KR101107630B1

KR101107630B1 - 바이오센서

Info

Publication number: KR101107630B1
Application number: KR1020057006620A
Authority: KR
Inventors: 홈므 더블유. 헤린가; 로렌 엘. 루거
Original assignee: 듀크 유니버시티
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2003-10-16
Publication date: 2012-01-25
Also published as: ATE423318T1; US20170322209A1; CA2502272A1; US20080166747A1; DE60326256D1; KR20050083772A; JP4571499B2; CN100492010C; US20040118681A1; CA2502272C; HK1080937A1; WO2004036176A2; EP1552303B1; EP1552303A2; ES2321931T3; WO2004036176A3; US10712341B2; AU2003277377A1; AU2003277377B2; JP2006503293A

Abstract

바이오센서는 최소한 하나의 리포터 그룹을 박테리아 원형질막 결합 단백질 (bPBP)의 하나 이상의 특정 부위에 공유결합 또는 비-공유결합적으로 접촉시킴으로서 제조된다. 바이오센서에 대해 리간드가 결합하는 동안, 리포터 그룹에 의해 신호 전달이 변화한다.

Description

바이오센서{Biosensor}

본 발명은 바이오센서, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

연방 지원된 연구 또는 개발

미합중국 정부는 NIH-RO1-GM49871 및 ONR-N00014-98-1-0110의 규정에 의해 제공되는 본 발명에 대해 권리를 갖고 있다.

바이오센서 (biosensor)는 생물학적 거대분자의 민감한 분자 인식 특성을 손쉽게 검출가능한 물리학적 변화와 커플 리간드 결합하는 신호 전달 매커니즘과 결합시킴으로써 복합체 혼합물에 있는 단일 분자 종의 존재 유무를 측정하는데 이용될 수 있는 분석학적 도구이다 (Hall, Biosensors, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey; Scheller et al., Curr. Op. Biotech. 12:35-40, 2001). 이상적으로, 효소-기초 (Enzyme-based) 분석 또는 경쟁적 면역분석과는 대조적으로, 바이오센서는 시약이 존재하지 않으며, 측정의 결과로서 조성물을 변화시키지 않는다 (Hellinga & Marvin, Trends Biotech. 16:183-189, 1998). 대부분의 바이오센 서들은 분자에 대해 개별적인 적합한 물리적 신호를 인식하는 효소나 항체와 같은 자연적으로 발생하는 거대분자를 시스템에 대해 특이적인 검출기의 구성요소와 결합시킨다 (Meadows, Adv. Drug Deliv. Rev. 21:177-189, 1996). 최근에는 거대분자를 개발하기 위해 광범위한 결합 특이성과 친화도를 공통적인 신호 전달 매커니즘과 결합시킨 분자 공학 기술이 연구됨으로써, 수많은 분석물에 대한 일반적인 검출 시스템을 구축하였다 (Hellinga & Marvin, Trends Biotech. 16:183-189, 1998).

대장균 (Escherichia coli)의 원형질막 결합 단백질은 단백질 슈퍼패밀리 (박테리아 원형질막 결합 단백질, bPBPs)의 일종으로서 (Tam & Saier, Microbiol. Rev. 57:320-346, 1993) 바이오센서 공학에 매우 적합한 것으로 알려졌다 (미합중국 특허 제6,277,627호). 이러한 단백질들은 경첩 (hinge) 부위에 의해 연결되는 두개의 도메인을 포함한다 (Quiocho & Ledvina, Molec. Microbiol. 20:17-25, 1996). 리간드-결합 위는 두개의 도메인 사이에 있는 경계면에 위치한다. 단백질들은 바람직하게는 하기의 두가지 형태: 리간드-프리 개방 형태 및 리간드-결합 폐쇄 형태를 채택하며, 이는 리간드 결합하는 동안 경첩-굽힘 (bending) 매커니즘을 통해 상호 호환한다. 이러한 광범위한, 리간드-유도된 형태학적 변화는 형광 강도에 있어서 단일 위치에서 커플 리간드의 결합이 변화하며, 위치들에 있는 환경학적으로 민감한 플루오로포어 (fluorophore)는 광범위한 변화와 함께 국소적인 형태학적 변화를 경험하는 것으로 밝혀졌다 (Brune et al., Biochemistry 33:8262-8271, 1994; Gilardi et al., Prot. Eng. 10:479-486, 1997; Gilardi et al., Anal. Chem. 66:3840-3847, 1994; Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366- 4371, 1997; Marvin and Hellinga, J. Am. Chem. Soc. 120:7-11, 1998; Tolosa et al., Anal. Biochem. 267:114-120, 1999; Dattelbaum & Lakowicz, Anal. Biochem. 291:89-95, 2001; Marvin & Hellinga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4955-4960, 2001; Salins et al., Anal. Biochem. 294:19-26, 2001). 또한, 형태학적 커플링 매커니즘은 공유결합한 레독스 (redox) 보조인자를 포함하는 조작된 (engineered) bPBP를 이용하여 유도된 전극의 표면 사이의 전류의 흐름을 변화시키기 위해 고안될 수 있다 (Benson et al., Science 293:1641-1644, 2001).

본 발명은 당, 아미노산, 디펩타이드, 양이온 및 음이온을 포함하는 다양한 화학적 클래스의 바이오센서를 생산하기 위해 bPBPs를 이용하는 방법을 제공한다. 이러한 바이오센서들은 의학적, 산업적 및 환경적 세팅을 포함하여 광범위하게 적용된다.

발명의 요약

본 발명은 바이오센서, 박테리아 원형질막 결합 단백질 (bPBP) 슈퍼패밀리의 야생형 또는 돌연변이 군으로부터 상기 바이오센서를 제조하는 방법 및 리간드를 분석하기 위한 (즉, 검출 및/또는 정량) 이의 용도에 관한 것이다. bPBP의 3차 구조는 두개의 도메인 사이의 경계면에 위치한 리간드-결합 포켓을 가지고 경첩 부위에 의해 연결된 두개의 도메인을 포함한다. 바람직하게 이들은 하기 두개의 형태를 적용하는데: 리간드-프리 개방 형태 및 리간드-결합 폐쇄 형태, 이 형태는 리간드가 그 위치에 결합하거나 그렇지 않은 것에 따라 의존하는 경첩-굽힘 매커니즘을 통해 상호전환한다. 바이오센서는 최소 하나의 리포터 그룹이 bPBP의 하나 이상의 특정 부위에 공유 또는 비-공유 결합함으로써 제조된다. 리간드가 바이오센서로 결합하는 동안, 리포터 그룹의 관찰가능한 모든 특징 (예, 광학 또는 전기화학적 특징)을 평가함으로써 분석될 수 있는 리포터 그룹에 의해 신호 전달이 변화할 수 있다. 바이오센서는 리포터 그룹의 결합 위치 및 리간드의 결합 위치(들) (즉, 알로스테릭, 엔도스테릭 또는 페리스테릭) 또는 이러한 위치 사이의 거리 (즉, 거리가 멀거나 가까운)와의 관계에 따라 분류된다.

본 발명에 따르면, 바이오센서로의 리간드의 결합은 위치-특이적으로 결합한 리포터 그룹의 국소적 환경을 변화시킨다. 상기 리포터 그룹의 신호는 하나 이상의 플루오로포어 및/또는 레독스 보조인자에 의해 유발될 수 있다. 상기 바이오센서는 추가적인 시약을 사용하지 않고도 생리적인 조건하에서 조작될 수 있다.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 기재로부터 명확해진다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 조작된 bPBPs, 예를 들어 E.coli bPBPs를 이용하여 제조된 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 콘쥬게이트가 제조되며, 이는 bPBPs에 대한 리간드의 결합을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 콘쥬게이트는 단백질 구조에 있는 하나 이상의 특정 위치에서 bPBP에 돌연변이를 도입함으로써 제조될 수 있으며, 공유 결합한 리포터 그룹 (예, 플루오로포어 또는 레독스 보조인자)은 리간드 결합하는 동안에 발생하는 bPBP의 형태학적 변화에 반응한다. 최소 하나의 리포터 그룹을 돌연변이 또는 야생형 bPBP의 일차 아미노산 서열에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에 공유결합시키거나 또는 비-공유결합시키기 위한 다른 방법은 하기 방법을 포함한다: 모든 활성 크로스링커의 부가 또는 치환, 디자이너 (designer) 또는 비-천연 tRNA의 사용, 결합 위치의 도입 등.

bPBPs에 있는 조작된 형태학적 커플링 매커니즘의 보편성은 본원에 개시되어 있다. 하기 실시예에서 개시한 바와 같이, 공지된 구조의 10개의 bPBPs가 사용되었으며, 8개의 다른 환경적으로 민감한 플루오로포어는 리간드-유도된 경첩-굽힘 모션으로 국소적인 형태학적 변화를 연결하는 것으로 예측된 다양한 부위에 전달되었다. 바이오인포매틱스 (bioinformatics) 기술은 공지된 구조의 bPBPs에 있는 연결된 위치를 예측하는데 사용될 수 있으며, 따라서 이는 게놈 시퀀싱 연구에 의해 최근에 확인된 수많은 파라로그 (paralog) 및 동형 (homolog)을 사용가능하게 한다 (Blattner et al., Science 277:1453-1474, 1997; Quentin et al., J. Mol. Biol. 287:467-484, 1999). 리간드-결합 특이성의 구조-기초 재디자인의 가능성과 함께 (Hellinga ＆ Richards, J. Mol. Biol. 222:763-785, 1991; Marvin ＆ Hellinga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4955-4960, 2001), 하기에 제공되는 실시예는 광범위하게 적용될 수 있도록 맞추어진 바이오센서 시스템에 대한 기초로서 bPBP 슈퍼패밀리의 광범위한 잠재성에 대해 개시한다.

또한, 리간드-결합 포켓은 야생형 bPBP에 의해 결합하지 않는 리간드에 결합하도록 조작될 수 있다. 리간드-결합 위치는 bPBP의 두개의 도메인 사이의 경계면에 위치한다. 야생형 bPBP의 결합 위치 근처 (즉 내부 또는 주위)의 경계면에서 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것은 리간드 (즉, MBP에 대한 Zn⁺⁺)와의 새로운 접촉을 유발할 것이며 유사한 리간드 (예, MBP에 대한 말토오즈)와의 결합을 파괴하거나 변화시킬 것이다. 이는 리간드-결합 포켓의 특이성을 변화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 말토오즈 결합 단백질은 하기의 비유사 리간드에 특이적으로 결합하도록 돌연변이되었다: 예, 금속 Zn⁺⁺ 이온, 트리니트로톨루엔, L-락테이트 및 세로토닌 (Marvin ＆ Hellinga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4955-4960, 2001; Looger et al., Nature 423:185-190, 2003; Dwyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11255-11260, 2003). 따라서, 비유사 리간드에 결합하는 바이오센서는 신규한 리간드-결합 포켓을 생성하기 위해 두개의 bPBP 도메인 사이의 경계면에 있는 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 제조될 수 있으며; 이러한 바이오센서에 의한 결합한 리간드는 야생형 bPBP에 결합하지 않을 것이다.

bPBP에 있는 다른 돌연변이는 바이오센서의 기능에 다음과 같은 영향을 주기 위해 제조될 수 있다: 예를 들어 돌연변이는 결합 친화도 또는 특이성을 증가 또는 감소시킬 수 있으며; 신호 전달을 상승 또는 감소시키고; 다른 탄수화물, 지방 또는 단백질 도메인을 이용해 융합시킴으로써 신규한 기능을 추가시키고; 열안정성 또는 열불안정성을 향상시키고; 촉매 활성을 도입하며; 조작 시간을 짧게하거나 길게하며; 조작하기 위한 조건을 넓게 또는 좁게하고; 또는 이들의 조합. 바람직한 것은 리포터 그룹이 결합하지 않는 bPBP의 위치에서 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것이다 (예, 플루오로포어로의 티올 결합을 통해 콘쥬게이트된 시스테인이 아닌 최소 하나의 미스센스 돌연변이).

