gln Thr Thr Ala Gln Gln Asp Val Ala Asn Ala

180 185 190

Leu Ser Gln Tyr Gly Glu Lys Ile Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp

195 200 205

Ala Met Ala Leu Gly Ala Leu Gln Ser Ile Gln Gln Ala Gly Arg Thr

210 215 220

Val Gly Lys Asp Val Tyr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Val Glu Ala

225 230 235 240

Val Gln Asn Val Val Asp Gly Asn Met Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp

245 250 255

Asp Val Gly Gln Ala Thr Lys Ala Ala Glu Ala Thr Lys Leu Phe Val

260 265 270

Glu Gly Lys Asp Val Glu Lys Tyr Tyr Trp Val Asp Tyr Val Lys Val

275 280 285

Thr Lys Asp Asn Ala Ser Gln Tyr Leu Lys Glu Asp Gly Gly Ser His

290 295 300

His His His His His

305

<210> 281

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cljGGBP_F11C（cljGGBP，信号序列被M置换；F11C、

C77A、和C198A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 281

Met Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Cys Asn Asn Thr Trp Ile

1 5 10 15

Thr Glu Leu Lys Asn Glu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Gly Lys Ala Arg

20 25 30

Val Asp Ile Trp Asn Gly Asp Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp Lys

35 40 45

Ile Asn Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asn Val Leu Asp Ile Asn Pro

50 55 60

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65 70 75 80

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130 135 140

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145 150 155 160

Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met Trp

165 170 175

Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Gly Pro Asn Phe Asp Ala Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu

195 200 205

Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly Lys

210 215 220

Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys Ala

225 230 235 240

Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala Lys

245 250 255

Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly Lys

260 265 270

Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Val Thr Asp Gly Lys Tyr

275 280 285

Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp Ala

290 295 300

Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310

<210> 282

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cljGGBP_W15C（cljGGBP，信号序列被M置换；W15C、

C77A、和C198A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 282

Met Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Cys Ile

1 5 10 15

Thr Glu Leu Lys Asn Glu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Gly Lys Ala Arg

20 25 30

Val Asp Ile Trp Asn Gly Asp Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp Lys

35 40 45

Ile Asn Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asn Val Leu Asp Ile Asn Pro

50 55 60

Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Ala Lys Lys Ala

65 70 75 80

Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp Met

85 90 95

Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser

100 105 110

Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His Pro

115 120 125

Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Thr Arg

130 135 140

Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Lys

145 150 155 160

Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met Trp

165 170 175

Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Gly Pro Asn Phe Asp Ala Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu

195 200 205

Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly Lys

210 215 220

Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys Ala

225 230 235 240

Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala Lys

245 250 255

Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly Lys

260 265 270

Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Val Thr Asp Gly Lys Tyr

275 280 285

Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp Ala

290 295 300

Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310

<210> 283

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cljGGBP_W176C（cljGGBP，信号序列被M置换；W176C、

C77A、和C198A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 283

Met Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Trp Ile

1 5 10 15

Thr Glu Leu Lys Asn Glu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Gly Lys Ala Arg

20 25 30

Val Asp Ile Trp Asn Gly Asp Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp Lys

35 40 45

Ile Asn Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asn Val Leu Asp Ile Asn Pro

50 55 60

Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Ala Lys Lys Ala

65 70 75 80

Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp Met

85 90 95

Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln Ser

100 105 110

Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His Pro

115 120 125

Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Thr Arg

130 135 140

Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu Lys

145 150 155 160

Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met Cys

165 170 175

Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser Tyr

180 185 190

Gly Pro Asn Phe Asp Ala Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala Leu

195 200 205

Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly Lys

210 215 220

Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys Ala

225 230 235 240

Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala Lys

245 250 255

Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly Lys

260 265 270

Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Val Thr Asp Gly Lys Tyr

275 280 285

Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp Ala

290 295 300

Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310

<210> 284

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cauGGBP_F12C（cauGGBP，信号序列被M置换；F12C、

C78A、和C199A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 284

Met Glu Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Cys Asn Asn Thr Trp

1 5 10 15

Ile Thr Glu Leu Lys Asn Glu Met Tyr Lys Val Ser Asn Gly Lys Ala

20 25 30

Arg Val Asp Ile Trp Asn Gly Asn Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Ser Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asp Val Leu Asp Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Ala Lys Lys

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp

85 90 95

Val Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His

115 120 125

Pro Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Met

130 135 140

Arg Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu

145 150 155 160

Glu Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met

165 170 175

Trp Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Gly Pro Asn Phe Asp Ala Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala

195 200 205

Leu Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly

210 215 220

Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys

225 230 235 240

Ala Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala

245 250 255

Lys Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly

260 265 270

Lys Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Ile Thr Asp Gly Lys

275 280 285

Tyr Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp

290 295 300

Ala Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 285

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cauGGBP_W16C（cauGGBP，信号序列被M置换；W16C、

C78A、和C199A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 285

Met Glu Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Cys

1 5 10 15

Ile Thr Glu Leu Lys Asn Glu Met Tyr Lys Val Ser Asn Gly Lys Ala

20 25 30

Arg Val Asp Ile Trp Asn Gly Asn Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Ser Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asp Val Leu Asp Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Ala Lys Lys

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp

85 90 95

Val Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His

115 120 125

Pro Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Met

130 135 140

Arg Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu

145 150 155 160

Glu Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met

165 170 175

Trp Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Gly Pro Asn Phe Asp Ala Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala

195 200 205

Leu Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly

210 215 220

Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys

225 230 235 240

Ala Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala

245 250 255

Lys Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly

260 265 270

Lys Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Ile Thr Asp Gly Lys

275 280 285

Tyr Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp

290 295 300

Ala Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 286

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cauGGBP_W177C（cauGGBP，信号序列被M置换；W177C、

C78A、和C199A突变；并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 286

Met Glu Pro Val Ile Gly Phe Val Ala Tyr Glu Phe Asn Asn Thr Trp

1 5 10 15

Ile Thr Glu Leu Lys Asn Glu Met Tyr Lys Val Ser Asn Gly Lys Ala

20 25 30

Arg Val Asp Ile Trp Asn Gly Asn Asn Ile Gln Thr Val Glu Asn Asp

35 40 45

Lys Ile Ser Leu Phe Ile Asn Arg Lys Val Asp Val Leu Asp Ile Asn

50 55 60

Pro Val Asp Val Asn Ala Ala Gly Gln Ile Ile Glu Lys Ala Lys Lys

65 70 75 80

Ala Asn Ile Pro Thr Val Phe Val Asn Arg Gln Pro Lys Lys Glu Asp

85 90 95

Val Glu Lys Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gln Met Leu Val Asn Tyr Phe Lys Gly His

