CN1705882A - 生物传感器 - Google Patents

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Abstract

生物传感器是通过将至少一个报告基团与细菌的细胞周质结合蛋白(bPBP)的一个或多个特定的位点共价或非共价地连接而制成的。当生物传感器上结合了配体时，报告基团传导的信号会有所改变。

Description

生物传感器
与相关申请的交叉引用
本申请要求申请号为60/418,359，申请日为2002年10月16日的临时申请的优先权。
联邦政府资助的研究或开发
根据MH-RO1-GM49871和ONR-N00014-98-1-0110条款的规定，美国政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本发明涉及生物传感器及其制造和使用方法。
背景技术
生物传感器是一种可以用于测量复杂混合物中单个分子种类存在的分析工具其通过将生物大分子的敏锐的分子识别特性与信号转导机制结合起来，该信号转导机制将配体结合与易识别的的物理变化相偶联(Hall，Biosensors，Prentice-Hall，Englewood Cliffs，New Jersey；Scheller等，Curr.Op.Biotech.12：35-40，2001)。在理想的情况下，生物传感器不需试剂，并且与基于酶的分析或竞争性免疫测定相反，作为检测的结果并不改变其组成成分(Hellinga和Marvin，Trends Biotech.16：183～189，1998)。大多数生物传感器将诸如酶或抗体等天然大分子，与特别是针对所述分子的适宜的物理信号的识别，及对该系统特异的探测器的构建结合起来(Meadows，Adv.Drug Deliv.Rev.21：177～189，1996)。近来，已经探索用分子工程技术来开发将广泛的结合特异性及亲和力与共同的信号转导机制相结合的大分子，来构建针对许多不同分析物的通用检测系统(Hellinga和Marvin，Trends Biotech.16：183～189，1998)。
大肠杆菌(Escherichia coli)的周质结合蛋白是蛋白质超家族(细菌周质结合蛋白，bPBP)的成员(Tam和Saier，Microbiol.Rev.57：320～346，1993)，已经表明该家族非常适于生物传感器工程(美国专利6,277,627)。这些蛋白包括通过铰链区结合的两个结构域(Quiocho和Ledvina，Molec.Microbiol.20：17～25，1996)。配体结合位点位于两个结构域的分界面。这些蛋白通常采用两种构象：无配体的开放式和与配体结合的闭合式，二者可以通过配体结合时的铰链弯曲机制来相互转换。通过在发生与整体改变一致的局部构象改变的位置放置单个的、环境敏感性荧光团，已经对这种整体的、配体介导的构象转变进行了探索以将配体结合与荧光强度的改变相偶联(Brune等，Biochemistry 33：8262～8271，1994；Gilardi等，Prot.Eng.10：479～486，1997；Gilardi等，Anal.Chem.66：3840～3847，1994；Marvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4366～4371，1997；Marvin和Hellinga，J.Am.Chem.Soc.120：7～11，1998；Tolosa等，Anal.Biochem.267：114～120，1999；Dattelbaum和Lakowicz，Anal.Biochem.291：89～95，2001；Marvin和Hellinga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：4955～4960，2001；Salins等，Anal.Biochem.294：19～26，2001)。也可以将构象偶联机制设计用于改变来源于生物工程bPBP的电极表面之间的电流，所述经生物工程改造的bPBP含有共价结合的氧化还原辅因子(Benson等，Science 293：1641～1644，2001)。
本发明提供一种利用bPBP来生产针对多种化学类型的生物传感器的方法，所述化学类型包括糖、氨基酸、二肽、阳离子和阴离子，这些生物传感器有广泛的用途，包括用于医疗、工业和环境方面。
发明内容
本发明涉及生物传感器，该生物传感器由细菌周质结合蛋白(bPBP)超家族的突变或野生型成员制成，并将其用于分析(即，检测和/或定量)配体。bPBP的三级结构包括由铰链区连接的两个结构域，并具有位于两个结构域之间分界面的配体结合袋。它们通常采用两种构象：无配体的开放式和与配体结合的闭合式，二者可以通过铰链弯曲机制来相互转换，而这依赖于该位置是否结合了配体。生物传感器是通过将至少一个报告基团与bPBP的一个或多个特定的位置共价或非共价地连接起来制成的。当生物传感器上结合了配体时，报告基团传导的信号会有所改变，通过评定所述信号的任何可观察到的特性(例如，光学或电化学特性)来分析该改变。根据报告基团的结合位点与配体的结合位点的关系(即，变构型、内构型(endosteric)或表构型(peristeric))或这些位点之间的距离(即远端型或近端型)来对生物传感器进行分类。
根据本发明，配体与生物传感器结合的事件改变了位置特异性结合报告基团的周边环境，报告基团的信号可以通过一个或多个荧光团和/或氧化还原辅因子产生。生物传感器可以在没有额外试剂的生理环境下操作。
本发明的目的和有益效果将在以下的说明书中明示。
附图说明
图1显示了11个bPBP的三维结构，标明了变构型、内构型、表构型位点的位置，每个蛋白质均以闭合式显示，通过球棍结构表明了结合配体。将每个bPBP的两个结构域垂直定向使第一个结构域(含有N-末端)位于第二结构域(含有C-末端)的上方。铰链片段连接两个结构域。组氨酸BP(组氨酸结合蛋白)的结构用于代表目前尚未确定结构的谷氨酸/天冬氨酸BP。突变为半胱氨酸的氨基酸残基用不同的阴影球表示，并区分为变构型(深色阴影)，内构型(中度阴影，只位于GBP中)或表构型(浅色阴影)。根据基于序列的关系按照Tam和Saier定义的簇将结构分组(Microbiol.Rev.57：320～346，1993)。簇2：阿拉伯糖BP(ABP)、葡萄糖BP(GBP)和核糖BP(RBP)；簇5：二肽BP(DPP)；簇3：谷氨酰胺BP(QBP)、组氨酸BP(HBP)和谷氨酸/天冬氨酸BP(EBP)；簇6：磷酸根BP(PBP)和硫酸根BP(SBP)；簇1：麦芽糖BP(MBP)和Fe(III)BP(FeBP)。用Molscript(Kraulis，J.Appl.Crystallogr.24：946～950，1991)进行分子制图。
图2是用clustalW(Thompson等，Nucl.Acids Res.22：4673～4680，1994)显示了E.coli YBEJ(推定的谷氨酸/天冬氨酸BP)、谷氨酰胺BP和组氨酸BP的序列比对(alignment)。从YBEJ的开放阅读框架(包括它的引导序列)的推定起始密码子开始记数。用下划线标注的蛋氨酸是表达本研究中所用的YBEJ的起始密码子。用黑体表示每个蛋白质中突变为用于荧光团偶联的半胱氨酸的残基。这些残基下的字母“a”和“p”表示它们的类型分别为变构型或表构型。
图3显示了硫醇反应性荧光团的结构式，蛋白质结合荧光团的最大荧光激发和发射的大致波长(nm)分别为：芘(340，390)；acrylodan(390，500)；荧光素(485，520)；NBD(490，540)；NBDE(490，530)；JPW4039(485，590)；JPW4042(470，640)；和JPW4045(470，640)。
图4A和4B显示了荧光测定参数的定义。图4A表示用于确定标准强度变化ΔIstd的参数λstd、I1和I2。图4B表示用于确定ΔR的参数A1、A2、oA和∞A。每个∞A区域包括各自的oA区域。
图5A和5B显示了葡萄糖BP和谷氨酸/天冬氨酸BP偶联物的荧光滴定。图5A表示用葡萄糖滴定葡萄糖BP W183C-acrylodan。图5B.表示用氨基酸滴定谷氨酸(glutamate)/天冬氨酸(aspartate)BP T129C-NBD。数据指向：●谷氨酸；+天冬氨酸；◆天冬酰胺；×谷氨酰胺。在图5A和图5B中，曲线表示的是最拟合的结合等温线。
图6A-6C表示320个荧光偶联物系列的荧光检测参数值。图6A显示了最大荧光强度的波长的位移分布(maxλ饱和-maxλapo)。图6B显示了强度变化参数ΔIstd的分布。图6C显示了比例测定(ratiometric)变化参数的分布ΔRmax。对于每一个参数，均标注各个间距的上限。
图7显示了在三类荧光团黏附位点间配体亲和力变化的出现。图例：内构型位点，填充竖条；外构型位点，阴影竖条；变构型位点，空白竖条。当为阿拉伯糖BP的时，WtKd值是C64A突变的值，其中所有的偶联物都进行了测定。不包括二肽BP和Fe(III)BP的数据。对于前者而言，野生型中Gly-Leu二肽的Kd值还没有报道。当为Fe(III)BP时，未偶联的突变体E57D的Kd值仍然没有确定。对x-轴上的各个间隔均标注其上限，例如，标注为“0”的间隔包括log(mutKd/wtKd)＞-1和≤0的值。
图8A和8B表示用发射波长带的不同配对来比例测定滴定bPBP荧光团偶联物。图8A表示用葡萄糖以下列荧光发射比例(波长以nm计)滴定与acrylodan偶联的葡萄糖BP-W183C：◇表示F450-459/F550-559(appKd～5.0mM)；□表示F450-459/F486-495(appKd～10.4mM)；○表示F472-481/F450-459(appKd～17.4mM)。曲线表示符合等式4。通过垂直线界定的正常血清葡萄糖范围(正常血糖)为4mM～6mM。图8B表示用核糖以下列荧光发射比例(波长以nm计)滴定与acrylodan偶联的核糖BP-T135C：□表示F501-510/F450-459(appkd～41μM)；○表示F450-459/F501-510(appKd～254μM)；◇表示F450-459/F547-556(appKd～461μM)。
具体实施方式
本发明涉及用诸如大肠杆菌bPBP等生物工程bPBP构建的生物传感器。根据本发明，构建了可以用于监控配体与bPBP的结合的偶联体。偶联体可以通过在蛋白质结构中共价地连接报告基团(例如，荧光团或氧化还原辅因子)的一个或多个特定位置向bPBP引入突变而产生，所述报告基团对配体结合时发生的bPBP构象改变作出响应。其它共价或非共价地将至少一个报告基团与突变体或野生型bPBP的一级氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基位置结合的方法包括：添加或替换任意的可激活的交联物，应用设计或非天然tRNA，引入配位位点等等。
这里揭示了bPBP中生物工程构象偶联机制的普遍性。如下列实施例所述，使用了10个已知结构的bPBP，并在预测将局部构象改变与配体介导的铰链弯曲机制相联系的多个位点引入了8个不同的环境敏感性荧光团。生物信息学技术可以用于预测未知结构的bPBP中连接位点的位置，由此可以利用由基因组序列研究最近鉴定的大量该家族的类似物和同系物(Blattner等，Science 277：1453～1474，1997；Quentin等，J.Mol.Biol.287：467～484，1999)。在具有基于结构的对配体结合特异性进行重新设计的机会(Hellinga和Richards，J.Mol.Biol.222：763～785，1991；Marvin和Hellinga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：4955～4960，2001)的同时，以下给出的实施例显示了bPBP超家族作为适于广泛应用的生物传感器系统的基础的巨大潜力。
进一步地，可以对配体结合袋进行生物工程改造以结合不被野生型bPBP所结合的配体。配体结合位点位于bPBP的两个结构域的交界面。在邻近(即位于或位于附近)野生型bPBP的结合位点的交界面使氨基酸残基突变可以与配体(例如MBP的Zn2+)产生新的接触，并损坏或改变与同类配体(例如MBP的麦芽糖)的结合。这可以用于改变配体结合袋的特异性。例如，使麦芽糖结合蛋白突变以特异性地结合至非同类的配体：例如金属Zn2+离子、三硝基甲苯、L-乳酸盐以及5-羟色胺(Marvin和Hellinga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：4955～4960，2001；Looger等，Nature 423：185～190，2003；Dwyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：11255～11260，2003)。因此，可以通过在两个bPBP结构域的交界面使氨基酸残基突变来产生新的配体结合袋，从而制备结合非同类配体的生物传感器；被这类生物传感器结合的配体可能不与野生型bPBP结合。