바람직한 구현예에서, 본 발명은 시약을 사용하지 않는 형광 바이오센서의 제작 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 리간드-유도된 경첩-굽힘 모션과 함께 국소적인 형태학적 변화를 경험하는 bPBP 상의 위치를 확인하는 단계를 포함한다. 시스테인 잔기는 하나 이상의 이러한 위치 및 이에 결합한 플루오로포어에 도입될 수 있으며, 따라서 플루오로포어의 형광 강도는 리간드 결합하는 동안에 변화한다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 bPBPs는 선별되거나 디자인될 수 있다. bPBP 슈퍼패밀리는 계산적 방법 또는 다른 수단이나 검출되어야 하는 리간드 상에 기초된 상기 모두 중의 어느 하나에 의해 리간드-결합 특이성을 재디자인하는데 매우 적합하다 (참조, 예, 표 1에 참조된 분석물들). 하나 이상의 리포터 (예, 플루오로포어 또는 레독스 보조인자)의 부착을 위해 적절한 bPBP상의 위치는 알로스테릭 위치, 페리스테릭 위치 및 엔도스테릭 위치를 포함한다 (리포터는 예를 들어 참조로서 사용하기 위해 비-신호 위치에 존재할 수 있다). 알로스테릭 위치의 경우에 있어서, 리포터 (예, 플루오로포어)는 리간드-결합 위치로부터 떨어진 하나 이상의 위치에 위치할 수 있으며 (예, 리간드-결합 포켓으로부터 먼) 리간드 결합하는 동안에 국소적인 형태학적 변화를 경험한다. 페리스테릭 위치의 경우에 있어서, 리포터 (예, 플루오로포어)는 결합 위치의 "테두리 (rim)" 상에 위치할 수 있으나 리간드와 직접적으로 결합하지는 않는다. 엔도스테릭 위치의 경우, 리포터 (예, 플루오로포어)는 결합 위치에 존재할 수 있기 때문에 리간드와 직접적으로 결합한다. 후자의 두가지 예는 리간드-결합 포켓에 근접하여 결합함을 보여준다.

알로스테릭, 페리스테릭 및 엔도스테릭 위치는 하기 실시예에 자세히 기술된 바와 같이 최소한 두가지 다른 방법으로 디자인될 수 있다. 일반적으로 개방 및 폐쇄된 상태 (알로스테릭 디자인에 대해) 또는 폐쇄된 상태 (페리스테릭 및 엔도스테릭 디자인에 대해) 단독의 구조에 사용될 수 있는 구조-기초의 디자인 접근이 실시되었다. 바람직하게는, 서열-기초의 접근은 3차원 구조가 밝혀지지 않은 단백질에 있는 시스테인 돌연변이의 위치를 예측하기 위해 동형 관계가 연구되는데 이용될 수 있으며, 알려진 구조의 단백질에서 동정된 이러한 돌연변이가 제공된다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에서 사용하기에 적합한 리포터는 플루오로포어 및 레독스 보조인자를 포함하며, 반드에 이에 한정되는 것은 아니다. 플루오로포어의 경우, 선택은 최소한 각각의 단백질 내부의 위치의 특성에 의존한다. 비록, 한개의 플루오로포어가 다른것 보다 특정의 위치에서 기능을 보다 잘 할 수 있다 하더라도, 당업자라면 특정 용도를 위한 바람직한 플루오로포어를 손쉽게 선택할 수 있다 (참고예, 미합중국 특허 제6,277,627호). 하기 실시예에서는 하기의 8개의 다른 플루오로포어가 형광 센서를 디자인하는데 사용되었다:

아라비노스 아라비노스 결합 단백질 (ABP)

디펩타이드 디펩타이드 결합 단백질 (DPP)

글루타메이트 및 아스파테이트 Glu/Asp 결합 단백질 (EBP)

글루타민 글루타민 결합 단백질 (QBP)

Fe(III) 철 결합 단백질 (FeBP)

히스티딘 히스티딘 결합 단백질 (HBP)

말토오즈 말토오즈 결합 단백질 (MBP)

글루코스 글루코스 결합 단백질 (GBP)

포스페이트 포스페이트 결합 단백질 (PhBP)

설페이트 설페이트 결합 단백질 (SBP).

그러나, 본 발명은 이러한 특정 구현예에 반드시 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하기 위한 레독스 리포터는 레독스-활성의 금속 센터 또는 레독스-활성의 유기 분자가 될 수 있다. 상기 레독스 리포터는 NAD, NADP, FAD와 같은 천연 유기 보조인자, 청동, 철-황 클러스터 또는 헴과 같은 천연 금속 센터 또는 류테늄 복합체와 같은 유기금속 컴파운드, 퀴논과 같은 유기 리간드와 같은 합성 센터 또는 단백질 또는 조작된 유기 보조인자 결합 위치에 도입된 조작된 금속 센터가 될 수 있다. 보조인자-결합 위치는 합리적 디자인 또는 직접적인 진화 기술을 이용하여 조작될 수 있다. 레독스 리포터는 위치-특이적 또는 보조인자와 단백질 간의 우연적 작용에 의해 단백질에 공유결합 또는 비-공유결합될 수 있다. 이는 금속 센터 (천연 또는 조작된) 또는 천연 유기 보조인자 (NAD, NADP, FAD) 또는 유기금속 보조인자 (헴)와 같은 단백질에 대해 내부발생적이 되거나 외부발생적 (공유적으로 콘쥬게이트되거나, 합성 유기금속 클러스터와 같은)이 될 수 있다. 예를 들어, 레독스 리포터는 단백질의 표면상에 있는 아미노산 잔기 위치에 결합 (예, 공유결합으로)할 수 있다.

레독스 리포터는 하나 이상의 전자를 가역적으로 또는 반-가역적으로 전달할 수 있는 금속-포함 그룹 (예, 전이 금속-포함 그룹)이 될 수 있다. 수개의 가능한 전이 금속-포함 리포터 그룹이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 리포터 그룹은 분자 산소에 의해 간섭되기 위해 주입되는 것 이하의 잠재적 윈도우에 있는 레독스 퍼텐셜 (potential)을 가지며, 단백질에 공유결합하기에 적합한 작용기 (예, 단백질에 있는 유일한 시스테인 잔기에 커플링하기 위한 말레이미드 또는 이오도아세트아미드와 같은 티올-반응성 작용기)를 가진다. 리포터 그룹의 금속은 환원 또는 산화된 상태에서 치환적으로 비활성이어야 한다 (즉, 바람직하게는 외인성 그룹은 리포터 그룹과 우연적인 결합을 형성하지 않는다). 리포터 그룹은 리간드 결합에 반응하여 전류변화 또는 전위차 변화를 경험할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리포터 그룹은 수용성이며, 단백질에 대해 위치-특이적 커플링을 할 수 있고 (즉, 단백질에 있는 유일한 시스테인과 반응하는 리포터 그룹 상의 티올-반응성 작용기를 통해), 리간드 결합하는 동안 전위차 반응을 경험한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 전이 금속은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 구리 (Cu), 코발트 (Co), 팔라듐 (Pd), 철 (Fe), 루테늄 (Ru), 로듐 (Rh), 오스뮴 (Os), 레늄 (Re), 백금 (Pt), 스칸디윰 (Sc), 티나늄 (Ti), 바나디윰 (V), 크로뮴 (Cr), 망간 (Mn), 니켈 (Ni), 몰리브데늄 (Mo), 테크네티윰 (Tc), 텅스텐 (W) 및 이리듐 (Ir)을 포함한다. 즉, Fe, Re, W, Mo 및 Tc와 함께 전이 금속의 제1열, 백금 금속 (Ru, Rh, Pd, Os, Ir 및 Pt)이 바람직하다. 특히 바람직한 것은 산화 상태에서 변화하는 동안 조정 위치의 수를 변화시키지 않는 금속이며, 루테늄, 오스뮴, 철, 백금 및 팔라듐과 함께 루테늄을 포함하는 것이 가장 바람직하다.

리포터 그룹은 단백질과 함께 공유결합 콘쥬게이트로서 바이오센서 내에 존재할 수 있거나 또는 단백질 복합체의 일부분을 형성하는 금속 센터가 될 수 있다 (예를 들어, 철-황 클러스터, 헴, 청동과 같으며 이의 전기화학적 특성이 이의 국소적 환경에 대해 민감한 레독스 센터). 또한, 리포터 그룹은 단백질과 금속 결합 도메인 사이의 융합으로서 존재할 수 있다 (예를 들어, 사이토크롬과 같은 작은 레독스-활성 단백질). 바람직하게는, 리포터 그룹은 단백질 상의 시스테인 (티올)에 결합한 말레이미드 작용기를 통해 단백질에 공유결합한다. 어떠한 경우에 있어서도, 리포터 그룹은 단백질에 결합하며, 따라서 단백질과 전극 사이에 위치한다.

본 발명의 조작된 단백질은 전체 합성, 반-합성 또는 유전자 융합에 의해 리포터 그룹(들)을 위치-특이적으로 도입시킴으로써 제조될 수 있다 (참고예로 Adams et al., Nature 39:694-697, 1991; Brune et al., Biochemistry 33:8262-8271, 1994; Gilardi et al., Anal. Chem. 66:3840-3847, 1994; Godwin et al., J. Am. Chem. Soc. 118:6514-6515, 1996; Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4366-4371, 1997; Post et al., J. Biol. Chem. 269:12880-12887, 1994; Romoser, J. Biol. Chem. 272:13270-13274, 1997; Thompson et al., J. Biomed. Op. 1:131-137, 1996; Walkup et al., J. Am. Chem. Soc. 119:5445-5450, 1997).