115 120 125

Pro Thr Gln Asp Gly Thr Ile Arg Tyr Ile Met Leu Lys Gly Glu Met

130 135 140

Arg Asn Gln Asp Ala Glu Lys Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Lys Ala Leu

145 150 155 160

Glu Asp Ser Gly Phe Lys Val Gln Lys Val Ala Glu Asp Thr Ala Met

165 170 175

Cys Asp Arg Thr Lys Ala Gln Glu Lys Met Thr Ser Phe Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Gly Pro Asn Phe Asp Ala Val Ile Ala Asn Asn Asp Asp Met Ala

195 200 205

Leu Gly Ala Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Phe Asn Gly Gly

210 215 220

Lys Tyr Val Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr Ala Pro Ala Val Lys

225 230 235 240

Ala Val Glu Asp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Ala

245 250 255

Lys Gln Gly Asp Ala Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Leu Ser Lys Gly

260 265 270

Lys Ile Pro Asp Glu Ser Asn Phe Lys Tyr Lys Ile Thr Asp Gly Lys

275 280 285

Tyr Ile Trp Ile Asp Tyr Lys Met Ile Thr Lys Glu Asn Val Gln Asp

290 295 300

Ala Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 287

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> erhGGBP_F13C（erhGGBP，信号序列被M置换；F13C突变；

并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 287

Met Lys Thr Tyr Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Cys Asp Asp Asn

1 5 10 15

Phe Met Thr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Ala Ser Tyr Phe Lys Glu Val

20 25 30

Gly Glu Lys Asp Gly Asn Thr Tyr Lys Leu Asp Ile Gln Asp Gly Lys

35 40 45

Gln Asp Gln Ala Asn Gln Thr Glu Gln Ile Asn Asn Phe Ile Ala Gln

50 55 60

Gly Lys Asp Leu Ile Ile Ala Asn Met Val Asp Pro Thr Ala Ala Gly

65 70 75 80

Ser Ile Ile Asn Ser Ala Lys Ala Lys Glu Ile Pro Val Val Phe Ile

85 90 95

Asn Arg Glu Pro Glu Thr Gln Glu Leu Glu Ile Trp Pro Gly Lys Thr

100 105 110

Thr Tyr Val Gly Ala Asp Ala Thr Gln Ser Gly Thr Ile Gln Gly Tyr

115 120 125

Met Ile Ala Asn Leu Glu Asn Lys Gly Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser

130 135 140

Val Ser Tyr Ile Thr Leu Met Gly Asp Pro Ala Asn Val Asp Ala Lys

145 150 155 160

Gln Arg Thr Glu Tyr Ser Val Lys Gly Leu Glu Glu Lys Gly Val Lys

165 170 175

Thr Asn Ala Leu Ala Gln Pro Tyr Gln Ala Asn Trp Asp Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gln Glu Phe Thr Ala Asn Ala Leu Glu Gln Phe Gly Asn Lys Leu

195 200 205

Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp Gly Met Ala Val Gly Ala Val Thr

210 215 220

Ala Ile Glu Ala Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Asp Ile Phe Val Val

225 230 235 240

Gly Val Asp Ala Ile Pro Asp Ala Ile Glu Leu Leu Lys Gly Gly Lys

245 250 255

Leu Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp His Phe Asn Gln Ser His Thr Ala

260 265 270

Val Asp Val Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gly Lys Asp Val Ser Ala Tyr

275 280 285

Tyr Trp His Asp Tyr Val Gly Val Thr Lys Pro Glu Glu Ala Glu Leu

290 295 300

Lys Arg Ala Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val Glu Glu Ala Val Lys Arg

305 310 315 320

Tyr Ala Glu Arg Asp Ala Gln Gly Gly Ser His His His His His His

325 330 335

<210> 288

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> erhGGBP_F17C（erhGGBP，信号序列被M置换；F17C突变；

并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 288

Met Lys Thr Tyr Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Asn

1 5 10 15

Cys Met Thr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Ala Ser Tyr Phe Lys Glu Val

20 25 30

Gly Glu Lys Asp Gly Asn Thr Tyr Lys Leu Asp Ile Gln Asp Gly Lys

35 40 45

Gln Asp Gln Ala Asn Gln Thr Glu Gln Ile Asn Asn Phe Ile Ala Gln

50 55 60

Gly Lys Asp Leu Ile Ile Ala Asn Met Val Asp Pro Thr Ala Ala Gly

65 70 75 80

Ser Ile Ile Asn Ser Ala Lys Ala Lys Glu Ile Pro Val Val Phe Ile

85 90 95

Asn Arg Glu Pro Glu Thr Gln Glu Leu Glu Ile Trp Pro Gly Lys Thr

100 105 110

Thr Tyr Val Gly Ala Asp Ala Thr Gln Ser Gly Thr Ile Gln Gly Tyr

115 120 125

Met Ile Ala Asn Leu Glu Asn Lys Gly Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser

130 135 140

Val Ser Tyr Ile Thr Leu Met Gly Asp Pro Ala Asn Val Asp Ala Lys

145 150 155 160

Gln Arg Thr Glu Tyr Ser Val Lys Gly Leu Glu Glu Lys Gly Val Lys

165 170 175

Thr Asn Ala Leu Ala Gln Pro Tyr Gln Ala Asn Trp Asp Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gln Glu Phe Thr Ala Asn Ala Leu Glu Gln Phe Gly Asn Lys Leu

195 200 205

Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp Gly Met Ala Val Gly Ala Val Thr

210 215 220

Ala Ile Glu Ala Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Asp Ile Phe Val Val

225 230 235 240

Gly Val Asp Ala Ile Pro Asp Ala Ile Glu Leu Leu Lys Gly Gly Lys

245 250 255

Leu Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp His Phe Asn Gln Ser His Thr Ala

260 265 270

Val Asp Val Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gly Lys Asp Val Ser Ala Tyr

275 280 285

Tyr Trp His Asp Tyr Val Gly Val Thr Lys Pro Glu Glu Ala Glu Leu

290 295 300

Lys Arg Ala Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val Glu Glu Ala Val Lys Arg