可以向bPBP中引入其它的突变来影响生物传感器的功能：例如，突变可以增强或降低结合亲和力或特异性；提高或降低信号转导；通过与另一个碳水化合物、脂质或蛋白质结构域融合而加入新的功能；提高热稳定性或热不稳定性；引入催化活性；缩短或延长使用期；加宽或缩窄操作条件；或以上任意的组合。优选在bPBP的没有与报告基团结合的位置使氨基酸残基突变(例如，至少一个错义突变，所述错义突变不是通过硫醇键与荧光团偶联的半胱氨酸)。
在一个具体实施例中，本发明涉及构建没有附加试剂的荧光生物传感器的方法。该方法包括识别bPBP上发生与配体介导的铰链弯曲运动相一致的局部构象改变的位点。可以在一个或多个这样的位点引入半胱氨酸残基并在其上连接荧光团，以便使配体结合时荧光团的荧光强度发生改变。
可以对适用于本方法的bPBP进行选择或设计。基于待筛选的配体(参见，例如表1中所列的分析物)，通过计算方法或通过其它的方式或同时通过上述两种方法，bPBP超家族十分适于配体结合特异性的重新设计。bPBP上适于一个或多个报告分子(例如，荧光团或氧化还原辅因子)结合的位点包括变构位点、表构位点和内构位点(报告分子也可存在于例如用作参考的非信号位点)。在变构部位的情况下，报告分子(例如，荧光团)可以位于远离配体结合位点的一个或多个位点(即，远离配体结合袋)，该位点当配体结合时发生局部构象变化。在表构位点的情况下，报告分子(例如，荧光团)可以位于结合位点的“边缘”，但并不与配体直接作用。对于内构位点，报告分子(例如，荧光团)可以位于配体结合位点中，以与配体直接作用。后两个实施例显示了邻近配体结合袋的结合。
表1.用于bPBP配体的生物传感器的潜在应用
  分析物   应用
  临床   工业   环境
  阿拉伯糖葡萄糖麦芽糖核糖谷氨酸谷氨酰胺组氨酸二肽磷酸根硫酸根Fe(III) Burrin和Price，1985Nelson等，1977Burtis和Ashwood，1994Smith和Forman，1994Taylor等，1991Burkhardt等，1979   Deanda等，1996AOAC，1995AOAC，1995AOAC，1995AOAC，1995 APHA，1992EPA，1999Martin，1992
如下面的实施例所详述，可以用至少两种不同方式设计变构位点、表构位点和内构位点。通常，可以采用基于结构的设计方法，其中检测开放和闭合状态(对于变构设计)或仅闭合状态(对于表构和内构设计)的结构。另外，可以采用基于序列的设计方法，其中如果半胱氨酸突变具有的特征已经在已知结构的蛋白质中被确定了，则可以对同源关系进行研究以预测三维结构还未确定的蛋白质中的该突变的位置。
如上所述，适于本发明的报告分子包括，但并不限于，荧光团和氧化还原辅因子。在采用荧光团的情况下，这一选择依赖于，至少部分依赖于特定蛋白质中的位置的性质。尽管一个荧光团在某一特定位置的功能优于在其他位点的功能，本领域的技术人员可以很容易地选择用于特定应用的优选荧光团(参见，例如美国专利6,277,627)。在下面的实例中，采用8个不同的荧光团来设计荧光传感器：
阿拉伯糖                    阿拉伯糖结合蛋白(ABP)
二肽                        二肽结合蛋白(DPP)
谷氨酸和天冬氨酸            Glu/Asp结合蛋白(EBP)
谷氨酰胺                    谷氨酰胺结合蛋白(QBP)
Fe(III)                     铁结合蛋白(FeBP)
组氨酸                      组氨酸结合蛋白(HBP)
麦芽糖                      麦芽糖结合蛋白(MBP)
葡萄糖                      葡萄糖结合蛋白(GBP)
磷酸根                      磷酸根结合蛋白(PhBP)
硫酸根                      硫酸根结合蛋白(SBP)
然而本发明并不以任何方式限于这些特定的实施例。
本发明中采用的氧化还原报告分子可以是有氧化还原活性的金属中心或有氧化还原活性的有机分子。它可以是天然有机辅因子例如NAD、NADP、FAD，或天然金属中心例如铜蓝、铁硫簇或血红素，或合成的中心例如，诸如钌复合体等有机金属化合物，有机配体如苯醌，或引入蛋白质中的生物工程金属中心，或生物工程有机辅因子结合位点。可以用推理设计或直接演变技术对辅因子结合位点进行生物工程改造。氧化还原报告分子可以通过辅因子和蛋白质之间的位点特异性或偶然相互作用共价地或非共价地与蛋白质连接，它可以是蛋白质本身所固有的，例如金属中心(天然或生物工程的)，或天然有机辅因子(NAD、NADP或FAD)或有机金属辅因子(血红素)；或外来的(如共价偶联、合成有机金属簇)。例如，氧化还原报告分子可以被结合(如共价地)在蛋白质表面的氨基酸残基的位置上。
氧化还原报告分子可以为含有金属的基团(例如，含有过渡金属的基团)，其能够可逆或半可逆地传递一个或多个电子。大量可能的含有过渡金属的报告基团均可以使用。有利地，报告基团具有这样的电势范围内的氧化还原电势，在该电势范围以下将受到分子氧的干扰；并具有适于与蛋白质共价偶联的官能团(例如，诸如与蛋白质内特有半胱氨酸残基偶联的马来酰亚胺或碘乙酰胺等硫醇反应性功能元件)。报告基团的金属应当以还原状态或氧化状态取代性地插入(即，有利地，外源基团不与报告分子形成偶然的连接)。报告基团能够针对配体的结合发生响应，而产生安培计或电位计的改变。在优选的实施方式中，报告基团是水溶性的，能够与蛋白质进行位点特异性结合(例如，通过位于报告基团上的与蛋白质中的独特半胱氨酸发生反应的硫醇反应性官能团)，并在配体结合时发生电位计响应。本发明中所采用的合适的过渡金属包括，但并不限于，铜(Cu)、钻(Co)、钯(Pd)、铁(Fe)、钌(Ru)、铑(Rh)、锇(Os)、铼(Re)、铂(Pt)、钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、镍(Ni)、钼(Mo)、锝(Tc)、钨(W)和铱(Ir)。即，优选第一系列的过渡金属，铂系金属(Ru、Rh、Pd、Os、Ir和Pt)，以及Fe、Re、W、Mo及Tc。特别优选的金属是在氧化状态中发生变化时不改变配位位点数量的金属，包括钌、锇、铁、铂和钯，其中特别优选钌。
报告基团可以作为与蛋白质的共价偶合物而存在于生物传感器中，或其可以为构成部分蛋白基质的金属中心(例如，氧化还原中心如铁硫簇、血红素、铜蓝，该氧化还原中心的电化学特性对其局部环境敏感)。或者，报告基团可以作为蛋白质和金属结合域间的融合物而存在(例如，诸如细胞色素等小的氧化还原活性蛋白)。优选地，报告基团通过与蛋白质的半胱氨酸(硫醇)结合的马来酰亚胺官能团来与蛋白质共价偶联。在任何情况下，报告基团与蛋白质连接，以便位于蛋白质和电极之间。
可以通过全合成、半合成或基因融合而位点特异性地引入报告基团而制备本发明的生物工程蛋白质(参见，例如Adams等，Nature 39：694～697，1991；Brune等，Biochemistry 33：8262～8271，1994；Gilardi等，Anal.Chem.66：3840～3847，1994；Godwin等，J.Am.Chem.Soc.118：6514～6515，1996；Marvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：4366～4371，1997；Post等，J.Biol.Chem.269：12880～12887，1994；Romoser，J.Biol.Chem.272：13270～13274，1997；Thompson等，J.Biomed.Op.1：131～137，1996；Walkup等，J.Am.Chem.Soc.119：5445～5450，1997)。
对配体的分析可以用生物传感器来完成。将样品在合适的分析条件下与生物传感器接触。如果样品中存在配体，则可以通过在分析中与生物传感器结合并测定由配体结合生物传感器所传导的信号来进行检测。为了检测的目的，因为只需要简单操作来确定样品中是否有配体的存在(在检测限内)，所以不需要对结合进行定量。另外，可能需要与一系列对照样品(如已知量的配体)进行对比来对样品中配体的量或浓度进行定量。给定样品的体积，则配体的量(即质量)和配体的浓度可以互相转换。可以采用不含配体的空白对照来确定背景信号。可以采用标准物来制作标准曲线(例如双曲线)以定量未知样品。尽管优选均相分析形式(即，不需要对已结合的和未结合的配体进行分离的形式)，但是如果样品中存在显著干扰信号传导和/或检测的物质，则需要在多相分析形式中进行分离。信号转导优选不需要添加外部试剂，因此可以用最少的样品制备物并且在生理状态下对体液进行检测。如果生物传感器适用于可植入的医疗装置，它们甚至可以在体内进行。另外，与皮肤接触的生物传感器可以检测间质液或汗液。可以采用灌洗来采取粘膜组织样品。
可以从以下来源获得样品：在实验室环境内(例如，临床或研究机构)；从环境来源(例如，空气；水和其它水体；陆地上的动物或植物产品；土壤)；工业来源(例如，食品、生物制药、化学或其它制造工业)。要检测的分析物与配体是一致的，包括配体的多个拷贝，其化学上与配体相关，因此可以通过信号传导中的变化(例如，与其“正确的”配体相比，相关的化学结构被生物传感器更强或更弱地结合)或其任意组合来识别。信号传导中的变化可以与化学结构的变化相关，因此不同的分析物被识别出来(参见下面综合分析的描述)。可以被检测或定量的配体的例子包括：氨基酸；碳水化合物；易溶于水性样品的生物活性固体和气体化合物；违禁品或受控物质(即其拥有或使用为非法或受高度控制的物质；环境污染物(例如，磷酸根、硫酸根)；爆炸物(例如TNT)；食品污染物和副产品(例如，致癌物、植物毒素、致畸剂)；脂质；金属离子(例如，二价阳离子、铁离子)；微生物毒素(例如，病毒、细菌或原生动物的毒性产物)；神经递质(例如，5-羟色胺)；核苷或核苷酸(例如，NAD、NADP、FAD)；肽或类固醇(例如，生长因子、激素、形态发生或发育信号)；以及治疗药物。物体(例如行李、信件、其它容器)；通过检查站的人或交通工具；以及边界或安全区域要检测的在安全以及军事上应用的生物试剂、禁运品、爆炸物、毒药和毒素。
一个或多个生物传感器可以共价或非共价地与固体或多孔基质连接。所述基质可以是扁平形的和平面形(例如，过滤膜、载玻片、半导体芯片)；圆柱体(例如，光纤、塑料杆)；球体(例如，交联聚合体或玻璃珠)；或加工为容器(例如，小室或小池、多孔板)。可以将基质制成可以用通过报告基团传导的信号来检测的装置(例如，显微镜，光度计，分光计)进行分析。单个生物传感器可以通过附加的标记(例如，条形码、无线电频率或RFID、或生物高聚物)进行编码，该标记可以通过检测器(例如，明暗模式扫描仪，无线电接收器，特异性结合探针或自动测序仪)进行解码或利用分选器根据其标记进行分离。识别每个生物传感器的编码可以用于通过快速分析一个样品中的大量配体而进行平行分析。具有不同配体结合特异性的多个生物传感器用于同一分析中来同时检测和/或定量多个配体。另外，将不同的生物传感器连接在基质的特定位置可以通过在何处产生信号而用于识别生物传感器的配体结合特异性。可以通过以下方式来验证信号：采用具有同样特异性的多个生物传感器的反复分析以进行重复分析；或将获自多个生物传感器的结果与重叠特异性相关联以进行综合分析。在后者情况下，生物传感器的特定反应模式与被其结合的分析物的身份相关联。与配体的化学结构更为接近的分析物将与同类生物传感器更为牢固地结合。将获自具有重叠的已知配体结合特异性的多个生物传感器的信号加以综合以推断分析物的身份。
在进一步的实施方式中，本发明涉及用上述方法构建的生物传感器和其在检测分析物中的应用，例如在临床，工业以及环境中的应用。在下面特定的实施例中描述了特定的应用。提供了基于GBP(与acrylodan偶联的W183C已经被成功用于葡萄糖传感器的光纤原型)能够用于光学葡萄糖传感器的多个位点。
至于在共有领域中可能存在的由本发明的方法构建的特定生物传感器(例如，在Marvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4366～4371，1997或美国专利6,277,627中被公开)，这种生物传感器不在本发明的范围内。
本发明的某些方面可以在以下非限定性实施例中更加详细地描述。
实施例
实验的详细资料