리간드의 분석은 바이오센서를 이용하여 수행할 수 있다. 샘플은 적절한 분석 조건하에서 바이오센서와 접촉한다. 샘플에 존재하는 리간드는, 어느 것이든지, 바이오센서에 결합시키고 분석에 있는 리간드-결합한 바이오센서에 의한 신호 전달을 측정함으로써 검출할 수 있다. 검출의 목적에서, 결합은 정량화될 필요가 없는데, 왜냐하면 리간드가 존재하거나 존재하지 않는지 간단하게 측정하는 것이 (검출 제한 내에서 )간단한 측정이 수행될 필요가 없기 때문이다. 다르게 말하면, 대조군 샘플류 (예, 공지된 양의 리간드)에 대한 비교는 샘플에 있는 리간드의 양이나 농도의 정량을 필요로하기 때문이다. 정해진 샘플 부피에서, 리간드의 양 (즉, 질량) 및 리간드의 농도는 비가역적이다. 리간드를 포함하지 않는 블랭크 (blank) 샘플은 배경 신호를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 표준은 알려진 샘플을 정량화하는데 사용된 표준 커브 (즉, 쌍곡선)를 작성하는데 사용될 수 있다. 비록 동형의 분석 포맷 (즉, 이들은 결합 및 비결합 리간드의 분리를 필요로하지 않는다)이 바람직하지만, 신호 전달 및/또는 측정과 상당하게 관련이 있는 기질이 샘플에 존재한다면 이형의 분석 포맷에서의 분리가 요구될 것이다. 신호 전달은 외부적 (exotic) 시약의 첨가를 필요로 하지 않는 것이 바람직한데, 이는 체액의 분석이 최소한의 샘플 재료와 함께 생리학적 조건하에서 수행되기 때문이다. 만약 바이오센서가 이식형 의학 장비에 적용된다면 분석은 인 비보에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 피부와 접촉하는 바이오센서는 간질액 또는 땀 (perspiration)을 분석한다. 세척물 (lavage)이 점막 조직 샘플로 사용될 수 있다.

샘플은 실험실 세팅에서 (예, 임상 또는 연구 기관); 환경적 원천으로부터 (예, 공기, 물의 아쿠아퍼 (aquafers) 및 다른 부분, 육지에서 자라는 동물 또는 식물의 생산물, 토양); 산업적 원천으로부터 (예, 식품, 생물약학적, 화학적 또는 다른 제조적 산업) 수득될 수 있다. 분석되어야 하는 분석물은 리간드와 유사하고, 리간드의 복합적 카피 (copies)를 포함하며, 신호 전달에서의 변화에 의해 확인되는 리간드와 화학적으로 연관되거나 (예, 연관된 화학적 구조는 그의 "정확한" 리간드에 비교했을때 바이오센서에 의해 훨씬 강하게 또는 훨씬 약하게 결합한다), 또는 이들의 조합과 연관된다. 신호 전달에서의 변화는 화학적 구조에서의 변화와 관련이 있을 것이며, 따라서 비-동일의 분석물이 확인된다 (하기의 통합분석에 대한 기재를 참고). 검출되거나 정량화되는 리간드의 예는 하기를 포함한다: 아미노산; 탄수화물; 액상 샘플에서 수용성인 생리활성의 고체 및 기체 컴파운드; 밀수품 (contraband) 또는 통제된 (controlled) 기질 (즉, 사용하거나 또는 소유하는데 있어서 불법이거나 강력하게 단속된 기질); 환경 오염물질 (예, 포스페이트, 설페이트); 폭발물 (예, TNT); 식품 첨가제 및 부산물 (예, 발암물질, 식물 독성, 기형발생물질); 지질; 금속 이온 (예, 2가성 양이온, 제2철 이온); 생물학적 독성물질 (예, 바이러스, 박테리아 또는 프로토조아의 독성 생산물); 신경전달물질 (예, 세로토닌); 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 (예, NAD, NADP, FAD); 펩타이드 또는 스테로이드 (예, 성장인자, 호르몬, 형태학적 또는 발생학적 신호); 및 치료학적 약물. 목적물 (예, 수화물, 메일, 다른 수송물); 체크포인트를 통과하는 사람 또는 수송수단; 및 국경 또는 안전 지대는 안전 또는 군사적 적용에 있는 생물학적 시약, 밀수품, 폭발물, 독 및 독성물질로 조사될 수 있다.

하나 이상의 바이오센서는 고체 또는 다공성 기질에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 상기 기질은 하기와 같은 형태가 될 수 있다: 평평하고 평면 (예, 필터 멤브레인, 글래스 슬라이드, 세미컨덕터 칩); 원통형 (예, 광학 섬유, 플라스틱 막대); 구형 (예, 크로스링크된 폴리머 또는 유리 구슬); 또는 컨테이터로 형성된 형태 (예, 셀 또는 큐벳, 멀티웰 플레이트). 상기 기질은 리포터 그룹에 의해 신호 전달을 측정하는 기기 (예, 현미경, 측광기, 분광기)를 이용하여 분석하는데 사용될 수 있다. 각각의 바이오센서들은 판독기 (예, 명암 패턴의 스캐너, 라디오 리시버, 특정 결합 프로브 또는 자동화된 시퀀서)에 의해 해독될 수 있거나 그의 마커에 따라 추출기 (sorter)에 의해 분리될 수 있는 부착된 마커 (예, 바코드, 라디오 주파수 또는 RFID, 또는 바이오폴리머)에 의해 코드될 수 있다. 각각의 바이오센서를 확인하는 코드는 과반수의 리간드에 대해 샘플을 신속하게 분석함으로써 평행하게 분석하는데 사용될 수 있다. 다른 리간드-결합 특이성을 갖는 복합 바이오센서는 동시에 복합 리간드를 검출하고/또는 정량하는 유사한 분석에 사용된다. 바람직하게는, 기질상의 개별적인 스팟에 부착하는 다른 바이오센서들은 신호가 생산되는 부위에 의해 그의 리간드-결합 특이성을 확인하는데 사용될 수 있다. 신호는 과량의 분석에 대해 유사한 특이성을 가진 복합 바이오센서를 이용하여 분석을 반복하거나 통합적 분석에 대해 오버래핑되는 특이성을 가진 복합 바이오센서로부터의 결과를 상호연관시킴으로써 증명될 수 있다. 후자에서, 바이오센서의 개별적인 반응성 패턴은 이들에 의해 결합된 분석물의 동일성과 관련이 있다. 리간드에 대한 화학적 구조에 훨씬 더 밀접하게 연관된 분석물은 유사한 바이오센서에 훨씬 더 강하게 결합할 것이다. 오버랩되고, 공지된 리간드-결합 특이성을 가진 과량의 바이오센서로부터의 신호는 분석물의 동일성을 감소시키기 위해 통합된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 상기-기재된 방법을 사용하여 제조된 바이오센서 및 분석물 검출에서, 예를 들어 임상적, 산업적 및 환경적 세팅에서 분석물을 검출하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 각각의 용도는 예로서 하기 특정 실시예에 개시되어 있다. GBP 상에 기초한 광학 글루코스 센서에 대해 사용될 수 있는 위치의 갯수의 기재가 제공된다 (아크릴로단에 콘쥬게이트된 W183C는 글루코스 센서의 섬유-광학 프로토타입 (prototype)에 성공적으로 사용되었다).

본 발명의 시도에 따라 제조된 범위가 한정된 특정 바이오센서는 공통의 도메인 (예, Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997 또는 미합중국 특허 제6,277,627호에 개시될 수 있다)에 존재할 것이며, 본 발명의 범위가 이러한 바이오센서에만 제한되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 예는 하기의 제한되지 않는 실시예에 더욱 자세하게 개시된다.

도 1은 본 발명에서 사용한 알로스테릭, 엔도스테릭 및 페리스테릭 위치를 표시한 11개의 bPBPs의 3-D 구조를 나타낸다. 각각의 단백질은 볼-스틱의 구조로 표시되는 결합한 리간드와 함께 폐쇄된 형태에 표시된다. bPBP 각각의 두개의 도메인은 두번째 도메인 (C-말단을 포함) 위에 첫번째 도메인(N-말단을 포함)이 직각 방향으로 위치한다. 경첩 조각은 도메인을 연결한다. 히스티딘 BP의 구조는 아직까지 밝혀지지 않은 글루타메이트/아스파테이트 BP의 구조로서 나타내기 위해 사용되었다. 시스테인에 대해 돌연변이된 잔기는 차등적으로 음영이 된 구 (sphere)로서 표시되며, 알로스테릭 (진한 음영), 엔도스테릭 (중간 음영, GBP 단독에서) 또는 페리스테릭 (밝은 음영)으로서 차등화된다. 구조는 서열-기초의 관련성에 따라 Tam ＆ Saier (Microbiol, Rev. 57:320-346, 1993)에 의해 정의된 클러스터에 의해 그룹지어진다. 클러스터 2: 아라비노스 BP (ABP), 글루코스 BP (GBP) 및 리보오스 BP (RBP). 클러스터 5: 디펩타이드 BP (DPP). 클러스터 3: 글루타민 BP (QBP), 히스티딘 BP (HBP) 및 글루타메이트/아스파테이트 BP (EBP). 클러스터 6: 포스페이트 BP (PBP) 및 설페이트 BP (SBP). 클러스터 1: 말토오스 BP (MBP) 및 Fe(III)BP (FeBP). 분자 그래픽은 Molscript를 이용하여 수행하였다 (Kraulis, J. Appl. Crystallogr. 24:946-950, 1991).

도 2는 clustalW (Thompson et al., Nucl. Acids Res. 22:4673-4680, 1994)를 이용하여 E.coli YBEJ (추정의 글루타메이트/아스파테이트 BP), 글루타민 BP 및 히스티딘 BP의 서열을 얼라인 한 결과를 나타낸다. YBEJ에 대한 개방 판독 프레임의 추정의 개시 코돈으로부터 시작하는 번호는 그의 리더 서열을 포함한다. 밑줄 표시된 메티오닌은 본 발명에서 사용된 YBEJ의 발현을 위한 개시 코돈이다. 플루오로포어 콘쥬게이션을 위해 시스테인에 대하여 돌연변이된 각각의 단백질에 있는 잔기는 굵은 글씨체로 표시하였다. 이러한 잔기의 아래쪽에 있는 문자 "a" 및 "p"는 각각 알로스테릭 또는 페리스테릭으로서 이들의 분류를 나타낸다.

도 3은 티올-반응성의 플루오로포어의 구조식을 나타낸다. 단백질-결합한 플루오로포어의 최대 형광 여기 및 방출 각각의 대략적 파장은 다음과 같다 (nm로 표시됨): 피렌 (340, 390); 아크릴로단 (390, 500); 플루오레신 (485, 520); NBD (490, 540); NBDE (490, 530); JPW4039 (485, 590); JPW4042 (470, 640); 및 JPW4045 (470, 640).

도 4A 및 4B는 형광측정법 (fluorimetric) 파라미터의 정의를 나타낸다. 도 4A는 표준 강도 변화 ΔI_std를 평가하는데 사용되는 파라미터 λ_std, I₁ 및 I₂를 나타낸다. 도 4B는 ΔR을 평가하는데 사용된 파라미터 A₁, A₂, ⁰A 및 ^∞A를 나타낸다. 구역 ^∞A 각각은 각각의 구역 ⁰A를 포함한다.

도 5A 및 5B는 글루코스 BP 및 글루타메이트/아스파테이트 BP 콘쥬게이트의 형광측정 적정을 나타낸다. 도 5A는 글루코스를 이용한 글루코스 BP W183C-아크릴로단의 적정을 나타낸다. 도 5B는 아미노산을 이용한 글루타메이트/아스파테이트 BP T129C-NBD의 적정을 나타낸다. 데이터 포인트: ● 글루탐산; ＋ 아스파트산; ◆ 아스파라긴; ×글루타민. 도 5A 및 5B에 있는 표시된 선은 최상으로 맞추어진 결합 등온선이다.