305 310 315 320

Tyr Ala Glu Arg Asp Ala Gln Gly Gly Ser His His His His His His

325 330 335

<210> 289

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> erhGGBP_W188C（erhGGBP，信号序列被M置换；W188C突变；

并且在C-末端具有GGSHHHHHH）

<400> 289

Met Lys Thr Tyr Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Asn

1 5 10 15

Phe Met Thr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Ala Ser Tyr Phe Lys Glu Val

20 25 30

Gly Glu Lys Asp Gly Asn Thr Tyr Lys Leu Asp Ile Gln Asp Gly Lys

35 40 45

Gln Asp Gln Ala Asn Gln Thr Glu Gln Ile Asn Asn Phe Ile Ala Gln

50 55 60

Gly Lys Asp Leu Ile Ile Ala Asn Met Val Asp Pro Thr Ala Ala Gly

65 70 75 80

Ser Ile Ile Asn Ser Ala Lys Ala Lys Glu Ile Pro Val Val Phe Ile

85 90 95

Asn Arg Glu Pro Glu Thr Gln Glu Leu Glu Ile Trp Pro Gly Lys Thr

100 105 110

Thr Tyr Val Gly Ala Asp Ala Thr Gln Ser Gly Thr Ile Gln Gly Tyr

115 120 125

Met Ile Ala Asn Leu Glu Asn Lys Gly Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser

130 135 140

Val Ser Tyr Ile Thr Leu Met Gly Asp Pro Ala Asn Val Asp Ala Lys

145 150 155 160

Gln Arg Thr Glu Tyr Ser Val Lys Gly Leu Glu Glu Lys Gly Val Lys

165 170 175

Thr Asn Ala Leu Ala Gln Pro Tyr Gln Ala Asn Cys Asp Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gln Glu Phe Thr Ala Asn Ala Leu Glu Gln Phe Gly Asn Lys Leu

195 200 205

Glu Val Val Phe Ala Asn Asn Asp Gly Met Ala Val Gly Ala Val Thr

210 215 220

Ala Ile Glu Ala Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Asp Ile Phe Val Val

225 230 235 240

Gly Val Asp Ala Ile Pro Asp Ala Ile Glu Leu Leu Lys Gly Gly Lys

245 250 255

Leu Thr Gly Thr Val Leu Asn Asp His Phe Asn Gln Ser His Thr Ala

260 265 270

Val Asp Val Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gly Lys Asp Val Ser Ala Tyr

275 280 285

Tyr Trp His Asp Tyr Val Gly Val Thr Lys Pro Glu Glu Ala Glu Leu

290 295 300

Lys Arg Ala Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val Glu Glu Ala Val Lys Arg

305 310 315 320

Tyr Ala Glu Arg Asp Ala Gln Gly Gly Ser His His His His His His

325 330 335

<210> 290

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ereGGBP_F17C（ereGGBP，信号序列被M置换；F17C、C10A、

C29A、C65A、C69A、和C183A突变；并且在C-末端具有

GGSHHHHHH）

<400> 290

Met Lys Gln Ile Tyr Ile Gly Val Thr Ala Tyr Asp Gln Lys Asp Thr

1 5 10 15

Cys Ile Gly Glu Leu Ile Glu Thr Phe Lys Lys Glu Ala Ala Ser Leu

20 25 30

Asp Thr Asp Lys Tyr Asp Ile Ser Met Thr Ile Met Asp Ala Ala Gly

35 40 45

Ser Gln Arg Ala Gln Asp Asp Gln Val Gln Glu Met Ile Glu Asp Gly

50 55 60

Ala Asn Val Leu Ala Ile Asn Leu Ala Asp Arg Thr Asp Leu Ser His

65 70 75 80

Ile Ile Asn Ala Ala Met Glu Lys Asp Ile Pro Ile Ile Phe Phe Asn

85 90 95

Arg Glu Pro Val Asp Glu Asp Leu Asn Arg Trp Asp Lys Leu Tyr Tyr

100 105 110

Val Gly Ala Lys Ala Lys Gln Ser Gly Gln Met Gln Gly Glu Leu Ile

115 120 125

Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Asn Pro Gly Val Asp Lys Asn Gly Asp Gly

130 135 140

Arg Ile Gln Tyr Val Ile Leu Glu Gly Glu Met Gly His Gln Asp Ala

145 150 155 160

Ile Val Arg Thr Glu Ser Val Thr Glu Ser Met Lys Asn Asn Gly Leu

165 170 175

Gln Ile Glu Lys Leu Ser Ala Gln Ile Ala Asn Trp Asn Arg Ala Gln

180 185 190

Ala Gln Asn Arg Met Thr Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Lys Asn Ser Ile

195 200 205

Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Asp

210 215 220

Ala Tyr Glu Lys Leu Gly Val Thr Glu Ser Asn Val Pro Ala Phe Phe

225 230 235 240

Gly Val Asp Gly Thr Asp Asp Gly Leu Glu Ala Val Gln Gln Ser Lys

245 250 255

Leu Ala Ala Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Met Ala Met

260 265 270

Ala Gln Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Thr Gly Gly Ser Met Lys Asn Ile

275 280 285

Lys Phe Glu Asp Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Glu Lys Val Thr

290 295 300

Pro Asp Asn Val Asn Glu Phe Val Lys Asp Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 291

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ereGGBP_Q13C（ereGGBP，信号序列被M置换；Q13C、C10A、

C29A、C65A、C69A、和C183A突变；并且在C-末端具有

GGSHHHHHH）

<400> 291

Met Lys Gln Ile Tyr Ile Gly Val Thr Ala Tyr Asp Cys Lys Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Gly Glu Leu Ile Glu Thr Phe Lys Lys Glu Ala Ala Ser Leu

20 25 30

Asp Thr Asp Lys Tyr Asp Ile Ser Met Thr Ile Met Asp Ala Ala Gly

35 40 45

Ser Gln Arg Ala Gln Asp Asp Gln Val Gln Glu Met Ile Glu Asp Gly

50 55 60

Ala Asn Val Leu Ala Ile Asn Leu Ala Asp Arg Thr Asp Leu Ser His

65 70 75 80

Ile Ile Asn Ala Ala Met Glu Lys Asp Ile Pro Ile Ile Phe Phe Asn

85 90 95

Arg Glu Pro Val Asp Glu Asp Leu Asn Arg Trp Asp Lys Leu Tyr Tyr

100 105 110

Val Gly Ala Lys Ala Lys Gln Ser Gly Gln Met Gln Gly Glu Leu Ile

115 120 125

Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Asn Pro Gly Val Asp Lys Asn Gly Asp Gly