分子克隆。采用PCR(聚合酶链式反应)从以下菌株的基因组DNA中扩增bPBPs的野生型基因：大肠杆菌CSH100菌株(阿拉伯糖、二肽、组氨酸、核糖、硫酸根和谷氨酸/天冬氨酸BP)；菌株W1485(葡萄糖和谷氨酰胺BP)和菌株RU1012(磷酸根BP)，或者流感嗜血菌(H.influenzae)菌株Rd(Fe(III)BP)。将扩增产物克隆入下列蛋白质表达载体之一：pAED4(Doering，“Functional and structural studies of a smallf-actin binding domain”博士论文，Massachusetts Institute of Technology，1992)；pKK223-3(Brosius和Holy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6929～6933，1984)；或pET载体(Studier等，Meth.Enzymol.185：60～89，1990)(Novagen)。设计了N-端寡核苷酸引物来只克隆加工后的删除信号序列的周质形式。设计了C-端引物来附加Gly-Ser-Gly-(His)n或Gly-Ser-(His)n序列，其中n＝5、6或10。在最后一个组氨酸密码子之后为两个串联终止密码子(TAATGA)。在质粒pMAL-c2X(New EnglandBioLabs)中构建和由其表达麦芽糖BP突变体。将大肠杆菌菌株XL1-BLUE(Stratagene)和DH5α(Hanahan，J.Mol.Biol.166：557～580，1983)用于质粒的构建。通过重叠PCR突变形成技术(Ho等，Gene 77：51～59，1989)来产生单个氨基酸替换。所有的克隆和突变体通过核酸测序进行验证。在采用阿拉伯糖BP时，用丙氨酸替换野生型序列中的单个半胱氨酸以消除报告集团与该硫醇偶联的可能性(Miller等，J.Biol.Chem.254：7521～7528，1979)。另外，通过用Asp替换Glu57来使Fe(III)BP序列发生突变，以将Kd提高到可以便利地用Fe(III)柠檬酸盐进行测定的浓度范围。
蛋白表达。将质粒转化至大肠杆菌菌株BL21-DE3，在营养肉汤中在37℃孵育过夜，接着用新鲜培养基稀释100倍，并在37℃或25℃继续培养。当培养基在600nm处的光密度达到0.4时通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷至1mM来诱导表达。2～4小时后，通过离心来收集细胞，重新将细胞悬浮在pH为6.9的20mM的3-吗啉代丙烷磺酸(MOPS)、100mM的NaCI的溶液中中，并冷冻保存或立即裂解以用于蛋白质纯化。
蛋白质纯化。用超声波降解法或穿过法国压力盒来裂解细胞。通过加入Polymin P至0.33％(重量/体积)处理裂解液，在冰上冷却15分钟，然后离心使细胞碎片沉淀，将上清液加入装载了Ni(II)的ChelatingSepharoseTM Fast Flow柱(Amersham Pharmacia Biotech)，该柱已用pH为7.5的20mM MOPS、500mM NaCl、10mM咪唑的溶液平衡。用上样缓冲液洗涤柱子，然后用含有60mM咪唑的同样的缓冲液洗涤，接着用含100mM咪唑的同样的缓冲液洗涤，最后，用含400mM咪唑的上样缓冲液洗脱蛋白，在级分中收集蛋白并通过凝胶电泳纯化分析。通过这个规范，所有的制备物都达到95％的纯度。含有蛋白质的级分用缓冲液(20mM MOPS、100mM NaCl、pH6.9或20mM NaH2PO4、100mMNaCl，pH6.9)进行彻底透析或者通过凝胶过滤除去盐分，以去除结合配体。
半胱氨酸替换的bPBP的荧光团偶联。从Molecular Probes(Eugene，Oregon)得到的硫醇反应性荧光团为5-碘乙酰氨基荧光素(荧光素)；N-(1-芘)碘乙酰胺(芘)；N，N′-二甲基-N-(碘乙酰基)-N′-(7-硝基苯基-2-噁-1，3-二唑-4-基)乙二酰胺(NBD)；N-((2-(碘乙酰氧基)乙基)-N-甲基)氨基-7-硝基苯基-2-噁-1，3-二唑(NBDE)，和6-丙烯酰基-2-二甲氨基萘(acrylodan)。苯乙烯基和萘基染料JPW4039、JPW4042和JPW4045(图3)在康涅狄格大学合成。所有的荧光团偶联步骤通常在室温下进行。向浓度为100μM的蛋白质中加入超过5倍摩尔数的盐酸化三-(2-羧乙基)膦以减少分子间的二硫键。将硫醇反应性荧光团(在乙腈或二甲基亚砜中的浓度为20mM～25mM)以小等量份加入直到比蛋白质的摩尔数超出5倍。在室温下避光偶联4小时，或在4℃过夜。通过彻底透析或大小排阻色谱法将蛋白质与未反应的荧光团分离。通过用Ellman′s试剂(Ellman，Arch.Biochem.Biophys.74：443～450，1958)确定未反应的硫醇，或通过由经纯化的偶联物的吸收光谱测量荧光团与蛋白质之间的比例，来测定报告基团结合的效率。
硫酸根和磷酸根的去除。分别对硫酸根BP和磷酸根BP溶液以及它们的缓冲液进行处理以降低杂质硫酸根和磷酸根的浓度。使硫酸根BP缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0)穿过氯化物型Dowex 1X2-100强碱性阴离子交换树脂。用处理缓冲液透析处理硫酸根BP溶液；装在分离透析试管中的Dowex树脂也包括在内。通过加入7-甲基鸟苷至1mM和用在分离透析试管中分隔的细菌核苷酸磷酸化酶(1单位/毫升)(Sigma-Aldrich)进行透析来去除磷酸根BP溶液和缓冲液(20mM MOPS、100mM NaCl、pH6.9)中的磷酸根(Brune等，Biochem.33：8262-8271，1994)。
荧光测定。将样品在25℃搅拌下，采用SLM Aminco-Bowman系列2荧光仪进行所有的检测。获得荧光发射谱，激发和发射的狭缝宽度分别为4nm和8nm。将光电倍增管的电压维持在400伏和800伏之间。蛋白质的浓度在50nM到1000nM之间。约在下列波长发生荧光团特异性激发：色氨酸，290nm；acrylodan，390nm；荧光素，485nm；芘，340nm；NBD和NBDE，490nm；JPW4039，485nm；JPW4042，470nm；JPW4045，470nm。
为了检测配体结合亲和力，将配体逐次加入3ml的浓度为50nM～1000nM的bPBP中，并记录放射强度。对蛋白质的稀释液和来自缓冲液的背景信号进行校正。适当地，利用适当的等式3或4使结合曲线与结合等温线相拟合。
Fe(III)BP具有10-21M数量级的Fe(III)解离常数(Adhikari等，J.Biol.Chem.270：25142～25149，1995)，妨碍了在纳摩尔的蛋白浓度下对亲和力的基于荧光的精确检测。因此，我们利用Fe(III)柠檬酸盐(logK约为10.25)(Martell和Smith，Critical Stability Constants，Plenum Press，New York，1977)作为竞争性分析中的配体。
结果
生物传感器家族。选择了11个具有广泛的配体结合特异性的bPBP系列以用于生物工程改造生物传感器的功能(表2)。除了Fe(III)BP来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)以外，其余的均来自大肠杆菌。已经鉴定了这些蛋白质对其各自配体的结合特异性和亲和力(参见表2的参考文献)。3个蛋白质结合单糖(阿拉伯糖、葡萄糖和核糖BP)，1个结合葡萄糖的二糖和三糖(麦芽糖BP)，3个结合氨基酸(天冬氨酸/谷氨酸、组氨酸和谷氨酰胺BP)，1个结合二肽和三肽(二肽BP)，2个结合含氧阴离子(磷酸根和硫酸根BP)，和1个结合金属离子(Fe(III)BP)。这些bPBP大多数以高亲和力结合最多两到三个配体(微摩尔或更高)。例如，磷酸根BP结合磷酸根和砷酸根，但不结合其它含氧阴离子(Luecke和Quiocho，Nature 347：402～406，1990)，而葡萄糖BP结合葡萄糖和半乳糖但不结合其它单糖(Anraku，J.Biol.Chem.243：3116～3122，1968)。二肽BP是一个例外，因为它结合多种二肽和三肽(Smith等，Microbiology 145：2891～2901，1999)。这些蛋白质中测定的配体解离常数通常在0.1μM到1μM的范围内。一个例外是Fe(III)BP，在竞争性分析中，Fe(III)(aq)与Fe(III)螯合物的Kd估计为10-21M(Adhikari等，J.Biol.Chem.270：25142～25149，1995)。
表2.bPBP结构、基因和配体结合的参考文献和PDBa档案资料
  bPBP                 晶体结构 DNA序列 配体亲和力
  开放式   闭合式
  阿拉伯糖BP二肽BPGlu/Asp BPFe(III)BP葡萄糖BP组氨酸BP麦芽糖BP磷酸根BP谷胺酰胺BP核糖BP硫酸根BP Nickitenko等，1995 1DPEBruns等，20011D9VSharff等，19921OMPLedvina等，19961OIBHsiao等，19961GGGBjorkman和Mowbray，19981URP   Quiocho和Vyas，1984，1ABEDunten和Mowbray，1995 1DPPBruns等，1997 1MRPVyas等，1988；Vyas等，1994 1GLGYao等，1994 1HSLSpurlino等，1991；Quiocho等，19971ANFLuecke和Quiocho，1990 1IXHSun等，1998 1WDNMowbray和Cole，1992 2DRIPflugrath和Quiocho，1985；He和Quiocho，1993 1SBP   Scripture等，1987Abouhamad等，1991Sanders等，1994Scholle等，1987Joshi和Ames1996Duplay等，1984Magota等，1984Nohno等，1986Groarke等，1983Hellinga和Evans，1985   Clark等，1982；Miller等，1983Guyer等，1986；Smith等，1999Barash Halpern，1975；Willis Furlong，1975Adhikari等，1995Anraku，1968Miller等，1983Schwartz等，1976Medveczky和Rosenberg，1969Weiner等，1971Willis和Furlong，1974Jacobson和Quiocho，1988
a：蛋白质数据库(Berman等，2000)
Abouhamad等，Molec.Microbiol.5：1035～1047(1991)
Adhikari等，J.Biol.Chem.270：25142～25149(1995)
Anraku，J.Biol.Chem.243：3116～3122(1968)
Barash和Halpern，Biochim.Biophys.Acta 386：168～180(1975)
Bjorkman和Mowbray，J.Mol.Biol.279：651～664(1998)
Bruns等，Biochemistry 40：15631～15637(2001)
Bruns等，Nat.Struct.Biol.4：919～924(1997)
Clark等，Biochemistry 21：2227～2233(1982)
Dunten和Mowbray，Protein Sci.4：2327～2334(1995)
Duplay等，J.Biol.Chem.259：10606～10613(1984)
Groarke等，J.Biol.Chem.258：12952～12956(1983)
Guyer等，J.Bacteriol.168：775～779(1986)
He和Quiocho，Protein Sci.2：1643～1647(1993)
Hellinga和Evans，Eur.J.Biochem.149：363～373(1985)
Hsiao等，J.Mol.Biol.262：225～242(1996)
Jacobson和Quiocho，J.Mol.Biol.204：783～787(1988)
Joshi和Ames，GenBank登录号U47027(1996)
Ledvina等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：6786～6791(1996)
Luecke和Quiocho，Nature 347：402～406(1990)
Magota等，J.Bacteriol.157：909～917(1984)
Medveczky和Rosenberg，Biochim.Biophys.Acta 192：369～371(1969)
Miller等，J.Biol.Chem.258：13665～13672(1983)
Mowbray和Cole，J.Mol.Biol.225：155～175(1992)
Nickitenko等，Biochemistry 34：16585～16595(1995)
Nohno等，Molec.Gen.Genet.205：260～269(1986)
Pflugrath和Quiocho，Nature 314：257～260(1985)
Quiocho等，Structure 5：997～1015(1997)
Quiocho和Vyas，Nature 310：381～386(1984)
Sanders等，Infect.Immun.62：4515～4525(1994)
Scholle等，Molec.Gen.Genet.208：247～253(1987)
Scripture等，J.Mol.Biol.197：37～46(1987)