도 6A-6C는 320개의 형광 콘쥬게이트 세트에 있는 형광측정 파라미터의 발생을 나타낸다. 도 6A는 최대 형광 강도 파장에서의 변화 (^maxλ_saturated - ^maxλ_apo) 분포를 나타낸다. 도 6B는 강도 변화 파라미터 ΔI_std의 분포를 나타낸다. 도 6C는 비율측정 (ratiometric) 변화 파라미터 ΔR_max의 분포를 나타낸다. 각각의 파라미터에 대해, 각 간격의 상부 경계 (upper bound)가 표시되어 있다.

도 7은 3 군의 플루오로포어 결합 위치 중에서 리간드 친화도에서의 변화 발생을 나타낸다. 설명: 엔도스테릭 위치, 채워진 막대; 페리스테릭 위치, 빗금친 막대; 알로스테릭 위치, 열린 막대. 아라비노스 BP의 경우, ^wtK_d 값은 C64A 돌연변 이의 값이며, 여기서 모든 콘쥬게이트가 제조되었다. 디펩타이드 BP 및 Fe(III)BP에 대한 결과는 포함되지 않았다. 전자에 대해, 야생형에 있는 Gly-Leu 디펩타이드에 대한 K_d 값은 보고되지 않았다. Fe(III)BP의 경우, 콘쥬게이트되지 않은 돌연변이 E57D의 K_d 값은 측정되지 않았다. x-축 상에서의 각 간격에 대해, 상부 경계가 표시되어 있다. 예를 들어, 표시된 간격 "0"은 log(^mutK_d/^wtK_d)>-1 및 ≤0의 값을 포함한다.

도 8A 및 8B는 방출 파장 밴드의 다른 쌍을 이용한 bPBP 플루오로포어 콘쥬게이트의 비율측정 적정을 나타낸다. 도 8A는 하기의 형광 방출비 (nm의 파장)에서 글루코스로 적정된, 아크릴로단에 콘쥬게이트된 글루코스 BP-W183C를 나타낸다: ◇, F_450-459/F_550-559 (^appK_d ~ 5.0 mM); □,F_450-459/F_486-495 (^appK_d ~ 10.4 mM); ○, F_472-481/F_450-459 (^appK_d ~ 17.4 mM). 선들은 수학식 4에 대입한 것을 나타낸다. 정상적인 혈청 글루코스 범위 (유글리세미아) 4 내지 6 mM은 수직의 선에 의해 경계된다. 도 8B는 하기의 형광 방출비 (nm의 파장)에서 리보오스로 적정된, 아크릴로단에 콘쥬게이트된 리보오스 BP-T135C를 나타낸다: □, F_501-510/F_450-459 (^appK_d ~ 41 μM); ○, F_450-459/F_501-510 (^appK_d ~ 254 μM); ◇, F_450-459/F_547-556 (^appK_d ~ 461 μM).

상세한 실험 방법

분자 클로닝. PCR을 이용하여 다음 세포주의 게놈 DNA로부터 bPBP 야생형 유전자를 증폭하였다: E.coli 세포주 CSH100 (아라비노스, 디펩타이드, 히스티딘, 리보오스, 설페이트 및 글루타메이트/아스파테이트 BP); 세포주 W1485 (글루코스 및 글루타민 BP) 및 세포주 RU1012 (포스페이트 BP) 또는 H.influenzae 세포주 Rd (Fe(III)BP). 증폭된 산물을 하기의 단백질 발현 벡터 중 하나에 클로닝하였다: pAED4 (Doering, "Functional and structural studies of a small f-actin binding domain" in Ph.D. thesis, Massachusetts Institute of Technology, 1992); pKK223-3 (Brosius ＆ Holy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6929-6933, 1984); 또는 pET 벡터 (Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990) (Novagen). 오직 원형질막 형태를 프로세싱하고, 신호 서열을 결실시키는 클로닝을 수행하기 위해 N-말단 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였다. 서열 Gly-Ser-Gly-(His)_n 또는 Gly-Ser-(His)_n, 상기 n=5, 6 또는 10인 서열을 덧붙이기 위해 C-말단 프라이머를 디자인하였다. 두개의 일련의 중지 코돈 (TAATGA)은 마지막 His 코돈의 뒤에 따른다. 플라스미드 pMAL-c2X (New England BioLabs)로부터 말토오즈 BP 돌연변이를 제조하고 발현시켰다. E.coli 세포주 XL1-BLUE (Stratagene) 및 DH5α (Hanahan, J. Mol. Biol. 166:557-580, 1983)는 플라스미드를 컨스트럭트하는데 사용하였다. 단일 아미노산 치환은 오버랩 PCR 돌연변이유발에 의해 형성되었다 (Ho et al., Gene 77:51-59, 1989). 모든 클론 및 돌연변이는 뉴클레오티드 시퀀싱을 통해 확인하였다. 아라비노스 BP의 경우에 있어서, 야생형 서열에 있는 단일의 시스테인은 알라닌에 의해 치환됨으로서 티올에 대한 리포터 그룹 콘쥬게이션의 가능성을 제거하였다 (Miller et al., J. Biol. Chem. 254:7521-7528, 1979). 또한, Fe(III)B)의 서열은 Glu57을 Asp으로 치환하여 돌연변이유도시켰으며, 이에 의해 Fe(III)시트레이트를 이용해 통상적으로 측정한 농도 범위에서 K_d를 상승시켰다.

단백질 발현. 플라스미드들을 E.coli 세포주 BL21-DE3에 형질전환시켜, 영양 배지에서 37℃로 밤새 배양한 뒤, 새로운 배지로 100배 희석한 뒤 37℃ 또는 25℃에서 추가적으로 배양하였다. 600 nm에서의 배양액의 광 밀도가 0.4에 도달할때 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드를 1 mM 첨가함으로써 발현을 유도하였다. 2-4시간 후, 세포를 원심분리로 수득한 뒤, 20 mM 3-모르폴리노프로판설폰산 (MOPS), 100 mM NaCl, pH 6.9에 재현탁하여 냉동보관하거나 단백질 분리를 위해 곧바로 용해시켰다.

단백질 분리. 세포를 소니케이션하거나 프렌치 프레셔 셀 (French pressure cell)로 통과시킴으로써 용해시켰다. Polymin P를 0.33% (w/v)로 첨가함으로써 용해물을 처리하였고, 15분 동안 얼음에 냉각시켰으며, 원심분리하여 세포 부스러기를 펠렛화하였다. 20 mM MOPS, 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 7.5로 평형화시 킨 킬레이팅 세파로즈^TM 패스트 플로우 (Amersham Pharmacia Biotech)의 Ni(II)-충전된 컬럼에 상등액을 로딩하였다. 상기 컬럼을 로딩 버퍼로 세척한 뒤, 60 mM 이미다졸을 포함하는 동일한 버퍼로 세척하고, 100 mM 이미다졸을 포함하는 동일한 버퍼로 세척하였다. 마지막으로, 400 mM 이미다졸을 포함하는 로딩 버퍼로 단백질을 용출해낸 뒤, 프랙션에 수집하여 젤 전기영동을 이용하여 순도를 측정하였다. 모든 제조물은 본원의 기준에서 최소 95% 순도를 나타내었다. 단백질-포함 프렉션을 버퍼 (20 mM MOPS, 100 mM NaCl, pH 6.9 또는 20 mM HaH₂PO₄, 100 mM NaCl, pH 6.9)에 대하여 고갈적으로 투석하거나 겔 여과에 의해 탈염시킴으로서 결합한 리간드를 제거하였다.

시스테인-치환된 bPBP에 대한 플루오로포어 콘쥬게이션. 몰큘라 프로브사 (Eugene, Oregon)로부터 구입한 티올-반응성 플루오로포어는 5-이오도아세트아미도플루오레신 (플루오레신); N-(1-피렌)이오도아세트아미드 (피렌); N,N'-디메틸-N-(이오도아세틸)-N'-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)에틸렌디아마이드 (NBD); N-((2-(이오도아세톡실)에틸)-N-메틸)아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸 (NBDE); 및 6-아크릴오일-2-디메틸아미노나프탈렌 (아크릴로단)이다. 스티릴 및 나프틸 염료 JPW4039, JPW4042 및 JPW4045 (도 3)는 코네티코트 대학에서 합성하였다. 모든 플루오로포어 컨쥬게이션 단계는 특히 실온에서 수행하였다. 100 μM 농도의 단백질에 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀 HCl을 5배 몰비 이상으로 첨가하 여 분자간 디설파이드 결합을 감소시켰다. 티올-반응성 플루오로포어 (아세토니트릴 또는 디메틸 설폭사이드에 20 내지 25 mM로 포함된)를 조금식 일정량으로 단백질의 5배 몰비 이상으로 첨가하였다. 콘쥬게이션은 4시간 동안 실온에서 또는 4℃에서 밤새도록 어두운 곳에서 수행하였다. 반응하지 않은 플루오로포어로부터의 단백질의 분리는 고갈적 투석 또는 크기-분리 (size-exclusion) 크로마토그래피를 이용해 수행하였다. 엘만 시약 (Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 74:443-450, 1985)을 이용하여 반응하지 않은 티올을 측정하거나 분리된 콘쥬게이트의 흡광 스펙트럼으로부터 단백질에 대한 플루오로포어의 비율을 계산함으로써 리포터 그룹의 부착 효율을 평가하였다.

설페이트 및 포스페이트의 고갈. 설페이트 BP 및 포스페이트 BP 용액 및 이들의 버퍼를 처리하여 오염된 설페이트 및 포스페이트 각각의 농도를 감소시켰다. 설페이트 BP 버퍼 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0)를 Dowex 1X2-100 강 염기성 음이온-교환 레진의 클로라이드형으로 통과시켰다. 설페이트 BP 용액을 처리된 버퍼에 대해 투석 처리하였다; 개별의 투석 튜브에 걸려있는 Dowex 레진도 포함시켰다. 포스페이트 BP 용액 및 버퍼 (20 mM MOPS, 100 mM NaCl, pH 6.9)에 7-메틸구아노신을 1 mM이 될때까지 첨가하고 개별의 투석 튜브에 분배되어 있는 박테리아 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (1 unit ㎖^-1)(Sigma-Aldrich)를 이용해 투석함으로써 (Brune et al., Biochem. 33:8262-8271, 1994) 포스페이트를 고갈시켰다.

형광측정법 (Fluorimetry). 모든 측정은 SLM 아민코-보우만 (Aminco-Bowman) 시리즈 2 형광측정기를 이용하고 25℃에서 샘플 교반함으로써 수행하였다. 형광 방출 스펙럼은 4 및 8 nm에서 각각 여기 (excitation) 및 방출 슬릿 (slit)을 가진다. 포토멀티플라이어 (photomultiplier) 튜브 포텐셜은 400 내지 800 볼트로 유지하였다. 단백질 농도는 50-1000 nM이었다. 플루오로포어-특이적 여기는 대략적으로 하기의 파장이다: 트립토판, 290 nm; 아크릴로단, 390 nm; 플루오레신, 485 nm; 피렌 340 nm; NBD 및 NBDE, 490 nm; JPW4039, 485 nm; JPW4042, 470 nm; JPW4045, 470 nm.

리간드 결합 친화도를 측정하기 위해, 3 ㎖의 bPBP에 리간드를 50-1000 nM 농도로 계단식으로 (serially) 첨가한 뒤, 방출 세기를 기록하였다. 단백질의 희석 및 버퍼로부터의 배경 신호에 대해 수정을 하였다. 결합 커브는 적절한 수학식 3 또는 4를 이용하여 결합 등온 (isotherm)에 맞추었다.