130 135 140

Arg Ile Gln Tyr Val Ile Leu Glu Gly Glu Met Gly His Gln Asp Ala

145 150 155 160

Ile Val Arg Thr Glu Ser Val Thr Glu Ser Met Lys Asn Asn Gly Leu

165 170 175

Gln Ile Glu Lys Leu Ser Ala Gln Ile Ala Asn Trp Asn Arg Ala Gln

180 185 190

Ala Gln Asn Arg Met Thr Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Lys Asn Ser Ile

195 200 205

Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Asp

210 215 220

Ala Tyr Glu Lys Leu Gly Val Thr Glu Ser Asn Val Pro Ala Phe Phe

225 230 235 240

Gly Val Asp Gly Thr Asp Asp Gly Leu Glu Ala Val Gln Gln Ser Lys

245 250 255

Leu Ala Ala Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Met Ala Met

260 265 270

Ala Gln Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Thr Gly Gly Ser Met Lys Asn Ile

275 280 285

Lys Phe Glu Asp Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Glu Lys Val Thr

290 295 300

Pro Asp Asn Val Asn Glu Phe Val Lys Asp Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 292

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ereGGBP_W188C（ereGGBP，信号序列被M置换；W188C、

C10A、C29A、C65A、C69A、和C183A突变；并且在C-末端

具有GGSHHHHHH）

<400> 292

Met Lys Gln Ile Tyr Ile Gly Val Thr Ala Tyr Asp Gln Lys Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Gly Glu Leu Ile Glu Thr Phe Lys Lys Glu Ala Ala Ser Leu

20 25 30

Asp Thr Asp Lys Tyr Asp Ile Ser Met Thr Ile Met Asp Ala Ala Gly

35 40 45

Ser Gln Arg Ala Gln Asp Asp Gln Val Gln Glu Met Ile Glu Asp Gly

50 55 60

Ala Asn Val Leu Ala Ile Asn Leu Ala Asp Arg Thr Asp Leu Ser His

65 70 75 80

Ile Ile Asn Ala Ala Met Glu Lys Asp Ile Pro Ile Ile Phe Phe Asn

85 90 95

Arg Glu Pro Val Asp Glu Asp Leu Asn Arg Trp Asp Lys Leu Tyr Tyr

100 105 110

Val Gly Ala Lys Ala Lys Gln Ser Gly Gln Met Gln Gly Glu Leu Ile

115 120 125

Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Asn Pro Gly Val Asp Lys Asn Gly Asp Gly

130 135 140

Arg Ile Gln Tyr Val Ile Leu Glu Gly Glu Met Gly His Gln Asp Ala

145 150 155 160

Ile Val Arg Thr Glu Ser Val Thr Glu Ser Met Lys Asn Asn Gly Leu

165 170 175

Gln Ile Glu Lys Leu Ser Ala Gln Ile Ala Asn Cys Asn Arg Ala Gln

180 185 190

Ala Gln Asn Arg Met Thr Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Lys Asn Ser Ile

195 200 205

Glu Leu Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Leu Gly Ala Ile Asp

210 215 220

Ala Tyr Glu Lys Leu Gly Val Thr Glu Ser Asn Val Pro Ala Phe Phe

225 230 235 240

Gly Val Asp Gly Thr Asp Asp Gly Leu Glu Ala Val Gln Gln Ser Lys

245 250 255

Leu Ala Ala Thr Val Tyr Asn Asp Lys Glu Gly Gln Ala Met Ala Met

260 265 270

Ala Gln Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Thr Gly Gly Ser Met Lys Asn Ile

275 280 285

Lys Phe Glu Asp Lys Lys Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Glu Lys Val Thr

290 295 300

Pro Asp Asn Val Asn Glu Phe Val Lys Asp Glu Gln Gly Gly Ser His

305 310 315 320

His His His His His

325

<210> 293

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bZif序列

<400> 293

Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser

1 5 10 15

Arg Ser

<210> 294

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ZF-QNK

<400> 294

Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser

1 5 10 15

Arg Ser Asp His Leu Ser Arg His Gln Arg Thr His Gln Asn Lys Lys

20 25 30

<210> 295

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 六聚组氨酸标签

<400> 295

His His His His His His

1 5

<210> 296

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 六聚赖氨酸标签

<400> 296

Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1 5

<210> 297

<211> 319

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ecGGBP.F16C（信号肽被M置换；F16C突变；并且在C-末端

具有GGSHHHHHH）

<400> 297

Met Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr Ile Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn

1 5 10 15

Cys Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu Gln Asp Ala Lys Ala Ala

20 25 30

Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser Gln Asn Asp Gln Ser Lys

35 40 45

Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala Lys Gly Val Lys Ala Leu

50 55 60

Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala Gly Thr Val Ile Glu Lys

65 70 75 80

Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Ser

85 90 95

Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Asp

100 105 110

Ser Lys Glu Ser Gly Ile Ile Gln Gly Asp Leu Ile Ala Lys His Trp

115 120 125

Ala Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys Asp Gly Gln Ile Gln Phe

130 135 140

Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr

145 150 155 160

Thr Tyr Val Ile Lys Glu Leu Asn Asp Lys Gly Ile Lys Thr Glu Gln

165 170 175

Leu Gln Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp Thr Ala Gln Ala Lys Asp Lys

180 185 190

Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala Asn Lys Ile Glu Val Val

195 200 205

Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly Ala Val Glu Ala Leu Lys

210 215 220

Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe Gly Val Asp Ala Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu

245 250 255

Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu Ala Lys Asn

260 265 270

Leu Ala Asp Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly Thr Asn Trp Lys Ile Asp

275 280 285

Asn Lys Val Val Arg Val Pro Tyr Val Gly Val Asp Lys Asp Asn Leu

290 295 300

Ala Glu Phe Ser Lys Lys Gly Gly Ser His His His His His His

305 310 315

<210> 298

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ttGGBP182C.2.0（亲和力调整突变体，182C背景（表6），

信号肽被M置换）

<400> 298

Met Lys Gln Leu Asn Ile Gly Val Ala Ile Tyr Lys Phe Asp Asp Thr

1 5 10 15

Phe Met Thr Gly Val Arg Asn Ala Met Thr Ala Glu Ala Gln Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Leu Asn Met Val Asp Ser Gln Asn Ser Gln Pro Thr Gln Asn