Schwartz等，Eur.J.Biochem.71：167～170(1976)
Sharff等，Biochemistry 31：10657～10663(1992)
Smith等，Microbiology 145：2891～2901(1999)
Spurlino等，J.Biol.Chem.266：5202～5219(1991)
Sun等，J.Mol.Biol.278：219～229(1998)
Vyas等，Biochemistry 33：4762～4768(1994)
Vyas等，Science 242：1290～1295(1988)
Weiner等，Arch.Biochem.Biophys.142：715～717(1971)
Willis和Furlong，J.Biol.Chem.249：6926～6929(1974)
Willis和Furlong，J.Biol.Chem.250：2574～2580(1975)
Yao等，Biochemistry 33：4769～4779(1994)
对于本研究中选择的11个蛋白质中的9个蛋白质，已经揭示了闭合的、配体结合状态的晶体结构(表2)。对于硫酸根BP，大肠杆菌中该蛋白质的晶体结构还没有报道，因此采用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)硫酸根BP来模拟大肠杆菌蛋白质。来自大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的硫酸根BP的氨基酸序列有95％的同一性，因此很可能具有高度相似的结构，这与来自这两种生物体的组氨酸BP类似(Oh等，J.Biol.Chem.269：4135～4143，1994；Yao等，Biochemistry 33：4769～4779，1994)。11种蛋白质中的6个蛋白质的开放式未与配体结合状态的结构也已经被揭示(表2)。
基于结构的构象偶联设计。如果由于复合体的形成和结合的构象改变，荧光团的局部环境改变，则可以建立配体结合和共价结合的、环境敏感性荧光团的荧光信号变化之间的偶联。可以辨别出两种建立这种结构连接关系的机制。直接连接包括在结合配体和偶联的荧光团之间的非结合性接触的形成。间接连接包括紧邻结合的荧光团的局部蛋白质结构的改变，和依赖于配体介导的构象改变，例如在bPBP中观察到的铰链弯曲运动。
通过用结合有荧光团的半胱氨酸替换已知形成配体接触的残基(“内构型”结合位点)，可以很容易设计直接连接关系。间接连接关系可以以两种方式建立。最直接的方法依赖于对配体复合体结构的视觉观察，以及识别位于结合位点附近但并非与配体直接接触的残基和可能参与构象改变的残基。对于bPBP，这样的残基位于形成配体结合位点的结构域间的缝隙的周边。当形成闭合状态时，这些“表构”位点的环境显著变化。这些是接近配体结合袋的位置的例子。第二种方法可以识别蛋白质结构中与配体结合位点具有一定距离的位点(即，远离配体结合袋的位点)，并经历与配体结合一致的局部构象改变。如果开放和闭合状态的结构都是已知的，那么，这样的“变构”位点可以用分析构象变化的计算方法来识别(Marvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4366～4371，1997)。另外，一旦在一个bPBP中识别了变构位点，就可以使用建模和结构同源性理论来识别其它只鉴别出一种状态的bPBP中的这样的位点(Marvin和Hellinga，J.Am.Chem.Soc.120：7～11，1998)。表3总结了本研究中所用的感受器中所有三类位点的设计。这些位点在11种bPBP中的位置列于图1中。
表3.荧光团偶联物位点
  蛋白质   突变体   空间排列的类型a   设计方法b   蛋白质   突变体   空间排列的类型a   设计方法b
  阿拉伯糖BP二肽BPGlu/AspBPFe(III)BP葡萄糖BP   D257CF23CK301CL253CL298CD450CK394CR141CS111CT44CW315CA207CA210CE119CF126CF131CF270CG211CK268CQ123CT129CE203CK202CK85CV287CY10CN15CE93CE149CH152CW183CL255CD257CV296C   aaaaapppppppppaappppappaaepppeeaaa   3333311111144444444441111111111333   组氨酸BP麦芽糖BP磷酸根BP谷氨酰胺BP核糖BP硫酸根BP   E167CK229CV163CY230CF231CY88CD95CF92CI329CS233CA225CN223CN226CS164CS39CN160CF221CK219CL162CW220Y163CY86CT135CD165CE192CA234CL236CL265CL65CN70CQ294CR134CW290CY67C   pppppaaaapaaappppppppapppaaapppppp   1111132222222222222222222222111111
a：a为变构型：e为内构型：p为表构型
b：1为封闭式结构的视觉检测；2为通过开放式和闭合式状态的自动化比较来识别；3为结构同源性；4为序列同源性
基于序列的构象偶联设计。已知序列的bPBP的数量大大超过了结构已经被揭示或通过遗传学或生物化学鉴定已经确定了功能的bPBP的数量。为开发这些潜在生物传感器的储备库，必须鉴定bPBP的编码序列，并且必须确定其推定的配体结合特异性。对微生物基因组中bPBP的鉴定依赖于发现与特定bPBP家族簇同源的氨基酸序列(Tam和Saier，Microbiol.Rev.57：320～346，1993)。那么配体结合可以通过直接的实验，或者通过与已知功能的bPBP的结构关系或者通过确定与其它已知功能基因的遗传连锁进行推断来确定(Pellegrini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：4285～4288，1999)。随后，必须鉴定同源体内发生局部构象改变的、且报告分子功能元件可以与之连接的位点。对用于连接报告分子功能元件的位点的选择依赖于已知结构的bPBPs的同源性。
为阐明这些原则，仅仅从基因组序列数据出发构建了谷氨酸生物传感器。大肠杆菌K12的基因组包含ybeJ基因座，基于与谷氨酸和组氨酸BP的氨基酸序列同源性(分别为26％和23％序列同一性，41％和43％序列相似性)(Blattner等，Science 277：1453～1474，1997)，ybeJ基因座编码据确定为推定bPBP的蛋白质。在大肠杆菌中被识别的已知结构的所有bPBP氨基酸结合蛋白质中，由于发现与配体的α-氨基酸和α-羧酸基团相结合有关的保守残基的存在，将YBEJ归为氨基酸结合蛋白得到进一步的确认(表4)。另外感兴趣的是YBEJ中精氨酸残基的存在，该精氨酸残基位于其余氨基酸结合蛋白中直接与结合的氨基酸的侧链发生作用的位置，表明YBEJ结合侧链带有负电荷的氨基酸。最后，ybeJ位于邻近三个假定参与谷氨酸/天冬氨酸转运体系的串联基因(gltJ、gltK、gltL)的位置，(Lum和Wallace，GenBank登录号U10981，1995)，表明ybeJ编码谷氨酸/天冬氨酸BP。对YBEJ与谷氨酸BP和组氨酸BP进行基于结构的序列对比，鉴定了推定的变构、内构和表构位点(图2)。
表4.配体与极性氨基酸结合蛋白的残基之间的相互作用
  配体基团*   sc   sc   sc  αN   αN   αC   sc   sc   αC   αN
  谷氨酰胺BP组氨酸BPlys/arg/omBPYBEJ   D10D11D11R25   F13Y14Y14S28   F50L52F52S73  G68S70S70S91   T70S72S72T93   R75R77R77R98   K115L117L117T137   T118T120T120T140   G119T121T121T141   D157D161D161D183
*sc：侧链；αN：α-氨基；αC：α-羧基
突变形成和蛋白质生产。本研究中所用的所有用于bPBP的基因均采用PCR技术由大肠杆菌或流感嗜血菌的基因组DNA中克隆。通过与蛋白质的已知N端序列的比较，或者对于YBEJ中，通过与已知的前导序列的同源性(von Heijne，Nucl.Acids Res.14：4683～4690，1986)来识别指导表达进入细胞周质的前导肽序列。在以下质粒中的强诱导型启动子的控制下，通过在细胞质中过表达加工后的形式来生产蛋白质，起始蛋氨酸恰好位于加工后蛋白质的N端前：pAED4(Doering，“Functional andstructural studies of a small f-actin binding domain”博士论文，MassachusettsInstitute of Technology，1992)；或pET-21a(Studier等，Meth.Enzymol.185：60～89，1990)(Novagen)；或pKK223-3(Blattner等，Science 277：1453～1474，1997)质粒。在克隆的感受器的羧端融合了寡组氨酸标签，以易于通过固定金属亲和层析法进行纯化(Hochuli等，J.Chromatogr.A 411：177～184，1987)。在所有的情况下，感受器均表达良好(每升发酵液中至少50mg纯化蛋白)。通过凝胶电泳估测的分子量与表达的阅读框架的预测分子量相一致。
通过PCR重叠法引入半胱氨酸点突变(Ho等，Gene 77：51～59，1989)。突变蛋白质通常与野生型蛋白质表达得同样好。阿拉伯糖BP中的所有的半胱氨酸替换均在C64A背景下构建，以避免来自内源性半胱氨酸的干扰(Miller等，J.Biol.Chem.254：7521～7528，1979)。在Fe(III)BP的情况下，所有的突变均在E57D背景构建。在Fe(III)BP的晶体结构中，该谷氨酸与铁进行配位(Bruns等，Nat.Struct.Biol.4：919～924，1997)。已经发现E57D突变降低了Fe(III)BP对Fe(III)的亲和力，假定1∶1的Fe(III)柠檬酸盐复合体的稳定常数为logK＝10.25(Martell和Smith，CriticalStability Constants，Plenum Press，New York，1977)，则所述亲和力从大约1×10-21(Adhikari等，J.Biol.Chem.270：25142～25149，1995)到大约3×10-8。这允许通过用Fe(III)BP为纳摩尔浓度的Fe(III)柠檬酸盐直接滴定来简便测定Fe(III)的亲和力。
利用荧光的信号转导。为报告11种bPBP的系列的配体结合，将荧光报告基团与单个半胱氨酸硫醇结合，该半胱氨酸硫醇已经通过生物工程改造加入预计发生结合依赖性变化的位置中。基于发射光谱对环境改变的敏感性和发射和激发波长覆盖的较大范围，选择并检测了8个硫醇反应性荧光团(图3)。本发明示例性生物传感器偶联物的结果列于表5(11个受体，68个半胱氨酸突变，320个荧光团偶联物)。
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体   位点b   荧光团   配体   λmax，apo λmax，sat  ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c  Kd(μM)   标准误差
  阿拉伯糖BP   D257CF23CK301CL253C   aaaa   JPW4039Acrylodan荧光素NBDJPW4039Acrylodan荧光素NBDJPW4039Acrylodan荧光素NBDJPW4039Acrylodan荧光素   阿拉伯糖   600495519538587503519543582486518532590482519   596495520544588503519548588486517538589495515   0.380.260.030.220.930.020.040.381.200.100.410.080.830.050.24   ---+-+----+----   0.921.661.171.150.760.990.450.761.731.191.063.151.311.812.71   90564.032383.93.25.0770.4624311650.6948   370.4210.60.50.140.011180.103
  NBD   539   539   0.41   +   1.66   775   49
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体   位点b   荧光团   配体   λmax，apo   λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