Fe(III)BP는 Fe(III)에 대해 10^-21 M의 분해 상수를 갖고 있으며 (Adhikari et al., J. Biol. Chem. 270:25142-25149, 1995), 나노몰의 단백질 농도에서는 친화도의 정확한 형광-기초 측정을 방해한다. 이에, 본 발명자들은 경쟁 분석에서 리간드로서 Fe(III) 시트레이트 (logK ~10.25) (Martell and Smith, Critical Stability Constants, Plenum Press, New York, 1977)를 사용하였다.

결과

바이오센서 패밀리. 바이오센서 기능을 조작시키기 위해 광범위한 리간드-결합 특이성을 가진 열한개의 bPBPs 세트를 선별하였다 (표 2). 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 유래의 Fe(III)BP를 제외한 모두는 E.coli 유래이다. 단백질 각각의 리간드에 대한 결합 특이성과 친화성은 보고되었다 (표 2에 있는 참조문헌). 세개의 단백질은 모노사카라이드와 결합하고 (아라비노스, 글루코스 및 리보오스 BP), 하나는 글루코스의 디- 및 트리사카라이드와 결합하며 (말토오즈 BP), 세개는 아미노산과 결합 (글루타메이트/아스파테이트, 히스티딘 및 글루타민 BP), 하나는 디- 및 트리펩타이드와 결합 (디펩타이드 BP), 두개는 옥시아나이온과 결합 (포스페이트 및 설페이트 BP) 및 하나는 금속 이온과 결합한다 (Fe(III)BP). 이러한 bPBPs 대부분은 높은 친화도로 (마이크로몰라 또는 그 이상) 최대한 두개 또는 세개의 연관된 리간드와 결합한다. 예를 들어, 포스페이트 BP는 포스페이트 및 비산염 (arsenate)과 결합하지만 다른 옥시음이온과는 결합하지 않으며 (Luecke ＆ Quiocho, Nature 347:402-406, 1990), 반면 글루코스 BP는 글루코스 및 갈락토오스와 결합하지만 다른 모노사카라이드와는 결합하지 않는다 (Anraku, J. Biol. Chem. 243:3116-3122, 1968). 예외적으로 디펩타이드 BP는 다양한 디- 및 트리펩타이드와 결합한다 (Smith et al., Microbiology 145:2891-2901, 1999). 이러한 단백질 측정된 리간드 분해 상수는 0.1-1 μM의 범위이다. 예외적으로, Fe(III)BP의 경우, Fe(III) 킬레이트를 이용한 경쟁 분석에서 Fe(III)_(aq)에 대한 K_d는 10^-21 M로 추정되었다 (Adhikari et al., J. Biol. Chem. 270:25142-25149, 1995).

a:단백질 데이터 뱅크 (Berman et al., 2000)

열한개의 단백질 중에서 본 발명에서 선택된 9개 단백질의 결정 구조는 폐쇄되고, 리간드-결합 상태인 것으로 밝혀졌다 (표 2). 설페이트 BP의 경우, E.coli 단백질의 결정 구조는 보고되지 않았기 때문에, 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 설페이트 BP의 결정 구조는 E.coli 단백질을 모델링하는데 적용되었다. E.coli 및 살모넬라 타이피뮤리움의 설페이트 BP는 아미노산 서열에 있어서 95% 상동성을 나타내므로 이러한 두 종으로부터의 히스티딘 BP에 대한 아날로그에 있어서 높은 유사 구조를 나타낸다 (Oh et al., J. Biol. Chem. 269:4135-4143, 1994; Yao et al., Biochemistry 33:4769-4779, 1994). 열한개의 단백질 중에서 여섯개에 대한 구조가 오픈된 리간드되지 않은 상태로 분석되었다 (표 2).

형태학적 커플링의 구조-기초 설계. 복합체의 형성 및 연결된 형태학적 변화로 인해 플루오로포어의 국소적 환경이 변화한다면 리간드 결합과 공유결합한 형광 신호, 환경적으로 민감한 플루오로포어에서의 변화 사이의 커플링이 수립될 수 있다. 이러한 구조적 연결 관계를 수립하기 위해 두개의 매커니즘이 구별될 수 있다. 직접 연결은 결합한 리간드 및 콘쥬게이트된 플루오로포어 사이의 비-결합 접촉의 형성과 관계된다. 간접 연결은 부착된 플루오로포어와 매우 근접한 국소적 단백질 구조에서의 변화와 관계되며, bPBPs에서 관찰되는 경첩-굽힘 모션과 같은 리간드-유도된 형태학적 변화에 의존한다.

직접 연결 관계는 플루오로포어가 부착되는 ("엔도스테릭" 부착 위치) 시스테인과 리간드 접촉을 형성하는 것으로 알려진 잔기를 대체함으로써 손쉽게 디자인될 수 있다. 간접 연결 관계는 두가지 방법으로 수립될 수 있다. 가장 직접적인 방법은 리간드 복합체 구조의 시각적 검사에 의존하며, 결합 부위의 근처에 위치하지만 리간드와 직접적으로 연결되지 않아 형태학적 변화와 관련되는 경향이 있는 잔기를 확인하는 것에 의존한다. bPBPs의 경우, 이러한 잔기들은 리간드 결합 위치를 형성하는 도메인간 틈새의 경계선에 위치한다. 이러한 "페리스테릭" 위치의 환경은 폐쇄된 상태가 형성되는 동안 상당하게 변화한다. 이러한 위치의 예로는 리간드-결합 포켓에 근접한 위치가 있다. 두번째 접근은 리간드-결합 위치로부터 약간의 거리를 두고 위치한 (즉, 리간드-결합 포켓과 거리가 먼) 단백질 구조에 있는 위치를 확인하는 것이며, 리간드 결합과 함께 국소적인 형태학적 변화를 수행하는 것이다. 만약 오픈되고 폐쇄된 상태 모두의 구조가 알려져 있다면, 이러한 "알로스테릭" 위치는 형태학적 변화를 분석하는 계산적 방법을 이용하여 확인될 수 있다 (Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997). 또한, 한개의 알로스테릭 위치가 한개의 bPBP에서 확인되었으며, 오직 하나의 상태가 확인된 다른 bPBP에 있는 이러한 위치를 확인하기 위해 모델링 및 구조적 상동성 논의가 요구될 수 있다 (Marvin ＆ Hellinga, J. Am. Chem. Soc. 120:7-11, 1998). 표 3은 본 발명에서 사용된 리포터 각각에 있는 모든 세 클래스의 위치 디자인을 요약한다. 열한개의 bPBPs에 있는 이러한 위치는 도 1에 나타내었다.

형태학적 커플링의 서열-기초 디자인. 공지된 서열의 bPBPs의 수는 밝혀진 구조에 대한 수 또는 유전적 또는 생화학적 특성에 의해 확인된 기능에 대한 수를 훨씬 초과한다. 잠재적 바이오센서의 이러한 리저부아 (reservoir)를 개발하기 위해, bPBPs에 대한 코딩 서열이 확인되어야 하고 이들의 추정의 리간드-결합 특이성이 확립되어야 한다. 미생물의 게놈에 있는 bPBPs의 동정은 bPBP 패밀리의 각각의 클러스터에 대한 아미노산 서열 상동성의 조사에 의존한다 (Tam ＆ Saier, Microbiol. Rev. 57:320-346, 1993). 그리고 나서, 리간드-결합은 직접 실험에 의해 결정될 수 있거나, 공지된 기능의 bPBPs에 대한 구조적 관계에 의하거나 또는 공지된 기능의 다른 유전자에 대한 유전적 연관성을 확립함으로써 추측될 수 있다 (Pellegrini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4285-4288, 1999). 국소적인 형태학적 변화를 경험하며, 이에 대한 리포터 기능이 결합될 수 있는 동종 내의 연속적인 위치가 확인되어야 한다. 리포터 기능이 결합되는 위치의 선별은 공지된 구조의 bPBPs에 대한 상동성에 의존한다.

이러한 원칙을 설명하기 위해, 게놈 서열 데이타만으로부터 글루타메이트 바이오센서가 컨스트럭트되기 시작하였다. E.coli K12의 게놈은 글루타민 및 히스티딘 BPs와의 아미노산 서열 상동성 (26% 및 23% 서열 동일성; 41% 및 43% 서열 유사성, 각각) (Blattner et al., Science 277:1453-1474, 1997)에 기초한 추정의 bPBP로서 동정된 단백질을 인코딩하는 로커스 ybeJ를 포함한다. 아미노산 결합 단백질로서 YBEJ의 임무는 E.coli에 있는 공지된 구조로 확인된 모든 bPBP 아미노산 결합 단백질에 있는 리간드의 α-아미노 및 α-카르복실레이트 그룹에 결합하여 연관되는 것으로 밝혀진 보존된 잔기의 존재에 의해 강화되었다 (표 4). 추가로 흥미로운 것은 결합한 아미노산의 사이드 체인과 직접적으로 작용하는 다른 아미노산-결합 단백질의 위치에 위치한 YBEJ에 아르기닌 잔기가 존재한다는 사실이며, 이는 아미노산과 결합한 YBEJ가 음전하된 사이드 체인을 함유하는 아미노산과 결합한다는 사실을 제시한다. 결국, ybeJ는 글루타메이트/아스파테이트 전달 시스템과 관계되는 것으로 가정된 3개의 일련의 유전자 (gltJ, gltK, gltL)에 인접하여 위치하며 (Lum ＆ Wallace, GenBank Accession Number U10981, 1995), 이러한 사실은 ybeJ가 글루타메이트/아스파테이트 BP를 인코딩한다는 사실을 제시해준다. 추정의 알로스테릭, 엔도스테릭 및 페리스테릭 위치는 글루타민 BP 및 히스티딘 BP를 가진 YBEJ의 구조-기초의 서열 얼라인먼트를 통해 확인되었다 (도 2).

＊sc:사이드 체인, αN:α-아미노, αC:α-카르복시

돌연변이유도 및 단백질 생산. 본 발명에서 사용된 모든 bPBPs 유전자는 PCR을 이용하여 E.coli 또는 H.인플루엔자 게놈 DNA로부터 클로닝하였다. 원형질막으로 직접 발현되는 리더 펩타이드 서열은 단백질의 공지된 N-말단과 비교하여 동정하거나, YBEJ의 경우는 공지된 리더 서열과의 상동성으로 동정하였다 (von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690, 1986). 플라스미드 pAED4 (Doering, "Functional and structural studies of a small f-actin binding domain" in Ph.D. thesis, Massachusetts Institute of Technology, 1992); pET-21a (Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990)(Novagen); 또는 pKK223-3 (Blattner et al., Science 277:1453-1474, 1997)에 있는 강한 유도성 프로모터의 조절하에서, 프로세싱된 단백질의 N-말단 바로 앞에 위치한 개시 메티오닌을 가지고 세포질에서 프로세싱된 형태로 과발현시킴으로써 단백질을 생산하였다. 올리고히스티딘 태그 (tag)는 손쉽게 정제하게 하기 위해 고정된 금속 친화 크로마토그래피를 이용하여 (Hochuli et al., J. Chromatogr. A 411:177-184, 1987) 클로닝된 수용체의 카르복시 말단에 연결시켰다. 모든 경우에서, 수용체들은 발현이 잘 되었다 (발효 리터당 순수한 단백질이 최소한 50 mg). 겔 전기영동에 의해 확인된 분자량은 발현된 리딩 프레임의 예측된 질량과 상응하였다.