35 40 45

Asp Gln Val Asp Leu Phe Ile Thr Lys Lys Met Asn Ala Leu Ala Ile

50 55 60

Asn Pro Val Asp Arg Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ile Asp Lys Ala Lys

65 70 75 80

Gln Ala Asn Ile Pro Val Val Phe Phe Asn Lys Glu Pro Leu Pro Glu

85 90 95

Asp Met Lys Lys Trp Asp Lys Val Tyr Tyr Val Gly Ala Lys Ala Glu

100 105 110

Gln Ser Gly Ile Leu Gln Gly Gln Ile Met Ala Asp Tyr Trp Lys Ala

115 120 125

His Pro Glu Ala Asp Lys Asn His Asp Gly Val Met Gln Tyr Val Met

130 135 140

Leu Met Gly Glu Pro Gly His Gln Asp Ala Ile Leu Arg Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Gln Thr Val Lys Asp Ala Gly Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Asn Cys Asp Arg Val Thr Ala His Asp Lys Met Ala

180 185 190

Ala Trp Leu Ser Ser Phe Gly Asp Lys Ile Glu Ala Val Phe Ala Asn

195 200 205

Asn Asp Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Tyr Phe Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Pro Val Val Gly Val Asp Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Ile Gln Ala Ile Lys Asp Gly Thr Leu Leu Gly Thr Val

245 250 255

Leu Asn Asp Ala Lys Asn Gln Ala Lys Ala Thr Phe Asn Ile Ala Tyr

260 265 270

Glu Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Thr Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Asp

275 280 285

Ile Thr Asp Gly Lys Tyr Val Trp Ile Pro Tyr Lys Lys Ile Thr Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Gln

305 310

Claims

1.一种用于配体的生物传感器，该生物传感器包括配体结合蛋白和与所述配体结合蛋白附接的报告基团，其中所述配体与所述配体结合蛋白的配体结合结构域的结合引起通过所述报告基团进行的信号传导的改变，

其中所述配体包括葡萄糖或半乳糖，并且

其中如果所述配体结合蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli/E.coli)葡萄糖-半乳糖结合蛋白，则所述配体结合蛋白包括除氨基酸Y10、D14、N15、F16、N91、K92、E93、S112、S115、E149、H152、D154、A155、R158、M182、W183、N211、D236、L255、N256、D257、P294、或V296的突变以外的突变，其中每个氨基酸位置按照在(SEQ ID NO:17)中进行编号。

2.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白包括如SEQ ID NO:298所示的序列中的氨基酸。

3.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白与天然存在的蛋白质相比包括突变。

4.如权利要求3所述的生物传感器，其中该配体结合蛋白的至少一个氨基酸已经被半胱氨酸取代。

5.如权利要求3所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白与该天然存在的蛋白质相比不具有缺失或插入。

6.如权利要求3所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白与该天然存在的蛋白质相比包括(i)少于约5个、4个、3个、2个、或1个插入的氨基酸，和/或(ii)少于约5个、4个、3个、2个、或1个缺失的氨基酸。

7.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白包括微生物葡萄糖-半乳糖结合蛋白的突变体。

8.如权利要求7所述的生物传感器，其中所述突变体与该微生物葡萄糖-半乳糖结合蛋白相比包括突变，该突变改变该突变体对葡萄糖和/或半乳糖的亲和力和/或特异性。

9.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白是以下各项或是以下各项的突变体：埃希氏菌属物种GGBP；热厌氧杆菌属物种GGBP；梭菌属物种GGBP；沙门氏菌属物种GGBP；热解纤维素菌属物种GGBP；类芽孢杆菌属物种GGBP；丁酸弧菌属物种GGBP；罗氏菌属物种GGBP；粪杆菌属物种GGBP；丹毒丝菌属物种GGBP；或真杆菌属物种GGBP。

10.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白是以下各项或是以下各项的突变体：大肠杆菌GGBP(ecGGBP；SEQ ID NO:1或16)；热解糖热厌氧杆菌GGBP(ttGGBP；SEQID NO:2或18)；鼠伤寒沙门氏菌GGBP(stGGBP；SEQ ID NO:3或19)；热水热解纤维素菌GGBP(chyGGBP；SEQ ID NO:4或20)；黑曜石热解纤维素菌GGBP(cobGGBP；SEQ ID NO:5或21)；类芽孢杆菌属物种GGBP(pspGGBP；SEQ ID NO:6或22)；解糖梭菌GGBP(csaGGBP；SEQ ID NO:7或23)；自产乙醇梭菌GGBP(cauGGBP；SEQ ID NO:12或28)；扬氏梭菌GGBP(cljGGBP；SEQ IDNO:11或27)；分裂蛋白丁酸弧菌GGBP(bprGGBP；SEQ ID NO:8或24)；肠罗氏菌GGBP(rinGGBP_A；SEQ ID NO:9或25；或者rinGGBP_B；SEQ ID NO:13或29)；普拉粪杆菌GGBP(fprGGBP；SEQ ID NO:10或26)；红斑丹毒丝菌GGBP(erhGGBP；SEQ ID NO:14或30)；或直肠真杆菌GGBP(ereGGBP；SEQ ID NO:15或31)。

11.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述葡萄糖-半乳糖结合蛋白包括与以下各项的氨基酸序列具有在10％与100％之间的一致性的氨基酸序列：ecGGBP(SEQ ID NO:1或16)；ttGGBP(SEQ ID NO:2或18)；stGGBP(SEQ ID NO:3或19)；chyGGBP(SEQ ID NO:4或20)；pspGGBP(SEQ ID NO:6或22)；csaGGBP(SEQ ID NO:7或23)；bprGGBP(SEQ ID NO:8或24)；rinGGBP_A(SEQ ID NO:9或25)；rinGGBP_B(SEQ ID NO:13或29)；fprGGBP(SEQ ID NO:10或26)；cljGGBP(SEQ ID NO:11或27)；cauGGBP(SEQ ID NO:12或28)；erhGGBP(SEQ ID NO:14或30)；和/或ereGGBP(SEQ ID NO:15或31)。

12.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白包括

(a)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置10的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(b)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置14的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(c)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置91的一段连续氨基酸具有至少约50％、55％、60％、65％、75％、80％、85％、90％、或95％的一致性；