二肽BP   L298CD450CK394C   app   JPW4039Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan Gly-Leu   591499518543602666663508520545592638631500   591500518539604664666521520544598644640500   0.420.070.020.450.200.200.230.060.100.020.370.060.010.23   ---+---++-++++   0.651.770.480.410.291.081.181.640.040.801.340.991.070.90   7044560.911.52.011307823   2240.200.30.54282
  荧光素NBD   522542   522541   0.300.06   +-   0.210.68   930.012   60.005
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体   位点b   荧光团   配体 λmax，apo  λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
  R141CS111CT44C   ppp   JPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042   592629610502522542597644634499521538594634   596631617501522544598644642501521542596635   0.060.060.150.060.120.000.240.180.010.110.070.010.130.06   -----+++-+-+--   0.690.871.180.250.660.130.331.491.071.610.180.180.330.30 2.3383415.84.82.6 1.214141.52.31.9
  JPW4045Acrylodan荧光素NBD   640499522539   636501522536   0.130.010.050.11   ----   0.821.520.210.30 0.640.006 0.380.005
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体   位点b   荧光团   配体   λmax，apo   λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
Glu/AspBP   W315CA207C   pp   JPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素 谷氨酸   594645640503521546592635637498520   593640640504521546593634639497520   0.260.050.140.080.020.150.050.200.150.260.12   ---------+-   0.450.160.550.470.210.370.351.371.191.610.25   1.003.20.130.06   0.191.00.040.02
A210C p   NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素   529593648647497522   542594645650496522   0.050.080.110.090.090.02   +-----   2.530.260.790.710.400.14   1190.103   110.054
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体   λmax，apo   λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
E119CF126C pa   NBDJPW4039JPW4045Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan   543593649498523544596642654495   542594644497523544592643643482   0.020.120.080.110.050.050.110.010.330.07   -+++--++++   0.300.341.730.650.090.250.850.401.272.70 90382 9413
F131C a   荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBD   522571593650649487522539   519572597643642492522541   0.220.030.150.060.020.080.050.01   ++-----+   1.730.790.370.680.480.840.130.10   1.71mM0.151   0.13mM0.080
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体   λmax，apo λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
F270CG211C pp JPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042 596640644490523572594628 594645647492523571592631 0.010.080.070.070.040.060.010.09 -+---+++ 0.110.140.690.600.210.310.120.12
K268CQ123C pp   JPW4045Acrylodan荧光素NBDAcrylodan荧光素JPW4039JPW4045Acrylodan荧光素   631493522538496522592640498524   634492521538497522588641495522   0.060.020.030.070.030.060.050.000.100.13   +--+--+---   0.360.290.180.320.720.180.750.880.402.23 0.75 0.09
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体 λmax，apo λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
T129C a   NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素   544587649644484523   542584650648482523   0.010.090.060.050.040.02   ++--+-   0.530.730.680.730.520.17 0.093 0.015
Fe(III)BP E203CK202CK85C ppa   NBDJPW4039Acrylodan荧光素NBDJPW4039Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042 Fe(III)柠檬酸盐   537599518523550602505520542593638   538592518522548602503521543591641   0.090.090.410.330.310.240.370.300.230.050.03   +----------   0.150.370.950.150.210.361.170.090.140.100.28   0.01913841.9221193195195260   0.011213.53129251636
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体   位点b   荧光团   配体   λmax，apo   λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
V287C a   Acrylodan荧光素NBDJPW4039   503519545596   501520543595   0.050.010.080.13   ----   0.410.030.120.59
葡萄糖BP D257CE149CE93C app   JPW4042Acrylodan荧光素NBDAcrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan 葡萄糖   596504521551505523545401525527549385461   591506520552509522547402519518539388462   0.060.210.210.050.180.070.720.060.600.321.740.810.44   -----+-+++++-   0.240.340.050.111.970.410.680.982.263.63 2.46 2.60 2.81 22192.50.660.301.390.902532.9420.28.74 357.50.270.020.010.0320.120.30.08
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体   位点b 荧光团   配体   λmax，apo λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
荧光素NBD   523557   521546   0.100.53   ++   0.563.27   0.7712.3   0.030.2
H152CL255CNI5CV296C eaea 芘Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBD   384527525546408506525541387522521544400501522541   385524519549389509523548385524522547408503522543   0.110.510.401.291.750.570.230.190.900.180.020.040.510.000.080.40   +++++-+++-+-+---   0.822.97 2.681.204.631.981.491.710.620.680.070.822.620.630.221.06 48.133.713479.30.4940.1590.2630.1330.210.1350.2160.169 0.50.510.40.0040.0090.0210.0220.010.0070.0060.011
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体   λmax，apo   λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
组氨酸BP W183CY10CE167CK229C eepp   芘Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素 组氨酸   388483525547391498521540388504517539384526517   392504521546390497521545391506518541384527516   0.140.730.100.130.060.150.430.030.190.170.080.050.210.020.03   +-+---++-+-++--   3.40 5.571.160.140.951.161.221.282.870.720.400.421.130.410.05 5.98mM17.6mM318mM1163.31mM0.060 0.03mM2.4mM15mM30.06mM0.003
  NBD芘   532384   536384   0.120.16   ++   0.310.73
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体   位点b   荧光团   配体   λmax，apo λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c  Kd(μM)   标准误差