시스테인 점돌연변이는 PCR 오버랩 방법에 의해 도입되었다 (Ho et al., Gene 77:51-59, 1989). 특히 돌연변이 단백질 뿐만 아니라 야생형 단백질도 발현시켰다. 아라비노스 BP에 있는 모든 시스테인 치환은 C64A를 배경으로 컨스트럭트함으로써 이러한 내성 시스테인으로부터 간섭받는 것을 방지하였다 (Miller et al., J. Biol. Chem. 254:7521-7528, 1979). Fe(III)BP의 경우, 모든 돌연변이는 E57D를 배경으로 컨스트럭트하였다. Fe(III)BP의 결정 구조에서, 이러한 글루타메이트는 철로 조화되었다 (Bruns et al., Nat. Struct. Biol. 4:919-924, 1997). E57D 돌연변이는 Fe(III)에 대한 Fe(III)BP의 친화도를 약 1×10^-21 (Adhikari et al., J. Biol. Chem. 270:25142-25149, 1995)으로부터 약 3×10^-8으로 약화시킴을 확인하였으며, 1:1 Fe(III) 시트레이트 복합체에 대한 안정 상수 (stability constant)가 logK=10.25로 측정되었다 (Martell ＆ Smith, Critical Stability Constants, Plenum Press, New York, 1997). 이는 나노몰 농도의 Fe(III)BP에서 Fe(III) 시트레이트를 이용해 직접 적정 (titration)함으로써 Fe(III) 친화도를 직접적으로 측정할 수 있게 한다.

형광에 의한 신호 전달. 열한개의 bPBPs 세트에 의한 리간드 결합을 조사하기 위해, 형광 리포터 그룹을 결합-의존적 형태학적 변화를 수반하는 것으로 예측되는 위치로 조작된 단독의 시스테인 티올에 부착시켰다. 여덟개의 티올-반응성 플루오로포어들을 실험하였으며 이들은 주위환경에서 변화하기 위해 그들의 방출 스펙트럼의 민감도에 기초하여 선택되며 광범위한 방출 및 여기 파장을 가졌다 (도 3). 본 발명의 구현예로서 바이오센서 콘쥬게이트에 대한 결과는 하기 표 5에 나타내었다 (11개의 수용체, 68개의 시스테인 돌연변이, 320개의 플루오로포어 콘쥬게이트).

a: 아라비노스 BP의 모든 돌연변이는 C64A를 배경으로 한다.

Fe(III)BP에 있는 모든 돌연변이는 E57D를 배경으로 한다.

b: a:알로스테릭, e:엔도스테릭, p:페리스테릭

c: 굵게 표시된 수는 본문에서 상술한 센서 용도의 역치 기준과 만난다.

밑줄로 표시된 수는 우수한 절대 강도 또는 비율측정 센서를 나타낸다.

굵게 이탤릭체로 표시된 수는 두개의 파라미터 모두에서 우수한 센서이다.

d: inc/dec, 리간드 결합하는 동안의 최대 형광 강도의 증가 (＋) 또는 감소 (-)

형광 바이오센서 기능의 평가. bPBP-플루오로포어 콘쥬게이트의 형광 방출 스펙트럼은 포화 리간드 농도의 부재 및 존재에서 기록하였다. 스펙트럼의 변화는 하기의 네개의 파라미터로 확인하였다: 파장의 이동 (결합되지 않은 상태 및 리간드-포화된 상태 사이에서의 최대 방출 파장의 차이), 강도 변화의 방향 (두개 상태에 있는 최대 방출 파장에서의 강도의 증가 또는 감소), 표준 강도 변화 (ΔI_std), 및 표준 비율측정 변화 (ΔR). ΔI_std는 평균 강도에 대한 표준화된 강도의 변화를 나타내며, 두개의 최대 방출 사이의 중간-점 (mid-point) 파장에서 측정하였다:

(1)

상기에서 λ_std=(λ_max,unbound ＋λ_{max,saturated})/2이며, I₁ 및 I₂는 각각의 스펙트럼의 λ_std에서의 형광 강도이다 (도 4A). ΔR은 두개의 방출 밴드, A₁([λ₁,λ₂]) 및 A₂([λ₃,λ₄)]의 간격을 나타낸다 (도 4B):

(2)

상기에서 ⁰A₁, ⁰A₂는 리간드가 존재하지 않은 상태의 구역이고, ^∞A₁, ^∞A₂는 포화된 리간드의 존재하에서의 구역이다. 두개의 스펙트럼에 있는 모든 가능한 파장 밴드의 쌍에 대한 ΔR을 확인하고, ΔR의 최대값으로 확인된 최적의 센싱 조건을 확인하기 위해 컴퓨터 프로그램을 이용하였다. 알고리즘의 적정 파라미터 및 본원에 보고된 ΔR_max 양에 사용한 값은 다음과 같다: 스텝 크기 (2 nm), 스텝 넓이 (10 nm), 최소 통합 구역 제한 (전체 프랙션: 0.1), 및 최대 통합 구역 제한 (전체 프랙션: 1).

분석물의 친화도 측정. ΔI_std>0.1으로 콘쥬게이트된 133 bPBP-플루오로포어는 형광측정법 적정을 이용하여 리간드 결합 친화도를 측정하기 위해 사용하였다 (표 5). 관찰된 방출 파장은 리간드-프리 및 결합한 상태 사이의 최대 강도 차이였다. 각각의 콘쥬게이트에 대해, 형광 강도측정법 관찰은 두개의-상태 모델에 대해 쌍곡선의 결합 등온선에 맞추었다 (Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997):

(3)

상기에서 F는 리간드 농도 [S]에서의 형광이고, K_d는 분해 상수이며, F_F, F_B는 각각 리간드-프리 및 리간드-결합 상태의 형광 강도이다. 글루코스 BP 및 글루타메이트/아스파테이트 BP에 대한 결합 등온선의 예는 도 5에 나타내었다. 비율측정 관찰에 대해, 수학식 3은 두개의 방출 밴드의 차등적 가중 기여에 대해 계산하여 변형시켰다 (Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2 ^nd Ed. Kluwer Academic Press, New York, p.698, 1999):

(4)

상기에서 R은 A₁/A₂ 비율, R_B=^∞A₁/^∞A₂, R_F=⁰A₁/⁰A₁, 및 ^appK_d는 외관상의 분해 상수이다:

(5)

형광 바이오센서 디자인 전략의 성공은 효과적으로 반응하는 형광 콘쥬게이트와 만나게 되는 가능성을 측정하고, 리간드-결합 친화도가 플루오로포어 콘쥬게이트에 의해 어떤 영향을 받는지를 평가함으로써 확인되었다.

형광에 있는 리간드-유도된 변화의 평가. 모든 콘쥬게이트 (n=320)에 대한 파장 변화, ΔI_std 및 ΔR_max의 요약은 도 6A에 있는 히스토그램에 표시하였다. 이러한 파장 변화의 분포는 대칭적으로 약 0이었다; 즉, 파랑- 또는 빨강-변화 어느것에 대해서도 한쪽으로 치우치는 경향을 나타내지 않았다. 콘쥬게이트의 전체 집합 중에서, 결합하는 동안의 형광 강도에 있어서 130개는 증가를 나타내었고 190개는 감소를 나타내었다. 이러한 편중된 부분이 나타나는 것은 모든 Fe(III)BP 콘쥬게이트에 대한 Fe(III) 시트레이트의 첨가가 감소된 형광 방출을 유발하기 때문이다. 이러한 결과가 용액에 있는 Fe(III)에 의해 퀀칭 (quenching)됨으로써 유발되는지를 알아보기 위해, Fe(III) 시트레이트를 다른 bPBPs의 콘쥬게이트에 첨가하였으며 방출 강도에 미치는 영향을 모니터하였다. 그 결과, Fe(III) 시트레이트는 모든 경우에서 형광을 퀀칭하는 것으로 확인되었으나, 단지 이보다 훨씬 높은 농도에서는 Fe(III)BP에 영향을 주었다. 따라서, Fe(III)BP의 모든 콘쥬게이트에서 관찰되는 형광 강도에서의 감소는 결합-특이적 과정에 의한 것이며, 금속-연관된 레독스 메커니즘을 통해 여기된 상태의 이완과 관련할 것이다 (Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2 ^nd Ed. Kluwer Academic Press, New York, p. 698, 1999). 특정 강도로 반응하는 콘쥬게이트를 만나게 될 가능성은 ΔI_std의 등급이 증가함에 따라 감소하였다 (도 6B). 비율측정 반응도 유사하였다 (도 6C).

광학적 센싱을 위해 가장 유용성이 큰 두가지 기준은 ΔI_std 및 ΔR_max이다. bPBP 콘쥬게이트의 수득은 스테릭 위치의 클래스, 플루오로포어 및 단백질 구조에 의해 분류하였으며, 그리고 나서 각각의 카테고리에 대해서는 ΔI_std> 0.25 및 ΔR_max>1.25인 분획에 따라 정량화하였다. 결과 (표 6-8)는 잠재적으로 유용한 형광 바이오센서 콘쥬게이트를 확인하기 위해 전체 성공 속도를 검증한 것이다. 320 콘쥬게이트의 콜렉션은 ΔI_std에 대한 기준을 약 24% 정도 만족시키며 ΔR_max에 대한 기준을 약 28% 정도 만족시킨다.

신호 성공률과 서열-연관된 패밀리 또는 클러스터 사이에 상호 관련이 있는 것으로 보인다 (Tam ＆ Saier, Microbiol. Rev. 57:320-346, 1993). ΔI_std 및 ΔR_max에 대하여 높은 성공률을 보이는 구조는 아라비노스 BP, 글루코스 BP, 리보오스 BP 및 포스페이트 BP이다 (표 6). 상기 전자의 세개는 헥소오스 및 펜토오스에 대한 결합 단백질을 포함하는 클러스터 2에 포함되지만, 설페이트 BP와 함께 포스페이트 BP는 무기 폴리음이온에 대한 결합 단백질을 포함하는 클러스터 6에 포함된다. 매우 낮은 성공율을 갖는 구조는 디펩타이드 BP (클러스터 5, 펩타이드 및 니켈 결합) 및 클러스터 3 (극성 아미노산 결합) 단백질 글루타민 BP, 히스티딘 BP 및 Glu/Asp BP이다.

연결 위치의 3개 클래스 중에서 엔도스테릭 및 알로스테릭 위치는 페리스테릭 위치에 비해 역치 기준을 만날 가능성이 높다 (표 7). ΔI_std에서의 성공율은 플루오로포어의 환경적 민감도에 따라 다양하며, 스티릴 및 나프틸 염료 JPW4039, JPW4042 및 JPW4045와 함께 높다. 유사하게, ΔR_max에 대한 더 높은 성공율은 JPW4045 및 아크릴로단과 관련이 있었다 (표 8).