(d)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置149的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(e)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置150的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(f)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置155的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(g)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置160的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(h)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置183的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(i)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置210的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(j)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置235的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(k)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置240的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；

(l)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置255的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性；或

(m)一段至少5个氨基酸，该段氨基酸与包括ecGGBP的位置260的一段连续氨基酸具有至少约50％的一致性，

其中每个ecGGBP氨基酸位置按照在SEQ ID NO:17中进行编号。

13.如权利要求1所述的生物传感器，其中当所述配体结合蛋白与ecGGBP共享主要互补表面(PCS)时，其中ecGGBP的该PCS包括位置14、16、91、152、154、158、183、211、236、和256，其中每个位置按照在SEQ ID NO:17中进行计数。

14.如权利要求13所述的生物传感器，其中当所述配体结合蛋白的氨基酸序列与ecGGBP(SEQ ID NO:17)比对时，则所述氨基酸序列包括

(i)在与ecGGBP的位置14比对的位置处的D或N；

(ii)在与ecGGBP的位置16比对的位置处的F、Y或W；

(iii)在与ecGGBP的位置91比对的位置处的N或D；

(iv)在与ecGGBP的位置152比对的位置处的H、N或Q；

(v)在与ecGGBP的位置154比对的位置处的D或N；

(vi)在与ecGGBP的位置158比对的位置处的R；

(vii)在与ecGGBP的位置183比对的位置处的W、F或Y；

(viii)在与ecGGBP的位置211比对的位置处的N或D；

(ix)在与ecGGBP的位置236比对的位置处的D或N；以及

(x)在与ecGGBP的位置256比对的位置处的N或D。

15.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白从N-末端至C-末端包括：第一β-折叠(β1)，接着是第一α-螺旋(α1)，接着是第二β-折叠(β2)，接着是第二α-螺旋(α2)，接着是第三β-折叠(β3)，接着是第三α-螺旋(α3)，接着是第四β-折叠(β4)，接着是第四α-螺旋(α4)，接着是第五β-折叠(β5)，接着是第一结构域间铰链区段(h1)，接着是第五α-螺旋(α5)，接着是第六β-折叠(β6)，接着是第六α-螺旋(α6)，接着是第七β-折叠(β7)，接着是第七α-螺旋(α7)，接着是第八β-折叠(β8)，接着是第八α-螺旋(α8)，接着是第九β-折叠(β9)，接着是第九α-螺旋(α9)，接着是第十β-折叠(β10)，接着是第二结构域间铰链区段(h2)，接着是第十α-螺旋(α10)，接着是第三结构域间铰链区段(h3)，接着是第十一β-折叠(β11)。

16.如权利要求15所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白包括(i)1个、2个或3个在β1与α1之间的氨基酸取代；(ii)1个、2个或3个在β2与α2之间的氨基酸取代；(iii)1个、2个或3个在β3与α3之间的氨基酸取代；(iv)1个、2个或3个在β4与α4之间的氨基酸取代；(v)1个、2个或3个在β6中的氨基酸取代；(vi)1个、2个或3个在α6中的氨基酸取代；(vii)1个、2个或3个在β7与α7之间的氨基酸取代；(viii)1个、2个或3个在α8中的氨基酸取代；和/或(ix)1个、2个或3个在β9与α9之间的氨基酸取代。

17.如权利要求1所述的生物传感器，其中在该配体结合多肽的主链与ecGGBP、ttGGBP、stGGBP、chyGGBP、cobGGBP、pspGGBP、csaGGBP、bprGGBP、rinGGBP_A、rinGGBP_B、fprGGBP、cljGGBP、cauGGBP、erhGGBP、ereGGBP、和/或chyGGBP之间的C_α均方根偏差(RMSD)是在约或之间，或小于约或

18.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白是ecGGBP的包括一个或多个以下取代的突变体：Y10X、D14X、N15X、F16X、P70X、N91X、K92X、S112X、S115X、E149X、H152X、P153X、D154X、A155X、R158X、M182X、W183X、N211X、D212X、D236X、L238X、D257X、P294X、和V296X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在不包括信号肽的ecGGBP(SEQ ID NO:17)中进行计数。

19.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述配体结合蛋白是ttGGBP的包括一个或多个以下取代的突变体：Y11X、D15X、T16X、F17X、G20X、N42X、V67X、R69X、R91X、E92X、A111X、Q148X、H151X、Q152X、A154X、N181X、W182X、D183X、D211X、T237X、T240X、L257X、N258X、D259X、A260X、和K300X，其中X是任何氨基酸、导致保守取代的氨基酸、或半胱氨酸，并且其中每个位置在不包括信号肽的ttGGBP(SEQ ID NO:18)中进行计数。

20.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述报告基团共价附接至所述配体结合蛋白。

21.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述报告基团非共价附接至所述配体结合蛋白。

22.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述报告基团附接至该配体结合蛋白的如下氨基酸，当该配体与该配体结合蛋白结合时，该氨基酸与该配体相距至少约0.1-100埃

23.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述报告基团与该配体结合蛋白的半胱氨酸轭合。

24.如权利要求23所述的生物传感器，其中所述半胱氨酸位于所述配体结合蛋白的N-末端或C-末端处。

25.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述报告基团包括荧光团，并且其中所述信号包括荧光信号。

26.如权利要求25所述的生物传感器，其中当所述荧光团内原子的位置相对于彼此改变时，所述荧光团的发射波长和/或强度改变。

27.如权利要求25所述的生物传感器，其中当(i)所述荧光团的一部分与所述荧光团的另一部分相比围绕键轴旋转时和/或(ii)当在所述荧光团的两个原子之间的键的角度改变时，所述荧光团的发射波长和/或强度改变。

28.如权利要求25所述的生物传感器，其中当正电荷或负电荷源在所述荧光团的约1、2、3、4、5或内改变其相对于所述荧光团的距离时，所述荧光团的发射波长和/或强度改变。