  V163CY230CF231CY88C   pppa   JPW4042Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBDAcrylodan荧光素   659493520542384523517535384524516545491518   654500521543384522517534384525516542493518   0.820.030.120.170.080.020.050.090.220.010.030.070.030.04   -+-++--++-++--   2.442.050.101.320.780.180.070.200.750.560.060.190.300.06   0.250.402.37   0.020.010.15
麦芽糖BP D95C a   NBD芘JPW4039 麦芽糖   532384591   532384593   0.010.150.08   -+-   0.180.440.70
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体   λmax，apo   λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c  Kd(μM)   标准误差
F92C1329C aa   JPW4042JPW4045AcrylodanJPW4039JPW4042Acrylodan荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan   663650522577646495519531595660652498   661645501583646484518533594660649500   0.010.080.040.430.040.160.020.090.050.050.040.02   -+---+++-++-   0.151.363.311.740.112.090.030.270.430.600.550.79 0.30 0.01
S233C p   荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan   517522577670678518   518523583652657519   0.040.370.420.870.420.01   ++--+-   0.081.331.734.00 3.920.80 0.20145382409 0.0261622
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体   λmax，apo   λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
磷酸根BP A225CN223C aa   荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBD荧光素 磷酸根   519544591615621503522544519   519544601628633502521554519   0.170.760.360.300.020.080.010.810.06   +++-+---+   0.100.362.861.320.821.950.971.210.01 9.30.0380.390.200.27 0.30.0190.080.030.03
  N226CS164C   ap   JPW4039JPW4042JPW4045JPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan   595673675599630645505   571651638550615563503   0.260.290.530.910.330.270.05   +++---+   2.942.053.83 3.391.782.99 3.53   0.0660.1720.2770.661.160.640.22   0.0540.1480.1690.030.220.060.06
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体 λmax，apo   λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
S39C p   荧光素NBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBD   521539597623671520519558   520540551622647520518559   0.070.020.360.010.180.100.030.18   ++-+---+   0.300.423.150.154.130.800.210.57   0.170.420.230.14   0.020.060.040.04
  谷氨酰胺BP   N160CF221C   pp   AcrylodanNBD芘JPW4042Acrylodan荧光素NBDNBDE   谷氨酰胺   529546387654498518544538   527543387652498518545537   0.110.090.040.180.040.020.060.04   ++----++   0.430.710.150.700.400.100.360.24   0.0980.0099   0.0230.0034
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
 蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体   λmax，apo λmax，sat  ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
  K219CL162CW220   ppp   AcrylodanNBDEAcrylodan荧光素Acrylodan荧光素NBDNBDE   494510496523519518538510   500510501519518518538510   0.250.020.460.170.030.010.030.00   -+-++---   1.340.212.171.800.580.030.450.28   0.380.170.38   0.030.020.06
Y163CY86C pa   芘Acrylodan荧光素NBDPyreneJPW4042AcrylodanNBDNBDE   386503518530385653490541541   390502518528385653484538551   0.400.070.040.050.010.110.410.270.12   ++------+   2.86 2.520.040.300.070.830.490.251.81 1.400.3380.052 0.120.0380.003
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体   位点b   荧光团   配体   λmax，apo λmax，sat  ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
  核糖BP   A234C   a   JPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBD   核糖   598668636504517546   600654578522517548   0.370.060.980.010.010.28   ---+-+   1.290.994.081.180.051.63   1.843.760.735   0.400.380.057
  D165CE192CL236C   ppa   JPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素JPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBDJPW4039   589650646501522598646646516526546589   593652647500522598679666516523540588   0.130.060.040.000.030.440.99 0.890.040.120.000.08   ---------++-   0.360.270.770.370.370.344.01 2.470.271.311.670.29 2.575.0315.011.42.60 0.670.770.40.80.26
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体   λmax，apo λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
  JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素   646643518520   670658518520   0.550.250.090.02   ----   3.581.700.710.29   0.621.53   0.220.41
硫酸根BP L265CT135CL65C app   NBDJPW4039JPW4042JPW4045AcrylodanNBDJPW4039JPW4042JPW4045Acrylodan荧光素NBDJPW4042 硫酸根   518600650669500545606680647518526542629   525596654663501540606674664498523544635   0.110.010.910.020.200.010.020.020.890.310.180.080.40   +----+-+-+++-   1.960.112.130.120.700.130.030.352.45 6.261.790.221.82   0.100.26＞1mM0.42mM2.09mM   0.050.060.01mM0.27mM
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体   λmax，apo λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
  Acrylodan荧光素   492520   482516   0.390.39   ++   2.951.31 1.09 0.05
N70CQ294CR134C ppp   NBD芘JPW4042Acrylodan荧光素NBD芘JPW4042Acrylodan荧光素NBD芘JPW4039JPW4042Acrylodan荧光素   522386522502517524386636500515530384522606493512   521385522502517524386630500514530384518608478512   0.020.130.010.010.010.010.010.270.040.000.000.010.080.520.180.01   -++------+++-+--   0.611.200.180.100.010.140.131.170.130.110.020.082.020.962.260.02 0.837.529.14.170.323 0.080.21.20.130.027
表5.荧光团偶联bPBP的光谱和结合参数
  蛋白质a   突变体  位点b   荧光团   配体 λmax，apo λmax，sat   ΔIstd c   inc/decd   ΔRmax c   Kd(μM)   标准误差
W290CY67C pp   NBD芘JPW4042Acrylolan荧光素NBD芘Acrylodan荧光素NBD芘   531382612496516538384503515536383   532386624496515537384502515534383   0.580.150.430.040.040.060.160.000.010.130.02   -+--+-+--++   0.371.300.890.030.090.110.370.120.040.200.48   22.40.336   0.50.012
a：所有阿拉伯糖BP的突变体在C64A背景下
   所有Fe(III)BP中的突变体在E57D背景下
b：a：变构型，e：内构型，p：表构型
c：黑体数字表示满足本文中所详细描述的传感器应用的阈值标准
   带下划线的数字表示优异的绝对强度或比例测定传感器
   黑斜体字表示两个参数均优异的传感器
d：inc/dec，配体结合后最大荧光强度增高(+)或降低(-)
对荧光生物传感器功能的评估。在不存在或存在饱和配体浓度的情况下，记录bPBP-荧光团偶联物的荧光发射光谱。光谱的改变由4个参数进行表征：波长偏移(未结合配体和配体饱和状态之间最大发射波长的差)；强度改变的方向(在两种状态下在最大发射波长时强度的增高或降低)；标准强度变化(ΔIstd)和标准比例测定变化(ΔR)。ΔIstd被定义为在两个发射极值间波长中点测定的相对于平均强度的标准化的强度变化：