리간드-결합 친화도에서의 변화의 평가. 각각의 리간드에 대한 결합 커브로부터 추출한 분해 상수, K_d의 범위는 표 9에 나타내었다. 리간드 결합 및 단백질과 결합한 플루오로포어의 상호작용 사이에 열역학적인 연관성이 있기 때문에, 플루오로포어는 내재성의 리간드 분해 상수를 변화시키는 것으로 예측되었다. 플루오로포어에 의해 전달되는 친화도의 변화는 단백질에 있는 그의 위치에 의존하는 것으로 예측되었다. 다양한 콘쥬게이트는 광범위한 친화도를 가진다 (표 9). log(^mutK_d/^wtK_d)로서 표현되는 친화도에서의 변화는 분해 상수가 측정되고 콘쥬게이트되지 않은 단백질의 분해 상수가 공지된 108개의 콘쥬게이트 중에서 연결 위치 분류 (엔도스테릭, 알로스테릭 또는 페리스테릭)의 기능으로서 검증되었다 (표 2). 상기 결과는 세 군의 위치가 친화도에 있어서 다른 영향을 줌을 나타내어 준다 (도 7). 엔도스테릭 위치에서의 플루오로포어 결합은 친화도를 교란시켜 매우 높게 만드는 경향이 있으며, 비정상적으로 야생형에 비해 K_d 값을 더 높게 한다. 알로스테릭 및 페리스테릭 결합은 결과적으로 K_d 값이 야생형에 비해 훨씬 높거나 낮게 만들며, 페리스테릭 위치를 가지게 되면 매우 큰 영향을 주게된다. 흥미롭게도, 이러한 콘쥬게이트들은 야생형 (낮은 K_d)에 비해 높은 친화도를 가지며, 알로스테릭 위치에서의 콘쥬게이션으로부터 더 큰 비율이 유도되었다. 이는 말토오스 BP에서의 상세한 연구를 통해 알로스테릭 위치에 있는 잔기의 부피를 조작함으로써 친화도가 증가한다는 사실을 입증하게 하였다 (Marvin ＆ Hellinga, Nat. Struct. Biol. 8:795-798, 2001). 효과에서의 차이는 유사한 것에 의하여 합리화될 수 있는데, 각각의 콘쥬게이트가 리간드 결합과 직접적으로 (엔도스테릭 위치 및 일부 페리스테릭 위치) 또는 개방되고 폐쇄된 상태 사이에서의 내재적 평형 (알로스테릭 위치, 페리스테릭 위치)에 영향을 줌으로써 위치적으로 영향을 줄 수 있다.

분해 상수에 대한 효과는 아라비노스 BP에 예시한 바와 같이, 결합 위치 뿐만 아니라 결합한 플루오로포어의 특성에 의해 결정된다. 트립토판 형광에 의해 측정된 다섯개의 시스테인-치환 돌연변이 (모두는 C64A 돌연변이를 가짐)의 아라비노스에 대한 분해 상수는 5.0 μM (F23C), 3.2 μM (L253C), 3.4 μM (D257C), 7.6 μM (L298C) 및 1.6 μM (K301C)이다. 따라서, 시스테인 치환은 아라비노스에 대한 친화도 (C64A 돌연변이의 Kd는 ~2.2 μM)를 교란시킨다. 결합한 플루오로포어 상의 가장 큰 의존도는 L253C 돌연변이에 대해, K_d 값이 0.7 μM (아크릴로단) 내지 775 μM (NBD)인 것으로 확인되었다. 유사하게는, 디펩타이드 BP의 K394C 돌연변이는 Gly-Leu 디펩타이드에 대해 6 nM (NBD) 내지 93 μM (플루오레신)의 친화도를 가진다. 대부분의 돌연변이는 이러한 광범위한 플루오로포어-의존적 리간드 친화도를 가지지 않았다. 예를 들어, 리보오스 BP E192C에 콘쥬게이트된 다섯개의 다른 플루오로포어는 리보오스에 대해 2.6 μM (NBD 및 JPW4039) 내지 15 μM (JPW4045)의 범위를 가진다.

서열 정보를 이용한 신규 바이오센서의 제조. 디자인이 공지된 구조를 가진 bPBPs에 제한되지 않는다는 것을 확인하기 위해, 페리스테릭 및 알로스테릭 위치에 대한 위치를 가이드하기 위한 구조로서 히스티딘 및 글루타민 BP를 이용하여, 글루타메이트/아스파테이트 BP를 코딩하는 것으로 예측되는 파라로그 (paralog)에 시스테인 돌연변이를 도입하였다. 콘쥬게이트를 생산하기 위해 시도된 모든 열개의 위치는 형광에서 글루타메이트 및 아스파테이트-의존적 변화를 유발하였다. 몇몇 위치는 좋거나 우수한 강도측정 또는 비율측정 센서를 유발하였다. 표 10에서는 반응이 글루타민 및 아스파라긴에 대해 50- 내지 500-배의 약한 친화도를 가진, 아스파테이트 및 글루타메이트 모두에 대해 특이적임을 나타내어 준다. 다른 아미노산 및 당은 형광에서 리간드-유도된 변화를 이끌어내지 않았다.

바이오인포매틱스 (bioinformatics)는 직접적인 실험을 하지 않고도 신규한 생화학적 적용의 개발을 가능하게 한다. 바이오센서의 경우, 각각의 박테리아 게놈은 특정 분자에 결합하여 수송 또는 신호 전달을 개시하게 하는 bPBPs의 스코어(score)를 인코딩할 수 있다 (Blattner et al., Science 277:1453-1474, 1997; Quentin et al., J. Mol. Biol. 287:467-484, 1999). 이들 대부분이 동정되지 않았으며, 많은 수가 잠재적인 바이오센서에 대한 구조로 이용되지 않은채로 남아있다. 신규한 특이성을 가진 바이오센서를 제조하기 위해, 동종의 단백질의 구조적 정보를 이용해 결합시킨 게놈 정보의 적용이 가능함이 검증되었다.

이전에, 글루타메이트/아스파테이트 BP가 E.coli로부터 분리되고 (Barash ＆ Halpern, Biochim. Biophys. Acta 386:168-180, 1975; Willis ＆ Furlong, J. Biol. Chem. 250:2574-2580, 1975) 동정되었다. 여러개의 증거는 YBEJ가 상기 단백질과 일치함을 제시해준다. 첫째, 글루타메이트/아스파테이트 BP는 추정의 원형질막 위치화 신호 서열을 가진 단백질을 인코딩하는 ybeJ로 구성되어 있는 원형질막 추출물로부터 분리되었다. 둘째, 종래에 측정된 글루타메이트/아스파테이트 BP의 분자량이 32 kDa (Barash ＆ Halpern, Biochim. Biophys. Acta 386:168-180, 1975) 또는 31 kDa (Willis ＆ Furlong, J. Biol. Chem. 250:2574-2580, 1975)인 것은 프로세싱된 ybeJ 생산물에 대해 예측한 질량 32.5 kDa 및 본 발명에서 겔 전기영동에 의해 확인한 질량 30 kDa과 매치한다. 셋째, 기존에 측정한 아미노산 조성은 (Barash ＆ Halpern, Biochim. Biophys. Acta 386:168-180, 1975; Willis ＆ Furlong, J. Biol. Chem. 250:2574-2580, 1975) 유전자 서열로부터 예측한 것과 유사하였으며, 단백질 산 가수분해물의 분석에서 비정확성을 나타내기 때문에 약간의 차이는 있었다. 마지막으로, 글루타메이트 (0.8 μM), 아스파테이트 (1.2 μM)에 대한 공지된 K_d 값 뿐만 아니라 글루타민 및 아스파라긴에 대한 상대적으로 낮은 친화도는 (Willis ＆ Furling, J. Biol. Chem. 250:2574-2580, 1975) 본원에서 측정한 것과 유사하였으며, Q123C-플루오레신 콘쥬게이트와 비교가능하였다 (표 10). 따라서, ybeJ는 기존에 동정된 글루타메이트/아스파테이트 BP를 인코딩한다.

효율적인 센서 디자인. 콘쥬게이트의 유용성은 신호 강도, 비율측정 변화 및 센서가 정확하게 반응할 수 있는 작동 농도 범위 이상의 실질적인 변화에 의해 측정될 수 있다. 두개의 관찰가능한 파라미터 중에서, 비율측정 변화는 실제적으로 강한 것이 바람직한데, 이는 프로브 농도에 의존하기 때문이다.

비록 사용가능한 콘쥬게이트는 ΔI_std>0.25 및 ΔR_max>1.25의 값을 가지는 것으로 정의될 수 있지만, "우수한" 센서는 ΔI_std>0.9 및 ΔR_max>2.5의 값을 가지는 것으로 정의될 수 있다. 우수한 센서에서의 변화의 등급은 혈액과 같은 복합 체액에 있는 "실제-세계 (real-world)" 적용에서 확실하게 측정하기에 매우 충분한 경향이 있다. 이러한 기준에 따르면 오직 열세개의 우수한 절대 강도-기초의 센서 (전체중에서 4%)가 있지만, 36개의 우수한 비율측정 센서 (전체중에서 11%)도 있고; 절대 강도 및 비율측정 센서가 모두 우수한 7개의 콘쥬게이트가 있다 (표 5). 디펩타이드 BP, Fe(III)BP 및 히스티딘 BP를 제외하고, 모든 단백질은 최소한 하나의 우수한 비율측정 및 강도-기초의 콘쥬게이트를 갖고 있다. 글루코스 BP는 수많은 우수한 콘쥬게이트를 갖고 있다. 이러한 콘쥬게이트 모두는 각각이 환경적으로 민감한것으로 알려진 플루오로포어 (아크릴로단, NBD, 피렌 및 스티릴 염료)와 관계있다. 우수한 센서의 영향범위는 알로스테릭 및 페리스테릭 위치에 골고루 분포되어 있다. 모든 엔도스테릭 위치는 우수한 센서를 유발한다.

콘쥬게이트의 분해 상수는 센서가 정확하게 반응할 수 있는 농도 범위에서 조작을 측정한다. 조작 범위는 5% 이하의 에러 스팬 (span) 농도를 보증하여 K_d 값을 5배 내외로 떨어뜨린다 (Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997). 만약에 정확한 측정을 하기 위해 요구되는 범위가 스팬보다 넓다면, 복합식 바이오센서는 다양한 친화도를 가진 수용체를 이용하여 말토오즈 BP에 대해 설명한 바와 같이 제조될 수 있다 (Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997). 분해 상수에 영향을 줄 수 있는 다음의 세가지 인자가 있다: 콘쥬게이트의 특징, 비율측정 센서에 대한 방출 밴드의 선택 (수학식 2) 및 추가적인 돌연변이. 각각의 적용을 위해, 이러한 세가지 인자가 적합한 센서를 제조하기 위해 조작될 수 있다.

글루코스 센서. 임상 의학에 적용가능한 분석물 중에서, 글루코스는 가장 중요한, 특히 당뇨병을 진단 및 치료하는데 있어서 중요한 것 중의 하나이다. 성인 인간 혈청에 있는 글루코스 농도의 정상 범위는 4-6 mM이다 (Burtis ＆ Ashwood, Teitz Textbook of Clinical Chemistry, 2 ^nd Ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pennsylvania, 1994). 글루코스 BP에 있는 엔도스테릭 위치 W183C의 아크릴로단 콘쥬게이트는 우수한 비율측정 반응 (ΔR_max=5.57) 및 5.98 mM의 분해 상수를 가지며, 이는 비율측정에 의한 생리적 범위에서 글루코스 변화를 감지하기 위한 좋은 지표가 된다 (도 8A). 또한, 비율측정 파라미터에 의한 적용에 의해, 관찰 범위는 5.0 mM에서부터 17.4 mM로 손쉽게 확장되며, 모든 임상학적으로 중요한 범위들은 하나의 센서를 이용해 관찰될 수 있다 (도 8A).