29.如权利要求25所述的生物传感器，其中所述荧光团的发射光谱在配体与所述配体结合蛋白的该配体结合结构域结合时表现出蓝移或红移。

30.如权利要求25所述的生物传感器，其中所述荧光团具有包括约400-800纳米(nm)波长的发射波长。

31.如权利要求25所述的生物传感器，其中所述荧光团包括5-碘乙酰胺基荧光素(5IAF)或6-碘乙酰胺基荧光素(6IAF)、罗丹明、俄勒冈绿、曙红、德克萨斯红、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫代碳菁、份菁、Badan、Acrylodan、IAEDANS、包括3-氰基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素-3-甲酸、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素、或7-氨基-4-甲基香豆素、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、DRAQ5、DRAQ7或CyTRAK橙、瀑布蓝、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、金胺、结晶紫、孔雀石绿、卟吩、酞菁、胆红素、芘、N,N'-二甲基-N-(碘乙酰基)-N'-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)乙二胺(NBD)、N-((2-(碘乙酰氧基)乙基)N-甲基)氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBDE)、Acrylodan、JPW4039、JPW4042、JPW4045、俄勒冈绿、太平洋蓝、N,N'-二甲基-N-(碘乙酰基)-N'-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)乙二胺(IANBD)、7-二乙基氨基-3-(4'-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基香豆素(CPM)、BODIPY 499、BODIPY 507、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Cy5、或1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐(PyMPO马来酰亚胺)(PyMPO)。

32.如权利要求25所述的生物传感器，该生物传感器包括Acrylodan(6-丙烯酰基-2-二甲氨基萘)或Badan(6-溴-乙酰基-2-二甲氨基萘)或其衍生物。

33.如权利要求32所述的生物传感器，其中所述衍生物包括用三环蒽、芴或苯乙烯置换Acrylodan或Badan的双环萘。

34.如权利要求25所述的生物传感器，其中所述荧光团包括荧光蛋白。

35.如权利要求34所述的生物传感器，其中所述荧光蛋白当与激发辐射接触时发射蓝色、青色、绿色、黄色、橙色、红色、远红外、或近红外辐射。

36.一种检测样品中配体的存在的方法，该方法包括：

(a)使如权利要求1所述的生物传感器与该样品接触；

(b)测量来自该生物传感器的信号；和

(c)将该信号与无配体对照进行比较，其中信号差异表明在该样品中存在配体，并且

其中该配体包括葡萄糖、半乳糖或其组合。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述生物传感器的报告基团是荧光的，并且其中所述方法进一步包括使所述报告基团与具有如下波长的电磁辐射接触，该波长包括在该报告基团的激发波长带内的波长。

38.如权利要求36所述的方法，该方法进一步包括将该信号与当与含有已知量的配体的对照样品接触时来自该生物传感器的信号进行比较。

39.如权利要求36所述的方法，该方法进一步包括(i)将该信号与当与含有已知量的配体的所述一系列对照样品接触时来自该生物传感器的信号进行比较；和(ii)基于所述比较确定所述样品中配体的量。

40.如权利要求39所述的方法，其中该系列对照样品包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个对照样品，并且其中每个对照样品包括不同量的配体。

41.如权利要求36所述的方法，该方法进一步包括确定样品中配体的浓度，其中确定所述样品中所述配体的浓度包括将该信号与标准双曲线配体结合曲线进行比较以确定在该测试样品中该配体的浓度，其中该标准双曲线配体结合曲线通过测量当与含有已知浓度的配体的对照样品接触时由该生物传感器产生的信号来制备。

42.如权利要求36所述的方法，该方法进一步包括测量由所述报告基团产生的信号的比率变化(ΔR)和/或强度变化(ΔI)。

43.如权利要求42所述的方法，其中测量由所述报告基团产生的信号的比例变化(ΔR)包括将所述报告基团的比率信号(R_1,2)与对照样品的比率信号(R_1,2)进行比较。

44.如权利要求43所述的方法，其中(R_1,2)是在两个独立波长λ₁和λ₂处测量的两个强度I_λ1和I_λ2的商，并且根据以下等式进行计算：

R_1,2＝I_λ1I_λ2，其中λ₁是452nm，并且λ₂是528nm。

45.如权利要求43所述的方法，其中(R_1,2)是在两个独立的波长范围λ₁和λ₂上测量的两个强度I_λ1和I_λ2的商，并且可以根据以下等式进行计算：

R_1,2＝I_λ1I_λ2，其中λ₁是中心在400nm与800nm之间的40-nm上积分的强度，并且λ₂是中心在400nm与800nm之间的40-nm上积分的强度。

46.如权利要求36所述的方法，该方法进一步包括定量所述样品中存在的配体的水平。

47.一种用于测定受试者中葡萄糖的水平的方法，该方法包括使根据权利要求1所述的生物传感器与来自所述受试者的生物样品接触。

48.如权利要求48所述的方法，其中所述受试者患有或疑似患有糖尿病。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述生物样品包括血浆或全血。

50.一种用于监测配体的水平的方法，该方法包括周期性检测该配体的水平，其中检测该配体的水平包括

(a)提供或获得样品；

(b)使所述样品与根据权利要求1所述的用于所述配体的生物传感器在使得所述生物传感器的该配体结合蛋白与所述配体结合的条件下接触，和

(c)检测由所述生物传感器产生的信号。

51.一种用于监测配体的水平的方法，该方法包括连续检测该配体的水平，其中检测该配体的水平包括

(d)提供或获得样品；

(e)使所述样品与根据权利要求1所述的用于所述配体的生物传感器在使得所述生物传感器的该配体结合蛋白与所述配体结合的条件下接触，和

(f)检测由所述生物传感器产生的比率信号。

52.一种用于监测受试者中配体的水平的方法，该方法包括：

(a)将根据权利要求1所述的生物传感器或包括根据权利要求1所述的生物传感器的装置施用于所述受试者，其中在施用后，该生物传感器与所述受试者的体液或表面接触，和

(b)检测(i)由所述生物传感器的报告基团以相隔小于约30分钟的间隔连续或重复地产生的信号、和/或(ii)信号是否由所述生物传感器的报告基团以相隔小于约30分钟的间隔连续或重复地产生。