这里λstd＝(λmax，未结合+λmax，饱和)/2；I1、I2分别为在各个光谱λstd处的荧光强度(图4A)。就两个发射带A1([λ1，λ2])和A2([λ3，λ4])(图4B)而言，ΔR的定义为：
Δ&Rgr; = | &Agr; 1 0 &Agr; 2 0 - &Agr; 1 ω &Agr; 2 ω | . . . ( 2 )
这里oA1和∞A2为没有配体的区域，∞A1和∞A2为具有饱和配体的区域。利用计算机程序来对于两种波谱的波长带的所有可能的配对列举ΔR，以鉴定最佳的感应条件，并将其定义为ΔR的最大值。运算法则的可调参数以及这里报道的它们用于定量ΔRmax的值为：步长(2nm)，步宽(10nm)，最小积分面积极限(占总体的分数：0.1)，和最大积分面积极限(占总体的分数：1)。
分析物亲和力检测。通过荧光滴定用Δstd＞0.1的133个bPBP-荧光团偶联物来确定配体结合亲和力(表5)。所监控的发射波长为无配体结合和配体结合状态之间的强度差别最大的波长。对于每个偶联物，荧光强度测定的观察结果拟合为两种状态模型的双曲线结合等温线(Marvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4366～4371，1997)：
F = K d F F + [ S ] F R K d + [ S ] . . . ( 3 )
这里F为配体浓度[S]时的荧光，Kd为解离常数，FF和FB分别为无配体和配体饱和状态时的荧光强度。葡萄糖BP和谷氨酸/天冬氨酸BP的结合等温线的实例如图5所示。对于比例测定观察结果，必须对等式3进行修正以解释两个发射带的差异加权分布(Lakowicz，Principles ofFluorescence Spectroscopy，第二版，Kluwer Academic Press，New York，第698页，1999)：
R = K d R F + [ S ] R B app K d + [ S ] app . . . ( 4 )
这里R为比例A1/A2；RB＝∞A1/∞A2；RF＝oA1/oA1；appKd为表观解离常数：
K d = A 2 0 A 2 ∞ app K d . . . ( 5 )
荧光生物传感器设计策略的成功通过以下方式来评价：确定遇到有效反应的荧光偶联物的概率，以及评估配体结合亲和力怎样受荧光团偶联物的影响。
对配体介导的荧光变化的评估。在图6A的柱状图中显示了所有偶联物(n＝320)的波长偏移、Δstd和ΔRmax的概图。波长偏移的分布大约以零为中轴对称分布，即没有朝向蓝移或红移的总体趋势。在全部偶联物的集合中，在配体结合时，130个偶联物表现出增高的荧光强度；190个偶联物表现出降低的荧光强度。这种不对称部分是由于所发现的向所有Fe(III)BP偶联物中加入Fe(III)柠檬酸盐，导致荧光发射降低的结果。为了检测这是否是由于被溶液中的Fe(III)所淬灭，将Fe(III)柠檬酸盐加入其它bPBP的偶联物中，并监控对发射强度的作用。发现在所有情况下，Fe(III)柠檬酸盐均淬灭荧光，但只有在浓度大大高于Fe(III)BP中导致该效应的浓度条件下。因此在所有Fe(III)BP偶联物中观察到的荧光强度的降低是由于特异性结合的过程，并且可能通过金属介导的氧化还原作用机制涉及激发态的驰豫(Lakowicz，Principles of FluorescenceSpectroscopy，第二版，Kluwer Academic Press，纽约，第698页，1999)。遇到对特定强度起反应的偶联物的概率随着ΔIstd量的增高而降低(图6B)。比例测定响应有类似表现(图6C)。
两个对视觉读取最有利用价值的标准为ΔIstd和ΔRmax。bPBP偶联物的集合通过空间排列位点、荧光团和蛋白支架的种类进行分类，那么，对每一个种类，根据ΔIstd＞0.25和ΔRmax＞1.25的分数进行定量。结果(表6到表8)显示了寻找潜在可利用的荧光生物传感器偶联物的总体成功率。对于320个偶联物的集合，大约24％达到ΔIstd标准，大约28％达到了ΔRmax的标准。
表6.结合蛋白的信号参数
结合蛋白   分数ΔIstd＞0.25   分数ΔRmax＞1.25   n(数量)
  阿拉伯糖BP葡萄糖BP核糖BP二肽BP谷胺酰胺BP组氨酸BPGlu/Asp BP磷酸根BP硫酸根BP麦芽糖BPFe(III)BP总计   0.500.470.320.080.200.040.040.450.230.290.280.24   0.400.500.410.140.240.130.150.550.200.380.000.28   2036343625245422302118320
表7.空间排列位点的信号参数
位点 分数ΔIstd＞0.25 分数ΔRmax＞1.25 n
  变构型表构型内构型总计   0.280.200.500.24   0.320.150.500.28   11019812320
表8.荧光团的信号参数
荧光团   分数ΔIstd＞0.25   分数ΔRmax＞1.25 n
  Acrylodan荧光素NBDNBDE芘JPW4039JPW4042JPW4045合计   0.210.130.250.000.220.380.320.290.24   0.380.160.200.250.300.280.300.390.28   666261423393728320
信号成功率和序列相关家族或簇之间看起来存在相关性(Tam和Saier，Microbiol.Rev.57：320～346，1993)，所述序列相关家族或簇含有支架。ΔIstd和ΔRmax的成功率最高的支架为阿拉伯糖BP、葡萄糖BP、核糖BP和磷酸根BP(表6)。前三者属于簇2，其中包括己糖和戊糖的结合蛋白；而磷酸根BP和硫酸根BP同属于簇6，其中包括无机物聚阴离子的结合蛋白。成功率最低的支架为二肽BP(簇5、肽和镍结合)以及簇3(结合极性氨基酸)蛋白谷氨酰胺BP、组氨酸BP和Glu/Asp BP。
在三类结合位点中，内构型和变构型位点比表构型位点具有更高的达到域值标准的几率(表7)。在ΔIstd方面的成功率随着荧光团的环境敏感性的变化而改变，苯乙烯基和萘基染料JPW4039、JPW4042和JPW4045的成功率最高。类似地，对于ΔRmax更高的成功率与JPW4045和acrylodan有关(表8)。
配体结合亲和力变化的评估。对于各个配体获自结合曲线的解离常数Kd的范围示于表9。由于配体结合与结合的荧光团和蛋白质之间的相互作用存在热力学联系，所以预计荧光团将改变其固有配体解离常数。预计由荧光团所赋予的亲和力的变化依赖于其在蛋白质的位置。各种偶联物表现出了广泛的亲和力范围(表9)。亲和力的变化定义为log(mutKd/wtKd)，在108种偶联物中检测了作为结合位点类型(内构型、变构型或表构型)函数的亲和力变化，对所述偶联物的解离常数进行检测并且非偶联蛋白的解离常数是已知的(表2)。其结果揭示三类位点对亲和力具有不同的效应(图7)。在内构型位点结合的荧光团倾向于最大地扰乱亲和力，并且一致具有比野生型更高的Kd值。变构型结合和表构型结合导致Kd值比野生型的增高或降低，而表构型位点表现的效应改变最大。有趣的是，在那些具有比野生型更高的亲和力的偶联物中(低Kd)，更高的比例来自在变构型位点的偶联物。这证实了在麦芽糖BP中进行的详细研究的正确性，在所述研究中，通过控制变构型位点的氨基酸残基的体积而提高其亲和力(Marvin和Hellinga，Nat.Struct.Biol.8：795～798，2001)。所述效应上的差异可以依照相似性进行合理解释：特定偶联物可以直接与配体结合(内构型位点，和一些表构位点)发生空间干扰，或通过影响开放式和闭合式状态间的固有平衡(变构型位点和表构位点)发生空间干扰。
表9.bPBP荧光偶联物中配体亲和力的范围
  bPBP  配体   Kd值的范围(μM)   n
  阿拉伯糖BP葡萄糖BP核糖BP二肽BP谷氨酰胺BP组氨酸BPGlu/Asp BP磷酸根BP硫酸根BP麦芽糖BPFe(III)BP  阿拉伯糖葡萄糖核糖Gly-Leu谷胺酰胺组氨酸谷氨酸磷酸根硫酸根麦芽糖Fe(III)柠檬酸盐   0.46～7750.13～3180000.1～20900.006～930.01～1.40.06～2.370.019～17000.038～1.20.32～290.2～4090.66～260   19261421849128610
如阿拉伯糖BP所阐明的，解离常数的效应不仅由结合位点决定，也由结合的荧光团的特性决定。通过色氨酸荧光团测定的5个半胱氨酸替代的突变体的阿拉伯糖的解离常数(均具有C64A突变)为5.0μM(F23C)、3.2μM(L253C)、3.4μM(D257C)、7.6μM(L298C)和1.6μM(K301C)。因此该半胱氨酸替代稍微干扰了对阿拉伯糖的亲和力(C64A突变体的Kd约为2.2μM)。对于L253C突变体发现了对结合荧光团的最大依赖，其Kd值在0.7μM(acrylodan)到775μM(NBD)之间。类似地，二肽BP的K394C突变体对Gly-Leu二肽的亲和力范围从6nM(NBD)到93μM(荧光素)。大多突变体并不表现出这样大范围对荧光的配体亲和力的依赖。例如，偶联至核糖BP E192C的5个不同的荧光团对核糖的亲和力范围为从2.6μM(NBD和JPW4039)到15μM(JPW4045)。
用序列信息构建新的生物传感器。为证明设计并不局限于采用那些已知结构的bPBP，采用组氨酸和谷氨酰胺BP作为指导类似的表构型和变构型位点位置的结构，向推测编码谷氨酸/天冬氨酸BP的同源物(paralog)中引入半胱氨酸突变。所测试的所有10个位点均产生了在荧光方面表现出谷氨酸和天冬氨酸依赖性变化的偶联物。多个位点生产出了良好或优异的强度测定或比例测定传感器。表10显示了该响应对于天冬氨酸和谷氨酸均具有特异性，并且对天冬氨酸和谷氨酸的亲和力减低50到500倍。其它的氨基酸和糖不会引起配体介导的荧光变化。
表10.谷氨酸/天冬氨酸BP的突变体中的结合特异性和亲和力
  突变体   荧光团                   Kd(μM)
  Glu   Asp   Gln   Asn
  Q123CF126CF126CF126CT129CT129CF131CA207CA210C   荧光素Acylodan荧光素JPW4045NBDJPW4039JPW4039NBDJPW4042   0.758217079030.0190.0930.151190.10   1.8115200014970.0610.035454   4912.123   965.4
生物信息学使不需直接试验就发现新的生物化学应用成为可能。对于生物传感器，单个细菌基因组可以编码许多结合特异性分子的bPBP，来开始转运或信号转导(Blattner等，Science 277：1453～1474，1997；Quentin等，J.Mol.Biol.287：467～484，1999)。其中这些很少进行了表征，使大量可作为潜在生物传感器支架的bPBP未被开发。应用基因组信息并结合来自同源蛋白质的结构信息，来构建具有新的特异性的生物传感器的可行性现已被论证。
以前已经从大肠杆菌中纯化了谷氨酸/天冬氨酸BP(Barash和Halpern，Biochim.Biophys.Acta 386：168～180，1975；Willis和Furlong，J.Biol.Chem.250：2574～2580，1975)并进行了表征。多个证据表明YBEJ相当于该蛋白。首先，谷氨酸/天冬氨酸BP是从细胞周质提取物中分离的，这与编码具有推测的周质定位信号序列的蛋白质的ybeJ一致。其次，以前确定的谷氨酸/天冬氨酸BP的分子量为32kDa(Barash和Halpern，Biochim.Biophys.Acta 386：168～180，1975)或31kDa(Willis和Furlong，J.Biol.Chem.250：2574～2580，1975)与推测的加工后ybeJ产物的32.5kDa，以及本研究中通过凝胶电泳得到的30kDa的分子量相一致。第三，以前确定的氨基酸组成(Barash和Halpern，Biochim.Biophys.Acta 386：168～180，1975；Willis和Furlong，J.Biol.Chem.250：2574～2580，1975)与从该基因序列中预测的氨基酸组成相似，某些偏差极可能是由于对蛋白质酸性水解产物的分析本身不精确。最后，所报道的对谷氨酸的Kd值(0.8μM)、对天冬氨酸的Kd值(1.2μM)，以及对谷氨酸和天冬氨酸的相对较低的亲和力(Willis和Furlong，J.Biol.Chem.250：2574～2580，1975)与本发明所确定的类似，并且与Q123C荧光素偶联物(表10)相当。因此，ybej可能编码先前表征的谷氨酸/天冬氨酸BP。
有效的传感器设计。通过信号强度的绝对变化、比例测定变化以及传感器可以精确发生响应的操作浓度范围来确定偶联物的应用。在两个可以观察到的参数中，因为比例测定改变不依赖于探针的浓度，所以比例测定变化优于绝对强度。