임상 화학을 위한 다른 센서들. 또한, 아미노산은 질병 상태의 지표로서 임상적 테스트에서 통상적으로 분석된다. 히스티딘은 히스티다아제 결핍의 지표이다 (Taylor et al., Molec. Biol. Med. 8:101-116, 1991). 우수한 신호 히스티딘 BP 콘쥬게이트, V163C-JPW4042는 K_d가 0.25 μM로서, 혈청에 있는 약 48-125 μM의 정상 범위보다 낮다. 그러나, 샘플을 희석함에 따라 이러한 콘쥬게이트는 효과적으로 기능을 할 수 있다. 선택적으로, K_d는 말토오즈 BP에 대해 수행된 돌연변이유도 (Marvin ＆ Hellinga, Nat. Struct. Biol. 8:795-798, 2001) 및 E57D 돌연변이를 가진 Fe(III)BP에 의해 적정될 수 있다. 신경흥분성 아미노산 글루타메이트는 정상적인 혈청 농도 20-220 μM을 가진다 (Burtis ＆ Ashwood, Teitz Textbook of Clinical Chemistry, 2 ^nd Ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pennsylvania, 1994). 가장 우수하게-맞추어진 바이오센서는 글루타메이트/아스파테이트 BP F126C-아크릴로단이며, 이의 K_d~80 μM이고 ΔR_max=2.70이다. 글루타메이트는 종종 뇌척수액에서 정상 범위 120-360 μM으로 관찰되며 (Smith ＆ Forman, Clin. Lab. Sci. 7:32-38, 1994), 우수한-신호 글루타민 BP 콘쥬게이트, Y163C-아크릴로단의 K_d (~1.4 μM)보다 훨씬 높다. 이러한 바이오센서는 K_d를 적정하기 위해 돌연변이유도하거나 샘플을 희석함으로써 이러한 목적에 대해 사용될 수 있다.

혈청 및 소변에 있는 포스페이트 농도는 임상적으로 적절하다 (Burkhardt et al., Am. J. Clin. Pathol. 72:326-329, 1979). 일부 우수한 포스페이트 BP 콘쥬게이트 신호, 가장 우수한 것으로 S39C-JPW4045는 그의 K_d값이 2 μM보다 모두 낮다. 혈청에 있는 무기 포스페이트는 일반적으로 1-3 mM이며 (Burtis ＆ Ashwood, Teitz Textbook of Clinical Chemistry, 2 ^nd Ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pennsylvania, 1994), 이러한 센서들을 이용하여 정확하게 측정하기 위해서는 K_d의 적정 또는 샘플의 희석이 필요하다.

말토오즈 농도는 약 2 μM의 정상 혈장 농도를 가지며, 산 말타아제에서의 결함에 대해 적절하다 (Rozaklis et al., Clin. Chem. 48:131-139, 2002). 본 발명의 우수한 말토오즈 센서는 말토오즈 BP 콘쥬게이트 S233C-JPW4042 (ΔR_max=4.0) 및 S233C-JPW4045 (ΔR_max=3.9)이며, 상기 모두는 유사한 친화도를 갖는다 (K_d~400 μM). 2 μM 범위의 친화도를 가지는 말토오즈 BP 돌연변이의 형광 콘쥬게이트는 Marvin 등에 의해 개시되었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997).

산업적 및 환경적 적용. bPBP 콘쥬게이트는 산업적 및 환경적 분석물에 대한 센서로서 기능할 수 있다. 아라비노스는 옥수수로부터의 에탄올 생산 효율을 향상시키기에 적절하다 (Deanda et al., Appl. Environ. Microbiol. 62:4465-4470, 1996). 아라비노스 BP 콘쥬게이트에서, 우수한 신호기 (signaler)는 K301C-NBD (K_d~31 μM, ΔR_max=3.2) 및 L253C-플루오레신 (K_d~48 μM, ΔR_max=2.7)이다. 식품 및 음료에서 분석된 리보오스 농도는 (AOAC, Official Methods of Analysis of AOAC International, 16 ^th Ed. AOAC International, Arlington, Virginia, 1995) 리보오스 BP 콘쥬게이트 T135C-아크릴로단 (K_d~0.4 mM, ΔR_max=6.3) 및 A234C-JPW4045 (K_d~3.8 μM, ΔR_max=4.1)에 의해 측정된다. 한개의 리보오스 BP 유도체를 이용한 리보오스의 비율측정 센싱 (sensing)은 T135C-아크릴로단 콘쥬게이트에 의해 예시된다 (도 8B). 형광비 (수학식 4, 5)에 있는 방출 파장 밴드를 변화시킴으로서 리보오스에 대한 ^appK_d를 41-146 μM로 적정시킬 수 있다 (도 8B). 음료수에 있는 설페이트 농도는 관심사이며 (U.S. EPA. Health Effects From Exposure to High Levels of Sulfate in Drinking Water, pp. 1-25, Office of Drinking Water and Ground Water, 1999), 설페이트 BP 콘쥬게이트 R134C-아크릴로단 (K_d~4 μM, ΔR_max=2.3)에 의해 분석될 수 있다. 높은 농도의 포스페이트는 환경적으로 유독하며, 상기 임상적 적용에서 언급한 바와 같이 포스페이트 BP 콘쥬게이트를 이용하여 모니터할 수 있다. 철 농도는 해양의 특정 부위에서의 일차 생산성을 제한한다 (Martin, Iron as a Limiting Factor in Primary Productivity and Biogeochemical Cycles in the Sea. Falkowski ＆ Woodhead, eds., pp. 123-137, Plenum Press, New York). 사용가능한 철 이온은 콘쥬게이트 E203C-아크릴로단 (K_d~138 μM, ΔI_std 0.4)과 같은 Fe(III)BP로부터 유도된 바이오센서를 이용하여 측정할 수 있다.

상기에 인용된 모든 문헌은 참조로서 삽입되었다. 또한 바이오일렉트로닉 센서를 포함하는 전기 장비의 개시에 대하여 참조로 삽입된 것으로는 미합중국 특허 제 10/229,286호 (미합중국 특허 공개 2003/0129622로서 공개된) 및 국제특허출원 PCT/US02/27279 (WO 03/021247)가 있다.

본 발명은 바이오센서, 박테리아 원형질막 결합 단백질 (bPBP) 슈퍼패밀리의 야생형 또는 돌연변이 군으로부터 상기 바이오센서를 제조하는 방법 및 리간드를 분석하기 위한 (즉, 검출 및/또는 정량) 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 바이오센서는 추가적인 시약을 사용하지 않고도 생리적인 조건하에서 조작될 수 있다.

Claims

글루코스 결합 단백질 (GBP) 및 대장균 GBP의 183 위치에 상응하는 상기 GBP 위치에 부착된 최소 하나의 리포터 그룹을 포함하고, 바이오센서의 글루코스 결합 포켓 내의 글루코스의 결합은 상기 리포터 그룹에 의한 신호에 변화를 일으키는 글루코스용 바이오센서.
제 1 항에 있어서, 상기 GBP는 GBP 돌연변이 W183C인 글루코스용 바이오센서.
제 2 항에 있어서, 상기 리포터 그룹은 아크릴로단(acrylodan)인 글루코스용 바이오센서.
제 1 항에 있어서, 상기 GBP는 대장균 GBP인 글루코스용 바이오센서.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 리포터 그룹은 공유결합으로 부착된 것인 글루코스용 바이오센서.
제 6 항에 있어서, 상기 리포터 그룹은 플루오로포어(fluorophore)인 것인 글루코스용 바이오센서.
제 7 항에 있어서, 글루코스 결합시에 상기 바이오센서의 표준 강도 변화(ΔI_std)는 0.25를 초과하는 것인 글루코스용 바이오센서.
제 8 항에 있어서, 상기 ΔI_std는 0.9를 초과하는 것인 글루코스용 바이오센서.
제 7 항에 있어서, 글루코스 결합시에 상기 바이오센서의 표준 비율측정 (ratiometric) 최대값의 변화 (ΔR_max)는 1.25를 초과하는 것인 글루코스용 바이오센서.
제 10 항에 있어서, 상기 ΔR_max는 2.5를 초과하는 것인 글루코스용 바이오센서.
제 1 항에 있어서, 상기 리포터 그룹은 비-공유결합으로 부착된 것인 글루코스용 바이오센서.
제 12 항에 있어서, 상기 리포터 그룹은 레독스 보조인자인 것인 글루코스용 바이오센서.
삭제
하기 단계를 포함하는, 샘플 내의 글루코스의 존재 또는 부재 여부를 검출하는 방법:

바이오센서가 상기 샘플에 존재하는 글루코스에 결합할 수 있는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서를 상기 샘플과 접촉시키는 단계;

상기 바이오센서가 상기 샘플과 접촉한 시점에 상기 바이오센서의 리포터 그룹에 의해 전달된 신호(들)를 상기 바이오센서가 공지된 양의 글루코스를 포함하는 최소 하나의 대조군 샘플과 접촉한 시점에 상기 바이오센서의 리포터 그룹에 의해 전달된 신호(들)와 비교하는 단계; 및

상기 비교 단계로부터 상기 샘플 내의 글루코스의 존재 또는 부재 여부를 결정하는 단계.
제 15 항에 있어서, 상기 샘플은 생리적 체액을 포함하는 것인 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 생리적 체액은 혈액, 간질액, 세척물 (lavage), 땀 (perspiration), 혈장, 침, 혈청 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
하기 단계를 포함하는, 샘플 내의 글루코스의 양 또는 농도를 측정하는 방법:

바이오센서가 상기 샘플에 존재하는 글루코스에 결합할 수 있는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서를 상기 샘플과 접촉시키는 단계;

상기 바이오센서가 상기 샘플과 접촉한 시점에 리포터 그룹에 의해 전달된 신호를 공지된 양의 글루코스를 포함하는 대조군 샘플의 시리즈 (series)에 의해 전달된 신호들과 비교하는 단계; 및

상기 비교 단계로부터 상기 샘플에 있는 글루코스의 양을 계산하는 단계.
제 18 항에 있어서, 상기 샘플은 생리적 체액을 포함하는 것인 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 생리적 체액은 혈액, 간질액, 세척물 (lavage), 땀 (perspiration), 혈장, 침, 혈청 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
하기 단계를 포함하는, 샘플에 있는 글루코스를 분석하는 방법:

(a) 바이오센서가 상기 샘플에 존재하는 글루코스에 결합할 수 있는 조건 하에서 제 1 항 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서를 상기 샘플과 접촉시키는 단계;

(b) 리포터 그룹에 의해 전달된 신호에 대한 비율측정 변화 (ΔR)를 측정하는 단계; 및

(c) 상기 샘플에 존재하는 글루코스를 적어도 검출하거나 정량하는 단계.
제 21 항에 있어서, 상기 샘플은 생리적 체액을 포함하는 것인 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 생리적 체액은 혈액, 간질액, 세척물 (lavage), 땀 (perspiration), 혈장, 침, 혈청 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.