53.一种装置，该装置包括根据权利要求1所述的生物传感器。

54.如权利要求53所述的装置，其中所述生物传感器附接至所述装置的表面或基质，其中所述表面或基质包括聚合物。

55.一种多肽，该多肽包括在SEQ ID NO:1-103、157-292、197或198中任一个的序列中的氨基酸。

56.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求55所述的多肽。

57.一种鉴定用于在生物传感器中使用的候选配体结合蛋白的方法，该方法包括：

(a)选择具有已知氨基酸序列(种子序列)的第一蛋白质，其中所述第一蛋白质是葡萄糖-半乳糖结合蛋白；

(b)鉴定具有与所述种子序列有至少15％序列一致性的氨基酸序列(命中序列)的第二蛋白质；

(c)比对该种子氨基酸序列和该命中序列，并且在该种子序列的对应于至少5个主要互补表面(PCS)氨基酸的位置处将该命中序列与该种子序列进行比较，其中当葡萄糖与该第一蛋白质结合时，该至少5个PCS氨基酸中的每一个与葡萄糖具有氢键相互作用或范德华力相互作用；和

(d)如果该命中序列包括与该PCS一致的至少5个氨基酸，则将该第二蛋白质鉴定为候选配体结合蛋白。

58.一种用于构建候选生物传感器的方法，该方法包括：

(a)提供根据权利要求57所述的方法鉴定的候选配体结合蛋白；

(b)产生所述第二蛋白质的结构；

(c)基于所述结构鉴定所述第二蛋白质的至少一个推定的变构位点、内部空间位点或外周空间位点；

(d)使所述第二蛋白质突变以用半胱氨酸取代所述第二蛋白质的所述至少一个推定的变构位点、内部空间位点或外周空间位点处的氨基酸；和

(e)将荧光化合物轭合至所述半胱氨酸上。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述结构包括使用所述第一蛋白质的结构产生的所述第二蛋白质的同源模型。

60.如权利要求58所述的方法，其中所述结构包括通过核磁共振光谱法或X射线晶体学实验性地确定的结构。

61.一种用于构建针对葡萄糖具有所希望的解离常数(KD)的生物传感器的方法，该方法包括：

(a)提供针对葡萄糖不具有所希望的KD的初始生物传感器，其中所述初始生物传感器是根据权利要求1所述的生物传感器；

(b)使所述初始生物传感器突变以(i)改变在所述初始生物传感器与结合的葡萄糖之间的PCS中的直接相互作用；(ii)操纵在所述初始生物传感器的开放状态和闭合状态之间的平衡；(iii)改变在所述初始生物传感器的该配体结合蛋白与该报告基团之间的相互作用；或(iv)改变使所述生物传感器的结合位点的几何学发生改变的间接相互作用，以产生经修饰的生物传感器；和

(c)如果所述经修饰的生物传感器针对葡萄糖具有所希望的KD，则选择所述经修饰的生物传感器。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述报告基团包括Acrylodan、Badan、或其衍生物，并且在(b)中使所述初始生物传感器突变包括改变在所述配体结合蛋白与所述Acrylodan、Badan、或其衍生物的羰基基团之间的相互作用。

63.如权利要求61所述的方法，其中所述报告基团包括Acrylodan、Badan、或其衍生物，并且在(b)中使所述初始生物传感器突变包括改变在所述配体结合蛋白与所述Acrylodan、Badan、或其衍生物的萘环之间的相互作用。

64.如权利要求61所述的方法，其中使所述初始生物传感器突变包括在所述初始生物传感器中引入取代突变。

65.如权利要求61所述的方法，该方法进一步包括将所述亲和力调整的生物传感器固定在固体基质上。

66.一种组合物，该组合物包括纯化的热稳定性结合葡萄糖的荧光响应性传感蛋白、以及固体基质，该传感蛋白包括单个半胱氨酸残基，所述残基位于所述蛋白质的葡萄糖接触位点中，其中所述传感蛋白被固定在所述固体基质上。

67.如权利要求66所述的组合物，其中所述传感蛋白具有大于50℃、大于60℃、大于70℃、大于80℃、大于90℃或大于100℃的中点热熔融转变。

68.如权利要求66所述的组合物，其中所述蛋白质包括SEQ ID NO:298的氨基酸序列。

69.如权利要求66所述的组合物，其中所述固体基质包括珠粒或平面表面。

70.如权利要求66所述的组合物，其中所述半胱氨酸与Badan、Acrylodan、或其衍生物轭合。

71.如权利要求66所述的组合物，其中所述固体基质包括环烯烃共聚物。

72.如权利要求66所述的组合物，其中报告基团与所述单个半胱氨酸共价结合。

73.如权利要求66所述的组合物，其中所述固体基质包括多种传感蛋白，该传感蛋白的每一种针对葡萄糖具有不同的解离常数(K_D)。

74.一种包括纯化的葡萄糖传感蛋白、和固体基质的组合物，该传感蛋白与SEQ ID NO:1、16或17具有小于65％的一致性和大于27％的一致性，其中所述传感蛋白包括单个半胱氨酸残基，所述残基位于所述蛋白质的葡萄糖接触位点中，其中所述传感蛋白被固定在所述固体基质上。

75.如权利要求74所述的组合物，其中所述传感蛋白与SEQ ID NO:1、16或17相比具有44％-48％的氨基酸序列一致性。

76.如权利要求74所述的组合物，其中报告基团与所述单个半胱氨酸共价结合。

77.如权利要求74所述的组合物，其中所述固体基质包括多种传感蛋白，这些传感蛋白中的每一种针对葡萄糖具有不同的解离常数(K_D)。

78.一种检测葡萄糖在测试样品中的存在或量的方法，该方法包括：

使所述样品与如权利要求1所述的生物传感器、如权利要求72所述的组合物、或如权利要求76所述的组合物接触，以产生所述葡萄糖和所述配体结合蛋白或所述生物传感蛋白的复合物；

使所述复合物与激发光接触；

从至少两个波长测量所述报告基团的发射强度；

计算来自所述波长的比率信号；和

将所述信号与信号的已知葡萄糖结合曲线进行比较，以鉴定葡萄糖在所述测试样品中的存在或计算葡萄糖在所述测试样品中的量。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述测试样品选自体液、食品、饮料或生物反应器培养肉汤。

80.如权利要求78所述的方法，其中所述方法在体内或离体进行。

81.如权利要求30所述的生物传感器，其中所述荧光团具有如下发射波长，该发射波长包括约550纳米(nm)、575nm、600nm、625nm、650nm、或550-650nm的波长。

82.如权利要求45所述的生物传感器，其中λ₁是针对λ₁中心在420nm与520nm之间的40-nm上积分的强度，并且针对λ₂中心在500nm至600nm之间的40-nm上积分的强度。