尽管可用的偶联物可以被定义为具有ΔIstd＞0.25和ΔRmax＞1.25的偶联物，“优异”的传感器可以被定义为具有ΔIstd＞0.9和ΔRmax＞2.5的偶联物。在优异的传感器中变化量可能足够大以允许在“真实世界”的应用中在诸如血液等复杂液体中进行强有力的测量。基于这些标准，只有13个优异的基于绝对强度的传感器(占总数的4％)，但有36个优异的比例测定传感器(占总数的11％)；有7个偶联物既是优异的绝对强度也是优异的比例测定传感器(表5)。除了二肽BP、Fe(III)BP和组氨酸BP外，所有的蛋白质均具有至少一个优异的比例测定和基于强度的偶联物。葡萄糖BP具有最大数量的优异的偶联物。这些偶联物均涉及已知的对环境具有特定敏感性的荧光团(acrylodan、NBD、芘、和苯乙烯基染料)。优异的传感器的出现率在变构型和表构型位点之间平均分布。所有的内构型位点均产生优异的传感器。
偶联物的解离常数决定了传感器可以发生精确响应的操作浓度范围。确保误差小于5％的操作范围落在为Kd值5倍的浓度范围内(Marvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4366～4371，1997)。如果对于精确测定所需的范围比上述范围大，那么，如已经证明的麦芽糖BP(Marvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4366～4371，1997)那样，可以采用具有不同亲和力的感受器来构建复合传感器。有3个影响解离常数的因素：偶联物的性质、对于比例测定感受器发射带的选择(等式2)以及附加的突变。对于特定应用，可以控制这三种因素来构建合适的传感器。
葡萄糖传感器。在可以应用于临床药物的分析物中，葡萄糖是其中最重要的一个，特别是对于糖尿病的诊断和治疗更为重要。成人血清中葡萄糖浓度的正常范围是4mM到6mM(Burtis和Ashwood，TeitzTextbook of Clinical Chemistry，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，Pennsylvania，1994)。葡萄糖BP中内构型位点W183C的Acrylodan偶联物具有优异的比例测定响应(ΔRmax＝5.57)，以及5.98mM的解离常数，因此是一种通过比例测定检测生理范围内葡萄糖波动的优良候选物(图8A)。而且，通过调节比例测定参数，观察窗口很容易从5.0mM扩展至17.4mM，从而可以用一个传感器观察到所有的临床相关范围(图8A)。
用于临床化学的其他传感器。在临床试验中通常还测定作为疾病状态指示物的氨基酸。组氨酸是组氨酸酶缺乏的指示物(Taylor等，Molec.Biol.Med.8：101～116，1991)。最好的信号组氨酸BP偶联物V163C-JPW4042，具有0.25μM的Kd，低于血清中约48μM至125μM的正常范围。然而，随着样品的稀释，该偶联物可以有效地发挥功能。选择性地，可通过诱变调节Kd，如对麦芽糖BP(Marvin和Hellinga，Nat.Struct.Biol.8：795～798，2001)以及具有E57D突变的Fe(III)BP所做的调节。神经兴奋性氨基酸谷氨酸具有正常的20μM至220μM的血清浓度(Burtis和Ashwood，Teitz Textbook of Clinical Chemistry，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，Pennsylvania，1994)。最适合的生物传感器为谷氨酸/天冬氨酸BP F 126C-acrylodan，其Kd约为80μM且ΔRmax＝2.70。谷氨酰胺常在脑脊液中测量(Smith和Forman，Clin.Lab.Sci.7：32～38，1994)，其中其正常范围为120μM至360μM，显著高于最好信号谷氨酰胺BP偶联物Y163C-acrylodan的Kd(约为1.4μM)。可通过诱变调节Kd，或将样品稀释而将该生物传感器用于上述目的。
血清和尿中磷酸根浓度是与临床相关的(Burkhardt等，Am.J.Clin.Pathol.72：326～329，1979)。许多磷酸根BP偶联物的信号良好，最好的为S39C-JPW4045，它们的Kd值均小于2μM。血清中无机磷酸根一般为1mM至3mM(Burtis和Ashwood，Teitz Textbook of Clinical Chemistry，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，Pennsylvania 1994)，为了用传感器进行正确的测量，需要调整Kd或将样品稀释。
麦芽糖浓度与酸性麦芽糖酶缺乏相关，正常血浆浓度约为2μM(Rozaklis等，Clin.Chem.48：131～139，2002)。本发明中最好的麦芽糖传感器为麦芽糖BP偶联物S233C-JPW4042(ΔRmax＝4.0)和S233C-JPW4045(ΔRmax＝3.9)，两者均具有类似的亲和力(Kd约为400μM)。在2μM范围具有亲和力的麦芽糖BP突变体的荧光偶联物已由Marvin等描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4366～4371，1997)。
工业和环境应用。bPBP偶联体可作为用于工业和环境分析物的传感器。阿拉伯糖与提高从谷物生产乙醇的效率相关(Deanda等，Appl.Environ.Microbiol.62：4465～4470，1996)。在阿拉伯糖BP偶联物中，最好的信号物为K301C-NBD(Kd约为31μM，ΔRmax＝3.2)和L253C-荧光素(Kd约为48μM，ΔRmax＝2.7)。在食物或饮料中所测定的核糖浓度(AOAC，Official Methods of Analysis of AOAC International，第16版，AOAC International，Arlington，Virginia，1995)可以通过核糖BP偶联物T135C-acrylodan(Kd约为0.4mM，ΔRmax＝6.3)和A234C-JPW4045(Kd约为3.8mM，ΔRmax＝4.1)测量。由T135C-acrylodan偶联物来举例说明使用单个核糖BP衍生物的核糖比例测定(图8B)。通过改变荧光比例中的发射波长带(等式4、5)，对于核糖的appKd可在41μM至146μM的范围调节(图8B)。饮用水中的硫酸根浓度正受到关注(U.S.EPA，HealthEffects From Exposure to High Levels of Sulfate in Drinking Water，第1～25页，Office of Drinking Water and Ground Water，1999)，可通过硫酸根BP偶联物R134C-acrylodan(Kd约为4μM，ΔRmax＝2.3)进行分析。高浓度磷酸根是对环境有害的，如上述提及的用于临床应用那样，可使用磷酸根BP偶联物来监控。铁浓度限制了海洋某些区域中的初级生产力(Martin，Iron as a Limiting Factor in Primary Productivity andBiogeochemical Cycles in the Sea.Falkowski和Woodhead，编辑，第123～137页，Plenum Press，纽约)。可使用源于Fe(III)BP如偶联物E203C-acrylodan(Kd约为138μM，ΔIstd为0.4)的生物传感器来测定可利用的铁离子。
所有上面引用的文献在此作为参考整体引用。美国申请No.10/229,286(以US 2003/0129622公开)和国际申请No.PCT/US02/27279(WO 03/021247)中包含生物电子传感器的电子装置的公开内容也作为参考引用。

Claims (23)

1.用于配体的生物传感器，该生物传感器包含非麦芽糖结合蛋白的细菌周质结合蛋白(bPBP)以及至少一个结合在所述bPBP的一个或多个特定位置的报告基团；其中在所述生物传感器的配体结合袋中所述配体的结合通过所述报告基团引起信号改变；条件是包含葡萄糖结合蛋白(GBP)的生物传感器限于在所述GBP选自10、93、149或183的一个或多个位置结合至少一个报告基团。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其中所述bPBP选自阿拉伯糖结合蛋白(ABP)、核糖结合蛋白(RBP)、二肽结合蛋白(DBP)、谷氨酰胺结合蛋白(QBP)、组氨酸结合蛋白(HBP)、谷氨酸/天冬氨酸结合蛋白(EBP)、磷酸根结合蛋白(PBP)、硫酸根结合蛋白(SBP)和Fe(III)结合蛋白(FeBP)。
3.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中所述bPBP包含位于与所述报告基团未共价连接的位置的一个或多个突变。
4.如权利要求1或2所述的生物传感器，其中所述配体结合袋包含一个或多个突变且所述配体不与野生型bPBP结合。
5.如权利要求1～4任一项所述的生物传感器，其中所述报告基团与所述bPBP在距所述配体结合袋一段距离的一个或多个位置结合。
6.如权利要求1～4任一项所述的生物传感器，其中所述报告基团与所述bPBP在邻近所述配体结合袋的一个或多个位置结合。
7.如权利要求1～6任一项所述的生物传感器，其中所述报告基团在所述bPBP的一个或多个特定位置共价结合。
8.如权利要求1～6任一项所述的生物传感器，其中所述报告基团在所述bPBP的一个或多个特定位置非共价结合。
9.如权利要求1～8任一项所述的生物传感器，其中所述报告基团为氧化还原辅因子。
10.如权利要求1～7任一项所述的生物传感器，其中所述报告基团为荧光团。
11.如权利要求10所述的生物传感器，其中一旦与配体结合，所述生物传感器的标准强度变化(ΔIstd)大于0.25。
12.如权利要求11所述的生物传感器，其中所述ΔIstd大于0.9。
13.如权利要求10所述的生物传感器，其中一旦与配体结合，所述生物传感器的标准比例测定变化(ΔRmax)的最大值大于1.25。
14.如权利要求13所述的生物传感器，其中所述ΔRmax大于2.5。
15.用于配体的生物传感器，其包含细菌周质结合蛋白(bPBP)以及至少一个结合在所述bPBP的一个或多个特定位置的报告基团，所述特定位置为表构位点或内构位点。
16.如权利要求1～15任一项所述的生物传感器在测定配体中的应用。
17.一种检测样品中配体存在或缺乏的方法，该方法包括：将如权利要求1～15任一项所述的生物传感器在所述生物传感器能与样品中所存在的配体结合的条件下与样品接触；将当所述生物传感器与所述样品接触时由报告基团传导的信号与当所述生物传感器与至少一种包含已知配体量的对照样品接触时由报告基团传导的信号进行比较；并且由所述比较确定所述样品中配体的存在或缺乏。
18.一种对样品中配体的含量或浓度进行定量的方法，该方法包括：将如权利要求1～15任一项所述的生物传感器在所述生物传感器能与样品中所存在的配体结合的条件下与样品接触；将当所述生物传感器与所述样品接触时由报告基团传导的信号与由一系列包含已知配体量的对照样品传导的信号进行比较；并且由所述比较计算所述样品中配体的量。
19.一种测定样品中的配体的方法，该方法包括：
(a)将包含细菌周质结合蛋白(bPBP)和至少一个结合在所述bPBP的一个或多个特定位置的报告基团的生物传感器与所述样品接触，其中在所述生物传感器的配体结合袋中的配体结合通过所述报告基团引起信号变化；
(b)测定由所述报告基团传导的信号的比例测定变化(ΔR)；以及
(c)至少检测或定量存在于所述样品中的配体。
20.如权利要求17～19任一项所述的方法，其中所述样品包含生理液体。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述生理液体选自血液、间质液、灌洗液、汗液、血浆、唾液、血清或尿。
22.如权利要求17～19任一项所述的方法，其中所述样品预计包含配体，该配体选自氨基酸、可溶的生物活性固体和气体化合物、碳水化合物、违禁品或受控物质、环境污染物、爆炸物、食物污染物和副产品、脂质、金属离子、微生物毒素、神经递质、核苷或核苷酸、肽、类固醇或治疗药品。
23.一种构建生物传感器的方法，该方法包括：
(a)选择具有已知氨基酸序列的第一细菌周质结合蛋白(bPBP)，其中所述第一bPBP的三维结构尚未确定；
(b)在第二bPBP的已确定的三维结构上模拟所述第一bPBP的三维结构；
(c)将所述第二bPBP的至少一个变构型、内构型或表构型位点与将结合报告基团的所述第一bPBP的一个或多个推定位置进行比对；以及
(d)将至少一个报告基团结合在所述第一bPBP的一个或多个所述推定位置以形成推定的生物传感器，并且测定所述推定的生物传感器是否具有功能。
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